KR20140070468A - 바이오마커 진단 방법 및 바이오마커 진단 키트 - Google Patents

Abstract

자성입자와 정량분석용 양자점을 이용한 바이오마커 진단 방법 및 바이오마커 진단 키트를 제공한다. 바이오마커의 진단 방법은, i) 링커를 이용하여 바이오마커를 수집할 수 있는 제1 항체를 그 표면에 고정시킨 자성입자들을 제공하는 단계, ii) 바이오마커를 탐지할 수 있는 제2 항체를 그 표면에 고정시킨 양자점들을 제공하는 단계, iii) 자성입자들과 양자점들에 의해 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계, iv) 양자점들 중 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리하는 단계, 및 v) 분리된 양자점들의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함한다.

Description

바이오마커 진단 방법 및 바이오마커 진단 키트 {METHOD FOR DIAGNOSING A BIOMARKER AND BIOMARKER DIAGNOSIS KIT}

본 발명은 바이오마커 진단 방법 및 바이오마커 진단 키트에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 본 발명은 자성입자와 정량분석용 양자점을 이용한 바이오마커 진단 방법 및 바이오마커 진단 키트에 관한 것이다.

소변 또는 혈액 등의 시료에서 단일 또는 복수의 물질들을 검지하여 질병을 진단할 수 있는 진단 키트가 개발되고 있다. 일반적으로 특정 물질에 대한 인식기능을 가진 생물학적 수용체는 전기 또는 광학적 변환기와 결합되어 생물학적 상호작용 및 인식반응을 전기적 또는 광학적 신호로 변환시킴으로써 분석대상물질을 선택적으로 감지한다.

최근에는 단순히 질병 바이오 마커의 유무를 판단하는 고전적인 정성분석보다는 바이오마커의 양을 정확히 정량화하여 정확하고 가치있는 정보를 전달하는 진단 키트가 개발되고 있다. 특히, 극미량 수준의 바이오마커의 정량화는 암 등의 치명적인 질병의 초기단계에서도 진단과 예측이 가능하므로, 미래의 의료기술로서 각광받고 있다. 특히, 다양한 나노기술이 발전하면서 새로운 진단 방법들이 개발되어 큰 각광을 받고 있다.

자성입자와 양자점을 이용하여 바이오마커를 정량적으로 정확하게 진단할 수 있는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 전술한 바이오마커를 정량적으로 정확히 진단할 수 있는 바이오마커 진단 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법은, i) 링커를 이용하여 바이오마커를 수집할 수 있는 제1 항체(primary antibody)를 그 표면에 고정시킨 자성입자들을 제공하는 단계, ii) 바이오마커를 탐지할 수 있는 제2 항체(secondary antibody)를 그 표면에 고정시킨 양자점들을 제공하는 단계, iii) 자성입자들과 양자점들에 의해 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계, iv) 양자점들 중 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리하는 단계, 및 v) 분리된 양자점들의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함한다.

자성입자들을 제공하는 단계는, i) 자성입자들의 표면을 티올로 기능화하는 단계, ii) 자성입자들의 표면에 화학적 링커를 이용하여 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 및 Fc 리셉터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 링커 단백질을 결합시키는 단계, 및 iii) 제1 항체를 자성입자의 표면에 고정시켜서 제1 항체의 F_ab를 활성화시키는 단계를 포함할 수 있다. 링커 단백질을 결합시키는 단계에서, 화학적 링커는 설포석시니미들-4-{엔-말레이미도메틸}시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfosuccinimidyl-4-{N-maleimidomethyl} cyclohexane-1-carboxylate) 및 석시니미들-4-{엔-말레이미도메틸}시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-{N-maleimidomethyl}cyclohexane-1-carboxylate)(SMCC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화학적 링커일 수 있다.

양자점들을 제공하는 단계는, i) 1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine)(MHPC), 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000(DPPE-PEG2000) 및 1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈 쏠트(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)(Ni-NTA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지질을 이용하여 양자점들의 표면을 친수성으로 변환시키는 단계, ii) 양자점의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스(Hexahistidine sequence)를 포함하는 링커 단백질을 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하는 단계, 및 iii) 링커 단백질 위에 제2 항체를 고정시키는 단계를 포함할 수 있다. 링커 단백질을 고정하는 단계에서, 링커 단백질은 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 및 Fc 리셉터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질이고, 링커 단백질에 의해 제2 항체의 F_ab가 항상 활성화될 수 있다. 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리하는 단계는, i) 이미다졸 및 에틸렌 디아민 테트라아세틱 에시드(ethylenediamine tetraacetic acid)(EDTA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 첨가제를 첨가하여 니켈-히스티딘 결합반응을 끊어서 제2 항체에 부착된 양자점들만을 분리하는 단계, 및 ii) 자력을 이용하여 자성입자들을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

바이오마커의 농도를 정량화하는 단계는, i) 농도가 서로 상이한 또다른 양자점들을 포함하는 복수의 용액들을 제공하는 단계, ii) 복수의 용액들의 350nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, iii) 또다른 양자점들의 농도와 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 표준 곡선을 제공하는 단계, iv) 분리된 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, v) 분리된 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 표준 곡선과 비교하여 분리된 양자점의 농도를 계산하는 단계, 및 vi) 분리된 양자점의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

자성입자들을 제공하는 단계에서, 제1 항체는 복수로 이루어지고, 양자점들을 제공하는 단계에서, 제2 항체는 복수로 이루어질 수 있다. 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계에서, 바이오마커는 복수로 이루어지고, 복수의 바이오마커들은 서로 상이하며, 바이오마커들마다 제1 항체와 2 항체가 각각 서로 상이할 수 있다. 양자점들을 제공하는 단계에서 양자점은 CdSe/ZnS의 코어/쉘로 된 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 바이오마커 진단 키트는 i) 바이오마커 수집용 자성입자 함유 용액이 수용된 제1 용기, ii) 제1 용기와 별도로 수납되고, 정량분석용 양자점 함유 용액이 수용된 하나 이상의 제2 용기, iii) 제2 용기와 별도로 수납되고, 이미다졸 및 에틸렌 디아민 테트라아세틱 에시드(ethylenediamine tetraacetic acid)(EDTA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분리제를 함유한 버퍼 용액이 수용된 제3 용기, iv) 제3 용기와 별도로 수납되고, 그 내부가 비어 있는 제4 용기, v) 제1 용기 내지 제4 용기와 별도로 수납된 자성체, 및 vi) 제1 용기 내지 제4 용기 및 자성체와 별도로 수납된 설명서를 포함한다.

설명서에는, i) 바이오마커와 제1 용기의 용액을 제4 용기에 넣어서 제1 혼합 용액을 제공하는 단계, ii) 제4 용기에 자성체를 접촉시켜서 제1 혼합 용액 중 자성체에 붙은 객체만 잔존시키는 단계, iii) 제4 용기에 제2 용기의 용액을 넣어서 제2 혼합 용액을 제공하는 단계, iv) 제4 용기에 제3 용기의 용액을 넣어서 제2 혼합 용액과 제3 용기의 용액이 혼합된 제3 혼합 용액을 제공하는 단계, 및 v) 제4 용기에 자성체를 접촉시켜서 제3 혼합 용액 중 자성체에 붙은 자성입자를 제외한 나머지 용액을 분리시키는 단계를 포함하는 내용이 안내될 수 있다. 설명서에는, i) 나머지 용액의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, ii) 바이오마커의 농도와 흡광도 또는 형광의 세기를 비교한 표준 곡선을 제공하는 단계, iii) 흡광도 또는 형광의 세기를 표준 곡선과 비교하여 나머지 용액의 농도를 계산하는 단계, 및 iv) 나머지 용액의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함하는 내용이 추가로 안내될 수 있다. 하나 이상의 제2 용기는 복수의 제2 용기들을 포함하고, 복수의 제2 용기들 각각의 제2 용기에는 상호 다른 정량분석용 양자점 함유 용액이 포함될 수 있다.

자성입자와 양자점을 조합하여 바이오마커의 농도를 정확하게 정량화할 수 있다. 그 결과, 바이오마커로부터 질병에 대한 정확한 정보를 얻을 수 있다. 병원에서는 임상의들의 질병 진단과 약물이나 치료법에 대한 예후 판단 및 건강 검진이 가능해진다. 또한, 바이오마커 진단 키트를 상용화하여 각종 질병을 쉽게 예측할 수 있다. 또한, 극미량의 다양한 단백질이나 바이오마커를 정량분석할 수 있다. 그리고 복수의 바이오마커들을 동시에 정량 분석할 수 있으므로, 하나의 바이오마커만 사용하는 경우에 비해 질병 진단의 정확도를 높일 수 있다. 또한, 복수의 바이오마커들을 사용하여 다중 분석하므로 검사 시간 및 검사 비용을 절감할 수 있다.

도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법의 개략적인 개념도이다.
도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법의 개략적인 순서도이다.
도 3 내지 도 8은 도 1의 바이오마커의 진단 방법의 각 단계를 개념적으로 나타낸 도면이다.
도 9는 본 발명의 제2 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법의 개략적인 개념도이다.
도 10은 서로 상이한 양자점의 형광특성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오마커 진단 키트의 개략적인 도면이다.
도 12는 본 발명의 실험예에서 형광다이가 표지된 이차항체를 단백질 G의 유무에 따라 자성입자에 결합시킨 경우의 개념도와 그 사진이다.
도 13은 본 발명의 실험예에서 C-반응성 단백질의 유무에 따라 기능화된 자성입자와 형광다이가 결합된 C-반응성 단백질 탐지항체로 샌드위치 표적한 경우의 개념도와 그 사진이다.
도 14는 본 발명의 실험예에서 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도를 이용하여 만든 표준곡선을 통해 양자점의 농도와 흡광도간에 나타나는 직선형 그래프이다.
도 15는 본 발명의 실험예에서 표적된 C-반응성 단백질과 같은 수의 분리된 양자점의 농도를 통해 C-반응성 단백질의 개수를 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 16 및 도 17은 각각 본 발명의 제1 실험예 및 제2 실험예의 바이오마커 진단 키트의 사진들이다.
도 18은 3가지 종류의 바이오마커를 각각 다른 색의 파장을 방출하는 서로 다른 양자점을 이용하여 검출하는 개념도와 그 검출 결과를 개략적으로 나타낸 그래프이다.
도 19는 도 18의 3가지 종류의 바이오마커를 상호 다른 색의 파장을 방출하는 서로 다른 양자점을 이용하여 동시에 검출하는 개념도와 그 검출 결과를 개략적으로 나타낸 그래프이다.

어느 부분이 다른 부분의 "위에" 있다고 언급하는 경우, 이는 바로 다른 부분의 위에 있을 수 있거나 그 사이에 다른 부분이 수반될 수 있다. 대조적으로 어느 부분이 다른 부분의 "바로 위에" 있다고 언급하는 경우, 그 사이에 다른 부분이 수반되지 않는다.

제1, 제2 및 제3 등의 용어들은 다양한 부분, 성분, 영역, 층 및/또는 섹션들을 설명하기 위해 사용되나 이들에 한정되지 않는다. 이들 용어들은 어느 부분, 성분, 영역, 층 또는 섹션을 다른 부분, 성분, 영역, 층 또는 섹션과 구별하기 위해서만 사용된다. 따라서, 이하에서 서술하는 제1 부분, 성분, 영역, 층 또는 섹션은 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 제2 부분, 성분, 영역, 층 또는 섹션으로 언급될 수 있다.

여기서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.

"아래", "위" 등의 상대적인 공간을 나타내는 용어는 도면에서 도시된 한 부분의 다른 부분에 대한 관계를 보다 쉽게 설명하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용어들은 도면에서 의도한 의미와 함께 사용중인 장치의 다른 의미나 동작을 포함하도록 의도된다. 예를 들면, 도면중의 장치를 뒤집으면, 다른 부분들의 "아래"에 있는 것으로 설명된 어느 부분들은 다른 부분들의 "위"에 있는 것으로 설명된다. 따라서 "아래"라는 예시적인 용어는 위와 아래 방향을 전부 포함한다. 장치는 90˚ 회전 또는 다른 각도로 회전할 수 있고, 상대적인 공간을 나타내는 용어도 이에 따라서 해석된다.

다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하에서 사용하는 "바이오마커"라는 용어는 DNA, RNA, 대사물질, 단백질 및 단백질 조각들에서 유래된 단일 분자 또는 분자들의 패턴을 근거로 한 분자적 정보로서 생명체내에서 유전적 또는 후생유전적 변화의 영향으로 유발된 신체의 변화를 감지할 수 있는 지표를 의미한다. 따라서 피측정물인 혈액, 혈청이나 소변에는 바이오마커가 포함되어 있는 것으로 해석되며, 바이오마커의 진단은 혈액, 혈청 또는 소변 등의 샘플의 진단으로 해석된다.

이하에서 사용하는 "자성입자"라는 용어는 크기가 1nm 내지 10μm의 단일입자 또는 복수의 입자들이 모여서 구성된 객체를 모두 포함한다. 이 경우, 자성입자는 금속 물질, 자성 물질, 또는 자성 합금 등을 모두 포함하는 것으로 해석된다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법을 개략적으로 개념화하여 나타낸다. 도 1의 바이오마커의 진단 방법의 개념은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 바이오마커의 진단 방법의 개념을 다른 형태로 변형할 수 있다.

도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 제1 실시예에서는 제1 항체가 그 표면에 고정된 자성입자와 제2 항체가 그 표면에 고정된 양자점을 제공한다. 바이오마커는 제1 항체에 의해 수집될 수 있고, 제2 항체에 의해 탐지될 수 있다. 제1 항체에 의해 수집된 바이오마커는 자성체에 의해 분리된 후 양자점과 결합된 제2 항체에 의해 탐지된다. 따라서 바이오마커는 자성입자와 양자점에 의해 샌드위치 표적된다. 다음으로, 표적된 바이오마커는 양자점에 붙은 상태로 첨가제에 의해 선택적으로 분리될 수 있다. 그 결과, 양자점을 통하여 바이오마커의 농도를 정량화할 수 있다. 이하에서는 도 2 내지 도 8을 통하여 도 1의 바이오마커의 진단 방법의 개념을 좀더 상세하게 설명한다.

도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법의 순서도를 개략적으로 나타낸다. 도 2의 바이오마커의 진단 방법은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 바이오마커의 진단 방법을 다양하게 변형할 수 있다. 이하에서는 도 2의 바이오마커의 진단 방법의 각 단계를 개념적으로 도시한 도 3 내지 도 8을 참조하여 바이오마커의 진단 방법을 상세하게 설명한다.

도 2에 도시한 바와 같이, 바이오마커의 진단 방법은, 링커를 이용하여 바이오마커를 수집할 수 있는 항체를 표면에 고정시킨 자성입자들을 제공하는 단계(S10), 바이오마커를 탐지할 수 있는 항체를 표면에 고정시킨 양자점들을 제공하는 단계(S20), 자성입자들과 양자점들에 의해 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계(S30), 양자점들 중 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리하는 단계(S40), 그리고 분리된 양자점들의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계(S50)를 포함한다. 이외에, 바이오마커의 진단 방법은 필요에 따라 다른 단계들을 더 포함할 수 있다.

먼저, 도 2의 단계(S10)에서는 링커를 이용하여 바이오마커 수집이 가능한 항체를 표면에 고정시킨 자성입자들을 제공한다. 이와 관련하여 도 3는 자성입자의 표면에 링커를 이용해 바이오마커를 수집할 수 있는 항체를 고정시켜 바이오마커 수집용 자성입자를 제조하는 방법을 개념적으로 나타낸다.

도 3에 도시한 바와 같이, 바이오마커를 탐지하는 항체와 양자점을 결합시켜주는 링커인 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 또는 Fc 리셉터가 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합한다. 따라서 바이오마커 수집용 항체의 F_ab 부분을 항상 활성화시킬 수 있다. 항체의 F_ab 부분이 항상 활성화된 상태로 자성입자에 결합되므로, 자성입자가 잘 기능화될 수 있다. 자성입자의 표면은 티올로 기능화할 수도 있다. 특히, 일반적인 화학결합방법은 예를 들면 엔-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide)(이하 "NHS"고 함)-에틸(디메틸아미노프로필)카르보디이미드, ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide (이하 "EDC"라고 함) 항체와 나노입자가 비특이적으로 결합하여 항체의 F_ab 부분이 활성화되지 못할 확률이 높으므로, 궁극적으로 표적 효율을 저하시킨다. 따라서 이러한 저효율을 극복하기 위해 고가의 항체를 많은 여분으로 반응시킬 필요가 있다. 이와는 대조적으로, 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오마커 진단 방법의 단계(S10)에서는 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 또는 Fc 리셉터를 링커 단백질로 활용하므로, 이러한 링커가 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합하여 항체의 F_ab 부분이 항상 활성화된다. 그 결과, 바이오마커의 항체 수집 능력을 극대화할 수 있다.

링커 단백질을 자성입자들의 표면에 결합시키기 위해 화학적 링커를 사용할 수 있다. 화학적 링커로는 설포석시니미들-4-{엔-말레이미도메틸}시클로헥산-1-카르복실레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-{N-maleimidomethyl} cyclohexane-1-carboxylate) 또는 석시니미들-4-{엔-말레이미도메틸}시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-{N-maleimidomethyl}cyclohexane-1-carboxylate)(SMCC)를 사용할 수 있다. 그 결과, 바이오마커를 표적하는 효율을 증가시킬 수 있다. 즉, 혈액, 혈청 또는 소변 등의 바이오마커가 함유된 용액에 자성입자를 넣어서 항체를 자성입자의 표면에 고정시킬 수 있다. 항체는 자성입자의 표면에 고정되어 항체의 F_ab 를 활성화시킨다.

다음으로, 도 2의 단계(S20)에서는 바이오마커를 탐지할 수 있는 제2 항체를 표면에 고정시킨 양자점들을 제공한다. 이와 관련하여 도 4은 바이오마커를 탐지할 수 있는 항체를 양자점 표면에 고정하여 정량분석용 양자점을 제조하는 상태를 개념적으로 나타낸다.

도 4의 아래 부분에 도시한 바와 같이, 바이오마커 탐지항체-단백질 G(링커)-양자점으로 구성된 복합체를 형성하기 위해 바이오마커 탐지항체의 Fc 부분에 결합된 단백질 G의 히스티딘 시퀀스와 양자점의 표면의 지질층에 있는 Ni-NTA를 반응시킨다. 즉, 바이오마커 탐지용 항체를 히스티딘 시퀀스가 포함된 단백질 G와 결합시키고 이를 Ni-NTA가 포함된 지질을 사용하여 만든 친수성의 양자점 표면에 고정시킨다. 양자점은 친수성을 가지면서 뭉침 현상이 최소로 발생해야 하고, 니켈로 기능화되어야 한다. 전술한 요구조건을 만족시키기 위해 양자점 표면에 친수성 지질층을 생성하는 경우, 지질층은 고유 성분 및 고유 성분비를 가지면서 최적화한다.

양자점 표면의 지질층은 3가지 종류의 지질로 이루어진다. 즉, "1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린 (1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine)"(이하 "MHPC"라고 함), "1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000 (1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000" (이하 "DPPE-PEG2000"이라고 함), "1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-카복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈 쏠트(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)" (이하 "Ni-NTA"라고 함)로 이루어진다. 일정량의 MHPC, DPPE-PEG2000 및 Ni-NTA를 순서대로 양자점과 같이 혼합하여 에멀젼 상태로 만들고, 초음파로 처리해서 양자점 표면에 기능성 지질층을 형성한다. 이 경우, 소수결합에 의해 양자점 표면에 지질의 소수성 부분이 결합되어 지질의 친수성 부분이 외측을 향한 채 양자점 표면에 코팅되므로 양자점 표면을 친수성으로 변환시킬 수 있다.

MHPC는 단일 아실(acyl)기 사슬 지질이므로, 구형 표면에 조밀하게 코팅할 수 있다. 또한, DPPE-PEG2000은 지질이 코팅된 양자점에 안정성을 부여한다. 그리고 Ni-NTA는 단백질 G에 있는 히스티딘과 결합하여 친수성의 양자점과 단백질 G를 결합시키고, 양자점 분리를 위해 후속 공정에서 이미다졸이 첨가된 경우, 선택적으로 분리되는 역할을 한다.

양자점의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스(Hexahistidine sequence)를 포함하는 링커 단백질을 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하고, 링커 단백질 위에 제2 항체를 고정한다. 여기서, 링커 단백질로서 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 또는 Fc 리셉터를 사용할 수 있고, 링커 단백질에 의해 항체의 F_ab가 항상 활성화된다. 그 결과, 바이오마커 탐지항체와 단백질 G 결합체에 친수성의 양자점을 첨가하여 바이오마커를 정량화할 수 있는 기능화된 양자점 나노구조체를 만들 수 있다.

한편, 도 2의 단계(S30)에서는 자성입자들과 양자점들에 의해 바이오마커를 샌드위치 표적시키킨다. 이와 관련하여 도 5는 나노구조체인 자성입자와 양자점을 이용하여 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 상태를 개념적으로 나타낸다. 즉, 바이오마커는 자성입자와 양자점에 의해 모두 표적화된 상태로 존재한다. 따라서 후속 공정에서 자성입자와 양자점을 이용하여 바이오마커를 정량화할 수 있다.

다음으로, 도 2의 단계(S40)에서는 양자점들 중 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리한다. 이와 관련하여 도 6는 바이오마커에 표적된 양자점만을 선택적으로 분리하는 상태를 개념적으로 나타낸다.

즉, 첨가제로서 히스티딘과 유사한 구조를 가진 과량의 이미다졸을 사용할 수 있다. 이미다졸 대신에 EDTA를 사용할 수 있다. 이미다졸 또는 EDTA를 첨가하여 링커로 사용된 단백질 G의 히스티딘과 양자점 표면의 Ni-NTA 사이의 결합, 즉 니켈-히스티딘 결합반응을 끊어서 항체에 부착된 양자점들을 분리한다. 분리된 양자점은 고유의 광학적 성질을 그대로 유지한다. 따라서 자석 등의 자성체를 사용하여 자력으로 용액에 자성입자를 잔존시켜 제거하고, 양자점만 별도로 분리할 수 있다. 그리고 분리된 양자점이 나타내는 흡광도 또는 형광의 세기를 이용해 바이오마커의 농도를 정량화할 수 있다.

마지막으로, 도 2의 단계(S50)에서는 분리된 양자점들의 흡광도를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량화한다. 흡광도 대신에 형광의 세기, 즉 발광의 세기를 측정할 수도 있다. 이와 관련하여 도 7은 분리된 양자점의 흡광도를 측정하여 바이오마커의 농도를 정량한 그래프를 나타낸다. 도 7에 도시한 바와 같이, 양자점을 이용해 그 흡광도를 측정함으로써 바이오마커의 농도를 정확하게 측정할 수 있다. 따라서 바이오마커에 대한 정확한 진단이 가능하다. 예를 들면, 표준 곡선을 제공하기 위해 농도가 서로 상이한 친수성의 양자점들을 포함하는 복수의 용액들을 제공하고, 이들의 350nm 파장에서의 흡광도를 측정한다. 따라서 양자점들의 농도와 흡광도를 비교하여 표준 곡선을 제공할 수 있다. 표준곡선을 이용하여 선택적으로 분리된 양자점 용액의 350nm에서의 흡광도의 측정을 통해 양자점의 광학적 특성을 이용해 양자점의 농도를 계산하고, 이와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하여 분석할 수 있다.

종래에는 자성입자의 자기현상 또는 자성입자와 양자점이 근접시 양자점의 형광 세기가 급격히 약해지는 현상으로 인해 바이오마커의 정량 분석이 어려웠다. 예를 들면, Prostate-specific Antigen (PSA)를 자성입자를 이용하여 분리 검출하고 정량화하는 경우, 양자점을 강산에 용해하여 양자점을 구성하는 카드뮴 이온으로 인한 전기전도도의 변화를 측정하였다. 그러나 다량의 카드뮴 이온이 발생하여 인체에 유해한 문제점이 있었다. 또한, 양자점을 자성입자로부터 분리하여 고유한 형광을 측정하기 위해 스트랩트아비딘(streptoavidin)-바이오틴(biotin) 결합을 끊어주기 위해 고농도의 알칼리 용액과 유기용매를 사용하였지만 유기용매에 의해 양자점이 뭉칠 수 있었다. 또한, 양자점의 안정성과 광학적 특성이 저하되어 다양한 버퍼용액을 만들어서 시험해야 했고, 재현성이 저하되는 문제점이 있었다.

이와는 대조적으로, 본 발명의 실시예에서는 바이오마커에 표적된 양자점이 그 고유한 광학적 특성을 유지한 상태에서 자성입자로부터 간단히 분리시킨다. 또한, 양자점이 뭉치지 않도록 하여 바이오마커의 농도가 양자점의 농도와 비례하도록 함으로써 바이오마커를 정확하게 정량 분석할 수 있다. 즉, 본 발명의 제1 실시예에서는 특별한 장치를 사용하지 않고 자성입자와 양자점만을 사용하여 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 후 이미다졸을 이용해 양자점의 광학적 특성에 영향을 주지 않으면서 표적된 양자점만을 선택적으로 쉽게 분리시킨다. 그 결과, 다른 물질의 영향을 배제하고 양자점 고유의 물성인 흡광도를 이용하여 바이오마커의 수를 고감도로 정량 분석할 수 있다.

도 8은 양자점의 기능화에 따라 그 크기가 변하는 것을 동적 광산란(dynamic light scattering)(이하 "DLS"라고 한다)으로 측정하여 나타낸 그래프를 나타낸다. 도 8의 (a)는 유기용매 중의 양자점 크기를 측정하여 나타내고, 도 8의 (b)는 친수성으로 만든 양자점의 크기를 측정하여 나타내며, 도 8의 (c)는 친수성 양자점과 항체를 결합시킨 후 측정한 크기를 나타낸다.

도 8에서는 양자점의 흡광도를 이용해 바이오마커의 농도를 정량화하는 원리를 개념적으로 나타내며, 도 8에서 양자점이 친수성이 되고, 항체가 양자점에 결합하면서 양자점의 크기가 점점 커지는 것을 알 수 있다. 즉, 도 8의 (a) 내지 도 8의 (c)에 도시한 바와 같이, 양자점의 직경은 6.35nm → 10.34nm → 11.15nm으로 점차 커진다. 따라서 DLS 측정값을 통해 친수성 양자점을 만드는 과정과 바이오마커 탐지용 항체와 친수성 양자점이 잘 결합된 것을 알 수 있다.

도 9는 본 발명의 제2 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법을 개략적으로 개념화하여 나타낸다. 도 9의 바이오마커의 진단 방법의 개념은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 바이오마커의 진단 방법의 개념을 다른 형태로 변형할 수 있다. 또한, 도 9의 본 발명의 제2 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법은 도 1의 본 발명의 제2 실시예에 따른 바이오마커의 진단 방법과 유사하므로, 동일한 내용에 대해서는 그 상세한 설명을 생략한다.

도 9에 도시한 바와 같이, 다중 바이오마커를 동시에 검출하여 정량 분석을 실시한다. 즉, 기능화된 자성입자에 제1 항체를 넣어서 결합하고, 동일한 양의 기능화된 자성입자를 사용하여 전술한 제1 항체와 상이한 제1 항체도 결합시킨다. 서로 상이한 제1 항체들을 결합시킨 자성입자용액들을 섞어서 제1 항체 고정 자성입자군 혼합용액을 제조한다. 즉, 자성입자를 2가지 이상의 군으로 나누어 각 군마다 서로 상이한 바이오마커를 표적하는 제1 항체를 결합시킨다.

그리고 단백질 G 용액과 제2 항체를 상온에서 반응시킴으로써 단백질 G와 제2 항체의 F_c 부분을 결합시킨다. 또한, 동일한 양의 단백질 G 용액을 사용하여 전술한 제2 항체와 상이한 제2 항체도 동일한 방법으로 결합시킨다. 그동안에 니켈이 포함된 지방질 조합을 코팅하여 친수성으로 만든 양자점을 앞서 제조한 제1 항체 고정 자성입자군 혼합용액에 첨가한 후 상온에서 반응시킨다. 이 경우, 양자점의 방출 파장은 대략 520nm, 620nm, 710nm로 이루어진 군에서 선택된다. 양자점은 CdSe/ZnS의 코어/쉘로 된 물질을 포함한다.

도 10은 서로 상이한 양자점의 형광 특성을 개략적으로 나타낸다. 도 10에 도시한 바와 같이, 양자점의 방출 파장은 각각 520nm, 620nm, 710nm로 이루어진 군에서 선택되며, 서로 다르다. 전술한 방법을 통하여 서로 상이한 바이오마커를 표적하는 각각의 제2 항체와 친수성의 양자점군에서 선택되는 서로 상이한 형광 특성을 나타내는 양자점을 고정시킨다.

그리고 서로 다른 제1 항체가 고정된 3가지의 자성입자군 혼합용액에 서로 상이한 바이오마커와 인산버퍼용액을 넣고 상온에서 반응시킴으로써 바이오마커를 표적한다. 이 경우, 사용되는 항체는 각각 다른 췌장암 바이오마커와 선택적으로 반응하는 항체이다. 각각의 제2 항체와 서로 다른 색의 형광을 발하는 친수성의 양자점들을 결합시킨다. 즉, 서로 상이한 바이오마커를 표적하는 각각의 제2 항체와 친수성의 양자점군에서 선택한 서로 상이한 형광 특성을 나타내는 양자점을 고정시킨다.

다음으로, 자성입자군 혼합용액으로 제1 항체를 표적한 용액에 서로 상이한 제2 항체들을 순서대로 넣어서 바이오마커를 샌드위치 표적시킨다. 이 경에 사용하는 제2 항체는 각각 다른 췌장암 바이오마커와 선택적으로 반응하고 각 항체에는 서로 다른 색의 형광을 발하는 양자점이 결합된다. 과량의 양자점이 결합된 제2 항체는 인산버퍼용액으로 세척하여 완전히 제거한다.

양자점을 서로 상이한 농도로 사용하여 각 농도에 따른 형광강도값을 측정한 결과를 이용하여 표준 곡선을 만든다. 친수성의 양자점군에서 서로 상이한 형광 특성을 나타내는 양자점들을 각각 농도가 서로 상이한 양자점들을 포함하는 복수의 용액들의 형광의 세기를 비교하여 표준 곡선을 제공할 수 있다.

그리고 이미다졸 용액을 샌드위치 어세이에 첨가하고 상온에서 반응시켜 제2 항체에 결합된 서로 상이한 양자점들을 분리시킨다. 바이오 마커의 분자의 개수와 일치하는 선택적으로 분리된 서로 상이한 각각의 양자점들은 자석을 이용해 자성입자를 끌어당긴 후 상청액을 수거하여 얻는다. 그리고 얻어진 용액을 방출파장이 520nm, 620nm, 710nm가 되도록 하여 형광강도값을 측정한다. 즉, 다중의 바이오마커 농도 정량화를 위해 분리된 각각의 양자점의 형광의 세기를 표준 곡선과 비교하여 농도를 계산하고, 분리된 각각의 양자점의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화한다. 따라서 각각의 분리된 바이오마커의 농도를 알아내어 정량분석할 수 있다.

도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오마커 진단 키트(100)를 개략적으로 나타낸다. 도 11의 바이오마커 진단 키트(100)의 구조는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 바이오마커 진단 키트(100)의 구조를 다른 형태로도 변형할 수 있다.

도 11에 도시한 바와 같이, 바이오마커 진단 키트(100)는 제1 용기 내지 제4 용기(10, 20, 30, 40), 자성체(50), 설명서(60), 고정대(70) 및 케이스(80)를 포함한다. 이외에, 필요에 따라 바이오마커 진단 키트(100)는 다른 부품들을 더 포함할 수 있다. 제1 용기 내지 제4 용기(10, 20, 30, 40), 자성체(50) 및 설명서(60)는 고정대(70)에 고정된 상태로 위치하고, 케이스(80)로부터 화살표 방향으로 빼내어 사용할 수 있다. 도 9에 도시한 바와 달리, 설명서(60)는 고정대(70)에 수납되지 않고, 고정대(70)와 별도로 케이스(80)내에 포함될 수 있다.

제1 용기(10)에는 바이오마커 수집용 자성입자 함유 용액이 수용된다. 제2 용기(20)는 제1 용기(10)와 이격되어 고정대(70)에 별도로 수납된다. 제2 용기(20)에는 정량분석용 양자점 함유 용액이 수용된다. 필요한 경우 도 16과는 달리 제2 용기는 복수로 이루어질 수 있다. 이 경우, 복수의 제2 용기들 각각의 제2 용기에는 상호 다른 정량분석용 양자점 함유 용액이 포함될 수 있다.

또한, 제3 용기(30)도 제1 용기(10) 및 제2 용기(20)와 이격되어 고정대(70)에 별도로 수납된다. 제3 용기(30)에는 이미다졸을 함유한 버퍼 용액이 수용된다. 그리고 제4 용기(40)는 제1 용기(10), 제2 용기(20) 및 제3 용기(30)와 이격되어 고정대(70)에 별도로 수납된다. 제4 용기(40)의 내부는 비어 있다. 한편, 자성체(50)는 제1 용기(10), 제2 용기(20), 제3 용기(30) 및 제4 용기(40)와 이격되어 고정대(70)에 별도로 수납된다. 자성체(50)로서 자석을 사용할 수 있다. 그리고 설명서(60)는 고정대(70)에 제1 용기(10), 제2 용기(20), 제3 용기(30), 제4 용기(40) 및 자성체(50)와 이격되어 별도로 수납된다.

도 11에는 도시하지 않았지만, 설명서(60)에는 i) 바이오마커와 제1 용기(10)의 용액을 제4 용기(40)에 넣어서 제1 혼합 용액을 제공하는 단계, ii) 제4 용기(40)에 자성체(50)를 접촉시켜서 제1 혼합 용액 중 자성체(50)에 붙은 객체만 잔존시키는 단계, iii) 제4 용기(40)에 제2 용기(20)의 용액을 넣어서 제2 혼합 용액을 제공하는 단계, iv) 제4 용기(40)에 제3 용기(30)의 용액을 넣어서 제2 혼합 용액과 제3 용기(30)의 용액이 혼합된 제3 혼합 용액을 제공하는 단계, v) 제4 용기(40)에 자성체(50)를 접촉시켜서 제3 혼합 용액 중 자성체(50)에 붙은 자성입자를 제외한 나머지 용액을 분리시키는 단계를 포함하는 내용이 안내되어 있다. 따라서 이러한 설명서(60)의 내용에 따라 초보자라도 쉽게 바이오마커를 진단할 수 있다.

좀더 구체적으로 바이오마커 진단 키트(100)의 사용 방법을 설명하면 다음과 같다. 먼저, 소변, 혈청 또는 혈액 등의 바이오 마커와 제1 용기(10)에 포함된 자성입자를 제4 용기(40)에서 혼합하고, 자성체(50)를 이용하여 자성입자만 잔존시킨다. 그리고 제2 용기(20)에 함유된 양자점을 제4 용기(40)에 넣어서 자성입자와 양자점으로 바이오마커를 샌드위치 표적시키고, 제3 용기(30)의 이미다졸 또는 EDTA을 제4 용기(40)에 넣어서 양자점을 바이오마커로부터 분리한다. 그리고 제4 용기(40)에 자성체(50)를 이용하여 바이오마커를 고정된 자성입자만 남기고 나머지 용액을 다른 용기에 부어서 양자점만을 분리한다. 최종적으로 분리한 양자점들의 농도와 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 추출한 표준 곡선에 따라 분리된 용액에서 양자점의 농도를 계산하고 이로부터 바이오마커의 농도를 정량화할 수 있다.

한편, 설명서(60)에는 i) 나머지 용액의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계, ii) 바이오마커의 농도와 흡광도 또는 형광의 세기를 비교한 표준 곡선을 제공하는 단계, iii) 흡광도 또는 형광의 세기를 표준 곡선과 비교하여 나머지 용액의 농도를 계산하는 단계, 및 iv) 나머지 용액의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계를 포함하는 내용이 추가로 안내되어 있을 수 있다. 여기서, 표준 곡선은 설명서(60)에 인쇄되어 제공될 수 있다. 따라서 양자점이 포함된 나머지 용액의 흡광도를 표준 곡선과 비교하여 나머지 용액에 포함된 양자점의 양을 구함으로써 양자점에 샌드위치 표적된 바이오마커의 양을 정확히 산출할 수 있다. 그 결과, 바이오마커의 양에 따라 정확한 진단이 가능하다. 정량분석용 양자점 함유 용액은 복수의 바이오마커들의 정량분석용 양자점군을 포함할 수 있다.

이하에서는 실험예를 통하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다. 이러한 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 좀더 구체적으로, 이하에서는 C-반응성 단백질을 대상으로 실시된 정량분석실험에 대하여 설명한다. 그러나 이러한 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니므로, 다른 종류의 바이오마커도 본 발명을 이용하여 정확하게 정량적으로 분석할 수 있다.

실험예 1

자성입자의 기능화

설프히드릴기 코팅된 9mg의 자성입자를 탈염수로 세척하였다. 그리고 자석을 이용하여 탈염수를 3번 여과하였다. 다음으로, 300μl의 탈염수에 자성입자를 다시 부유시켜서 30mg/ml 농도의 자성입자용액을 제조하였다. 14.2M 농도의 100μl의 베타-멀캅토에탄올을 자성입자용액에 넣어서 상온에서 30분 동안 반응시켜 자성입자에 있는 설포히드릴기를 활성화 상태로 변환시켰다. 이로써 자성입자표면의 설포히드릴기와 다른 자성입자의 설포히드릴기와의 결합을 끊어서 자성입자가 상호 뭉치는 것을 막을 수 있었다. 그리고 과량의 베타-멀캅토에탄올을 제거하기 위하여 pH 7.2 및 5mM의 에틸렌디아민 사초산(EDTA))으로 된 결합버퍼용액으로 자성입자를 세척하고, pH 7.2의 인산버퍼용액을 넣어서 그 최종부피를 1ml로 만들었다. 또한, 자성입자와 안정된 티오에테르 결합이 이루어지도록 5μg/mL의 Sulfo-SMCC 용액을 만들어서 30분동안 상온에서 반응시켰다. 그리고 과량의 Sulfo-SMCC 용액을 pH 7.2 및 1ml의 인산버퍼용액을 이용하여 3번 씻어주었다.

자성입자 표면의 항체 고정화

1μg/mL의 단백질 G 용액 5μl를 기능화된 자성입자에 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과, Sulfo-SMCC의 NHS기와 단백질 G에 있는 아민기가 결합하여 안정적인 아미드 결합이 형성되었다. 반응하지 않고 남아있는 설포히드릴기의 비특이적 결합을 예방하기 위해 상청액을 제거하였다. 그리고 8μg/mL의 시스테인(cysteine) 1 mL를 자성입자에 첨가하여 상온에서 30분동안 반응시켰다. 또한, C-반응성 단백질 항체가 미반응상태로 잔존한 자성입자 표면에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하기 위해 1.4μg/mL의 소혈청 알부민(bovine serum albumin) 1mL을 넣어서 상온에서 30분간 반응시킨 후 pH:7.2의 인산버퍼용액을 이용해 3번 세척하였다.

그리고 1.365mg/mL의 C-반응성 단백질 항체 3.8μL를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켜서 단백질 G와 C-반응성 단백질 항체의 Fc 부분을 결합시켰다. 과량의 C-반응성 단백질 항체는 pH:7.2의 인산버퍼용액으로 3번 세척하였다.

도 12는 단백질 G가 자성입자에 고정이 잘 되었음을 확인하기 위해 형광다이가 표지된 이차항체를 단백질 G의 유무에 따라 자성입자에 결합시킨 경우의 개념도와 그 사진을 나타낸다.

도 12의 a에 도시한 바와 같이, 단백질 G가 항체의 Fc 부분에만 특이적으로 결합하므로 형광이미지가 나타나면 단백질 G가 성공적으로 결합되었음을 의미한다. 도 12의 b에서 단백질 G가 없는 경우, 자성입자의 명시야 이미지와 형광이미지가 중첩되지 않았다. 또한, 도 12의 c에서 단백질 G가 있는 경우, 자성입자의 명시야 이미지와 형광이미지가 중첩되므로, 단백질 G가 자성입자에 성공적으로 결합되었음을 알 수 있었다.

양자점에 대한 C-반응성 단백질 탐지항체 고정화

0.5mg/mL의 단백질 G 용액 2μL와 0.035mg/mL의 C-반응성 단백질 탐지항체 22μL를 상온에서 30분 동안 반응시켜서 단백질 G와 탐지항체의 Fc 부분을 결합시켰다. 니켈이 포함된 지방질 조합을 코팅하여 친수성으로 만든 양자점을 앞서 만든 혼합물에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 히스티딘이 포함되어 있는 단백질 G와 친수성 양자점에 코팅된 Ni-NTA가 결합하여 C-반응성 단백질 탐지항체와 양자점을 결합시켰다.

C-반응성 단백질 표적

100ng, 200ng, 400ng, 600ng, 800ng 및 1000ng의 C-반응성 단백질을 함유한 각각의 pH 7.2의 인산버퍼용액 500μl에 앞서 만든 C-반응성 단백질 항체를 표면에 결합시킨 50μl의 자성입자용액을 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 과량의 C-반응성 단백질은 pH:7.2의 인산버퍼용액으로 3번 세척하여 제거하였다. 0.2468μM의 C-반응성 탐지항체가 결합된 352μL의 친수성 양자점 용액을 넣어서 수집된 C-반응성 단백질을 샌드위치 표적시켰다. 과량의 양자점이 결합된 C-반응성 단백질 탐지항체는 pH 7.2의 인산버퍼용액으로 세척하여 완전히 제거하였다.

도 13은 C-반응성 단백질이 샌드위치 표적이 잘 되었는지 여부를 확인하기 위해 C-반응성 단백질의 유무에 따라 기능화된 자성입자와 형광다이가 결합된 C-반응성 단백질 탐지항체로 샌드위치 표적한 경우의 개념도와 그 사진을 나타낸다.

도 13의 a에 도시한 바와 같이, C-반응성 단백질 탐지항체는 C-반응성 단백질이 C-반응성 단백질 프라이머리 항체에 의해 표적된 경우에만 샌드위치로 표적할 수 있기 때문에 형광이미지가 나타나면 C-반응성 단백질이 샌드위치 표적이 잘 되었음을 알 수 있었다. 도 13의 b에서 C-반응성 단백질이 없는 경우, 명시야 이미지와 형광이미지가 중첩되지 않았다. 한편, 도 13의 c에서 C-반응성 단백질이 있는 경우, 명시야 이미지와 형광이미지가 중첩되므로, C-반응성 단백질이 샌드위치 표적이 잘 된 것을 확인할 수 있었다.

정량분석

0.37nM, 0.9nM, 1.6nM, 3nM, 5nM, 12.5nM 및 25nM의 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 표준곡선을 만들었다. 그 후, 1M의 이미다졸 100 μL를 샌드위치 어세이에 첨가해 상온에서 30분 동안 반응시킴으로써 C-반응성 단백질의 탐지항체에 결합된 양자점을 분리시켰다. C-반응성 단백질의 분자의 개수와 일치하는 선택적으로 분리된 양자점은 자석을 이용해 자성입자를 끌어당긴 후 상청액을 수거하여 얻었다. 전술한 방법으로 얻어진 용액의 흡광도를 측정하여 정량분석을 실시하였다.

도 14는 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도를 이용하여 만든 표준곡선을 통해 양자점의 농도와 흡광도간에 나타나는 직선형 그래프를 나타낸다. 도 14에 도시한 양자점의 농도와 흡광도의 관계를 나타낸 표준 곡선을 이용하여 양자점의 농도를 구할 수 있다.

도 15는 표적된 C-반응성 단백질과 같은 수의 분리된 양자점의 농도를 통해 C-반응성 단백질의 개수를 정량적으로 분석한 그래프를 나타낸다.

도 15에 도시한 바와 같이, C-반응성 단백질의 농도와 C-반응성 단백질 탐지항체에서 선택적으로 분리된 양자점의 농도가 선형적으로 비례하면서 pmol 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

진단키트

자성입자와 양자점을 이용하여 바이오마커를 샌드위치 표적하고, 바이오마커 탐지항체에 결합된 양자점만을 선택적으로 분리해 양자점의 광학적 특성을 이용하여 정량분석을 실시하였고, 이를 이용할 수 있는 정량분석 진단키트를 개발하였다.

도 16은 본 발명의 제1 실험예의 바이오마커 진단 키트의 사진을 나타낸다. 도 16의 바이오마커 진단 키트의 구조는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 바이오마커 진단 키트의 구조는 다양한 형태로 변형될 수 있다.

도 16에 도시한 바와 같이, 바이오마커 진단 키트를 5가지의 구성요소로 제조하였다. 도 16에서, A는 바이오마커 수집용 항체를 결합시켜 기능화를 끝낸 "바이오마커 수집용 자성입자 용액", B는 "정량분석용 양자점 용액", C는 "이미다졸을 함유하는 버퍼용액", D는 "반응용기", 그리고 E는 "자성입자 분리용 자석"을 나타낸다.

바이오마커 진단 키트는 다음과 같은 방법으로 사용하였다. 먼저, A의 100μl의 자성입자용액을 D의 반응용기에 넣었다. 그리고 정량진단하고자 하는 바이오마커 샘플인 10μl의 혈청 또는 소변을 반응용기에 함께 넣어 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 다음으로, 자석을 이용하여 자성입자를 분리한 후 B의 정량분석용 양자점 용액 100μl를 넣어서 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 그리고 C의 이미다졸 버퍼용액 10μl를 넣어서 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 마지막으로, E의 자석을 반응용기에 대고 자성입자를 분리시킨 후 상청액만 다른 반응 용기에 넣었다. 그리고 350nm에서의 흡광도값을 측정해 주어진 표준곡선과 비교함으로써 바이오마커를 정량적으로 분석하였다. 바이오마커의 정량적인 분석 결과를 바탕으로 정량분석한 바이오마커가 지시하는 질병을 진단할 수 있었다.

실험예 2

다중 바이오마커를 동시에 검출하여 정량 분석하였다. 자성 입자를 기능화하는 방법, 자성입자 표면에 제1 항체를 고정하는 방법과 양자점을 친수화시켜 제2 항체를 고정하는 방법은 전술한 실험예 1과 동일하였다.

도 17은 본 발명의 제2 실험예의 바이오마커 진단 키트의 사진을 나타낸다. 도 17의 바이오마커 진단 키트의 구조는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다. 따라서 바이오마커 진단 키트의 구조는 다양한 형태로 변형될 수 있다.

도 17에 도시한 바와 같이, A 용기는 표적용 항체가 결합된 자성입자를 수용하고, B 용기, C 용기, 및 D 용기는 서로 다른 색의 형광을 나타내는 양자점에 검출용 항체가 결합된 용액을 수용한다. 또한, E 용기는 양자점을 분리시키기 위한 이미다졸 용액을 수용하고, F는 반응용기이며, G는 자성입자 분리용 자석이다. 제2 실험예에서는 제1 실험예와 달리 다중 바이오마커 진단을 위하여 서로 다른 복수의 양자점들을 사용한다. 따라서 서로 다른 양자점들에 검출용 항체가 결합된 용액들을 사용하도록 B 용기, C 용기, 및 D 용기가 필요하다. 한편, 다중 바이오마커들의 수에 따라 전술한 용기들의 개수는 변경될 수 있다.

다중검출용 자성입자군 용액 제조

기능화된 자성입자 50μl에 100μg/ml 농도의 osteopontin 제1 항체를 20μl 넣어서 결합시켰다. 동일한 양의 기능화된 자성 입자를 사용하여 macrophage inhibitory cytokine 1(MIC-1)과 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1(ceacam1) 제1 항체도 동일한 방법으로 결합시켰다. 이와 같이 제조한 제1 항체를 결합시킨 자성입자용액들을 각각 20μl 씩 섞어서 제1 항체 고정 자성입자군 혼합용액 60μl를 제조하였다.

다중검출용 양자점 용액 제조

100μg/mL의 단백질 G 용액 3μL와, 100μg/mL의 osteopontin 제2 항체 10μL를 상온에서 1시간 동안 반응시켜서 단백질 G와 제2 항체의 F_c 부분을 결합시켰다. 동일한 양의 단백질 G 용액을 사용하여 MIC-1과 ceacam1 제1 항체도 동일한 방법으로 결합시켰다. 그동안에 니켈이 포함된 지방질 조합을 코팅하여 친수성으로 만든 양자점을 앞서 제조한 제1 항체 고정 자성입자군 혼합용액에 첨가하여 상온에서 1시간 동안 각각 반응시켰다. 이 경우, 양자점의 방출 파장은 대략 520nm, 620nm, 710nm로 이루어진 군에서 선택되었다. 이러한 방법을 사용하여 서로 상이한 바이오마커를 표적하는 각각의 제2 항체와 친수성의 양자점군에서 선택되는 서로 상이한 형광 특성을 나타내는 양자점을 고정시킬 수 있었다.

다중의 바이오마커 표적

서로 상이한 제1 항체가 고정된 3가지의 자성입자군 혼합용액 60μl에 3가지 종류의 췌장암 바이오마커(osteopontin, MIC-1, ceacam-1)를 각각 10nM, 20nM, 30nM, 40nM, 50nM의 농도가 되도록 pH 7.2의 인산버퍼용액을 넣어 최종 부피를 400μl로 제조하였다. 그리고 상온에서 1 시간 동안 반응시켜서 바이오마커를 표적하였다. 이 경우, 사용되는 항체는 각각 다른 췌장암 바이오마커와 선택적으로 반응하는 항체였다. 그동안 100μg/ml 농도의 osteopontin, MIC-1, ceacam-1 각각의 제2 항체 10μl와 서로 다른 색의 형광을 발하는 친수성의 양자점들을 결합시켰다. 그리고 자성입자군 혼합용액으로 osteopontin, MIC-1, ceacam-1을 표적한 용액에 서로 상이한 제2 항체들을 순서대로 넣어서 osteopontin, MIC-1, ceacam-1를 샌드위치 표적시켰다. 이 경우에 사용하는 제2 항체는 각각 다른 췌장암 바이오마커와 선택적으로 반응하고 각 항체에는 서로 다른 색의 형광을 발하는 양자점이 결합되었다. 과량의 양자점이 결합된 osteopontin, MIC-1, ceacam-1 제2 항체는 pH 7.2의 인산버퍼용액으로 세척하여 완전히 제거하였다.

정량 분석

도 18의 좌측은 3가지 종류의 바이오마커를 각각 다른 색의 파장을 방출하는 서로 다른 양자점을 이용하여 검출하는 개념도이고, 도 17의 우측은 그 검출 결과를 나타낸 그래프이다. 즉, 양자점을 1nM, 2nM, 3nM, 4nM, 5nM, 10nM, 15nM, 20nM, 25nM 농도로 사용하여 각 농도에 따른 형광강도값을 측정한 결과 그 값이 각각 1385, 2755, 4202, 5611, 7452, 14954, 23011, 32111, 40012로 측정되었고, 이를 이용하여 표준 곡선을 만들었다.

도 19의 좌측은 도 18의 3가지 종류의 바이오마커를 상호 다른 색의 파장을 방출하는 서로 다른 양자점을 이용하여 동시에 검출하는 과정을 개념적으로 나타낸다. 그리고 도 19의 우측은 그 검출 결과를 개략적으로 나타낸 그래프이다.

1M의 이미다졸용액 100μL를 샌드위치 어세이에 첨가해 상온에서 30분 동안 반응시킴으로써 osteopontin, MIC-1, ceacam-1의 제2 항체에 결합된 서로 상이한 양자점들을 분리시켰다. osteopontin, MIC-1, ceacam-1의 분자의 개수와 일치하는 선택적으로 분리된 서로 상이한 각각의 양자점들은 자석을 이용해 자성입자를 끌어당긴 후 상청액을 수거하여 얻었다. 얻어진 용액을 방출파장이 520nm, 620nm, 710nm 가 되도록 해 형광강도값을 측정하였다. 실험예 2에서 사용한 양자점들은 방출파장이 각각 520nm, 620nm, 710nm로 서로 간섭하지 않으므로, 각 양자점에 대한 형광강도값을 얻을 수 있었다. 따라서 이를 바탕으로 각각의 분리된 바이오마커의 농도를 알 수 있으므로 정량분석이 가능하였다.

본 발명을 앞서 기재한 바에 따라 설명하였지만, 다음에 기재하는 특허청구범위의 개념과 범위를 벗어나지 않는 한, 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것을 본 발명이 속하는 기술 분야에 종사하는 자들은 쉽게 이해할 것이다.

10. 제1 용기
20. 제2 용기
30. 제3 용기
40. 제4 용기
50. 자성체
60. 설명서
70. 고정대
80. 케이스
100. 바이오마커 진단 키트

Claims (13)

1. 링커를 이용하여 바이오마커를 수집할 수 있는 제1 항체(primary antibody)를 그 표면에 고정시킨 자성입자들을 제공하는 단계,
   상기 바이오마커를 탐지할 수 있는 제2 항체(secondary antibody)를 그 표면에 고정시킨 양자점들을 제공하는 단계,
   상기 자성입자들과 상기 양자점들에 의해 상기 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계,
   상기 양자점들 중 상기 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리하는 단계, 및
   상기 분리된 양자점들의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하여 상기 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계
   를 포함하는 바이오마커의 진단 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 자성입자들을 제공하는 단계는,
   상기 자성입자들의 표면을 티올로 기능화하는 단계,
   상기 자성입자들의 표면에 화학적 링커를 이용하여 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 및 Fc 리셉터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 링커 단백질을 결합시키는 단계, 및
   상기 제1 항체를 상기 자성입자의 표면에 고정시켜서 상기 제1 항체의 F_ab를 활성화시키는 단계
   를 포함하는 바이오마커의 진단 방법.
3. 제2항에 있어서,
   상기 링커 단백질을 결합시키는 단계에서, 상기 화학적 링커는 설포석시니미들-4-{엔-말레이미도메틸}시클로헥산-1-카르복실레이트 (Sulfosuccinimidyl-4-{N-maleimidomethyl} cyclohexane-1-carboxylate) 및 석시니미들-4-{엔-말레이미도메틸}시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-{N-maleimidomethyl}cyclohexane-1-carboxylate)(SMCC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화학적 링커인 바이오마커의 진단 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 양자점들을 제공하는 단계는,
   1-마이리스토일-2-하이드록시-에스엔-글리세로-3-포스포콜린(1-Myristoyl-2-Hydroxy-sn-Glycero-3-Phosphocholine)(MHPC), 1,2-디스티어로일-에스엔-글라이세로-3-포스포에탄올아민-엔-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-2000(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(Methoxy Polyethylene glycol)-2000(DPPE-PEG2000) 및 1,2-디오레일-에스엔-글리세로-3-엔-{5-아미노-1-복실펜틸}이미노디아세틱 에시드 석시닐 니켈 쏠트(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-N-{5-amino-1-carboxypentyl} iminodiacetic acid succinyl nickel salt)(Ni-NTA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 지질을 이용하여 상기 양자점들의 표면을 친수성으로 변환시키는 단계,
   상기 양자점의 표면에 헥사히스티딘 시퀀스(Hexahistidine sequence)를 포함하는 링커 단백질을 니켈-히스티딘 결합반응을 이용하여 고정하는 단계, 및
   상기 링커 단백질 위에 상기 제2 항체를 고정시키는 단계
   를 포함하는 바이오마커의 진단 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 링커 단백질을 고정하는 단계에서, 상기 링커 단백질은 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G 및 Fc 리셉터로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질이고, 상기 링커 단백질에 의해 상기 제2 항체의 F_ab가 항상 활성화되는 바이오마커의 진단 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 하나 이상의 바이오마커를 샌드위치 표적시킨 양자점들을 선택적으로 분리하는 단계는,
   이미다졸 및 에틸렌 디아민 테트라아세틱 에시드(ethylenediamine tetraacetic acid)(EDTA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 첨가제를 첨가하여 니켈-히스티딘 결합반응을 끊어서 상기 제2 항체에 부착된 양자점들만을 분리하는 단계, 및
   자력을 이용하여 상기 자성입자들을 제거하는 단계
   를 포함하는 바이오마커의 진단 방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 하나 이상의 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계는,
   농도가 서로 상이한 또다른 양자점들을 포함하는 복수의 용액들을 제공하는 단계,
   상기 복수의 용액들의 350nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계,
   상기 또다른 양자점들의 농도와 상기 흡광도 또는 형광의 세기를 비교하여 표준 곡선을 제공하는 단계,
   상기 분리된 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계,
   상기 분리된 양자점의 350nm 파장에서의 흡광도 또는 형광의 세기를 상기 표준 곡선과 비교하여 상기 분리된 양자점의 농도를 계산하는 단계, 및
   상기 분리된 양자점의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계
   를 포함하는 바이오마커의 진단 방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 자성입자들을 제공하는 단계에서, 상기 제1 항체는 복수로 이루어지고,
   상기 양자점들을 제공하는 단계에서, 상기 제2 항체는 복수로 이루어지며,
   상기 바이오마커를 샌드위치 표적시키는 단계에서, 상기 바이오마커는 복수로 이루어지고, 상기 복수의 바이오마커들은 서로 상이하며, 상기 바이오마커들마다 상기 제1 항체와 상기 2 항체가 각각 서로 상이한 바이오마커의 진단 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 양자점들을 제공하는 단계에서 상기 양자점은 CdSe/ZnS의 코어/쉘로 된 물질을 포함하는 바이오마커의 진단 방법.
10. 바이오마커 수집용 자성입자 함유 용액이 수용된 제1 용기,
    상기 제1 용기와 별도로 수납되고, 정량분석용 양자점 함유 용액이 수용된 하나 이상의 제2 용기,
    상기 제2 용기와 별도로 수납되고, 이미다졸 및 에틸렌 디아민 테트라아세틱 에시드(ethylenediamine tetraacetic acid)(EDTA)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분리제를 함유한 버퍼 용액이 수용된 제3 용기,
    상기 제3 용기와 별도로 수납되고, 그 내부가 비어 있는 제4 용기,
    상기 제1 용기 내지 상기 제4 용기와 별도로 수납된 자성체, 및
    상기 제1 용기 내지 상기 제4 용기 및 자성체와 별도로 수납된 설명서
    를 포함하는 바이오마커 진단 키트.
11. 제10항에 있어서,
    상기 설명서에는,
    바이오마커와 상기 제1 용기의 용액을 상기 제4 용기에 넣어서 제1 혼합 용액을 제공하는 단계,
    상기 제4 용기에 상기 자성체를 접촉시켜서 상기 제1 혼합 용액 중 상기 자성체에 붙은 객체만 잔존시키는 단계,
    상기 제4 용기에 상기 제2 용기의 용액을 넣어서 제2 혼합 용액을 제공하는 단계,
    상기 제4 용기에 상기 제3 용기의 용액을 넣어서 상기 제2 혼합 용액과 상기 제3 용기의 용액이 혼합된 제3 혼합 용액을 제공하는 단계, 및
    상기 제4 용기에 상기 자성체를 접촉시켜서 상기 제3 혼합 용액 중 상기 자성체에 붙은 자성입자를 제외한 나머지 용액을 분리시키는 단계
    를 포함하는 내용이 안내된 바이오마커 진단 키트.
12. 제11항에 있어서,
    상기 설명서에는,
    상기 나머지 용액의 흡광도 또는 형광의 세기를 측정하는 단계,
    상기 바이오마커의 농도와 상기 흡광도 또는 형광의 세기를 비교한 표준 곡선을 제공하는 단계,
    상기 흡광도 또는 형광의 세기를 상기 표준 곡선과 비교하여 상기 나머지 용액의 농도를 계산하는 단계, 및
    상기 나머지 용액의 농도와 비례하는 바이오마커의 농도를 정량화하는 단계
    를 포함하는 내용이 추가로 안내된 바이오마커 진단 키트.
13. 제10항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제2 용기는 복수의 제2 용기들을 포함하고, 상기 복수의 제2 용기들 각각의 제2 용기에는 상호 다른 정량분석용 양자점 함유 용액이 포함된 바이오마커 진단 키트.

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