JP6431522B2 - 核酸の精製のための1工程法 - Google Patents
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Description
本発明は、ゲル溶液および/またはゲル成分(後記で例示されているもの、または過度な実験を伴わずに当業者により決定されうる均等物)、核酸への結合に適した磁気粒子および説明を含有するキットをも含む。場合により、特定の用途(例えば、RNAの単離)のため、および/または手順の実施で使用者を補助するために、バイアル、反応溶液および他の物品が本発明のキットにおいて提供されうる。
本発明の概念は、核酸を磁気粒子に結合させ、ついで粘性水性ゲルまたはゲル溶液を介して粒子を引き寄せることにより、例えば細胞ライセートまたは他の細胞サンプルから核酸が容易に精製されうるというものである。第1の試験は、該ゲルが核酸非含有サンプル中の塩レベルを低減しうるかどうかを調べることであった。
この実験においては、既知量の核酸をサンプルにおいて使用した。被検核酸はAbbott RealTime(TM) HCVアッセイからのキャリブレーター(Calibrator)Bであり、HCV内部対照をアッセイ抽出において使用した。キャリブレーターBは、ヒト血漿における約10,000,000 Iu/ml(ミリリットル当たりの国際単位)濃度のHCV配列を含有するRNAサンプルである。また、該内部対照は、HCVを抽出するために使用されるサンプル調製系の抽出性能を試験するために使用されるRNA分子である。ゲル内のグリセロールおよびエタノールの存在も、それらが該抽出に何らかの影響を及ぼしうるかどうかを判定するために試験した。エタノールの存在は粒子上の核酸の保持を補助することがあり、グリセロールはゲルの密度を変化させることがある。
0.05gのアガロースをボトル1に加えて0.2%ゲルを調製する。
0.10gのアガロースをボトル2に加えて0.4%ゲルを調製する。
0.15gのアガロースをボトル3に加えて0.6%ゲルを調製する。
10mlの該細胞溶解エタノール混合物、
5mlのHCVキャリブレーターB、
350μlのHCV内部対照、
500μlのMMP(多官能性磁気粒子)。
1サイクルの工程1
55 1200
4サイクルの工程2
温度 時間(秒)
95 20
46 30
68 20
6サイクルの工程3
温度 時間(秒)
92 20
60 30
68 20
37サイクルの工程4
温度 時間(秒)
90 20
56 40
68 20
35 40
ついで各サンプルを測定した。
1サイクルの工程1
55 1800
4サイクルの工程2
温度 時間(秒)
95 40
46 30
68 20
6サイクルの工程3
温度 時間(秒)
92 40
60 30
68 20
37サイクルの工程4
温度 時間(秒)
90 30
56 40
68 20
35 40
各サンプルを測定した。
Claims (21)
- a)核酸を含む又は含む疑いのある試料を準備し、
b)試料を1以上の溶解バッファーと接触させ、溶解した試料を生成させ、
c)試料中の核酸が固体基体に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、溶解した試料を固体基体と接触させ、固体基体に結合した核酸を含む溶解した試料を生成させ、該固体基体は磁気を帯びた微粒子であり、
d)固体基体に結合した核酸を含む溶解した試料を、容器に置き、固体基体に結合した核酸を含む溶解した試料の上に、水性ベース分離ゲルを層として重ね、さらに、水性ベース分離ゲルの上にバッファーを層として重ね、及び
e)試料中に核酸が存在する場合には、核酸に結合した固体基体を、水性ベース分離ゲルを通ってバッファーを通過させることを含む、溶解バッファー成分を核酸サンプルから除去する方法。 - 溶解バッファーが約1モル濃度を超える濃度で塩を含有する、請求項1に記載の方法。
- 固体基体が直径約0.1nm〜約5nmの微粒子である、請求項1に記載の方法。
- 固体基体が直径約0.8nm〜約5nmの微粒子である、請求項3に記載の方法。
- 水性ゲルに通過させた後で、固体基体から核酸を溶出する溶出バッファーと接触させる、請求項1に記載の方法。
- 有機溶媒中の核酸の沈殿を含まない、請求項5に記載の方法。
- エタノールである有機溶媒中の核酸の沈殿を含む、請求項5に記載の方法。
- 固体基体に結合した核酸を、水性ゲルに通過させた後で酵素と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 酵素がDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素である、請求項8に記載の方法。
- 核酸を、希釈を行うことなく、固体基体上で配列決定する、請求項8に記載の方法。
- 固体基体に結合した核酸を、非メチル化シトシンが脱アミノ化されるように、水性ゲルに通過させた後で亜硫酸水素塩と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 核酸内の少なくとも1つの核酸塩基がエピジェネティックな修飾を有するかどうかを決定することを更に含む、請求項11に記載の方法。
- 核酸が、核酸ハイブリダイゼーション、アプタマー、抗体、抗体フラグメント、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される実体を介して固体基体に結合される、請求項1に記載の方法。
- a)i)核酸を含む疑いのあるサンプル、
ii)核酸への結合に適した磁気を帯びている微粒子、および
iii)水性ベース分離ゲル
を準備し、
b)サンプル中の核酸が磁気微粒子に結合するのに適した時間の長さ及び条件下、サンプルを微粒子と接触させて、負荷磁気微粒子を生成させ、
c)容器に、負荷磁気微粒子を置き、溶解した負荷磁気微粒子の上に、水性ベース分離ゲルを層として重ね、さらに、水性ベース分離ゲルの上にバッファーを層として重ねること、及び
d)負荷磁気微粒子を水性ベース分離ゲルを介して磁場でバッファーに引き寄せることを含む、サンプルからの核酸を富化させるための方法。 - 分離ゲルがアガロースを含む、請求項14に記載の方法。
- アガロースが約0.10%〜約1.0%の濃度である、請求項15に記載の方法。
- 分離ゲルがエタノールおよびグリセロールの1以上をも含む、請求項15に記載の方法。
- 粒子が、核酸に結合するのに適した官能基を含む、請求項14に記載の方法。
- 磁気微粒子がシリカおよびガラスの1以上で少なくとも部分的に被覆されている、請求項14に記載の方法。
- 磁気微粒子が回転楕円体である、請求項14に記載の方法。
- サンプルが溶解バッファーを含む、請求項14に記載の方法。
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