CN104350152B - 选择性核酸片段回收 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于核酸纯化以及片段选择与回收的方法和试剂盒。通过调节结合缓冲液的盐浓度和/或pH，只有具有所需尺寸范围的核酸片段能够在某些盐浓度和/或pH条件下可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且可以随后在水和/或低盐洗脱缓冲液中从所述固体表面洗脱和/或回收。

Description

选择性核酸片段回收
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年6月1日提交的美国临时申请序列号61/689,221的优先权，这个临时申请以其全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及用于核酸纯化以及片段尺寸选择与回收的方法。
发明背景
许多分子生物学应用，如毛细管电泳、核苷酸测序，需要分离高质量的核酸制剂。质量是用于所有测序方法以及用于基因治疗方案的毛细管电泳的特别重要的因素。数量也是用于一些应用的同等重要的考虑因素，例如，大规模基因组作图和测序计划，其需要产生成千上万个高质量的DNA模板。
如下一代测序(Next Generation Sequencing；NGS)的新型技术的出现需要在DNA片段的某些群组的精确尺寸控制下的高质量的DNA样品制备。在DNA片段化或剪切之后，用于下一代测序的文库构建过程主要需要与平台无关的片段选择。片段选择后获得高回收率正成为用于减小测序偏差的重要的贡献因素。举例来说，为了制备用于Illumina NGS平台的DNA文库，在150-500bp范围内的DNA片段的回收对于较好的测序结果来说是关键的。其它NGS平台需要范围介于300-700bp之间的DNA片段。
存在两种常用方法来进行尺寸选择以用于NGS文库制备。一种方法是将片段化的DNA运行到琼脂糖凝胶中，然后切割具有所选的DNA尺寸的凝胶，然后从凝胶回收DNA片段。这种方法是精密的，但非常缓慢并且是劳动密集型的。
用来准备片段化的DNA的尺寸选择的另一种通常使用的方法是通过调节聚乙二醇(PEG)和盐的浓度使DNA结合于涂布有官能团(如羧基)的磁性小珠上。参看美国专利号6,534,262。这种方法有效地使DNA片段化并且可以在自动化平台中容易地适应以一次性处理大量样品。然而，当DNA片段大于400bp时，这种方法不会很好地工作以使DNA片段化。不需要的大DNA片段降低了后续NGS结果的数据质量并且浪费了仪器的能力。对于需要大DNA片段的NGS平台，例如用于Roche 454 Genome Sequencer的NGS平台，这种方法并不适合。
美国专利号5,234,809描述了一种使用固相粒子以在离液盐存在下特异性地和/或非特异性地结合来自样品的核酸的方法，这些离液盐如胍盐、碘化钠和碘化钾。然而，这种方法并未提供对核酸片段的任何尺寸控制。
因此，下一代测序(NGS)的不断增长的应用需要新的核酸纯化与片段尺寸选择方法，这些方法提供了高的核酸回收率和精确的片段尺寸控制。
发明概要
本发明提供了用于核酸纯化与片段尺寸选择的方法和试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供了一种选择性地回收核酸片段的方法，其包括：a)将目标核酸与具有选定pH和盐浓度的结合缓冲液混合以允许具有所需尺寸范围的核酸片段结合到固体表面；b)将来自步骤a)的混合物施加到固体表面以使得只有具有所需尺寸范围的核酸片段可逆地并且非特异性地结合到固体表面；以及c)通过用洗脱缓冲液从固体表面洗脱结合的核酸片段来选择性地回收具有所需尺寸范围的结合的核酸片段。
在某些实施方案中，本发明方法中所用的结合缓冲液包含离液盐。离液盐的实例包括(但不限于)盐酸胍(GHCl)、硫氰酸胍(GITC)、碘化钠(NaI)和高氯酸钠，以及其混合物。在某些实施方案中，结合缓冲液的离液盐的浓度经过调节以使得只有具有所需尺寸范围的某些核酸片段能够可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且随后用洗脱缓冲液从固体表面洗脱。在某些实施方案中，盐酸胍(GHCl)或硫氰酸胍(GITC)的浓度介于0.8-5.0M之间；碘化钠(NaI)的浓度介于0.8-7.0M之间；并且高氯酸钠的浓度介于1.0-7.0M之间。在某些实施方案中，结合缓冲液中的离液盐浓度是通过用水稀释结合缓冲液来调节。
本发明提供了，通过调节结合缓冲液中的离液盐浓度，只有具有所需尺寸范围的某些核酸片段能够结合到固体表面，不需要的核酸片段与结合缓冲液一起保留在样品混合物中，并且在离心后被弃去。在某些实施方案中，固体表面包括(但不限于)二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒(小珠)。在某些实施方案中，核酸片段包括(但不限于)DNA片段、RNA片段或PNA片段。
在某些实施方案中，本发明提供了一种从二氧化硅膜滤柱选择性地回收具有小于或等于100bp、小于或等于200bp或小于或等于300bp的所需尺寸范围的DNA片段的方法。本发明方法包括将目标DNA样品(例如，100μl)与包含4M硫氰酸胍(GITC，pH 7.0)的结合缓冲液(例如，100μl)混合，其中在将每种混合物独立地施加到二氧化硅膜柱中之前，用200μl、300μl或400μl水进一步稀释每种DNA样品混合物(总共200μl)。只有小于或等于100bp的DNA片段当用200μl水稀释时在约1.0M的GITC的最终浓度下、小于或等于200bp的DNA片段当用300μl水稀释时在约0.8M的GITC的最终浓度下、以及小于或等于300bp的DNA片段当用400μl水稀释时在约0.7M的GITC的最终浓度下，能够结合到二氧化硅膜柱，并且随后从二氧化硅膜柱洗脱并在水和/或含有低盐的洗脱缓冲液中回收。每种混合物的pH为约7.0并且由于与DNA样品混合的结合缓冲液而可能稍有变化。
在其它实施方案中，本发明提供了一种从二氧化硅涂布的微粒选择性地回收具有小于或等于200bp、小于或等于300bp或小于或等于400bp的所需尺寸范围的DNA片段的方法。本发明方法包括将目标DNA样品与包含4M硫氰酸胍(GITC)的结合缓冲液混合，其中在将每种混合物进一步与二氧化硅涂布的微粒组合之前，用200μl、300μl或400μl水进一步稀释每种DNA样品混合物。只有小于或等于200bp的DNA片段当用200μl水稀释时在约1.0M的GITC的最终浓度下、小于或等于300bp的DNA片段当用300μl水稀释时在约0.8M的GITC的最终浓度下、以及小于或等于400bp的DNA片段当用400μl水稀释时在约0.7M的GITC的最终浓度下，能够结合到二氧化硅涂布的微粒，并且随后从微粒洗脱并在水和/或含有低盐的洗脱缓冲液中回收。类似地，每种混合物的pH为约7.0并且由于与DNA样品混合的结合缓冲液而可能稍有变化。
本发明进一步提供了一种通过调节过程中所用的结合缓冲液的盐浓度或pH或两者来选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段的方法。本发明方法包括以下步骤：a)通过将目标核酸与第一结合缓冲液混合来提供第一样品混合物，其中所述第一结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以只允许较大的核酸片段，例如大于700bp的DNA片段结合到固体表面；b)将来自步骤a)的所述第一样品混合物施加到第一固体表面；c)收集从第一固体表面与第一样品混合物离心而得的流通溶液；d)通过将流通溶液与第二结合缓冲液混合来提供第二样品混合物，其中所述第二结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以只允许具有较小的所需尺寸范围的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段结合到固体表面；e)将来自步骤d)的第二样品混合物施加到第二固体表面；以及e)通过从所述第二固体表面洗脱结合的核酸片段并在水和/或包含低盐的洗脱缓冲液中将其回收来选择性地洗脱并回收具有较小的所需尺寸范围的核酸片段，例如150bp-700bp DNA片段。
本发明提供了，DNA结合能力随着结合缓冲液中的离液盐浓度与pH的组合而变化。在某些实施方案中，当结合缓冲液含有最终浓度为约1.0M的GITC时，在约5.33的pH下，具有500bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约4.92的pH下，具有400bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约3.44的pH下，具有300bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约2.57的pH下，具有250bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面(参看下表的说明)。
在其它实施方案中，当结合缓冲液含有最终浓度为约2.5M的GITC时，在约5.67的pH下，具有100bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.75的pH下，具有110bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.83的pH下，具有120bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.90的pH下，具有130bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.96的pH下，具有140bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；并且在约6.02的pH下，具有150bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面(参看下表的说明)。
1.0M GITC/pH DNA结合 2.5M GITC/pH DNA结合
5.33 >500bp 5.67 >100bp
4.92 >400bp 5.75 >110bp
3.44 >300bp 5.83 >120bp
2.57 >250bp 5.90 >130bp
5.96 >140bp
6.02 >150bp
在某些实施方案中，第一和/或第二结合缓冲液包含离液盐，其包括(但不限于)浓度介于0.8-5.0M之间的盐酸胍(GHCl)、浓度介于0.8-5.0M之间的硫氰酸胍(GITC)、浓度介于0.8-7.0M之间的碘化钠(NaI)，以及浓度介于1.0-7.0M之间的高氯酸钠。在一些实施方案中，第一结合缓冲液包含低离液盐浓度，例如0.85M硫氰酸胍(pH 7.0)，而第二结合缓冲液包含高离液盐，例如4.0M硫氰酸胍(pH 6.5)。通过调节第一和第二结合缓冲液中的盐浓度，某些核酸片段分别选择性地结合到第一或第二固体表面，并且可以随后在水和/或洗脱缓冲液中从任一固体表面洗脱并回收。
在其它实施方案中，还调节第一和/或第二结合缓冲液的pH。本发明提供了，核酸片段的结合能力对结合缓冲液的pH敏感。较低的pH促进了较大的核酸片段对固体表面的结合能力，而当pH增大时较小的核酸片段损失了对固体表面的结合能力(参看上表的说明)。在某些实施方案中，使用酸或酸性盐，如Tris-HCl、磷酸钠或其它磷酸盐来调节结合缓冲液的pH，以允许较大的核酸片段结合到固体表面。在其它实施方案中，使用碱或碱性盐，如NaOH来调节结合缓冲液的pH，以去除较小的核酸片段并且只允许具有所需尺寸范围的某些核酸片段结合到固体表面，并且随后从其中回收。在某些实施方案中，结合缓冲液的pH在约5.5到约7.5的范围内。
本发明进一步提供了用于选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的试剂盒。本发明试剂盒包含：a)用于核酸片段选择性地结合到固相的一种或多种结合缓冲液；b)表面上涂布有某种官能团的一种或多种固相；c)用于核酸纯化与回收的其它试剂；以及d)提供用于选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的指南和方案的说明书。在某些实施方案中，固相是二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒。在某些实施方案中，用于核酸纯化与回收的试剂包括(但不限于)洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和/或水。
附图简述
图1示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了使用经不同量的水稀释的DNA尺寸选择结合缓冲液从二氧化硅柱洗脱并回收的DNA片段的分离与选择。
图2示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了使用经不同量的水稀释的DNA尺寸选择结合缓冲液从二氧化硅磁性粒子/小珠洗脱并回收的DNA片段的分离与选择。
图3示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了通过调节DNA尺寸选择结合溶液中的盐浓度并且用低盐缓冲液和/或水从第一和第二二氧化硅柱洗脱靶向的DNA片段来进行不同尺寸范围内的DNA片段的分离与选择。
图4示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了DNA尺寸选择结合缓冲液中的pH条件影响着用低盐洗脱缓冲液从二氧化硅柱洗脱并回收的不同尺寸的DNA片段的分离与选择。
图5说明了核酸尺寸选择的工作流程。
图6说明了通过使用不同量的酸性缓冲液(例如，包含HCl的缓冲液)进行的DNA尺寸选择。
图7说明了通过使用不同量的碱缓冲液(例如，包含NaOH的缓冲液)联合酸性缓冲液进行的DNA尺寸选择。
发明详述
本发明提供了核酸纯化以及片段选择与回收的快速、简单和高通量的方法。通过调节结合缓冲液的盐浓度和/或pH，本发明提供了一种方法，其中只有具有所需尺寸范围的核酸片段能够在某些盐浓度和/或pH条件下可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且可以随后用水或低盐洗脱缓冲液从固体表面洗脱并回收。通过本发明方法获得的具有所需尺寸范围的核酸片段可以用于稍后的基于核酸的生物化学和诊断检测程序中，如大规模基因组作图、后DNA剪切、文库构建，以及用于下一代测序平台。本发明进一步提供了用于纯化和选择具有所需尺寸范围的核酸片段的试剂盒。
如本文所用的“核酸”指的是任何多核苷酸，包括(但不限于)DNA、RNA或聚酰胺核酸(PNA)、其天然存在或合成的修饰和/或其任何组合。在某些实施方案中，核酸片段指的是DNA片段，其可以是单链、双链或三链，并且呈任何形式，如线性或环状。在其它实施方案中，核酸片段指的是RNA或PNA片段。核酸可以与任何其它生物分子分离和隔离，这些生物分子包括(但不限于)蛋白质、单糖、多糖、脂质、RNA以及任何其它细胞组分。尽管以此描述的本发明方法提及DNA片段作为一个实例，但应了解，本发明方法还可以用于以类似方式选择性地回收具有所需尺寸范围的RNA或PNA或任何核酸片段，因为操纵结合缓冲液的盐浓度和/或pH条件可以控制核酸基于尺寸差异选择性地结合到固相的能力。本发明提供了，由于小的核酸片段需要较高的盐浓度和/或较低的pH用于强有力地结合到二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒/小珠，因此可以选择性地操纵盐浓度和/或pH以释放基于尺寸结合到二氧化硅材料的核酸片段。
如本文所用的核酸可以获自含有核酸的任何样品材料。举例来说，样品材料可以是来自食品和联合产品、临床和环境样品的任何材料。在某些实施方案中，样品材料是生物样品。在某些实施方案中，所述生物材料包含所有类型的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞和细菌。代表性样品包括全血和血源性产品，如血浆或血沉棕黄层、唾液、精液、组织匀浆、尿液、粪便、脑脊髓液或任何其它体液、组织、细胞培养物、细胞悬浮液等。生物材料还包括环境样品，如土壤、水或食品样品。样品材料还可以包括相对纯的或部分纯化的起始材料，如通过其它细胞分离过程获得的半纯制剂，如质粒、PCR产品、基因分型和/或测序起始产品。
本发明提供了选择性地回收核酸片段的方法，其包括：a)将目标核酸与具有选定pH和盐浓度的结合缓冲液混合以允许具有所需尺寸范围的核酸片段结合到固体表面；b)将来自步骤a)的混合物施加到固体表面以使得具有所需尺寸范围的核酸片段可逆地并且非特异性地结合到固体表面；以及c)通过用洗脱缓冲液从固体表面洗脱结合的核酸片段来选择性地回收具有所需尺寸范围的结合的核酸片段。
如本文所用的“结合缓冲液”指的是现今已知或稍后开发用于核酸分离与纯化过程的任何缓冲溶液。用于本发明的结合缓冲液包含通常用于核酸结合与沉淀的任何盐。在某些实施方案中，用于本发明方法中的结合缓冲液包含离液盐。离液盐的实例包括(但不限于)盐酸胍(GHCl)、硫氰酸胍(GITC)、碘化钠(NaI)、高氯酸钠，以及其混合物。在某些实施方案中，结合缓冲液的离液盐的浓度经过调节以使得只有具有所需尺寸范围的某些核酸片段可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且随后用洗脱缓冲液从固体表面洗脱。在某些实施方案中，盐酸胍(GHCl)或硫氰酸胍(GITC)的浓度介于0.8-5.0M之间；碘化钠(NaI)的浓度介于0.8-7.0M之间；并且高氯酸钠的浓度介于1.0-7.0M之间。本发明并不限制存在于结合缓冲液中的不同类型的盐的范围。在某些实施方案中，结合缓冲液包含硫氰酸胍(4M)、Tris-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)。在其它实施方案中，第一结合缓冲液包含硫氰酸胍(0.85M)、Tris-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)，并且第二结合缓冲液包含硫氰酸胍(4M)和Tris-HCl(100mM，pH 6.5)。在其它实施方案中，第一结合缓冲液包含硫氰酸胍(1.3M)、磷酸二氢钠(0.3M，pH 6.0)，并且第二结合缓冲液包含硫氰酸胍(4M)和Tris-HCl(100mM，pH 6.5)。
在某些实施方案中，通过用一定量的能够调节结合缓冲液的盐浓度的水或任何其它溶液和/或溶剂稀释结合缓冲液来调节结合缓冲液中的离液盐浓度。调节结合缓冲液中的盐浓度的方法在本领域中是众所周知的，并且本发明并不限制调节结合缓冲液的盐浓度的不同方法的范围。
本发明提供了，通过调节结合缓冲液中的离液盐浓度，只有具有所需尺寸范围的某些核酸片段能够结合到固体表面，而不需要的核酸片段与结合缓冲液一起保留在样品混合物中，并且在离心后被弃去。如本文所用的固体表面指的是任何固体支撑物的表面，包括当前广泛用于或建议用于固定或分离的任何众所周知的支撑物或基质。这些固体表面可以采用以下形式：小珠、粒子、薄片、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、板或孔。支撑物可以由玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合材料制成。优选的是呈现用于核酸结合的高表面积的材料。所述支撑物将一般具有不规则表面并且可以例如是多孔的或颗粒的，例如粒子、纤维、网状物、烧结物或筛。在某些实施方案中，用于本发明的固体表面包括(但不限于)膜滤柱或磁性微粒或球形小珠。小珠的尺寸例如为约至少0.2μm或至少1μm直径，并且具有不大于10μm或不大于6μm的最大直径。在某些实施方案中，0.2μm到1μm直径的小珠很好地工作。
固体支撑物还可以带有帮助核酸的特异性或非特异性结合的官能团，这些核酸如DNA结合蛋白，例如亮氨酸拉链或组蛋白或嵌入染料(例如溴化乙锭或Hoechst 42945)，这些官能团可以涂布到固体支撑物上。同样地，固体支撑物还可以具有结合伴侣以帮助核酸的选择性捕获。举例来说，可以使用互补DNA或RNA序列，或DNA结合蛋白。所述蛋白附着于固相是使用本领域中众所周知的技术来实现。在某些实施方案中，固体表面包括(但不限于)二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒/小珠，包括(但不限于)SERA-MAG.RTM磁性粒子(参看例如，来自Thermo Scientific(Indianapolis,Ind.)的磁性粒子)。
核酸与固体支撑物的结合是以本领域中已知的任何方式来实现。便利地，核酸可逆地并且非特异性地结合到支撑物，即，与序列无关。在某些实施方案中，所需的核酸片段与固相的非特异性结合是通过适当选择固体支撑物和条件来实现，例如，固体支撑物的表面的化学或物理性质(例如，疏水性或电荷)、结合缓冲液的pH或组成。便利地，在样品与固体支撑物接触之前、同时或之后将具有适当电荷和渗透性的缓冲液添加到样品中。替代的非特异性核酸-支撑物结合技术使用离液剂用于结合核酸的固相，如二氧化硅粒子，描述于例如EP-A-0389063(Akzo N.V.)中。核酸与支撑物的离子性结合可以通过使用具有带电表面的固体支撑物，例如涂布有二氧化硅和/或聚胺的支撑物来实现。
将各种组分组合并且使其简单地静置一段适合的时间间隔以允许所需的核酸片段结合到固体支撑物。混合可以通过任何便利的手段来进行，包括例如通过搅拌或涡旋来简单地搅动。而且，必要时，可以使用较高或较低的温度，但不是必需的。然后可以通过任何便利的手段从溶液中去除固体支撑物，这取决于固体支撑物的性质，并且包括从样品上清液中抽走固体支撑物的所有形式，反之亦然，包括(但不限于)离心、倾析或吸移。
可以使用用于核酸的已知沉淀剂中的任一者使核酸片段沉淀到支撑物上，这些沉淀剂如醇、醇/盐组合以及聚乙二醇(PEG)。在核酸结合和/或沉淀步骤之后，可以引入一个或多个洗涤步骤。可以使用任何常规的洗涤缓冲液或其它介质。一般来说，低到中等离子强度的缓冲液是优选的，例如20mM Tris-HCl(pH 8.0)/20mM C2H3NaO2。必要时，还可以使用例如含有醇的其它标准洗涤介质，例如用70％乙醇洗涤。
在核酸分离过程和任何任选的洗涤步骤(必要时)之后，将带有结合的核酸的支撑物转移(例如再悬浮或浸入)到任何适合的介质中，例如水或低离子强度的缓冲液，用于洗脱和回收。具有所需尺寸范围的结合的核酸片段的洗脱可以容易地使用已知的手段来实现，例如通过加热到65℃维持5到10分钟，此后可以从介质中去除支撑物，从而在溶液中留下结合的核酸片段。本发明涵盖在本领域中现今已知或稍后开发的适合于从固体支撑物洗脱和/或释放结合的核酸到溶液中的任何洗脱缓冲液。示范性的洗脱缓冲液包括(但不限于)水和/或含有低盐的任何洗脱缓冲液，例如10mM Tris-HCl(pH 8.5)。
在某些实施方案中，本发明提供了一种通过调节结合缓冲液中的离液剂浓度来从二氧化硅膜滤柱选择性地回收具有所需尺寸范围的DNA片段的方法。在某些实施方案中，本发明提供了，只有具有所需尺寸范围的某些DNA、RNA和/或PNA片段能够结合到二氧化硅膜滤柱，并且可以随后洗脱和/或回收。所需的片段小于或等于100bp或mer、小于或等于200bp或mer、小于或等于300bp或mer、小于或等于400bp或mer、小于或等于500bp或mer、小于或等于600bp或mer、小于或等于700bp或mer、小于或等于800bp或mer、小于或等于900bp或mer，或小于或等于1,000bp或mer。
在一些实施方案中，本发明方法包括将目标DNA样品(例如，100μl)与包含4M硫氰酸胍(pH 7.0)的结合缓冲液(例如，100μl)混合，其中在将每种混合物独立地施加到二氧化硅膜柱中之前，用200μl、300μl或400μl水进一步稀释每种DNA样品混合物(例如，总共200μl)。只有小于或等于100bp的DNA片段当用200μl水稀释时在约1.0M的GITC的最终浓度下、小于或等于200bp的DNA片段当用300μl水稀释时在约0.8M的GITC的最终浓度下、以及小于或等于300bp的DNA片段当用400μl水稀释时在约0.7M的GITC的最终浓度下，能够结合到二氧化硅膜柱，并且随后从二氧化硅膜柱洗脱并在水和/或含有低盐的洗脱缓冲液中回收。
在其它实施方案中，本发明提供了一种通过调节结合缓冲液中的离液剂浓度来从二氧化硅涂布的微粒选择性地回收具有所需尺寸范围的DNA片段的方法。在某些实施方案中，本发明提供了，只有具有所需尺寸范围的某些DNA、RNA和/或PNA片段能够结合到二氧化硅涂布的磁性小珠，并且可以随后洗脱和/或回收。所需的片段小于或等于100bp或mer、小于或等于200bp或mer、小于或等于300bp或mer、小于或等于400bp或mer、小于或等于500bp或mer、小于或等于600bp或mer、小于或等于700bp或mer、小于或等于800bp或mer、小于或等于900bp mer，或小于或等于1,000bp或mer。
在某些实施方案中，本发明方法包括将目标DNA样品与包含4M硫氰酸胍的结合缓冲液混合，其中在将每种混合物进一步与二氧化硅涂布的微粒混合之前，用200μl、300μl或400μl水进一步稀释每种DNA样品混合物。只有小于或等于200bp的DNA片段当用200μl水稀释时在约1.0M的GITC的最终浓度下、小于或等于300bp的DNA片段当用300μl水稀释时在约0.8M的GITC的最终浓度下、以及小于或等于400bp的DNA片段当用400μl水稀释时在约0.7M的GITC的最终浓度下，能够结合到二氧化硅涂布的微粒，并且随后从微粒洗脱并在水和/或含有低盐的洗脱缓冲液中回收。
本发明进一步提供了一种通过调节过程中所用的第一和第二结合缓冲液的盐浓度或pH或两者来选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法，例如，100-1000bp或mer、150-950bp或mer、150-900bp或mer、150-850bp或mer、150-800bp或mer、150-700bp或mer、150-600bp或mer、150-500bp或mer、150-400bp或mer、150-300bp或mer、150-200bp或mer、200-900bp或mer、250-850bp或mer、250-700bp或mer、300-900bp或mer、350-850bp或mer、350-700bp或mer、400-900bp或mer、450-850bp或mer、500-900bp或mer、500-800bp或mer、500-700bp或mer、550-950bp或mer，以及任何所需尺寸范围。
在某些实施方案中，第一和/或第二结合缓冲液包含离液盐，包括(但不限于)浓度介于0.8-5.0M之间的盐酸胍(GHCl)、浓度介于0.8-5.0M之间的硫氰酸胍(GITC)、浓度介于0.8-7.0M之间的碘化钠(NaI)，以及浓度介于1.0-7.0M之间的高氯酸钠。在一些实施方案中，第一结合缓冲液包含低离液盐浓度，例如0.85M硫氰酸胍(pH 7.0)，而第二结合缓冲液包含高离液盐，例如4.0M硫氰酸胍(pH 6.5)。通过调节第一和第二结合缓冲液中的盐浓度，某些核酸片段分别选择性地结合到第一或第二固体表面，并且可以随后在水和/或洗脱缓冲液中从任一固体表面洗脱并回收。
在某些实施方案中，本发明方法包括以下步骤：a)通过将目标核酸与第一结合缓冲液混合来提供第一样品混合物，其中所述第一结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以只允许较大的核酸片段，例如大于700bp或mer、大于600bp或mer、大于500bp或mer、大于400bp或mer和/或大于300bp或mer的DNA、RNA或PNA片段能够结合到固体表面；b)将来自步骤a)的所述第一样品混合物施加到第一固体表面；c)收集从第一固体表面与第一样品混合物离心而得的流通溶液；d)通过将流通溶液与第二结合缓冲液混合来提供第二样品混合物，其中所述第二结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以允许具有所需尺寸范围的核酸片段，例如150-700bp或mer、150-600bp或mer、150-500bp或mer、150-400bp或mer和/或150-300bp或mer的DNA、RNA或PNA片段能够结合到固体表面；e)将来自步骤d)的第二样品混合物施加到第二固体表面；以及e)通过从所述第二固体表面洗脱结合的核酸片段并在水和/或包含低盐的洗脱缓冲液中将其回收来选择性地洗脱并回收具有所需尺寸范围的核酸片段，例如150-700bp或mer、150-600bp或mer、150-500bp或mer、150-400bp或mer和/或150-300bp或mer的DNA、RNA或PNA片段。图5示出了核酸尺寸选择的工作流程。
在其它实施方案中，还可以调节第一和/或第二结合缓冲液的pH以允许具有所需尺寸范围的某些核酸片段结合到固体支撑物。本发明提供了，核酸片段的结合能力对结合缓冲液的pH敏感。较低的pH促进了较大的核酸片段对固体表面的结合能力，而当pH增大时较小的核酸片段损失了对固体表面的结合能力。
在某些实施方案中，如上表中所说明，当结合缓冲液含有最终浓度为约1.0M的GITC时，在约5.33的pH下，具有500bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约4.92的pH下，具有400bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约3.44的pH下，具有300bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约2.57的pH下，具有250bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面。在其它实施方案中，当结合缓冲液含有最终浓度为约2.5M的GITC时，在约5.67的pH下，具有100bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.75的pH下，具有110bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.83的pH下，具有120bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.90的pH下，具有130bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；在约5.96的pH下，具有140bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面；并且在约6.02的pH下，具有150bp或更高的大多数DNA片段能够结合到固体表面。如本文所用的术语“大多数”意味着纯化核酸样品中多于50％、多于55％、多于60％、多于65％、多于70％、多于75％、多于80％、多于85％、多于90％以及多于95％的总DNA、RNA和/或PNA片段。
调节结合缓冲液的pH的方法在本领域中是众所周知的。在某些实施方案中，使用酸或酸性盐，如Tris-HCl、磷酸钠或其它磷酸盐来调节结合缓冲液的pH，以允许较大的核酸片段结合到固体表面。举例来说，可以使包含HCl的酸性缓冲液与包含GITC和Tris-HCl的结合缓冲液混合以降低结合缓冲液的pH以便调节不同尺寸的核酸片段的结合能力。在其它实施方案中，使用碱或碱性盐，如NaOH来调节结合缓冲液的pH，以去除较小的核酸片段并且只允许具有所需尺寸范围的某些核酸片段结合到固体表面，并且随后从其中回收。举例来说，可以使包含NaOH的碱性缓冲液与包含GITC和Tris-HCl的结合缓冲液混合以提高结合缓冲液的pH以便调节不同尺寸的核酸片段的结合能力。对应于用于调节结合缓冲液的pH的酸性和/或碱性缓冲液的体积的核酸片段尺寸选择说明于图6和图7中。在某些实施方案中，结合缓冲液的pH范围介于5.5与7.5之间。本发明的范围并不限于用来调节结合缓冲液的pH的材料和/或方法。
本发明还提供了用于选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的试剂盒。本发明试剂盒包含：a)用于核酸片段选择性地结合到固相的一种或多种结合缓冲液；b)表面上涂布有官能团的固相；c)用于核酸纯化与回收的其它试剂；以及d)提供用于选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方案的说明书。在某些实施方案中，固相是二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒。在某些实施方案中，用于核酸纯化与回收过程的试剂包括(但不限于)如上文所论述的洗涤缓冲液、洗脱缓冲液和/或水。
因此，本发明的尺寸选择方法和/或试剂盒提供了一种便利的系统用于以超过50％的回收率选择性地回收不含寡核苷酸、核苷酸和聚合酶的核酸片段，由此提供了从文库构建中的下一代步骤(NGS)中的各种酶促反应步骤快速而可靠地回收核酸片段，以及使用用于所有常用NGS平台，如Illumina HiSeq/GA/MiSeq、Roche 454Genome Sequencer和Life Technologies SOLiD的文库构建工作流程。在某些实施方案中，本发明的尺寸选择方法和/或试剂盒提供了介于100-300bp或mer和/或150-300bp或mer之间的截止尺寸的选择。在其它实施方案中，本发明的尺寸选择方法和/或试剂盒提供了通过用适当体积的特别配制的结合缓冲液调节核酸结合条件来选择性地回收介于150-700bp或mer之间的核酸片段，其中在加载到固相柱和/或小珠之前缓冲液的离液盐浓度和pH经过调节。
在本申请的通篇，提及各种出版物。所有这些出版物的公开内容以及那些出版物全文中所引用的那些参考文献特此以引用的方式并入本申请中以更全面地描述本发明所属领域的技术现状。
还应了解，前述内容涉及本发明的某些实施方案并且在不脱离本发明的范围的情况下可以在其中作出众多改变。本发明用以下实施例进一步说明，这些实施例不应以任何方式被解释为对本发明的范围施加限制。相反，应清楚地了解，在不脱离本发明的精神和/或随附权利要求书的范围的情况下可以采用各种其它实施方案、修改和其等价物，在阅读本文中的描述之后，这些本身可以被本领域的技术人员所想到。
本发明的其它特征和优点将从其某些实施方案的以下描述并且从权利要求书显而易见。本发明的这些和许多其它变化和实施方案在回顾随附描述和实施例之后将为本领域的技术人员显而易见。
实施例
实施例1
从二氧化硅膜滤柱的DNA片段选择与回收
将0.1ml 100bp DNA梯(Omega Bio-tek,Inc.,Norcross,GA)与100μl包含硫氰酸胍(4M)、Tri-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)的DNA尺寸选择结合缓冲液在微量离心管中混合。将DNA样品混合物倒置10次，在室温下孵育5分钟，通过分别添加200μl、300μl和400μl水来用水稀释，然后通过将每个管倒置10次来进一步混合。随后将每种混合的溶液转移到二氧化硅织物过滤柱(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)中，并且以13,000×G离心1分钟以使DNA结合到这个柱。将上面结合有DNA的柱用70％乙醇洗涤两次，每次以13,000×G离心1分钟，并且通过以13,000×G离心3分钟来干燥。在洗涤和干燥之后，然后将五十(50)μl包含Tris-HCl(10mM pH 8.5)的洗脱缓冲液添加到柱中，接下来使柱离心5分钟以从这个柱洗脱结合的DNA片段。
图1示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了使用经不同量的水稀释的DNA尺寸选择结合缓冲液从二氧化硅膜滤柱洗脱并回收的DNA片段的分离与选择。结果指示：1)用200μl水稀释DNA样品混合物，尺寸小于或等于100bp的DNA片段完全从二氧化硅膜柱洗脱和/或回收；2)用300μl水稀释DNA样品混合物，尺寸小于或等于200bp的DNA片段完全从二氧化硅膜柱洗脱和/或回收；以及3)用400μl水稀释DNA样品混合物，尺寸小于或等于300bp的DNA片段完全从二氧化硅膜柱洗脱和/或回收。
实施例2
从二氧化硅涂布的顺磁性粒子/小珠的DNA片段选择与回收
将0.1ml 100bp DNA梯(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA]与100μl包含硫氰酸胍(4M)、Tri-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)的DNA尺寸选择结合缓冲液在微量离心管中混合。将DNA样品混合物倒置10次，在室温下孵育5分钟，通过分别添加0μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl和600μl水来用水稀释，然后通过将每个管倒置10次来进一步混合。通过以50mg/ml添加10μl粒子/小珠将每种混合的溶液与二氧化硅涂布的磁性粒子/小珠(Omega Bio-Tek,Atlanta,GA)进一步混合，并且将混合的溶液倒置10次。通过将管放到磁力架(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)上2分钟来收集磁性粒子/小珠。在使用吸移管从每个管完全抽吸并弃去澄清的上清液之后，将500μl 70％乙醇添加到每个管中，并且通过涡旋1分钟来混合以使磁性粒子/小珠悬浮。然后将每个管放在磁力架上再过1分钟以收集磁性粒子/小珠，接下来使用吸移管从每个管完全抽吸并弃去澄清的上清液。使每个管进一步留在磁力架上再过5分钟以使磁性粒子/小珠干燥。然后将五十(50)μl包含Tris-HCl(10mM，pH 8.5)的洗脱缓冲液添加到每个管中，并且通过涡旋30秒使磁性粒子/小珠再悬浮以洗脱DNA。
图2示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了使用经不同量的水稀释的DNA尺寸选择结合缓冲液从二氧化硅磁性粒子/小珠洗脱并回收的DNA片段的分离与选择。结果指示：1)用200μl水稀释DNA样品混合物，尺寸小于或等于200bp的DNA片段完全从二氧化硅磁性粒子/小珠洗脱和/或回收；2)用300μl水稀释DNA样品混合物，尺寸小于或等于300bp的DNA片段完全从二氧化硅磁性粒子/小珠洗脱和/或回收；以及3)用400μl水稀释DNA样品混合物，尺寸小于或等于400bp的DNA片段完全从二氧化硅磁性粒子/小珠洗脱和/或回收。
实施例3
DNA尺寸结合缓冲液中的盐浓度对DNA片段选择与回收的影响
将0.1ml 100bp DNA梯(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)与350μl、400μl和500μl包含硫氰酸胍(0.85M)、Tri-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)的第一结合缓冲液在微量离心管中混合。将这种第一DNA样品混合物倒置10次，并且在室温下孵育5分钟。然后将每种混合的溶液转移到第一二氧化硅织物过滤柱(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)中，并且以13,000×G离心1分钟以使较大的DNA结合到这个柱。收集流通液，然后与30μl包含硫氰酸胍(4M)和Tri-HCl(100mM，pH 6.5)的第二结合缓冲液混合。然后将这种第二DNA混合物溶液加载到第二二氧化硅织物过滤柱中，并且以13,000×G离心1分钟。然后通过以13,000×G离心1分钟将每个第一和第二柱用70％乙醇洗涤两次，接下来以13,000×G进一步离心3分钟以干燥这些柱。然后将四十(40)μl包含10mM Tris-HCl(pH 8.5)的洗脱缓冲液添加到每个柱中并且接下来离心5分钟以从这些柱洗脱DNA。
图3示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了通过调节DNA尺寸选择结合溶液中的盐浓度并且用低盐缓冲液和/或水从第一和第二二氧化硅柱洗脱靶向的DNA片段来进行不同尺寸范围内的DNA片段的分离与选择。结果显示：1)当将350μl包含硫氰酸胍(0.85M)、Tri-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)的第一结合缓冲液添加到DNA混合物样品中时，尺寸大于700bp的DNA片段能够结合到第一二氧化硅织物过滤柱上，并且当随后将30μl包含硫氰酸胍(4M)和Tri-HCl(100mM，pH 6.5)的第二结合缓冲液添加到从第一二氧化硅柱收集的流通液中时，尺寸介于200bp到700bp之间的DNA片段从第二二氧化硅柱洗脱和/或回收；2)当将400μl包含硫氰酸胍(0.85M)、Tri-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)的结合缓冲液添加到DNA混合物样品中时，尺寸大于500bp的DNA片段能够结合到第一二氧化硅柱上，并且当随后将30μl包含硫氰酸胍(4M)和Tri-HCl(100mM，pH 6.5)的第二结合缓冲液添加到从第一二氧化硅柱收集的流通液中时，尺寸介于200bp到500bp之间的DNA片段从第二二氧化硅柱洗脱和/或回收；以及3)当将500μl包含硫氰酸胍(0.85M)、Tri-HCl(100mM，pH 7.0)和EDTA(10mM)的结合缓冲液添加到DNA混合物样品中时，尺寸大于300bp的DNA片段能够结合到第一二氧化硅柱上，并且当随后将30μl包含硫氰酸胍(4M)和Tri-HCl(100mM，pH 6.5)的第二结合缓冲液添加到从第一二氧化硅柱收集的流通液中时，尺寸介于200bp到300bp之间的DNA片段从第二二氧化硅柱洗脱并回收。
实施例4
DNA尺寸结合缓冲液的pH对DNA片段选择与回收的影响
每个微量离心管含有0.1ml 100bp DNA梯(Omega Bio-Tek,Inc.,Norcross,GA)与400μl处于约pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1和pH 6.2下的包含硫氰酸胍(1.3M)和磷酸二氢钠(0.3M)的第一结合缓冲液的混合物。将具有DNA混合物样品的每个管倒置10次，并且在室温下孵育5分钟。然后将来自每个管的DNA样品混合物溶液转移到第一二氧化硅织物过滤柱(Omega Bio-Tek,Atlanta,GA)中，并且独立地以13,000×G离心1分钟以使较大的DNA结合到这个柱。收集来自第一二氧化硅柱的流通液，并且与100μl包含硫氰酸胍(4M)和Tri-HCl(100mM，pH 6.5)的第二结合缓冲液混合。然后将具有第二结合缓冲液的每种混合物加载到第二二氧化硅织物过滤柱中，并且以13,000×G离心1分钟。然后通过以13,000×G离心1分钟将每个第一和第二柱用70％乙醇洗涤两次，接下来以13,000×G进一步离心3分钟以干燥这些柱。然后将四十(40)μl包含10mM Tris-HCl(pH 8.5)的洗脱缓冲液添加到每个柱中并且接下来离心5分钟以从这些柱洗脱DNA。
图4示出了EtBr染色的琼脂糖凝胶电泳的结果，其说明了DNA尺寸选择结合缓冲液中的pH条件影响着用低盐洗脱缓冲液从二氧化硅柱洗脱并回收的不同尺寸的DNA片段的分离与选择。结果展示，DNA片段对二氧化硅膜柱的结合能力对结合缓冲液的pH非常敏感。当pH增大时，DNA片段越小，结合能力越低。
虽然出于清晰和理解的目的已经相当详细地描述了本发明，但本领域的技术人员从阅读本公开中应了解，在不脱离本发明和随附权利要求书的真正范围的情况下可以对形式和细节作出各种改变。

Claims (14)

1.一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法，其包括：
a)将目标核酸与具有选定pH和盐浓度的结合缓冲液混合以允许具有所述所需尺寸范围的所述核酸片段结合到固体表面，其中所述结合缓冲液包含终浓度介于0.7-0.8M之间的硫氰酸胍(GITC)，所述核酸片段的所述所需尺寸范围是小于或等于700bp；
b)将来自步骤a)的混合物施加到所述固体表面以使得具有所述所需尺寸范围的所述核酸片段可逆地并且非特异性地结合到所述固体表面；以及
c)通过用洗脱缓冲液从所述固体表面洗脱所述结合的核酸片段来选择性地回收具有所述所需尺寸范围的所述核酸片段。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述结合缓冲液的所述离液盐浓度是用一定量的水来调节，这允许具有所述所需尺寸范围的所述核酸片段结合到所述固体表面并且随后从所述固体表面洗脱。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述固体表面是二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中所述核酸片段是DNA片段、RNA片段或PNA片段。
5.如权利要求4所述的方法，其中当所述结合缓冲液中GITC的最终浓度为约0.8M时，具有小于或等于200bp的所需尺寸范围的DNA片段结合到二氧化硅膜滤柱并且随后从二氧化硅膜滤柱洗脱。
6.如权利要求4所述的方法，其中当GITC的最终浓度为约0.7M时，具有小于或等于300bp的所需尺寸范围的DNA片段结合到二氧化硅膜滤柱并且随后从二氧化硅膜滤柱洗脱。
7.一种选择性地回收具有所需尺寸范围的核酸片段的方法，其包括：
a)通过将目标核酸与第一结合缓冲液混合来提供第一样品混合物，其中所述第一结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以允许较大的核酸片段结合到固体表面；
b)将来自步骤a)的所述第一样品混合物施加到第一固体表面；
c)收集从所述第一固体表面与所述第一样品混合物离心而得的流通溶液；
d)通过将所述流通溶液与第二结合缓冲液混合来提供第二样品混合物，其中所述第二结合缓冲液的盐浓度或pH经过调节以允许具有较小的所需尺寸范围的核酸片段结合到固体表面，其中所述第二结合缓冲液包含终浓度介于0.7-0.8M之间的硫氰酸胍(GITC)，所述核酸片段的所述较小的所需尺寸范围是小于或等于700bp；
e)将来自步骤d)的所述第二样品混合物施加到第二固体表面；以及
f)通过用洗脱缓冲液从所述第二固体表面独立地洗脱所述结合的核酸片段来选择性地回收具有所述较小的所需尺寸范围的所述核酸片段。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第一结合缓冲液包含选自由以下组成的群组的离液盐：浓度介于0.8-5.0M之间的盐酸胍(GHCl)、浓度介于0.8-5.0M之间的硫氰酸胍(GITC)、浓度介于0.8-7.0M之间的碘化钠(NaI)，以及浓度介于1.0-7.0M之间的高氯酸钠。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述第一结合缓冲液包含酸或其酸性盐，以降低所述结合缓冲液的pH以便促进较大的核酸片段结合到所述固体表面。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述第二结合缓冲液包含碱或其碱性盐，以提高所述结合缓冲液的pH以便去除较小的核酸片段。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述结合缓冲液的pH范围介于5.5与7.5之间。
12.一种用于核酸片段选择与回收的试剂盒，其包含：
a)用于核酸片段选择性地结合到固相的一种或多种结合缓冲液，其中至少一种所述结合缓冲液包含终浓度介于0.7-0.8M之间的硫氰酸胍(GITC)以允许具有较小的所需尺寸范围的核酸片段结合到固体表面，所述核酸片段的所述较小的所需尺寸范围是小于或等于700bp；
b)涂布有官能团的一种或多种固相；
c)用于核酸纯化与回收的其它试剂；以及
d)提供用于核酸片段选择与回收的方案的说明书。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述固相是二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述用于核酸纯化与回收的试剂包含洗涤缓冲液、洗脱缓冲液或水。
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