JP6506371B2 - 核酸を精製するための方法およびキット - Google Patents

Description

関連出願の参照
本願は、２０１２年８月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／６９３，９６３号および２０１２年９月５日に出願された米国仮特許出願第６１／６９７，１１６からの優先権を主張する。

本発明は、全般的に核酸を分離および／または精製するための方法、および具体的には、自動化に適合しやすい固形モノリスフィルターを用いてサンプルから核酸を分離および／または精製するための方法に関する。

核酸精製は、非侵襲的出生前診断（ＮＩＰＤ）のための胎児ＤＮＡの精製を含む、大半の分子診断および研究使用のみの用途に必要である。抽出プロセスは、磁気ビーズおよび膜に基づくフォーマットを利用することにより合理化および自動化されている。粒子および膜は、有効である一方で困難な臨床マトリクスに直面するとき限界を有することが知られている。たとえば、膜およびビーズに基づくカラムは柔軟であり、孔径が小さく、かつ遠心分離または真空システムで処理するためにある種の支持体が必要である。膜およびビーズカラムの物理的な性質により顕著な流動抵抗がもたらされ、これが消耗品を目詰まりさせることなく効率よく処理できるサンプルの種類および／または流路内で一方向処理のできる総（装填）サンプル体積を限定する。反対に、磁気粒子は攪拌によりサンプル全体に分布させなければならない。溶液中に磁気粒子を均一に分散させる必要があることから、大半の磁気ビーズ消耗品では処理できる総サンプル装填体積が制限される。臨床サンプルの性状（粘度または完全性など）により、管またはロッド側面上での磁気粒子の濃縮が非効率的となることがある。また、抽出プロセス中にビーズからシリカ微粒子が剥落し、その磁気が失われて最終サンプルを汚染することがある。

スクリーニングおよび診断の両者を目的とした分子検査に対する需要が高いことから、試験室におけるサンプルスループットの要求が高まっている。抽出から検出を経た処理手順の自動化は、これらのサンプル処理負荷を軽減する上で最も重要である。上述した他の抽出技術に固有の限界があるので、自動化に適合しやすい簡素で低費用の核酸精製システムに対するニーズが未だに存在する。

本願の態様の１つは、液状サンプルから核酸を精製するための自動化法であって：（ａ）フィルターが核酸と特異的に結合することを特徴としかつ自動化ロボットプラットフォームが自動的に試薬を分注し、サンプル内容物を取出し、かつピペットチップおよび／またはサンプルチップを移動することができることを特徴とする、各チップが第１の開口部と第２の開口部の間の流路を規定するハウジングおよび流路の１区分を占めるフィルターを含む、複数のピペットチップをロボットプラットフォームに装填すること；（ｂ）核酸がピペットチップを通り、かつその中のフィルターと結合するよう、核酸を含む液状サンプルの少なくとも一部分をピペットの第１の開口部から流し入れること；（ｃ）液状サンプルのその一部分がピペットチップ外に出る間に２回目にフィルターを通過することを特徴とする、ピペットチップから第１の開口部を経て液状サンプルのその一部分を排除すること；および（ｄ）溶離バッファーがピペットチップに出入りする間にフィルターを通過することを特徴とする、溶離バッファーをピペットチップの第１の開口部から流し入れかつ溶離バッファーをピペットチップから第１の開口部を経て排除することによって核酸をフィルターから溶離させることを含む自動化法に関する。

本願の他の態様は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するための方法であって：（ａ）胎児および母体核酸の第１のフィルターとの特異的結合を可能とする条件下で胎児核酸および母体核酸を含む血漿サンプルを第１のフィルターに流すこと；（ｂ）結合した胎児および母体核酸を第１のフィルターから溶離させて胎児核酸と母体核酸を含む濃縮核酸サンプルを形成すること；（ｃ）母体核酸が第２のフィルターと結合しかつ胎児核酸が第２のフィルターを通過することを可能とする条件下で濃縮核酸サンプルを第２のフィルターに流すこと；および（ｄ）第２のフィルターからのフロースルー分画が胎児核酸を含むことを特徴とする、第２のフィルターからフロースルー分画を捕集することを含む方法に関する。

本願の他の態様は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分離するためのキットであって：ガラスフリットフィルターが２〜２２０ミクロンの孔径を有しかつ核酸のガラスフリットフィルターとの結合を促進する薬剤によって処理またはコーティングされていないことを特徴とする、自立型ガラスフリットフィルターを含むピペットチップ、血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール約１７〜２５％ｖ／ｖおよび約０．５Ｍから約４．０Ｍの間の濃度のカオトロピック塩を有する第１の結合混合物を提供するよう配合された第１の結合バッファー；および血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール約０〜１０％ｖ／ｖおよび約１Ｍから約４．０Ｍの間の濃度のカオトロピック塩を有する第１の結合混合物を提供するよう配合された第２の結合バッファーを含むキットに関する。

これらのおよび他の態様および利点は、以下の発明を実施するための形態を付属の図面と共に読む際に明らかになるであろう。

図１Ａ〜１Ｄは、本願にしたがって核酸を精製するための中空チャンバーおよびフィルターを含むピペットチップデバイスの多様な実施形態の模式図である。 同上。 図２Ａ〜２Ｄは、本願にしたがって胎児核酸を精製するための典型的なプロセスの模式図である。 同上。 エッペンドルフｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０サンプルプレートレイアウト（Ａ）およびワークテーブル上の試薬／消耗品の配置（Ｂ）を描出する。サンプルプレートは最大２４サンプルについて設定することができるが（それぞれカラム１、５および９）、ｅｐＭｏｔｉｏｎは８サンプルのみを同時に処理する。 鼻咽頭吸引物（ＮＰＡ）に混合されたインフルエンザウイルスの自動化抽出物からのリアルタイムＰＣＲの結果を描出する。ＮＰＡ装填体積＝１００μL、溶離体積＝５０μL。結果は、各希釈レベルおよび目的インフルエンザ毎に異なる５つのＮＰＡバックグラウンドから各３回繰り返した抽出の平均（ｎ＝１５）である。ｑＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム上で実施した。 全血からゲノムＤＮＡを精製するためのハミルトンＳＴＡＲデッキレイアウトを描出する（原寸と比例せず）。デッキ位置１＝ハミルトン１ｍＬフィルターチップ；２＝ハミルトン１ｍＬノンフィルターチップ；３＝アコーニ／ハミルトン１ｍＬ ＬＰＴ２ｍｍフィルターチップ；４＝装填血液サンプルキャリアー（採血管またはマイクロ遠心管）；５〜９＝それぞれ溶解バッファーＦ、エタノール、洗浄バッファーＪ、洗浄バッファーＫおよび溶離バッファーＡ２用２９０ｍＬ試薬トラフ；１０＝深型９６ウェル結合プレート；１１＝深型９６ウェル洗浄プレートＪ；１２＝深型９６ウェル洗浄プレートＫ；１３＝深型９６ウェル溶離プレート；１４＝ハミルトンＨＨＳ２ヒーター／シェーカーとＮｕｎｃ深型９６ウェルインキュベーションプレート；１５＝プロテイナーゼＫを収容する５０ｍＬ試薬トラフ。 図６Ａ〜Ｇは、種々のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出の結果を示す。図６Ａは全血から反復実施したヒトｇＤＮＡ抽出から無作為選択した１０サンプルのナノドロップ１０００（サーモフィッシャー）によるＵＶ可視光トレースを示す。図６Ｂは全血から抽出されたフィルターチップ精製ヒトｇＤＮＡの１％アガロースゲルを示す。Ｍ＝フィッシャー２４ｋｂ ＭＡＸ ＤＮＡラダー。レーン１〜４＝反復抽出物から無作為に選択した４サンプルに由来する約１００ｎｇの精製ｇＤＮＡ。図６Ｃはプール全血装填２００μＬを本発明にしたがった各８回の処理からのｇＤＮＡ収量の再現性を示す。図６Ｄは全血からの平均ｇＤＮＡ収量が、１ｍＬ ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルターから処理された全血装填体積１００μＬ、２００μＬおよび３００μＬ（左側）および５ｍＬ ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルターから処理された全血体積１０００μＬおよび２０００μＬ（中央および右側）の範囲にわたって線形であったことを示す。図６Ｅは４００μＬサンプル４８本（唾液２４本およびブランク２４本）がｑＰＣＲ分析に付された交叉汚染試験結果を示す。図６Ｆは、キアゲンのマニュアルスピンカラム法（右カラム／対）および本発明による自動化抽出法（左カラム／対）を用いて抽出した７名の盲検化唾液サンプル（サンプルＡ〜Ｇ；４００μＬ装填／１００μＬ溶離）からの平均ｇＤＮＡ収量の比較からのＵＶ吸収率の結果を示す。図６Ｇは、競合会社５社の抽出系（カラム２〜６）と比較した、ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルター（カラム１）から処理した２００μＬ全血の処理時間を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 本願にしたがって胎児核酸を精製するためのプロセスの実施形態を示す流れ図である。 図８Ａは、実際の母体サンプル中に認められる長さをシミュレートするために超音波処理でフラグメント化した女性および男性ゲノムＤＮＡを示すアガロースゲルの写真である（女性＝母体ＤＮＡ、男性＝胎児ＤＮＡ）。図８Ｂは、種々の希釈度の胎児ＤＮＡの回収量を示す図である。ＰＣＲサンプル１つあたりｎ＝３として各ｎ＝３抽出した、ＴｒｕＴｉｐ（黒菱形および黒四角）およびキアゲン（白三角および×）のそれぞれについて各サンプルが１００から１ｎｇの範囲のフラグメント化男性ＤＮＡと２００ｎｇのフラグメント化女性ＤＮＡを含めた総ＤＮＡを含有する抽出サンプルからのリアルタイムＰＣＲの結果。誤差棒は±１標準誤差を示す。 本願の濃縮手順用いるか、または用いない胎児ＤＮＡ（Ｃｈｒｏｍ Ｙ）および総ＤＮＡ（Ｃｈｒｏｍ１）の回収量を示す図である。１回に母体血漿５ｍＬを用いた測定を４回実施。ＣＨＹは男性胎児ＤＮＡを定量しかつＣＨ１は存在する総ＤＮＡ（胎児および母体）を定量する。ＣＨＹおよびＣＨ１を標的とする過去に公表された測定法を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０システム上でｑＰＣＲを実施した。 大量血漿サンプル由来ＤＮＡを精製するためのハミルトンＳＴＡＲｐｌｕｓデッキレイアウトを描出する（原寸と比例せず）。システムは８×５ｍＬチャネルおよび８×１ｍＬチャネルを具備する。デッキポジション１＝ハミルトン４ｍＬフィルターチップ；２＝アコーニ／ハミルトン５ｍＬフィルターチップ；３＝ソース血漿サンプル；４＝５０ｍＬ円錐管；５＝ＣＮ−Ｗ１、ＣＮ−Ｗ２およびＣＮ−Ｗ４試薬を収容する１２０ｍＬ試薬トラフ；６＝プロテイナーゼＫ、ＣＮ−Ｂ２、ＣＮ−Ｂ３、ＥＢＡ２、ＥＢＢおよびＣＮ−Ｗ３試薬を収容する低体積試薬トラフ；７＝ＣＮ−Ｌ１試薬を収容する２９０ｍＬ試薬トラフ；８＝ＣＮ−Ｂ１試薬を収容する２９０ｍＬ試薬トラフ；９＝手順１用深型９６ウェルプレート；１０＝手順２用深型９６ウェルプレート；１１＝精製最終生成物用サンプルキャリアー；１２＝ハミルトン１ｍＬノンフィルターチップ；１３＝アコーニ／ハミルトン１ｍＬ ＬＰＴ ４ｍｍフィルターチップ。 図１１Ａは、大容量フィルターチップ手順で８回反復サンプル処理したプール母体血漿のサンプルからのｑＰＣＲの結果を描出する。プロトコルの全体（オフラインでのプロテイナーゼＫ前処理を含む）は約２時間で完了する。すべての繰り返し処理を通じた平均Ｃ_ｔ値は胎児男性（ＣＨＹ）および総（ＣＨ１）ＤＮＡについてそれぞれ３４．５８±０．６６および２９．７６±０．５０であり、これらは自動化抽出法の優れた反復性を証明する。標準物質に対するフィットポイント分析比較に基づき、総ＤＮＡプール中の胎児ＤＮＡ濃度（ゲノム等価物中）を算出した結果、全サンプルを通じた平均％胎児ＤＮＡは２．８％であった。サンプルは抽出を実施する前にプールされていたので、このサンプルについての実際の％胎児ＤＮＡは不明である。 図１１Ｂは、上記の抽出手順にしたがってアコーニＴｒｕＴｉｐ（登録商標）を採用した自動化システム（左カラム／対）と、キアゲンのマニュアル循環核酸キット（右カラム／対）を用いた個別に異なる母体血漿１１サンプルから２ずつ回収した胎児ＤＮＡの百分率の比較を示す。

本願は試験サンプルから核酸を精製するための方法およびデバイスを提供する。具体的には、本願は、それによってモノリス核酸結合マトリクスがピペットチップまたは類似のデバイスに挿入される簡易な核酸抽出技術を提供する。核酸抽出は、大半の液状物操作機器と適合し、かつそれゆえ自動化に適合しやすくかつ高スループット臨床用途およびサンプルマトリクスに向けた多くの媒体に適合化できるサンプル調製フォーマットを用いて実施される。一部の実施形態においては、本願は複数のピペットチップを有するロボットプラットフォームを用いて液状サンプルから核酸を精製するための自動化法に関する。

本願は、高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡのバックグラウンド（母体ＤＮＡなど）からの低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡフラグメント（胎児ＤＮＡなど）の優先的な選択に適合化した方法論をさらに提供する。方法論は、ＨＭＷ ＤＮＡ存在量と無関係にサンプル中に存在するＬＭＷ ＤＮＡの百分率を高め、かつ一定の臨床用途のための感度条件に適合するためにたとえば最大２０ｍＬまでの大きなサンプル体積を処理する能力を提供する。一部の実施形態においては、本願は、胎児および／または母体核酸のフィルターへの特異的結合を可能にするフィルターを用いて血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するための方法に関する。本願は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分離するためのキットも提供する。

本願で用いる用語「試験サンプル」または「サンプル」は、核酸を含みうる任意の材料を意味する。試験サンプルの例は生体サンプル、環境サンプルおよび非自然サンプルを含むが、これに限定されない。生体サンプルの例は組織サンプル、生体液サンプル、細胞サンプル、細菌サンプル、およびウイルスサンプルを含むが、これに限定されない。組織サンプルは、任意の動物または植物から分離された組織を含む。生体液サンプルは、血液、血漿、尿、唾液、喀痰、脳脊髄液、鼻咽頭、頬、洗浄液（例：気管支）、および白血球除去（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）サンプルを含むが、これに限定されない。細胞サンプルは培養細胞または任意の採取源から分離された細胞を含むが、これに限定されない。ウイルスサンプルは培養ウイルスまたは分離ウイルスを含むが、これに限定されない。環境サンプルは、空気サンプル、水サンプル、土壌サンプル、岩石サンプルおよび自然環境から得られる任意の他のサンプルを含むが、これに限定されない。人工的サンプルは、自然環境中に存在しない任意のサンプルを含む。「人工的サンプル」の例は、精製または分離した材料、培養材料、合成材料および他の任意の人工的材料を含むが、これに限定されない。一部の実施形態においては、試験サンプルは喀痰、ＮＡＬＣ処理喀痰、全血または血液培養、血漿、脳脊髄液、鼻咽頭ぬぐい液および吸引液、気管支洗浄液、新鮮または凍結細胞または組織、ＦＦＰＥサンプル、バフィーコート、血液カード、唾液、頬部ぬぐい液、糞便、固形または液状細菌培養、ＮＰＡ、親水施設および土壌を含む。

本願で用いる「核酸」は、天然に発生するものまたは人工的に合成されるもの（その類似体を含む）を問わないＤＮＡおよびＲＮＡ、またはその修飾物、特に任意の鎖長を有する天然に発生することが知られている修飾物を含む、個々の核酸および核酸の重合鎖を意味する。本願と一致する核酸の鎖長の例は、ＰＣＲ生成物に適した長さ（例：約３０から３０００塩基対（ｂｐ）、約３０〜２０００ｂｐ、約３０〜１０００ｂｐ）、鎖長範囲５０〜６００ｂｐのＤＮＡフラグメント、鎖長範囲１００〜３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントおよびヒトゲノムＤＮＡ（例：約１０キロ塩基対（Ｋｂ）からギガ塩基対（Ｇｂ）の単位）を制限なく含む。したがって、用語「核酸」が単一の核酸、さらには、たとえば発現された配列タグまたは遺伝子フラグメントなどの小さなフラグメント、さらには個々の遺伝子および染色体全体までをも含むゲノム材料によって例示されるようなより大きな鎖の状態である天然または人工的ヌクレオチド、ヌクレオシドの延伸、その組み合わせを包含することが認識されるであろう。本願で用いる用語「低分子量（ＬＭＷ）ＤＮＡ」は、種々の実施形態において約２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４０００ｂｐ、３５０ｂｐまたは３００ｂｐ未満の鎖長を有するＤＮＡフラグメントを意味する。本願で用いる用語「高分子量（ＨＭＷ）ＤＮＡ」は、種々の実施形態において、約３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、または１００ｋｂ超の鎖長を有するＤＮＡフラグメントを意味する。一部の実施形態においては、用語「高分子量ＤＮＡ」は３０００ｂｐまたはそれ以上、２０００ｂｐまたはそれ以上、１０００ｂｐまたはそれ以上、８００ｂｐまたはそれ以上、６００ｂｐまたはそれ以上、５００ｂｐまたはそれ以上、４００ｂｐまたはそれ以上、または３５０ｂｐまたはそれ以上のサイズ範囲のＤＮＡを意味する一方；用語「低分子量ＤＮＡ」は３０００ｂｐまたはそれ以下、２０００ｂｐまたはそれ以下、１０００ｂｐまたはそれ以下、８００ｂｐまたはそれ以下、６００ｂｐまたはそれ以下、５００ｂｐまたはそれ以下、４００ｂｐまたはそれ以下、３５０ｂｐまたはそれ以下、または３００ｂｐまたはそれ以下のサイズ範囲のＤＮＡを意味する。一部の実施形態においては、用語低分子量ＤＮＡは、母親の循環（例：血液）中に存在する胎児ＤＮＡを意味する一方、用語高分子量ＤＮＡは母体ＤＮＡを意味する。

本願で用いる用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、硬質、自立型のほぼモノリス状の構造を含みうる、単一片状の連続的相互連結小孔構造を有する多孔質三次元吸着材料を意味する。モノリスは、たとえば、前駆体を所望の形態の型に入れて注型、焼結または重合することにより作製される。用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、その中で最終生成物が個々の吸着剤粒子を含む、ベッド構造に充填されるかまたは多孔質マトリクスに包埋される個々の吸着剤粒子の集合体と鑑別されるよう意図されている。用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、ろ紙または吸着剤でコーティングされたろ紙などの、吸着繊維または吸着剤でコーティングされた繊維の集合体とも識別されるよう意図されている。

（フィルターおよびピペットチップ）
本発明のフィルターチップシステムは、それによってモノリス結合マトリクスフィルターがピペットチップに挿入される核酸抽出技術を提供する。多孔質モノリス材料は核酸と特異的に結合しかつ硬質、自立型、ほぼモノリス状の構造から構成される。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は核酸親和性を提供する追加的な材料を含まない。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、ガラスフリットなどのガラス基剤のモノリス材料である。一部の実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。ガラスフリットまたは焼結ガラスフリットなどの多孔質モノリス材料の多孔度は用途に依存する。一般に、多孔質モノリス材料は、個々の用途に対する所望のサンプル流量を可能にし、かつ所望のサイズ範囲の核酸を保持することのできる多孔度を持たなければならない。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、２〜４００ミクロン、２〜３００ミクロン、２〜２２０ミクロン、２〜２００ミクロン、２〜１８０ミクロン、２〜１６０ミクロン、２〜１４０ミクロン、２〜１２０ミクロン、２〜１００ミクロン、２〜８０ミクロン、２〜６０ミクロン、２〜４０ミクロン、２〜２０ミクロン、２〜１６ミクロン、２〜１０ミクロン、２〜５．５ミクロン、４〜４００ミクロン、４〜３００ミクロン、４〜２２０ミクロン、４〜２００ミクロン、４〜１８０ミクロン、４〜１６０ミクロン、４〜１４０ミクロン、４〜１２０ミクロン、４〜１００ミクロン、４〜８０ミクロン、４〜６０ミクロン、４〜４０ミクロン、４〜２０ミクロン、４〜１６ミクロン、４〜１０ミクロン、４〜５．５ミクロン、１０〜４００ミクロン、１０〜３００ミクロン、１０〜２２０ミクロン、１０〜２００ミクロン、１０〜１８０ミクロン、１０〜１６０ミクロン、１０〜１４０ミクロン、１０〜１２０ミクロン、１０〜１００ミクロン、１０〜８０ミクロン、１０〜６０ミクロン、１０〜４０ミクロン、１０〜２０ミクロン、１０〜１６ミクロン、１６〜４００ミクロン、１６〜３００ミクロン、１６〜２２０ミクロン、１６〜２００ミクロン、１６〜１８０ミクロン、１６〜１６０ミクロン、１６〜１４０ミクロン、１６〜１２０ミクロン、１６〜１００ミクロン、１６〜８０ミクロン、１６〜６０ミクロン、１６〜４０ミクロン、４０〜４００ミクロン、４０〜３００ミクロン、４０〜２２０ミクロン、４０〜２００ミクロン、４０〜１８０ミクロン、４０〜１６０ミクロン、４０〜１４０ミクロン、４０〜１２０ミクロン、４０〜１００ミクロン、４０〜８０ミクロン、４０〜６０ミクロン、１００〜４００ミクロン、１００〜３００ミクロン、１００〜２２０ミクロン、１００〜２００ミクロン、１００〜１８０ミクロン、１００〜１６０ミクロン、１００〜１４０ミクロン、１００〜１２０ミクロン、１６０〜４００ミクロン、１６０〜３００ミクロン、１６０〜２２０ミクロン、１６０〜２００ミクロン、１６０〜１８０ミクロン、２００〜４００ミクロン、２００〜３００ミクロン、または２００〜２２０ミクロンの範囲の多孔度（すなわち平均孔径）を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。他の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、異なる多孔度を有する２つの区分を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。各区分は上記の範囲の多孔度（例：４〜１０ミクロン区分と１６〜４０ミクロン区分、または１６〜４０ミクロン区分と１００〜１６０ミクロン区分）を有しうる。

一部の実施形態においては、フィルターは１〜３０ｍｍ、１〜２５ｍｍ、１〜２０ｍｍ、１〜１５ｍｍ、１〜１０ｍｍ、１〜８ｍｍ、１〜６ｍｍ、１〜４ｍｍ、２〜３０ｍｍ、２〜２５ｍｍ、２〜２０ｍｍ、２〜１５ｍｍ、２〜１０ｍｍ、２〜８ｍｍ、２〜６ｍｍ、２〜４ｍｍ、４〜３０ｍｍ、４〜２５ｍｍ、４〜２０ｍｍ、４〜１５ｍｍ、４〜１０ｍｍ、４〜８ｍｍ、４〜６ｍｍ、６〜３０ｍｍ、６〜２５ｍｍ、６〜２０ｍｍ、６〜１５ｍｍ、６〜１０ｍｍ、６〜８ｍｍ、８〜３０ｍｍ、８〜２５ｍｍ、８〜２０ｍｍ、８〜１５ｍｍ、８〜１０ｍｍ、１０〜３０ｍｍ、１０〜２５ｍｍ、１０〜２０ｍｍ、１０〜１５ｍｍ、１５〜３０ｍｍ、１５〜２５ｍｍ、１５〜２０ｍｍ、２０〜３０ｍｍ、２０〜２５ｍｍ、または２５〜３０ｍｍの範囲の厚さを有する。

一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、核酸親和性を有する１つまたはそれ以上の材料によって修飾されうる。

一部の実施形態においては、フィルターは多孔質ガラスモノリス、多孔質ガラス−セラミック、または多孔質モノリスポリマーから作製される。一部の実施形態においては、多孔質ガラスモノリスは、その全文を参照文献として本願に援用する米国特許第４，８１０，６７４号および第４，７６５，８１８号に記載のゾル−ゲル法を用いて生成される。多孔質ガラス−セラミックは、多孔質ガラスモノリスの制御結晶化によって作製しうる。好ましい実施形態においては、多孔質ガラスモノリス、多孔質ガラス−セラミック、または多孔質モノリスポリマーは、その抗体に対する親和性を改善するためにポリヌクレオチドまたは抗体といった何らかの追加的材料によってコーティングされるかまたはこれが包埋されることはない。

多孔質モノリスポリマーは、最近１０年間に開発された材料の新たな分類である。非常に小さなビーズから構成されるポリマーと対照的に、モノリスは、単純な成形工程を用いて作製された単一の連続的なポリマー片である。

一部の実施形態においては、フィルターは液状サンプルがそこを通過しうる微細孔質ガラスフリットを材料として作製される。多孔質ガラスフリットは、その核酸に対する親和性を改善するためにポリヌクレオチドまたは抗体といった何らかの追加的材料によってコーティングされるか、またはこれが包埋されることはない。核酸を精製することに適した基剤は、ホットプレスでビーズを圧縮して単一のモノリス構造を形成することによって形成される焼結ガラスを材料として作製される多孔質ガラスフリットを含む。フリットの均一な構造は、フリット内部での予測可能な液状物の流動を提供し、かつサンプルが流れるにつれて溶離液が同様の流体力学を有することを可能とする。予測可能な液状物の流動は、溶離プロセス時に高い回収率を提供する。

一部の実施形態においては、フィルターはピペットチップ内に配置される。フィルターはカラム、シリンジ、または体積および形状の異なる他のハウジングに嵌合される。本願に記載の方法は、マニュアルまたは自動ピペット、シリンジポンプ、手持ちシリンジを含む多様なデバイス、または液状物をフィルターを通過して移動させるための他の種類の自動化またはマニュアル法を用いて遂行することができる。

一部の実施形態においては、フィルターはサンプル中の異物から核酸をほぼ分別するよう設計される。本願で用いる「異物」は、サンプル中の核酸とは異なるすべての材料を意味する。そのような異物の例は、タンパク質、デンプン、脂質、金属イオン、および膜フラグメントおよび他の細胞性物質といったより大きな細胞構造物を含むが、これに限定されない。本願で用いる語句「ほぼ分別する」は、一部の実施形態において、異物に対して少なくとも３０％の純度の核酸を提供する、より具体的な実施形態においては異物に対して少なくとも５０％または６０％の純度の核酸を提供する、さらにより具体的な実施形態においては異物に対して少なくとも７０％または８０％の純度の核酸を提供する、さらにより具体的な実施形態においては異物に対して少なくとも９０％または９５％の純度の核酸を提供する、かつさらにより一層具体的な実施形態においては異物に対して少なくとも９７％または９９％の純度の核酸を提供する分別を意味する。本願で用いるところの、異物に対して少なくとも３０％の純度の核酸は、核酸対異物材料の重量比が３０：７０またはそれ以上である核酸試料を意味する。同様に、異物に対して少なくとも９９％の純度の核酸は、核酸対異物材料の重量比が９９：１またはそれ以上である核酸試料を意味する。

ここで図１Ａに言及すると、ピペットチップデバイス１００の実施形態はハウジング１０、および核酸をそのような核酸を含有する液状物からほぼ除去することのできるモノリス多孔質フィルター２０を含む。一部の実施形態においては、フィルター２０は均一な多孔度を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。他の実施形態においては、フィルター２０は、相異なる多孔度を有する２つの区分を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットであって、より大きな孔径を有する区分がより小さな孔径を有する区分よりもピペット入口に近く排置されることを特徴とする。これらすべての実施形態において、ガラスフリットは、その抗体に対する親和性を改善するためにポリヌクレオチドまたは抗体といった何らかの追加的材料によってコーティングされたり、あるいはこれが包埋されたりすることはない。

ピペットチップ１００は、サンプル源からそこに核酸材料を流すためのピペットチップ入口または開口部１６を含む。ハウジング１０は、ピペッティングデバイスを受容するよう採用される遠位開口部１４と入口１６の間の中空チャンバー１２によって規定される。ハウジング１０の形状およびサイズは具体的に制限されていない。好ましいハウジングの形態は、操作中の流動ベクトルがほぼ直線状であり、これにより非円筒形形態に伴って起こりうる希釈洗浄を最小化または回避するよう、ほぼ円筒形である。一部の実施形態においては、ハウジング１０は約０．１μＬから約５０ｍＬ、約１０μＬから約５０ｍＬ、約１００μＬから約５０ｍＬ、約１ｍＬから約５０ｍＬ、約２ｍＬから約５０ｍＬ、約５ｍＬから約５０ｍＬ、約１０ｍＬから約５０ｍＬ、約２０ｍＬから約５０ｍＬ、約０．１μＬから約２０ｍＬ、約１０μＬから約２０ｍＬ、約１００μＬから約２０ｍＬ、約１ｍＬから約２０ｍＬ、約２ｍＬから約２０ｍＬ、約５ｍＬから約２０ｍＬ、約１０ｍＬから約２０ｍＬ、約０．１μＬから約１０ｍＬ、約１０μＬから約１０ｍＬ、約１００μＬから約１０ｍＬ、約１ｍＬから約１０ｍＬ、約２ｍＬから約１０ｍＬ、約０．１μＬから約５ｍＬ、約１０μＬから約５ｍＬ、約１００μＬから約５ｍＬ、約１ｍＬから約５ｍＬ、約０．１μＬから約２ｍＬ、約１０μＬから約２ｍＬ、約１００μＬから約２ｍＬ、約１ｍＬから約２ｍＬ、約０．１μＬから約１ｍＬ、約１０μＬから約１ｍＬ、約１００μＬから約１ｍＬ、約０．１μＬから約１００μＬまたは約１０μＬから約１００μＬの体積を有する。他の実施形態においては、ハウジング１０は約０．１ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．５ｍＬ、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約５ｍＬ、約１０ｍＬ、約２０ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬまたは約５０ｍＬの体積を有する。これ以降用いるハウジング１０の体積は「チップ体積」とも呼ばれる。

ハウジング１０に適した材料は具体的には制限されず、かつプラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリスチレンなど）、ガラスおよびステンレスを含む。

サンプルフィルター２０はハウジング１０内の任意の位置に配置しうる。一部の実施形態においては、サンプルフィルター２０は、サンプルが入口１６を経てハウジング１０に取り込まれた直後に濾過されるよう、入口１６に近い近傍に配置される。１つの実施形態においては、サンプルフィルター２０は入口１６に隣接する。他の実施形態においては、サンプルフィルター２０は入口１６から０〜６０ｍｍ、０〜４０ｍｍ、０〜３０ｍｍ、０〜２０ｍｍ、０〜１０ｍｍ、５〜６０ｍｍ、５〜４０ｍｍ、５〜３０ｍｍ、５〜２０ｍｍ、５〜１０ｍｍ、１０〜６０ｍｍ、１０〜４０ｍｍ、１０〜３０ｍｍ、１０〜２０ｍｍ、２０〜６０ｍｍ、２０〜４０ｍｍ、２０〜３０ｍｍ、３０〜６０ｍｍまたは４０〜６０ｍｍの距離で離れている。他の実施形態においては、サンプルフィルター２０は入口１６から６０〜１２０ｍｍ、６０〜１００ｍｍ、６０〜８０ｍｍ、８０〜１２０ｍｍ、８０〜１００ｍｍまたは１００〜１２０ｍｍの距離で離れている。さらに他の実施形態においては、サンプルフィルター２０は入口１６から６０〜８０ｍｍ、たとえば約７５ｍｍの距離で離れている。サンプルフィルター２０は、目的の核酸の分離に適した多孔度を有しうる。一部の実施形態においては、サンプルフィルター２０は４〜５．５ミクロン、４〜１６ミクロン、１６〜４０ミクロン、４０〜１００ミクロン、１００〜１６０ミクロンまたは２〜２２０ミクロンの平均孔径を有する。

一部の実施形態においては、フィルター２０は２つまたはそれ以上のサブフィルターを有する。図１Ｂは、サブフィルター２２および２４を含むフィルター２０を有するピペットチップ１００の実施形態を示す。一部の実施形態においては、サブフィルター２２および２４は相異なる多孔度を有しかつサブフィルター間の空隙と縦一列に配置される。他の実施形態においては、サブフィルター２２および２４はサブフィルター間に全く空隙を伴うことなく互いに隣接して配置される（図１Ｂ）。さらに他の実施形態においては、サブフィルター２２および２４は互いに融着され、相異なる多孔度の２つの区分（２２および２４）を有するモノリス構造２０を形成する。典型的には、より大きな孔径のフィルターまたはフィルター区分はピペットチップ入口１６により近く排置される。より孔径の大きなフィルターをピペットチップ入口により近く配置することは、より小さな空隙がサンプル材料によって目詰まりすることを回避するためのプレフィルターを提供することに寄与すると考えられている。

一部の実施形態においては、サブフィルター２２は約８０〜２００ミクロン、好ましくは１００〜１６０ミクロンの孔径を有し、かつサブフィルター２４は約８〜８０ミクロン、好ましくは１６〜４０ミクロンの孔径を有する。一部の実施形態においては、サブフィルター２２は約８〜８０ミクロン、好ましくは１６〜４０ミクロンの孔径を有し、かつサブフィルター２４は約２〜１６ミクロン、４〜１０ミクロンまたは４〜５．５ミクロンの孔径を有する。

１つの実施形態においては、フィルター２０は約１ｍｍと約２０ｍｍの間の厚さを有する。他の実施形態においては、フィルター２０は約２ｍｍと約１０ｍｍの間の厚さを有し、他の実施形態においては、フィルター２０は約２ｍｍと約６ｍｍの間の厚さを有する。さらに他の実施形態においては、フィルター２０は約４ｍｍの厚さを有する。

一部の実施形態においては、ピペットチップ１００は、第２の開口部１６とサンプルフィルター２０の間に配置されたプレフィルター３０をさらに含む（図１Ｃ）。プレフィルター３０は、サンプルフィルター２０の孔径よりも大きな孔径を有し、かつ核酸と特異的に結合しない。さらに他の実施形態においては、ピペットチップ１００は、第１の開口部１４の近傍にポンピングデバイスからの汚染を防止するためのエアロゾルフィルター４０を収容する（図１Ｄ）。

（サンプル調製、結合、洗浄および溶離条件）
サンプル調製手順は、典型的には、細胞、細菌またはウイルスといった元の宿主から目的の核酸を遊離させる溶解手順を含む。細胞またはウイルス構造の溶解は、化学的（例：ＮａＯＨまたはチオシアン酸グアニジン）、機械的（例：ガラスビーズまたは超音波処理）、または物理的（例：凍結−解凍サイクル）に遂行することができる。組織サンプルについては、溶解手順の前に酵素消化手順を採用しうる。溶解したサンプルは、その後核酸の分離のために本願のモノリスフィルターに装填される。図２Ａ〜２Ｄは本願のピペットチップ１００を用いて核酸を精製する典型的なプロセスを示す。初めに、サンプル材料を、サンプル中の核酸がフィルター２０上に保持されるよう内容物を濾過しながら、フィルター２０を経てピペット器具に通過させる（または流す）。好ましくは、サンプル材料はフィルター２０を経て入口１６に向かって戻した後、結合効率を改善するためにフィルター２０を経て複数回往復させる（例：２〜５回、２〜１０回、２〜２５回、２〜２０回、５〜１０回、５〜１５回、５〜２０回、１０〜１５回、１０〜２０回または１５〜２０回）。一部の例においては、サンプル材料はフィルター２０を経て少なくとも２回、５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回またはそれ以上往復させる。典型的には、流動物はフィルターを通過して第１の方向に流れた後、対応するフィルターを横切って第１の方向と反対の方向に流れ、少なくとも２回フィルターを通過したフロースルー分画をもたらす（図２Ａ）。

核酸は、適切な結合バッファーを用いてフィルターと結合させうる。結合の標的（例：ＨＭＷ ＤＮＡ、ＬＭＷ ＤＮＡまたはその両者）に応じて、１つまたはそれ以上のカオトロピック剤および／またはそのカオトロピック塩の濃度を調節することによって適切な結合条件を達成することができる。典型的なカオトロピック剤は、尿素、チオ尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムおよび過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピック塩；ブタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールなどの脂肪族アルコール；フェノールおよびその他のフェノール化合物；アルギニン、および塩化マグネシウムを含むが、これに限定されない。典型的なカオトロピック塩はチオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、尿素およびチオ尿素を含む。

一部の実施形態においては、結合バッファーは第１の手順においてＨＭＷおよびＬＭＷ ＤＮＡの両者の選択されたフィルターとの結合を促進するために利用され、イソプロパノールなどの脂肪族アルコールが約１７％から約２５％、好ましくは約２０％から約２４％（至適＝２２．５％）の間の範囲で提供され、かつイソチオシアン酸グアニジンおよび／または塩酸グアニジンなどのカオトロピック塩が約０．５Ｍから約４．０Ｍ、好ましくは約１．０Ｍから約２．５Ｍ（至適＝１．８Ｍ）の間の範囲で提供されることを特徴とする。ＨＭＷ ＤＮＡの選択されたフィルターとの選択的結合を促進するために、イソプロパノールなどの脂肪族アルコールは約０％から約１０％、好ましくは約４％から約６％（至適＝４．７％）の間の範囲で提供されかつイソチオシアン酸グアニジンおよび／または塩酸グアニジンなどのカオトロピック塩は約１．０Ｍから約４．０Ｍ、好ましくは約３．０Ｍから約４．０Ｍの間の範囲で提供されうる。回収されたＬＭＷ ＤＮＡの選択されたフィルターとの結合（および濃縮）を促進するために、イソプロパノールなどの脂肪族アルコールは約１０％から約２５％、好ましくは約１５％から約２０％（至適＝１７．７％）の間の範囲で提供されかつイソチオシアン酸グアニジンおよび／または塩酸グアニジンなどのカオトロピック塩は約１．０Ｍから約５．０Ｍ、好ましくは約２．０Ｍから約４．０Ｍ（至適＝３．３Ｍ）の間の範囲で提供されうる。

次の手順では（図２Ｂ）、フィルター２０を洗浄バッファーで洗浄してフィルターと特異的に結合しない材料を除去する。手順１のそれと同様、洗浄バッファーは、フィルター２０を経て少なくとも１回、５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回またはそれ以上往復させる。一部の実施形態においては、フィルター２０は次の手順の前に単一の洗浄バッファーで洗浄する。他の実施形態においては、フィルター２０は次の手順の前に２つまたはそれ以上の洗浄バッファーで洗浄する。この手順は、一部の実施形態では必要とされないこともある任意の手順である。

洗浄手順は、核酸抽出物または分画中に存在する外来性の未結合材料を除去する。洗浄バッファーの例は、グアニジン、酢酸ナトリウム、およびエタノールを含有するバッファー、トリスおよびエタノール、アセトン、エタノール、アセトンとエタノールの混合物を含有するバッファー、およびフィルターを乾燥するために容易に蒸発する他の溶媒を含むが、これに限定されない。

次の手順においては（図２Ｃ）、フィルター２０はフィルターに空気を１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００回またはそれ以上通過させることにより乾燥する。この手順は、フィルター２０から余剰の液状物を除去しかつ結合した核酸をより小さな体積で溶離することを可能とする。結合および／または洗浄手順からの残余の溶媒はＰＣＲといった後続の反応に好ましくない影響を及ぼしうるので、この手順ではそうした残余の溶媒も除去する。この手順は、一部の実施形態では必要とされないこともある任意の手順である。

次の手順においては（図２Ｄ）、フィルター２０に結合した核酸が溶離バッファーによってフィルターから溶離される。溶離バッファーはフィルター２０を経て少なくとも２回、５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、または少なくとも２０回またはそれ以上往復させる。

核酸は、適切な溶離バッファーを用いてフィルターから溶離させうる。適切な溶離条件は溶離バッファーを添加することにより達成することが可能であり、溶離バッファーの例は１ｍＭ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、または好ましくはｐＨが６．５を上回る任意の低塩バッファーまたは水を含むが、これに限定されない。

一つの実施形態においては、本願に記載の方法は１）大きな体積のサンプルからある範囲のＤＮＡフラグメント長の分離；および２）一定のサイズ範囲内のＤＮＡフラグメントの選択的分離を可能にする。

ピペットチップ内にモノリス結合マトリクスを包埋することにより、困難な種類のサンプルから核酸を精製するために必要とされる抽出プロセスおよび機器の使用が大きく簡素化される。結合マトリクスの幾何学的配置および多孔度は、全体積が０．１から５０ｍＬの範囲のピペットチップ内部で核酸結合のための大きな表面積を提供しながら、流動抵抗または目詰まりを最小化するよう個別に調節される。したがってマトリクスは、低圧を用いてサンプルをその中を通して移動させることができるので、微小流動に適している。サンプル吸引および分注時の二方向流動は、至適な核酸回収および溶離のためのサンプル抽出とマトリクス結合の間の滞留時間の延長を可能とし、かつ単一のフィルターチップ内で目詰まりすることなく比較的大きなサンプル体積を処理することを可能とする。ピペットチップフォーマットは、サンプル数が少ないかまたはリソースが限られている環境において有用な手持ちピペットから、多数のサンプルを同時に処理することのできる大量液状物操作システムまでの、液状物を吸い上げる任意のデバイスに対して汎用的である。

（高分子量核酸からの低分子量核酸の分別）
１つの態様においては、本願は、低分子量（ＬＭＷ）核酸（例：胎児核酸）および高分子量（ＨＭＷ）核酸（例：母体核酸）の両者を含有するサンプルから、ＬＭＷ核酸および／またはＨＭＷ核酸と特異的に結合する１つまたはそれ以上のフィルターを用いてＬＭＷ核酸および／またはＨＭＷ核酸を濃縮および分別するための方法を提供する。方法は、ＬＭＷ核酸およびＨＭＷ核酸の両者と結合する第１のフィルターにサンプルを通し、第１のフィルターから結合した核酸を回収し、ＨＭＷ核酸の第２のフィルターとの結合が可能な条件下で回収した核酸を第２のフィルターに通してフロースルー分画を生成する手順であって、フロースルー分画がＬＭＷ核酸を含有することを特徴とする手順を含む。一部の実施形態においては、方法は、第２のフィルターからＨＭＷ核酸を溶離させ、その後ＬＭＷ核酸の第２のフィルターとの結合を可能とする条件下でＬＭＷ核酸を含有するフロースルー分画を第２のフィルターに通し、さらに第２のフィルターからＬＭＷ核酸を溶離させる手順をさらに含む。代替的に、方法は、ＬＭＷ核酸の第３のフィルターとの結合を可能とする条件下でＬＭＷ核酸を含有するフロースルー分画を第３のフィルターに通し、さらに第３のフィルターからＬＭＷ核酸を溶離させる手順をさらに含みうる。一部の実施形態においては、第１および第２のフィルターは同じフィルターである。他の実施形態においては、第１のフィルターおよび／または第２のフィルターは相異なる多孔度の２つのサブフィルターをそれぞれ含む。一部の実施形態においては、サブフィルターは互いに離れて配置される。他の実施形態においては、サブフィルターはサブフィルター間に全く空隙を伴うことなく互いに隣接して配置される。さらに他の実施形態においては、サブフィルターは互いに融着されて相異なる多孔度の２つの区分を有する単一のモノリス構造を形成する。他の実施形態においては、第１および第２のフィルターは相異なる多孔度の２つのサブフィルターを有する同じフィルターである。

一部の実施形態においては、上記の方法（すなわちサイズ排除または濃縮に基づくＤＮＡの分別）は、通常は体積の大きい臨床サンプルからの無細胞ＤＮＡの分離において用いられる。そのような臨床サンプルの例は、妊婦由来のサンプル（母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡの分別を目的とする）、癌患者由来のサンプル（腫瘍ＤＮＡからの正常ＤＮＡの分別を目的とする）、移植患者由来のサンプル（ドナーＤＮＡからの宿主ＤＮＡの分別を目的とする）を含むが、これに限定されない。一部の他の実施形態においては、上記の方法はＮｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施する前のライブラリー作成プロトコルにおいて、または腎臓サンプルからの感染症の分離を目的として用いられる。

一部の実施形態においては、方法は血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するために用いられる。具体的には、方法はＨＭＷ核酸（例：母体核酸）およびＬＭＷ核酸（例：胎児核酸）の両者の捕捉および濃縮のために規定された孔径を有するフィルターを利用する。この後、ＨＭＷ核酸の捕捉（および溶離）およびＬＭＷ胎児核酸の保持および濃縮を実施する。

好ましい実施形態においては、ピペットチップ内でサンプルをピペッティングすることによって、サンプルがフィルターに装填されかつフィルターから溶離できるよう、フィルターはピペットチップの内部に配置される。ピペットチップフォーマットは、高スループット処理能力を提供する多様な液状物操作機器の自動化に適合しやすい。

１つの具体的な実施形態においては、方法は：ａ）胎児核酸および母体核酸の両者が第１のモノリスガラスフリットに結合することを可能とする条件下で、胎児核酸および母体核酸を含む血漿サンプルを第１のモノリスガラスフリットを含む第１のピペットチップの内部体積内に流すこと、（ｂ）第１の溶離バッファーを第１のモノリスガラスフリット内に流して結合した核酸を溶離させること、（ｃ）母体核酸の第２のモノリスガラスフリットとの結合および溶離した核酸のフロースルー分画を捕集することに好都合な条件下で、溶離した核酸を第２のモノリスガラスフリットを含む第２のピペットチップ内に流すこと、（ｄ）結合した母体核酸を第２のピペットチップから溶離させること、（ｅ）胎児核酸の第２のモノリスガラスフリットとの結合に好都合な条件下でフロースルー分画を再度第２のチップの内に流すこと、および（ｆ）胎児核酸を第２のモノリスガラスフリットから溶離させることを含む。

サンプルは、相異なるサイズの核酸を含有する任意の液状サンプルとすることができる。方法は、一方のサイズ範囲（例：５０〜６００ｂｐ）の核酸を他方のサイズ範囲（例：６００ｂｐより長い）の核酸から分別することを可能とするよう最適化することができる。一部の実施形態においては、サンプルは血液、血漿、尿、唾液、リンパ液または脊髄液などの体液サンプルである。具体的な実施形態においては、サンプルは妊婦に由来する血漿サンプルである。

用語「ＬＭＷ核酸」および「ＨＭＷ核酸」は、母体血液または血漿からの胎児ＤＮＡ抽出の文脈において用いられるとき、２種類の相異なるサイズ群の核酸を意味する。「ＬＭＷ核酸」群の核酸は「ＨＭＷ核酸」群の核酸よりも小さなサイズを有する。一部の実施形態においては、用語「ＬＭＷ核酸」は１０００ｂｐまたはそれ以下の核酸を意味しかつ用語「ＨＭＷ核酸」は１０００ｂｐよりも大きな核酸を意味する。他の実施形態においては、用語「ＬＭＷ核酸」は８００ｂｐまたはそれ以下の核酸を意味しかつ用語「ＨＭＷ核酸」は８００ｂｐよりも大きな核酸を意味する。他の実施形態においては、用語「ＬＭＷ核酸」は６００ｂｐまたはそれ以下の核酸を意味しかつ用語「ＨＭＷ核酸」は６００ｂｐよりも大きな核酸を意味する。

典型的な実施形態においては、方法は血漿サンプル中の母体ＤＮＡ（典型的には６００ｂｐよりも大きい）から胎児ＤＮＡ（典型的には６００ｂｐよりも小さい）を分離するために用いられる。方法の第１の手順は、より濃いサンプルが目詰まりすることなくマトリクスを流れることを可能とする多孔度、およびより小さなフラグメントの至適な結合を可能とする厚さを有する第１のガラスフリットフィルターを収容する１〜５０ｍＬの第１のピペットチップを利用する。一部の実施形態においては、第１のピペットチップは約２０ｍＬ、約１０ｍＬ、約５ｍＬ、約２ｍＬ、約１ｍＬ、約０．５ｍＬまたは約０．１ｍＬのチップ体積を有する。適切な血漿サンプル体積は約１から約２０ｍＬの間である。一部の例においては、処理するサンプルの体積を増加させるためにサンプルを複数のピペットチップ（例：２〜４個）に分配しうる。チップはモーター駆動ピペットフィラーと共に用いてもよく、本願に記載の方法は、シリンジポンプ、手持ちシリンジを含む多様なデバイス、または液状物をガラスフリットまたは他の種類のフィルターを通して移動させるための他の種類の自動化またはマニュアル法を用いて遂行することができる。十分に大きなフィルターを収容できる寸法である限り、種々の体積およびデザインのカラム、シリンジまたは他のフィルター用ハウジングも採用することができる。一部の実施形態においては、第１のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有する。他の実施形態においては、第１のガラスフリットフィルターは１００〜１６０ミクロンの孔径を有する第１の区分および１６〜４０ミクロンの孔径を有する第２の区分を有する融着フィルターである。さらに他の実施形態においては、第１のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有する第１の区分および４〜５．５ミクロンまたは４〜１０ミクロンの孔径を有する第２の区分を有する融着フィルターである。第１のガラスフィルターは２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍの厚さ、および５〜１０ｍｍ、好ましくは７〜８ｍｍの直径を有しうる。１つの実施形態においては、チップはアダプターによりモーター駆動ピペットフィラーに着接される。この設定は、上記の結合、洗浄、乾燥および溶離手順を用いた１０〜２０ｍＬの血漿からの胎児核酸の抽出に用いうる。

第一のガラスフリットフィルターについての結合条件は、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡの両者のフィルターへの結合について最適化される。一部の実施形態においては、結合混合物は、プロテイナーゼＫのような酵素、Ｔｒｉｔｏｎ、ＳＤＳ、およびＴｗｅｅｎなどの界面活性剤およびグアニジンなどの変性剤、および／またはグアニジン、イソプロパノールおよび酢酸ナトリウムといった所望のサイズ範囲のＤＮＡのフィルターとの結合を促進する試薬を含んだ、血漿、細胞材料および血漿中に存在する他のタンパク質の消化、可溶化および変性のための試薬を含む。一部の実施形態においては、結合混合物は、１７〜２５％ｖ／ｖ、好ましくは約２２．５％ｖ／ｖの最終濃度のイソプロパノールまたはエタノール、および約０．５〜４Ｍ、好ましくは１．８Ｍの最終濃度のイソチオシアン酸グアニジンおよび／または塩酸グアニジンを含有する。そのような結合混合物は、結合混合物中の胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡの両者が第１のガラスフリットフィルターと結合することを可能とする。胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡのフィルターとの結合のために１ラウンドまたはそれ以上の間、結合混合物に第１のガラスフリットフィルターを両方向に通過させた後（すなわち一方の方向にフィルターを通過してピペットチップ内に入りさらにもう一方の方向に通過してピペットチップ外に出る）、結合したＤＮＡを溶離バッファーで第１のフィルターから溶離させる。一部の実施形態においては、第１のフィルターは洗浄バッファーで１回またはそれ以上洗浄される。胎児および母体ＤＮＡの両者を含有する結合したＤＮＡの溶離。一部の実施形態においては、結合したＤＮＡは０．０１〜５ｍＬ、０．０１〜２．５ｍＬ、０．０１〜１ｍＬ、０．０１〜０．５ｍＬ、０．０１〜０．２５ｍＬ、０．０１〜０．１ｍＬ、０．０１〜０．０５ｍＬ、０．０５〜５ｍＬ、０．０５〜２．５ｍＬ、０．０５〜１ｍＬ、０．０５〜０．５ｍＬ、０．０５〜０．２５ｍＬ、０．１〜５ｍＬ、０．１〜２．５ｍＬ、０．１〜１ｍＬ、０．１〜０．５ｍＬ、０．１〜０．２５ｍＬ、０．２５〜５ｍＬ、０．２５〜２．５ｍＬ、０．２５〜１ｍＬ、０．２５〜０．５ｍＬ、０．５〜５ｍＬ、０．５〜２．５ｍＬ、０．５〜１ｍＬ、１〜５ｍＬ、１〜２．５ｍＬまたは２〜５ｍＬの体積で溶離する。一部の実施形態においては、胎児および母体ＤＮＡを濃縮するために結合したＤＮＡは約０．０５ｍＬから約１ｍＬ、または約０．２５ｍＬから約０．５ｍＬの体積で溶離される。ＤＮＡのサブポピュレーションの濃縮を必要としない用途においては、この手順はＤＮＡ抽出プロセスの最終手順でありかつＤＮＡは典型的には５０〜１００μＬの体積で溶離する。

方法の第２手順は、第１のフィルターから溶離したＤＮＡサンプルからの母体ＤＮＡの除去を包含する。一部の実施形態においては、この手順は第２のガラスフリットフィルターを収容する０．２〜２ｍＬ、好ましくは１ｍＬのピペットチップを用いて遂行される。一部の実施形態においては、第２のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有する。他の実施形態においては、第２のガラスフリットフィルターは４〜４０ミクロンの孔径を有する。他の実施形態においては、第２のガラスフリットフィルターは１００〜１６０ミクロンの孔径を有する第１の区分および１６〜４０ミクロンの孔径を有する第２の区分を有する融着フィルターである。さらに他の実施形態においては、第２のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有する第１の区分および４〜１０ミクロンの孔径を有する第２の区分を有する融着フィルターである。第２のガラスフィルターは２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍの厚さ、および２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍの直径を有しうる。

この手順における結合混合物は、胎児ＤＮＡではなく母体ＤＮＡを第２のガラスフリットフィルターに結合させるために最適化される。一部の実施形態においては、結合混合物は、０〜１０％ｖ／ｖ、好ましくは約４．７％ｖ／ｖの最終濃度のイソプロパノールまたはエタノール、および約１．０〜４．０Ｍ、好ましくは３．４Ｍの最終濃度のイソチオシアン酸グアニジンおよび／または塩酸グアニジンを含有する。母体ＤＮＡのフィルターとの結合のために１ラウンドまたはそれ以上の間結合混合物を第２のガラスフリットフィルターに双方向通過させた後（すなわち一方の方向にフィルターを通過してピペットチップ内に入りさらにもう一方の方向に通過してピペットチップ外に出る）、次の手順のために結合混合物を捕集する。捕集した結合混合物は、このとき第２のフィルターからのフロースルー分画と名付けられ、胎児ＤＮＡを含有しかつ母体ＤＮＡを除去されている。

方法の第３手順は第２のフィルターからのフロースルー分画からの胎児ＤＮＡの分離を包含する。一部の実施形態においては、この手順は第２の手順で用いたものと同じピペットチップを用いて遂行される。これらの実施形態においては、第２の手順からのピペットチップを初めに溶離バッファーで洗浄して第２手順で第２のフィルターと結合した母体ＤＮＡを除去する。洗浄された母体ＤＮＡを含まない第２のフィルターは、次に胎児ＤＮＡの第２のフィルターとの結合に好都合な条件下で胎児ＤＮＡを分離するために用いる。結合した胎児ＤＮＡは、次に第２のフィルターから体積０．０１〜０．１ｍＬの溶離バッファーを用いて溶離させる。他の実施形態においては、第３手順で第３のガラスフリットフィルターを収容する０．２〜２ｍＬ、好ましくは１ｍＬの第３のピペットチップを用いる。一部の実施形態においては、第３のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有する。他の実施形態においては、第３のガラスフリットフィルターは４〜５．５ミクロンまたは４〜１０ミクロンの孔径を有する。他の実施形態においては、第３のガラスフリットフィルターは１００〜１６０ミクロンの孔径を有する第１の区分および１６〜４０ミクロンの孔径を有する第２の区分を有する融着フィルターである。さらに他の実施形態においては、第３のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有する第１の区分および４〜５．５ミクロンまたは４〜１０ミクロンの孔径を有する第２の区分を有する融着フィルターである。第３のガラスフィルターは２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍの厚さ、および２〜６ｍｍ、好ましくは４ｍｍの直径を有しうる。

一部の実施形態においては、胎児ＤＮＡ精製における上記の手順は単一のフィルター（すなわち単一のチップ）を用いて遂行される。胎児および／または母体ＤＮＡの結合は結合バッファーの組成によって制御される（例：結合バッファー１は胎児および母体ＤＮＡの両者のフィルターへの結合を可能とし、結合バッファー２は母体ＤＮＡのフィルターとの結合のみを可能とし、かつ結合バッファー３は胎児ＤＮＡのフィルターとの結合のみを可能とする）。一部の実施形態においては、単一のフィルターは多孔度が相異なる２つの区分を有するフィルターである。

（キット）
本願の他の態様は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するためのキットを提供する。キットは上記の要素の任意の組み合わせを含みうる。１つの実施形態においては、キットは：円錐台形状を有しかつピペッティング機器の末端に契合するよう寸法取りされている１つまたはそれ以上のピペットチップを含む。１つまたはそれ以上のピペットチップは、約１６ミクロンと約４０ミクロンの間の孔径を有する硬質、自立型でほぼモノリスである焼結ガラス構造物を含むフィルターを含む１つのチップを含む。一部の実施形態においては、キットは、条件が０％を上回り１０％未満のアルコールおよび約１．０Ｍから約４．０Ｍの間の範囲のグアニジンを含むことを特徴とする、母体核酸をフィルターに結合させるための条件を提供するよう配合された少なくとも１つの結合バッファー；および条件が約１０〜２５％の範囲のアルコールおよび約１．０Ｍから約５．０Ｍの間の範囲のグアニジンを含むことを特徴とする、胎児核酸をフィルターに結合させるための条件を提供するよう配合された少なくとも１つの結合バッファーをさらに含む。一部の実施形態においては、キットは、焼結ガラス構造物からＤＮＡを溶離するために適切に配合された少なくとも１つの溶離バッファーおよび焼結ガラス構造物と結合しない異物を除去するために適切に配合された少なくとも１つの洗浄バッファーをさらに含む。一部の実施形態においては、１つまたはそれ以上のピペットチップは、その中に配置された２つまたはそれ以上のチップを含む。１つの実施形態においては、１つまたはそれ以上のピペットチップは、相異なる多孔度の２つの区分を有するガラスモノリスフィルターを有するチップを含む。他の実施形態においては、１つまたはそれ以上のピペットチップは多孔度の相異なる２つのフィルターを有するチップであって、一方のフィルターの末端が他方のフィルターの末端と融着されることを特徴とするチップを含む。

（自動フィルターチップシステム）
本願に従った方法を実施する任意の様態を採用することができる。しかし、フィルターチップの特性、適合性、簡素性、およびワークフローは、それが容易に適合化され、自動化され、かつ数多くの臨床サンプルマトリクス、装填サンプル体積、および液状物操作システムに対して有効となることを可能とする。したがって、好ましい実施形態においては、操作の様態はある種の自動化を含む。

一部の実施形態においては、本願は本願のフィルターを用いて液状サンプルから核酸を精製するための自動化法を提供する。方法は、（ａ）自動的に試薬を分注し、サンプル内容物を取出し、かつピペットチップおよび／またはサンプルチューブを移動させることができる自動化ロボットプラットフォームを提供すること；（ｂ）各チップが第１の開口部と第２の開口部の間の流路を規定するハウジング、および流路の一区分を占めるフィルターを含み、フィルターが核酸と特異的に結合するモノリスフィルター材料を含む複数の本願のピペットチップを、ロボットプラットフォームに装填すること；（ｃ）液状サンプルの少なくとも一部分が、その一部分に含まれる核酸がフィルター材料を通過しかつこれと結合するよう、第１の開口部を経てハウジング内に汲み上げられることを特徴とする、核酸を含む液状サンプルのその一部分をピペットチップに流し入れること；（ｄ）液状サンプルのその一部分がピペットチップ外に出る間にフィルターを２回目に通過することを特徴とする、液状サンプルのその一部分を第１の開口部を経てピペットチップから排除すること；（ｅ）溶離バッファーがピペットチップに出入りする間にフィルターを通過することを特徴とする、溶離バッファーを第一の開口部からピペットチップに流し入れかつその溶離バッファーを第１の開口部を経てピペットチップから排除することによって核酸をフィルターから溶離させること；および（ｆ）複数のピペットチップのそれぞれにおいて手順（ｃ）〜（ｅ）を繰り返すことを含む。

さらなる実施形態においては、洗浄バッファーがピペットチップに出入りする間にフィルターを通過するよう洗浄バッファーを第１の開口部からピペットチップに流し入れかつその洗浄バッファーを第１の開口部を経てピペットチップから排除することによってフィルターが洗浄されることを特徴とする、洗浄手順が含まれる。好ましくは、洗浄手順は複数のピペットチップのそれぞれにおいて複数回反復される。

さらなる実施形態においては、フィルターに空気を複数回通過させることによってフィルターを乾燥することを特徴とする乾燥手順が含まれる。一部の実施形態においては、フィルターはフィルターに空気を１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００回またはそれ以上通過させることによって乾燥する。

一部の実施形態においては、フィルター材料は約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有しかつ／または約２ｍｍから６ｍｍの厚さを有する焼結ガラスフリットを含む。一定の実施形態においては、ピペットチップは、２つまたはそれ以上のフィルターのそれぞれが核酸と特異的に結合することを特徴とする、相異なる多孔度の２つまたはそれ以上のフィルターを含む。

一定の実施形態においては、液状サンプルは母体核酸および胎児核酸を含む血漿サンプルであり、かつ第１のフィルターから遊離された母体および胎児核酸を含む溶離した核酸の一部分は第２のフィルター材料を含む第２のフィルターを含む第２のピペットチップを流れ、母体核酸がピペットチップを通過して第２のフィルター材料と結合しかつ胎児核酸が第２のピペットチップの第２のフィルター材料およびそこから胎児核酸を回収する第１の開口部を通過するよう、溶離した核酸が第２のピペットチップの第１の開口部を経て上下に流れることを特徴とする。

システム、デバイス、および方法は、プログラマブルロジックによって完全自動化または半自動化することができる。操作の１つの様態においては、方法はマルチウェルプレート（例：２４−ウェル、９６ウェルなど）において実施される。自動化液状物操作は試験しようとする混合物を調製するために行う必要のある作業の量を減らすことになるので、混合物はこれを用いて混合することが好ましい。自動サンプリングプロトコルは、技術上既知である装置および方法を用いてロボティクスにより実施することもある。

任意の適切な機械または装置を用いて、自動化精製システムおよびその種々の処理手順にわたってサンプルを移動させうる。たとえば、本願で採用されるシステムは技術上既知である多様なロボティクスを用いてサンプル、試薬、および他のシステム構成要素の移動を自動化することができる。典型的なロボットシステムは、サンプルを１、２、または３軸上で移動させかつ／またはサンプル約１、２、または３軸の周りで回転させる能力を有する。典型的なロボットは工作物の上、下または横に位置しうるトラック上を移動する。典型的には、ロボットコンポーネントは、たとえば工作物を把握しかつ／または移動し、ピペッターを挿入し、試薬を分注し、吸引することなどができるロボットアームなどの機能的コンポーネントを含む。本願で用いる「ロボットアーム」は、好ましくはマイクロプロセッサで制御される、サンプル、試験管またはサンプルを収容するプレートを一方の位置から他の位置に物理的に移動するデバイスを意味する。各位置は自動化精製システムのユニットとすることができる。ロボットアームの制御のためのソフトウェアは、一般に、アームの製造者から入手可能である。

ロボティクスは、たとえば作業領域の上、下、または横などのトラック上に翻訳され、かつ／またはアームが作業領域の異なる位置に到達することを可能とする関節セグメントを含みうる。ロボティクスは、たとえば電気、空気圧または液圧駆動されうる、技術上既知のモーターによって駆動されうる。標準的ＰＬＣプログラミングまたは他の技術上周知の方法といった、任意の適切な駆動制御システムを用いてロボティクスを制御することができる。ロボティクスは、任意に、光学的または機械的に位置および／または力を測定し、かつロボットが所望の位置まで誘導されることを可能にする位置フィードバックシステムを含む。ロボティクスは、任意に、特定の位置を反復的に確保することを可能とする機械的留め具、光学マーカーまたはレーザーガイドなどの位置確定メカニズムも含む。

典型的な自動化サンプリングプロトコルは、たとえば、エッペンドルフｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０、ｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７５、ハミルトンＳＴＡＲｌｅｔ、ＳＴＡＲおよびＳＴＡＲｐｌｕｓ液状物操作ロボットを利用しうる。そのようなプロトコルはＲＮＡ分離、全血からのゲノムＤＮＡ分離および以下にさらに説明するような母体血漿からの胎児ＤＮＡ抽出および濃縮のために改変しうる。

しかし、すべての臨床サンプルはそれぞれ異なり、かつ粘度、粒子、粘液、表面汚染物質、微生物および／またはヒトゲノムバックグラウンドが個々に異なることを認識しなければならない。臨床サンプルの組成および自動化フィルターチップサンプル調製プロトコルの意図される用途に多様性が予測されると仮定すれば、所望の結果を達成するためにフィルターチップ手順のうちある手順を変更することが必要となりうる。たとえば、本願に記載される核酸の純度および／またはフィルターからの回収率は、（１）サンプル混合および溶解バッファー（およびアルコール）によるホモジナイゼーション；（２）流量；（３）サンプル数；（４）洗浄の回数および種類および（５）乾燥といった数多くのパラメーターによって影響されうる。

たとえば（１）に関しては、本願に記載のフィルターチップが比較的大きな孔径を有する一方で、サンプルのホモジナイゼーションおよび液化は効率的な細胞溶解およびその後のフィルターチップマトリクスへの結合手順にとって非常に重要である。均一かつ十分に液化されたライセートがあれば、サンプルをより高い流量でフィルターチップに通過させることも可能であり、これにより全般的なサンプル処理時間が短縮される。以下の大量血漿プロトコルによって説明するように、大きな装填サンプル体積は、困難なサンプルを（オンラインまたはオフラインで）完全にホモジナイズしかつ液化する機会をユーザーに提供するフィルターチップで効率的に処理することが可能であり、装填サンプル体積に対する懸念はわずかに過ぎない。

さらに、総処理時間が長くなるが、核酸結合または溶離時の流量がより遅いと、典型的には高い核酸収率がもたらされることを認識しなければならない。より遅い流量はＤＮＡ剪断の程度も最小化するであろう。

吸引および分注サイクルの至適回数は、サンプルの種類、総サンプル体積、および流量によって異なる。図２Ａの手順１は、相異なる患者に由来する鼻咽頭吸引液の粘度範囲によって最適化がより困難なライセートの１つの典型であるＮＰＡなどのサンプルに伴い、サイクル回数（および流量）がある種の経験的最適化を必要とする典型的な時点である。

フィルターチップマトリクスの完全な乾燥は、残留有機溶媒が精製された核酸サンプルと共溶離して下流の処理または試験を阻害することを防止するために推奨される。フィルターチップは遠心分離または真空濾過では乾燥されないので、流量および乾燥手順のサイクル数を共に最大化することが重要である。時に、乾燥サイクルが完了した後フィルターチップの末端に残留洗浄液の滴が存在する。ハミルトンロボットは、ウェルの側面で「チップタッチ」を実施して滴を除去し、それにより溶媒のない溶離を確保する能力を有する。ｅｐＭｏｔｉｏｎシステムにはこの機能がないが、溶離バッファーでのフィルターチップ末端のプレリンスをプログラムして同じ効果を達成することができる。

幾何学的配置、ピペットチップ材料、およびロボットチャネルアームへの着接法は各機器の製造者に特有であるので、各液状物操作システムに対して相異なるフィルターチップ構造が必要である。フィルターチップマトリクスの寸法（直径、厚さおよび孔径）は、あらゆる固相抽出技術について予測されるように、核酸結合能力（および溶離効率）と相関する。大きな体積のサンプルに対する核酸結合能力を高めかつ／または個々のフィルターチップフォーマット間でマトリクス結合能力を均等化するために厚い（＞４ｍｍ）マトリクスを１ｍＬフィルターチップに包埋しうるが、その一方でフィルターチップの厚さと初回結合手順中の流量の間にトレードオフがある。したがって、自動化プロコルの開始手順には、より大きな体積のピペットチップにより大きな直径のマトリクスを包埋することが時に有益である（例：大量抽出用５ｍＬハミルトン／アコーニＴｒｕＴｉｐｓ（登録商標））。しかし、液状物操作ロボットの製造者が規定する個々のフィルターチップ設定を考えると、フィルターチップの核酸収量が、相異なる製造者の液状物操作プラットフォームまたは相異なるフィルターチップサイズ間で同一であると予測することは合理的でない。自動化フィルターチッププロトコルの臨床的な評価および市販の自動化システムとの直接比較は、他稿で詳細に報告される予定である。

（定義上の）臨床サンプルは、通常は無菌である部位から取得されている場合（例：脳脊髄液）を除き、相当な量のヒトゲノムＤＮＡを含有するであろう。時にヒトゲノムＤＮＡが所望される一方で、他の用途においてヒトＤＮＡは望ましくないゲノムバックグラウンドを意味する。また、所望の核酸が痕跡量で存在する場合はキャリアーの役割を果たすこともある。バックグラウンドＤＮＡの存在は、サンプル中の核酸の総量がマトリクスの結合能力を上回らない限り、通常は問題とならない。

下記の大量血漿抽出プロトコルの場合（図９）、目的は１０〜２０倍過量の母体ＤＮＡの存在下で（フラグメント化）胎児ＤＮＡを分離することであり、これは、配列が高度に一致しかつ特異度の高い分子的試験および／またはサイズ判別によってのみ識別することができることを除いて、感染症検査のサンプル調製の目的と同様である。一部の実施形態においては、総循環ＤＮＡは５ｍＬフィルターチップを用いて分離し、さらにその後の高分子量および低分子量胎児ＤＮＡは、この後で結合バッファー条件を変化させることによる１ｍＬフィルターチップとの結合および溶離によって分別される。シリカモノリスへの標的核酸の結合および溶離特性に基づくその選択的サイズ分別および濃縮は、膜またはサイズ排除スピンカラムによって達成されるものから著しく異なる作業様式である。ヒトゲノムＤＮＡからの微生物ＤＮＡのサイズ分別および濃縮は、フィルターチップ結合および溶離バッファーを個別調節することによって同様に達成しうる。

一旦自動化フィルターチッププロトコルが検証されれば、プロセスに過誤が導入される状況は比較的少ない。しかしながら、誤ったフィルターチップを用いるかまたは誤った試薬トラフに試薬を配置して液状物操作ロボットを設定する可能性もある。一部の実施形態においては、プレフィルド、ホイル密封試薬プレートを提供してそのようなミスを回避する。プレフィルドプレートは自動化手順の複雑度を著しく簡素化し、ピペットチップおよび消耗品の数を減少させ、かつ抽出を実施するために必要なデッキスペースを最小化することができる。その後は、抽出の結果は典型的には初期サンプルの品質を表し、通常の場合低い回収率は抽出における過誤ではなくサンプル劣化（輸送または保管時）と関係する。

本願でさらに説明する自動化プロトコルは、多様な臨床サンプルを処理することに対するフィルターチップマトリクスそれ自体の有用性、および大きな体積および個々の液状物操作ロボット対してそれをどのように適合化できるかを強調する。フィルターチップ手順を自動化するために必要とされる主要なハードウェアは、磁性ロッド、真空システムまたはオンボード遠心分離器よりもむしろピペットチャネルアームそれ自体であるので、本願のフィルターチップシステムの簡素さは、新しい自動化核酸精製システムを購入することに興味を持つ者に対してある程度の費用面の利点をもたらす。フィルターチッププロトコルによってデッキスペースを最小化することにより、上級ユーザーは上流または下流自動化プロセスを本発明のフィルターチップシステムと一体化することもできる。たとえば、全血を分画化するハミルトンのｅａｓｙＢｌｏｏｄソリューションは、自動化フィルターチップ抽出法と組み合わせることが可能であり、これによりバイオバンキングプロセスが著しく能率化されるであろう。核酸定量および正規化などの抽出後プロセス、ＰＣＲ設定およびＤＮＡシークエンシングも、より大きな液状物操作プラットフォームを用いてフィルターチップと容易に一体化される。

本願の態様の１つは、液状サンプルから核酸を精製するための自動化法であって：（ａ）フィルターが核酸と特異的に結合することを特徴としかつ自動化ロボットプラットフォームが自動的に試薬を分注し、サンプル内容物を取出し、およびピペットチップおよび／またはサンプルチップを移動させることができることを特徴とする、各チップが第１の開口部と第２の開口部の間の流路を規定するハウジングおよび流路の一区分を占めるフィルターを含む、複数のピペットチップをロボットプラットフォームに装填すること；（ｂ）核酸がピペットチップを通過しかつその中のフィルターと結合するよう核酸を含む液状サンプルの少なくとも一部をピペットの第１の開口部から流し入れること；（ｃ）液状サンプルのその一部分がピペットチップ外に出る間に２回目にフィルターを通過することを特徴とする、ピペットチップから第１の開口部を経て液状サンプルのその一部分を排除すること；および（ｄ）溶離バッファーがピペットチップに出入りする間にフィルターを通過することを特徴とする、溶離バッファーをピペットチップの第１の開口部から流し入れかつその溶離バッファーを第１の開口部を経てピペットチップから排除することによって核酸をフィルターから溶離させることを含む自動化法に関する。一部の実施形態においては、手順（ｂ）〜（ｄ）は複数のピペットチップのそれぞれにおいて遂行される。

一部の実施形態においては、方法は、洗浄バッファーがピペットチップに出入りする間にフィルターを通過することを特徴とする、洗浄バッファーを第１の開口部を経てピペットチップに流し入れかつその洗浄バッファーを第１の開口部を経てピペットチップから排除することによってフィルターを洗浄する手順をさらに含む。関連する実施形態において、洗浄手順は２回またはそれ以上反復される。

一部の実施形態においては、サンプルを流しかつ排除する手順はすべての液状サンプルが少なくとも１回フィルターを通過するまで反復される。

一部の実施形態においては、フィルターは自立型ガラスフリットを含む。関連する実施形態においては、ガラスフリットは核酸の結合を促進する薬剤によって処理またはコーティングされていない焼結ガラスフリットである。他の関連する実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンと約２２０ミクロンの間の孔径を有しかつ約２ｍｍと約２０ｍｍの間の厚さを有する。

一部の実施形態においては、液状サンプルは母体および胎児核酸を含有する血漿を含む。関連する実施形態においては、ピペットチップは、２つまたはそれ以上のフィルターのそれぞれが核酸と特異的に結合することを特徴とする、多孔度の相異なる２つまたはそれ以上のフィルターを含む。

本願の他の態様は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するための方法であって：（ａ）胎児および母体核酸の第１のフィルターとの結合を可能とする条件下で胎児核酸および母体核酸を含む血漿サンプルを第１のフィルターに流すこと；（ｂ）結合した胎児および母体核酸を第１のフィルターから溶離させて胎児核酸と母体核酸を含む濃縮核酸サンプルを形成すること；（ｃ）母体核酸が第２のフィルターと結合しかつ胎児核酸が第２のフィルターを経て流れることを可能とする条件下で濃縮核酸サンプルを第２のフィルターに流すこと；および（ｄ）第２のフィルターからのフロースルー分画が胎児核酸を含有することを特徴とする、第２のフィルターからのフロースルー分画を捕集することを含む方法に関する。

一部の実施形態においては、手順（ａ）において胎児および母体核酸の第１のフィルターとの特異的結合を可能とする条件は、血漿サンプル、約１７〜２５％（ｖ／ｖ）の間の範囲の脂肪族アルコールおよび約０．５Ｍから約４．０Ｍの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第１の結合混合物を形成することを含む。

一部の実施形態においては、手順（ｃ）における母体核酸の第２のガラスフリットフィルターとの結合のための条件は、濃縮核酸サンプル、約０〜１０％（ｖ／ｖ）の間の範囲の脂肪族アルコールおよび約１Ｍから約４．０Ｍの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第２の結合混合物を形成することを含む。

一部の実施形態においては、方法は：（ｅ１）第２のフィルターから母体核酸を溶離させて再生された第２のフィルターを生成する；（ｆ１）胎児核酸の第２のフィルターとの結合を可能とする条件下で第２のフィルターからのフロースルー分画を再生された第２のフィルターに流す；および（ｈ１）手順（ｆ１）において第２のフィルターから結合した胎児核酸を溶離させる手順を含む。関連する実施形態においては、手順（ｆ１）において胎児核酸を第２のフィルターと結合させるための条件は、第２のガラスフリットフィルターからのフロースルー分画、約１０〜２５％（ｖ／ｖ）の間の範囲の脂肪族アルコールおよび約１Ｍから約５．０Ｍの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第３の結合混合物を形成することを含む。一部の実施形態においては、方法は、（ｅ２）胎児核酸が第１のフィルターと結合することを可能とする条件下で第２のフィルターからのフロースルー分画を第１のフィルターに流す；および（ｆ２）結合した胎児核酸を手順（ｅ２）の第１のフィルターから溶離させる手順をさらに含む。

一部の実施形態においては、第１および第２のフィルターは自立型ガラスフリットである。関連する実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。他の関連する実施形態においては、第１のガラスフリットは１６〜４０ミクロンの孔径を有しかつ第２のガラスフリットフィルターは４〜１０ミクロンの孔径を有する。

一部の実施形態においては、方法は：（ｅ３）胎児核酸が第３のフィルターと結合することを可能とする条件下で第２のフィルターからのフロースルー分画を第３のフィルターに流す；および（ｆ３）結合した胎児核酸を第３のフィルターから溶離させる手順をさらに含む。

一部の実施形態においては、第１および第２のフィルターの一方または両者は、第１の孔径が第２の孔径と異なることを特徴とする、第１の孔径を有する第１の区分および第２の孔径を有する第２の区分を含むガラスフリットを含む。

一部の実施形態においては、第１のフィルターおよび第２のフィルターは同じフィルターである。

本願の他の態様は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分離するためのキットであって：ガラスフリットフィルターが２〜２２０ミクロンの孔径を有しかつ核酸のガラスフリットフィルターとの結合を促進する薬剤によって処理またはコーティングされていないことを特徴とする、自立型ガラスフリットフィルターを含むピペットチップ、血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール約１７〜２５％ｖ／ｖおよび約０．５Ｍから約４．０Ｍの間の濃度のカオトロピック塩を有する第１の結合混合物を提供するよう配合された第１の結合バッファー；および血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール約０〜１０％ｖ／ｖおよび約１Ｍから約４．０Ｍの間の濃度のカオトロピック塩を有する第１の結合混合物を提供するよう配合された第２の結合バッファーを含むキットに関する。

一部の実施形態においては、キットは第１のガラスフリットフィルターを含みかつ０．５〜５０ｍＬのチップ体積を有する第１のピペットチップ；および第２のガラスフリットフィルターを含みかつ０．５〜５０ｍＬのチップ体積を有する第２のピペットチップを含む。関連する実施形態においては、第１のガラスフリットフィルターは１６〜４０ミクロンの孔径を有しかつ第２のガラスフリットフィルターは４〜１０ミクロンの孔径を有する。一部の実施形態においては、ガラスフリットフィルターは第１の孔径を有する第１の区分および第２の孔径を有する第２の区分を含む融着ガラスフリットを含む。関連する実施形態においては、第１の区分は１００〜１６０ミクロンの孔径を有しかつ第２の区分は１６〜４０ミクロンの孔径を有するか、または第１の区分は１６〜４０ミクロンの孔径を有しかつ第２の区分は４〜１０ミクロンの孔径を有することを特徴とする。

以下の実施例は、本発明のある態様を例示しかつ当業者が本発明を実践することを支援するために提供される。これらの実施例はいかなる様態においても全く本発明の範囲を制限すると考慮されない。

（鼻咽頭吸引物からの自動ＲＮＡ抽出）
エッペンドルフｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０液状物操作ロボットを、１．２ｍＬエッペンドルフピペットチップに包埋した大孔径アコーニＴｒｕＴｉｐ（登録商標）マトリクス、２ｍＬ深型ウェルプレート（ＵＳＡサイエンティフィック）、アコーニＴｒｕＴｉｐ（登録商標）抽出試薬、およびサンプルマトリクスとしての鼻咽頭吸引物と共に用いた。ｅｐＭｏｔｉｏｎ５０７０液状物操作ロボットは８チップのみを同時に保持するので、ベースライン自動化プロトコルは８サンプル同時抽出用に記述した。しかし、１枚の９６ウェル深型ウェルサンプルプレートでは１プログラムで２４サンプルまで処理することができる。１６または２４サンプルの処理用に別のｅｐＭｏｔｉｏｎプログラムを入手することができる（また必要とされる）。以下に概要を示すプロトコルは、８サンプル自動化スクリプト用である。

（設定）
１．１ 抽出を開始する前に鼻咽頭サンプルを室温中に取り出す。
１．２．鼻咽頭吸引物１００μＬ＋非ヌクレアーゼ含有水１５０μＬをサンプルプレートのカラム１に分注する；図３Ａ）。
１．３ サンプルプレートをｅｐＭｏｔｉｏｎワークテーブルの位置Ｂ１に載置する（図３Ｂ）。
１．４ ピペットチップ、フィルターチップおよび３０ｍＬ試薬トラフをｅｐＭｏｔｉｏｎワークテーブルのそれぞれの位置に載置する（図３Ｂ）。
１．５ エッペンドルフｅｐＢｌｕｅソフトウェアを開き、アコーニが８サンプル用に提供するＲｕｎファイルを選択し、ＲＵＮタブ上のＲＵＮボタンをクリックして方法を読み込む。
１．６ Ｌｅｖｅｌセンサー設定でＬｅｖｅｌとＴｉｐを選択し、さらにＲＵＮボタンをクリックする。
１．７ サンプル体積をソフトウェアに入力し、ＲＵＮをクリックする。
１．８ ｅｐＭｏｔｉｏｎスクリプトが、ワークテーブルの位置Ｂ２に位置する試薬レザバーに抽出および溶離試薬を補充するようユーザーに要求する。各試薬の推奨体積をそれぞれのトラフに補充する。８サンプルに対する最小試薬体積を表１に示す。

１．９ 上記の手順１．８の要求時に、ｅｐＭｏｔｉｏｎソフトウェアに表示される表に試薬の体積を入力すること。ユーザーが各試薬レザバーに分注するバッファーの体積は、上記の最小体積よりも大きいかまたは等しくなければならない。実際のバッファーの体積が手順１．８の推奨体積と比べて著しく大きい場合は、ｅｐＭｏｔｉｏｎソフトウェアの表に各レザバー内のおおよその体積を入力すること。体積を誤入力するとｅｐＭｏｔｉｏｎハードウェアが各チューブまたは９８ウェルプレートのウェルに誤った分取体積を送達する可能性がある。

（自動化プログラム）
１．１０ ＲＵＮを選択して自動化法を開始する。自動化スクリプトは、ユーザーが介入することなく以下の手順（すなわち１．１１〜１．２３）を経て進行する。

（サンプル溶解および試薬分取）
１．１１ 溶解バッファーＤ ３７４μＬをカラム１に分注すると共に１０サイクル（吸引＋分注＝１サイクル）混合する。この手順から分解インキュベーションプロセスが開始し、同時に残りの試薬が分取される。
１．１２ 洗浄バッファーＤ １．６μＬをカラム２に分注する。
１．１３ 洗浄バッファーＥ １．６μＬをカラム３に分注する。
１．１４ 溶離バッファーＡ ５０μＬをカラム４に分注する。
１．１５ ６分間休止して分解バッファーＤ中での１０分間のサンプルインキュベーションを完了する。
１．１６ カラム１の各ウェルにエタノール３７５μＬを加え、各サンプルを１０ピペッティングサイクルでエタノールと混合する。

（抽出）
１．１７ ８本のフィルターチップをワークテーブル上の位置Ａ２から装填し、図３Ａおよび３Ｂに概要を示す抽出プロセスを開始する。
１．１８ サンプル／溶解バッファー／エタノール混合液をサンプルプレートカラム１から７サイクル吸引および分注し、核酸をＴｒｕＴｉｐ（登録商標）マトリクスと結合させる。ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）マトリクスを流れるサンプル流量は変動することがあるものの（臨床サンプルの粘度の違いによる）、核酸収量は影響されない。サンプルの流動を改善するための選択肢は、考察において記載する。
１．１９ フィルターチップをサンプルプレートカラム２に移動し、マトリクスを通して洗浄バッファーＤで５回サイクルし、残留溶解バッファーおよびサンプルマトリクスを除去する。
１．２０ フィルターチップをサンプルプレートカラム３に移動し、マトリクスを通して洗浄バッファーＥで５回サイクルし、タンパク質およびその他の汚染物質を結合した核酸から除去する。
１．２１ フィルターチップを（ワークテーブルの位置Ｂ２の）位置１の空の試薬レザバーに移動し、（高流量で）８０回サイクルしてマトリクスを乾燥する。溶離する核酸標本中の残留溶媒は逆転写酵素およびＴａｑポリメラーゼなどの酵素に好ましくない影響を与えるので、フィルターチップを完全に乾燥することが重要である。
１．２２ フィルターチップをサンプルプレートのカラム４に移動し溶離バッファーＡで５回サイクルする。抽出および精製された核酸はこのときサンプルプレートカラム４のウェル内の溶離バッファー中に存在する。
１．２３ フィルターチップをｅｐＭｏｔｉｏｎの廃棄物容器に押し出す。

プログラムが完了したならば、サンプルプレートを機器からマニュアルで取り出し、さらに精製された核酸を長期保存またはさらなる使用のために新しい試験管に移す。上級ｅｐＭｏｔｉｏｎユーザーは、所望であれば、溶離したサンプルを別の保存用チューブまたはＰＣＲプレートに移すよう、Ｒｕｎファイルに指示を追加することができる。合計１６サンプル用のプログラムでは、サンプルプレートカラム５〜８を用いて手順１．１１から１．１６まで繰り返す。２４サンプルプログラムについては、手順１．１１から１．１６を、それぞれサンプルカラム５〜８および９〜１２を用いてさらに２回繰り返す。

表２は、実施例１で用いる試薬および装置のリストを提供する。

（実施例１で用いられる試薬および装置）

（代表的な結果）
鼻咽頭吸引物からのインフルエンザＲＮＡ抽出についてのリアルタイムＰＣＲデータを図４に示す。平均Ｃ_ｔ値における線形反応が１０^４ゲノムコピーｍＬ^−１と１０^６ゲノムコピーｍＬ^−１の間のインフルエンザで認められ（インフルエンザＡおよびＢについてそれぞれＲ^２＝０．９９および０．９８）、平均Ｃ_ｔ値の標準偏差は１サイクル未満である。８、１６および２４サンプルについての総サンプル処理時間は、それぞれ１６、２８および４０分である。典型的な鼻咽頭吸引物またはスワブはインフルエンザＡまたはＢを＞１０^４ＴＣＩＤ_５０ｍＬ^−１含有し、これは＞１０^７ゲノムコピーｍｌ^−１（１ＴＣＩＤ_５０あたり１０００ビリオンと仮定）を表しているので、それゆえ自動化ｅｐＭｏｔｉｏｎプロトコルは大半の臨床ＮＰＡ検体に対して有効であると予測される。

（ゲノムＤＮＡの自動抽出）
ハミルトンＳＴＡＲ液状物操作ロボットを用いて、全血からの９６サンプルの自動化抽出を実証した。ハミルトンＳＴＡＲは、デッキ上でオプションのヒーター／シェーカーユニットを利用できるという点でｅｐＭｏｔｉｏｎシステムと異なり、これは全血などのいくつかの臨床マトリクスの酵素的消化にとって重要である。システムは９６チャネルピペットヘッドに嵌合することができるので、フィルターチップ手順および試薬のそれぞれに専用の９６ウェルプレートがある。

（設定）
２．１ ＳＴＡＲ機器およびコンピュータの電源を入れる。
２．２ ハミルトンＲｕｎ Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを開く。
２．３ アコーニが９６サンプル用に提供するＲｕｎファイルを開く。
２．４ 実験器具を図５に示すようにＳＴＡＲデッキに配置する。
２．５ 表３に従い、対応するトラフに試薬を分注する（体積は９６サンプルの処理に必要とされる最小量を示す）：

２．６ サンプルを室温と平衡させる。
２．７ サンプルキャリアーラック（図５のデッキ位置４）にサンプルチューブを配置する。サンプル１をキャリアーの左端の最後部に配置し、各キャリアーを連続的に下に移動し、正面右のサンプル９６で終了する。

（自動化プログラム）
２．８ Ｒｕｎファイルウインドウの左上のＰＬＡＹボタンを選択する。自動化スクリプトはユーザーが介入することなく以下の手順で進行する。

（前処理）
２．９ 各サンプルチューブから２００μＬをヒーター／シェーカーモジュール上の位置１４にあるインキュベーションプレートに移す（図５）。
２．１０ プロテイナーゼＫ８０μＬをインキュベーションプレートの各サンプルウェルに分注する。
２．１１ 溶解バッファーＦ ６００μＬをインキュベーションプレートの各ウェルに分注する。
２．１２ フィルターチップで溶液を１０サイクル混合し、さらにその後７０℃かつ５００ｒｐｍで２０分間インキュベートする。サンプルをインキュベートすると同時に、液状物操作システムが試薬をその対応するプレートおよびウェルに分注して作動し続ける。
・位置１０の深型ウェルプレートの各ウェルにエタノール８００μＬ。
・位置１１の深型ウェルプレートの各ウェルに洗浄バッファーＪ １．６ｍＬ。
・位置１２の深型ウェルプレートの各ウェルに洗浄バッファーＫ １．６ｍＬ。
・位置１３の深型ウェルプレートの各ウェルに溶離バッファーＡ １００μＬ。
２．１３ ２０分間インキュベートした後、サンプル混合物をインキュベーションプレートから位置１０の深型ウェルプレートに移し、さらに１２ピペッティングサイクルで混合される。
２．１４ 試薬チップを廃棄物容器に押し出す。

（抽出）
ｇＤＮＡ血液手順のこの部分は、洗浄試薬の組成とサイクル数以外は、ｅｐＭｏｔｉｏｎインフルエンザのプロトコルと非常に類似している。ハミルトンＴｒｕＴｉｐ（登録商標）チップは液状物レベルの感知を可能とするため炭素含浸されているので、ユーザーはＴｒｕＴｉｐ内の液状物の流動を容易に目視できない。
２．１５ デッキ位置３から９６本のＴｒｕＴｉｐ（登録商標）を装填する。
２．１６ 位置１０のサンプル／溶解バッファー／エタノール混合液を１０サイクル吸引および分注し、核酸をＴｒｕＴｉｐ（登録商標）マトリクスと結合させる。
２．１７ フィルターチップを位置１１に移動し、マトリクスを通して洗浄バッファーＪで５回サイクルし、残留溶解バッファーおよびサンプルマトリクスを除去する。
２．１８ フィルターチップを位置１２に移動し、洗浄バッファーＫで５回サイクルしてタンパク質およびその他の汚染物質を結合した核酸から除去する。
２．１９ フィルターチップを高速で４０回サイクルして風乾する。
２．２０ フィルターチップを位置１３に移動し溶離バッファーＡ２中で５回サイクルする。抽出および精製された核酸はこのとき深型ウェルプレート中の溶離バッファー内に存在する。
２．２１ フィルターチップを廃棄物容器に押し出す。

プログラムが完了したならば、溶離プレートを機器から取り除きさらに抽出されたサンプルを長期保存または下流用途のための適切なチューブに移す。

表４は、実施例２で用いる試薬および装置のリストを提供する。

（実施例２で用いられる試薬および装置）

（代表的な結果）
ヒトゲノムＤＮＡに対して実施する分子的試験の範囲を考えると、全血からの核酸抽出の主要な目的は純度の高い高分子量ゲノムＤＮＡを生成することである。９６サンプル用自動化プロトコルは１時間以内に完了する。図６Ａは、ハミルトンＳＴＡＲプロトコルで４５本の試薬ブランクと同時に処理した４５本の陽性血液サンプルについてのＵＶ／可視光吸光度プロフィールを示し、平均Ａ_{２６０／２８０}比は１．９６でありかつ平均Ａ_{２６０／２３０}比は１．９３である。１．７〜２．０の平均Ａ_{２６０／２８０}比および＞１．７のＡ_{２６０／２３０}比は、一般に、非常に純度の高いＤＮＡである、残留塩、タンパク質または溶媒を含まない、および大半の下流の分子的用途に許容されることを示す。図６Ｂの１％アガロースゲルは、生成するｇＮＤＡが高分子量（＞２４Ｋｂ）で剪断が最小限であることを示す。全４５本の陽性サンプル一式に由来するヒトＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム上でＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ（登録商標）ヒトＤＮＡ定量キット（ライフテクノロジーズ）により定量し、全血２００μLあたりヒトＤＮＡ５．２６±０．４６μｇの平均収量をもたらした。

表５は、全血、バフィーコート、唾液、頬部ぬぐい液、ラット肺、ラット肝臓、ラット脾臓およびラット腎臓から自動精製したｇＤＮＡからの平均Ａ_{２６０／２８０}比を示す。

（多様なサンプル種に由来するゲノムＤＮＡの品質）

図６Ｃはプール全血装填２００μＬを１ｍＬ ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルターで処理しさらに体積１００μＬで溶離した各８回の分離からのリアルタイムｑＰＣＲの結果を示す。結果は、独立した３測定日に相異なる測定者が分離したヒトＤＮＡの平均収量に高度な再現性があることを示す。図６Ｄは、全血からの平均ｇＤＮＡ収量が、１ｍＬ ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルターから処理した全血装填体積１００μＬ、２００μＬおよび３００μＬ（左側）および ５ｍＬ ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルターから処理した全血体積１０００μＬおよび２０００μＬ（中央および右）にわたって線形であったことを示す。図６Ｅは、唾液２４ウェルおよびＰＢＳ２４ウェルを収容するプレートが自動ＤＮＡ抽出プロセスに付された交叉汚染試験の結果を示す。各ウェルから抽出されたＤＮＡをその後ｑＰＣＲで増幅した。図６Ｅに示すように、ウェル間に交叉汚染はなかった。図６Ｆは、キアゲンのマニュアルスピンカラム法（右カラム／対）および本発明による自動化抽出法（左カラム／対）を用いて抽出した７つの個別盲検化唾液サンプル（サンプルＡ〜Ｇ；４００μＬ装填／１００μＬ溶離）からの平均ｇＤＮＡ収量の比較からのＵＶ吸収率の結果を示す。データは、本願の自動プロセスはキアゲンプロセスよりも優れたサンプルｇＤＮＡ回収率を提供することを示唆する。図６Ｇは、５つの競合他社の抽出系（カラム２〜６）と比較した、ＴｒｕＴｉｐ（登録商標）フィルター（カラム１）から処理した２００μＬ全血の処理時間を示す。

（胎児核酸を精製するためのプロトコル）
非侵襲的出生前診断（ＮＩＰＤ）は、胎児奇形および流産を含む多くのリスクを負う標準的な出生前診断法の代替となるその能力によって、革新的な医療の進歩を提供する、重要かつ急速に成長する市場である。そればかりか、母体の血漿中に存在する胎児ＤＮＡの遺伝的異常を検査することに必要なのは簡易な採血のみである。この方法は、出生前診断のよりリスクの低い手法を提供するものの、特殊な処理技術を必要とするサンプルの種類には多くの困難もある。第１に、妊娠初期の胎児ＤＮＡは母体血漿中に低濃度で存在するので、大量のサンプルを処理および濃縮して分析に適した量を達成できることが重要である。しかし、現在市販されているキットではわずか２５０μＬ〜５ｍＬを装填して総核酸を分離することができる。第２に、循環胎児ＤＮＡは、母体血漿中で高い母体循環ＤＮＡバックグラウンド中で存在する（Ｌｏ １９９７）。血液サンプルを適切な時点で（＜２４時間）処理しなければ、母体ＤＮＡバックグラウンドが時間と共に上昇して存在する％胎児ＤＮＡのさらなる低下を引き起こす（Ｂａｒｒｅｔｔ ２０１１）。この低比率は、胎児ＤＮＡに特異的な遺伝子の種々のコピー数を正確に定量することを困難にする。さらに、母体血漿サンプルは、どれだけ迅速に処理されるかに応じて、スピンカラム結合材料の目詰まりを引き起こす凝固因子および他のタンパク質および凝固剤を含有することがある。第３に、規制当局が承認する臨床診断測定法に移行する場合に自動化が容易であることは重要な能力であるが、現在のキットは自動化が容易でないシリカスピンカラム法を用いている。

本発明にしたがって血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するための典型的なプロトコルを以下に提供する。

（３．１．０ 設定）
３．１．１ プロテイナーゼＫを５ｍＬサンプルチューブに６１５μＬずつ分注する（１サンプルにつき５ｍＬサンプルチューブ２本）。
３．１．２ キャリアーＲＮＡをサンプルチューブに１μｇ（０．２μｇ／μＬを５μＬ）ずつ添加する。
３．１．３ 溶解バッファーＣＮ−Ｌ１をサンプルチューブに６．２ｍＬずつ添加する。
３．１．４ 血漿サンプルをサンプルチューブに５ｍＬ添加する。
３．１．５ サンプルチューブをボルテックスの最大スピードで３０秒間振盪する。
３．１．６ 水浴内で６０℃で３０分間インキュベートする。
３．１．７ 結合バッファーＣＮ−Ｂ１をサンプルチューブに１２ｍＬ添加する。
３．１．８ ＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）をサンプルチューブに１０μＬ（２０ｍｇ／ｍＬ）添加する。
３．１．９ サンプルチューブをボルテックスの最大スピードで１５秒間振盪する。
３．１．１０ サンプルチューブを氷上で５分間インキュベートする。

（３．２．０ 抽出）
３．２．１ 胎児および母体ＤＮＡのフィルターへの結合
３．２．１．１ ２０ｍＬピペットチップをモーター駆動ピペットフィラーに着接する。
３．２．１．２ サンプルチューブＡ内で液状サンプルを１８サイクルピペッティングする（サイクル＝吸引＋分注）。
３．２．１．３ サンプルチューブＢについて手順３．２．１．２を繰り返す。
３．２．１．４ （液状サンプルの入った）サンプルチューブを廃棄するが、ピペットチップは保持する。
このとき核酸はピペットチップフィルターと結合している。
３．２．２ 洗浄
３．２．２．１モーター駆動ピペットフィラーを用いて、ピペットチップにより洗浄バッファーを１サイクルピペッティングする。
３．２．２．２ 洗浄バッファーは廃棄するがピペットチップは保持する。
３．２．２．３ 手順３．２．２をさらに３回繰り返す。
核酸はまだピペットチップフィルターと結合している。
３．２．３ 乾燥
３．２．３．１ モーター駆動ピペットフィラーを用いて、ピペットチップフィルターに１５サイクル通気する。相当量の洗浄バッファーが残っている場合は、ピペットチップを穏やかに間欠的にタッピングする。
この手順は、過量の洗浄バッファーから発生しうるＰＣＲ阻害を回避するためのものである。
３．２．３．２ １分間待ってピペットチップフィルターを完全に乾燥させる。
核酸はまだピペットチップフィルターと結合している。
３．２．４ 精製された母体および胎児核酸をピペットチップから溶離する。
３．２．４．１ 溶離バッファーをピペットチップ内に吸い上げ、１分間待って溶離バッファーをフィルター上でインキュベートする。
３．２．４．２ 液状物を溶離１チューブにピペッティングし、合計５サイクル繰り返す。
３．２．４．３ 溶離２チューブで手順３．２．４．１および３．２．４．２を繰り返す。
３．２．４．４ チューブを遠心機に付して内容物を底に集め、溶離チューブ１および２のサンプルを合わせる。
３．２．４．５ 溶離チューブに収容された総体積を測定し、溶離バッファーＡ２を加えて全量を４５０μＬとする。
このとき抽出された核酸は溶離チューブ内に存在する。
３．２．４．６ ピペットチップを廃棄する。
このとき精製された核酸は排除および濃縮できる状態である。

（３．３．０ ＨＭＷ核酸の排除）
３．１．１ 準備
３．３．１．１ 手順３．２．４．５からの溶離サンプルを、適切なサンプル番号をラベル表示した２ｍＬマイクロ遠心チューブに移す。
３．３．１．２ 結合バッファーＣＮ−Ｂ２を４９５μＬ加える。
３．３．１．３ サンプルをボルテックスで１０秒間振盪しさらにパルス遠心する。
３．３．２ ＨＭＷ核酸をピペットチップと選択的に結合させる。
３．２．２．１ １ｍＬ４ｍｍピペットチップを電子ピペットに着接する。
３．２．２．２ サンプルチューブの液状サンプルを２０サイクルピペッティングする（サイクル＝吸引＋分注）。
３．３．２．３ サンプルチューブを閉じ、取り出す。
廃棄してはならない；サンプルチューブは胎児ＤＮＡを含んでいる。
３．３．２．４． ピペットチップを保持する。
このとき高ＭＷ核酸（母体ＤＮＡ）はピペットチップフィルターと結合している。
３．３．３ （ピペットチップをすすぐ）
３．３．３．１ リンスチューブ内で液状物を５サイクルピペッティングする。
３．２．２．２ リンスチューブは廃棄するがピペットチップは保持する。
核酸はフィルターから遊離する。

（３．４．０ ＬＭＷ核酸の濃縮）
３．４．１ 準備
３．４．１．１ 結合バッファーＣＮ−Ｂ３をサンプルチューブに５７５μＬ加える。
３．４．１．２ サンプルチューブをボルテックスで１０秒間振盪しさらにパルス遠心する。
３．４．２ ＬＭＷ核酸を結合させる。
３．４．２．１ サンプルチューブ内で液状物を２０サイクルピペッティングする。
３．４．２．２ サンプルチューブは廃棄するがピペットチップは保持する。
このとき核酸はフィルターと結合している。
３．４．３ ＬＭＷ核酸の洗浄
３．４．３．１ レイニンピペットに対して上記と同じ条件を維持する。
３．４．３．２ 洗浄１チューブ内で液状物を１サイクルピペッティングする。
３．４．３．３ 洗浄１チューブは廃棄するがピペットチップは保持する。
３．４．３．４ 溶離２チューブで手順３．４．３．２および３．４．３．３を繰り返す。
核酸はまだフィルターと結合している。
３．４．４ 乾燥
３．４．４．１ ピペットチップを空の乾燥チューブに入れ、ピペットチップに１５サイクル通気する。相当量の洗浄バッファーが残っている場合は、ピペットチップを穏やかに間欠的にタッピングする。
この手順は、過量の洗浄バッファーから発生しうるＰＣＲ阻害を回避するためのものである。
３．４．４．２ １分間待ってフィルターを完全に乾燥させる。
核酸はまだピペットチップフィルターと結合している。
３．４．５ 溶離
３．４．５．１ 溶離チューブ内の液状物をピペットチップ内に引き上げ、１分間待って溶離バッファーをフィルター上でインキュベートする。
３．４．５．２ 溶離チューブ内で液状物を合計１０サイクルピペッティングする。
３．４．５．３ 溶離したサンプルを溶離チューブ内に保持する。
このとき抽出された核酸は溶離チューブ内に存在する。
３．４．５．４ ピペットチップを廃棄する。
このとき、精製された核酸はＰＣＲ増幅または−２０℃（長期保存には−８０℃）での保存ができる状態である。

上記の精製手順は図７に要約される。一部の実施形態においては、手順の費用を低減するために全精製手順（すなわち３．１．０から３．４．５．４）において単一のピペットチップのみを用いる。胎児および／または母体ＤＮＡのピペットチップフィルターとの選択的結合は、相異なる結合バッファーによって達成される。一部の実施形態においては、単一のピペットチップは多孔度が相異なる２つの区分を有するガラスフリットフィルターを収容する。他の実施形態においては、単一のピペットチップは多孔度の相異なる２つの区分を有する焼結ガラスフリットフィルターを収容する。他の実施形態においては、単一のピペットチップは多孔度の相異なる２つのフィルターを収容しかつフィルターは互いに融着される。他の実施形態においては、単一のピペットチップは多孔度の相異なる２つまたはそれ以上のフィルターを収容する。

一部の実施形態においては、上記の方法（すなわちサイズ排除または濃縮に基づく胎児ＤＮＡの分別）は、癌患者のサンプル（腫瘍ＤＮＡからの正常ＤＮＡの分別用）または移植患者由来のサンプル（ドナーＤＮＡからの宿主ＤＮＡの分別用）からの他の無細胞ＤＮＡの分離において用いられる。プロトコルのサイズ排除／濃縮部分は、Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施する前のライブラリー作成プロトコルにおいても用いることができるであろう。大量のサンプルからのＤＮＡ小フラグメントの分離（必ずしも濃縮を含まない）は、腎臓サンプルからの感染症の分離のための一般的な用途でもある。

（胎児ＤＮＡ抽出手順の特性決定）
（ＤＮＡ回収効率）
男性および女性全長ゲノムＤＮＡ（プロメガ）を、ガラスビーズを有するＰＣＲチューブの側壁でホーンソニケーターを用いてフラグメント化し、さらに女性および男性ＤＮＡについて超音波処理時間を最適化して所望のフラグメント範囲を生成し、プロトコルの排除手順用にサイズ間を識別する能力を開発および実証した。結果を図８Ａに示す。男性ＤＮＡは＜６００ｂｐのサイズ範囲にフラグメント化し（約１５０ｂｐ前後が中心）、血漿サンプル中の循環胎児ＤＮＡをシミュレーションした。女性ＤＮＡは約４００ｂｐから１２００ｂｐのサイズ範囲にフラグメント化し（約８００ｂｐ前後が中心）、血漿サンプル中の母体ＤＮＡをシミュレーションした。フラグメント化女性ＤＮＡ２００ｎｇおよび種々の量のフラグメント化男性ＤＮＡ（１、３、１０、３０および１００ｎｇ）の混合物を含有するサンプルを調製し、実施例３に記載のＤＮＡ抽出プロトコルで抽出した。図８Ｂは、フラグメント化男性ＤＮＡ（Ｃｈｒｏｍ Ｙ）ＤＮＡおよび総ＤＮＡ（Ｃｈｒｏｍ１）の回収物のｑＰＣＲ結果を示す。３回の抽出の平均であるデータを示す。各抽出サンプルはｑＰＣＲにより２回ずつ測定した。結果は、試験濃度範囲内で有効な男性ＤＮＡ回収量が達成されかつキアゲン循環核酸キットを用いた収量と匹敵することを示す。キアゲン法と比較して低いＴｒｕＴｉｐについての総ＤＮＡ回収量は、ＴｒｕＴｉｐプロトコルの濃縮効果を証明している。

他の一連の実験では、相異なる寸法およびマトリクス多孔度を有するガラスフリットフィルターを、胎児および母体ＤＮＡの回収について試験した。簡単に述べると、フラグメント化男性ＤＮＡを１０ｎｇ添加した女性血漿１０ｍＬを、相異なる寸法およびマトリクス多孔性を有するガラスフリットフィルターを用い、実施例３の手順３．２．０に記載の手順（抽出手順のみ）にしたがって処理し、抽出したＤＮＡを溶離バッファー２５０μLに回収し、胎児（ＣＨＹ）および総（ＣＨ１）ＤＮＡについてｑＰＣＲで分析した。結果を表６に要約する。

（排除手順（実施例３の手順３．３）および濃縮手順（実施例３の手順３．４）の効果と対比した濃縮手順（実施例３の手順３．４）のみの効果）
フラグメント化男性および女性ＤＮＡの混合物（装填）を、手順３．３によって、またはこれを用いない実施例３の基本的プロトコルを用いて抽出した。図９に示すように、排除手順３．３がない場合、濃縮手順３．４は男性ＤＮＡを８０％回収し、装填量（約２．４％）と比較してわずかに濃縮することができた。排除手順３．３が濃縮手順に含められると、結果は男性ＤＮＡ（ＣＨＹ）についてわずかに低いが女性ＤＮＡについては著しく低い回収率がみられることを示し、その結果この場合の％胎児ＤＮＡは全体的に約８％上昇する（表７）。

（大量血漿サンプルから胎児核酸を抽出するための自動化プロトコル）
ハミルトンＳＴＡＲｐｌｕｓ機器を用いて、母体血漿５ｍＬより遊離循環胎児ＤＮＡを抽出するための自動化プロトコルを開発および実証した。ＳＴＡＲｐｌｕｓシステムは、一方が８×５ｍＬチャネルでかつ一方が８×１ｍＬチャネルの、２台の自動化ピペットチャネルアームを支持することができる。これらのアームは、各８サンプルのバッチで交互処理を実施するために平行して作動することができる。初回の大量抽出には５ｍＬフィルターチップを用いてよく、また抽出された核酸のサイズ分別およびさらなる濃縮には１ｍＬフィルターを用いてよい。

（準備）
５．１ ＳＴＡＲｐｌｕｓ機器およびコンピュータの電源を入れる。
５．２ ハミルトンＲｕｎ Ｃｏｎｔｒｏｌソフトウェアを開く。
５．３ アコーニより８サンプルの大量血漿サンプル用に提供されたＲｕｎファイルを開く。
５．４ 実験器具を図１０に示すようにＳＴＡＲｐｌｕｓデッキに配置する。
５．５ 表８に従い、試薬をその対応するレザバーに分注する。

５．６ サンプルを室温と平衡させる。
５．７ サンプルキャリアーラック（図１０Ａのデッキ位置３）にサンプルチューブを配置する。再後部にサンプル１を配置し、デッキの前方に連続的に移動する。

（自動化プログラム）
装填サンプルの体積が大きいので、ハミルトンＳＴＡＲｐｌｕｓ機器の外で水浴中での前処理手順を実施しなければならない。自動化プロトコル中のユーザーの介入を要する手順は文頭の米印（＊）（および太字）で表示する。

（前処理）
サンプルをプロテイナーゼＫおよび溶解バッファーでインキュベートしてサンプルをホモジナイズしかつ細胞を溶解してＤＮＡを遊離させる。
５．８ Ｒｕｎファイルウインドウの左上のＰＬＡＹボタンを選択する。
５．９ 自動化スクリプトで血漿５ｍＬ、プロテイナーゼＫ ６１５μL、および溶解バッファーＣＮ−Ｌ１ ６．３ｍＬを各５０ｍＬコニカルチューブに添加すると、その後ＰＡＵＳＥとなる。
５．１０ ＊サンプルデッキより５０ｍＬコニカルチューブを取り出し、ボルテックスで３０秒間高速振盪し、水浴またはヒートブロック上で３０分間６０℃でオフラインインキュベーションを実施する。コニカルチューブをハミルトンデッキから取り出した後、自動化スクリプトをＲＥＳＵＭＥとして引き続き試薬をそれぞれのプレートおよびウェルに分注する（図１０Ｂおよび１０Ｃ）。
・ＣＮ−Ｗ１ ２ｍＬを位置９カラム１のウェルに１つおきに分注する。
・ＣＮ−Ｗ２ ２ｍＬを位置９カラム２のウェルに１つおきに分注する。
・ＣＮ−Ｗ４ ２ｍＬを位置９カラム３のウェルに１つおきに分注する。
・ＥＡ２ ２５０μＬを位置９のカラム４および５のウェルに１つおきに分注する。
・ＥＢＢ １ｍＬを位置１０カラム２の全ウェルに分注する。
・ＣＮ−Ｗ３ ５００μＬを位置１０カラム３の全ウェルに分注する。
・ＣＮ−Ｗ４ ５００μＬを位置１０カラム４の全ウェルに分注する。
・ＥＢＡ２ ５０μＬを位置１０カラム５の全ウェルに分注する。
５ｍＬチャネルは各サンプルを隣り合ったウェルで使用するには口径が大きすぎるので、自動化プログラムではデッキ位置９の深型ウェルプレートの１つおきのウェルに試薬を分注する。
試薬を分注すると、プログラムはＰＡＵＳＥとなる。
５．１１ ＊３０分、６０℃でのインキュベーション後、５０ｍＬコニカルチューブを氷上に５分間載置する。
５．１２ ＊５０ｍＬコニカルチューブをデッキ位置４のサンプルキャリアーラック内の元の位置に戻し、自動化スクリプトをＲＥＳＵＭＥとする。
５．１３ 結合バッファーＣＮ−Ｂ１を各サンプルチューブに１２ｍＬ添加し、１０回混合する。

（大量抽出）
５ｍＬフィルターチップを用いて溶解血漿サンプルから総ＤＮＡを抽出してもよい。
５．１４ 大量核酸抽出用に５ｍＬフィルターチップを位置２から取り出す。
５．１５ ５０ｍＬコニカルチューブ中で、チューブの底から開始して各ピペッティングサイクル後に３ｍｍ上に移動しながら、サンプル混合物を１５回サイクルする。この手順で総核酸を結合マトリクスと結合させる。
５．１６ フィルターチップを位置６の深型ウェルプレートカラム１に移動し、洗浄バッファーＣＮ−Ｗ１中で１回サイクルする。
５．１７ フィルターチップを位置９のカラム２に移動し、洗浄ＣＮ−Ｗ２中で１回サイクルする。
５．１８ フィルターチップを位置９のカラム３に移動し、洗浄ＣＮ−Ｗ４中で２回サイクルする。
５．１９ フィルターチップを位置９のカラム４に移動し、高速で４０回サイクルして結合マトリクスを乾燥する。
５．２０ フィルターチップを位置９のカラム５に移動し、１０回サイクルして結合した核酸を５ｍＬフィルターチップから溶離させる。これは大量溶離物＃１である。
５．２１ フィルターチップをカラム６に移動し、溶離バッファーの第２の分取物を用いて手順を繰り返す。これは大量溶離物＃２である。
５．２２ 溶離物＃２を位置９のカラム５に移動して溶離物＃１と合わせ、さらにフィルターチップを廃棄する。

（排除および濃縮）
高分子量ＤＮＡを抽出サンプルから除去し、残りのＤＮＡを分離および濃縮する。
５．２３ 手順５．２２の混合した溶離液を位置１０のカラム１に添加し、完全に１０回混合する。
５．２４ 位置１３から１ｍＬフィルターチップを取り出し、２０回サイクルして高分子量ＤＮＡをマトリクスと結合させる。
５．２５ フィルターチップを位置１０のカラム２に移動し５回サイクルしてチップをすすぐ。フィルターチップは保持し、位置１３のチップラックに戻す。
５．２６ 位置１２の試薬チップを用いて、結合バッファーＣＮ−Ｂ３を位置１０カラム１のサンプルに５７５μＬ添加しさらに１０回混合する。
５．２７ 手順５．２５のフィルターチップを取り出し、位置１０のカラム１に戻し、２０回サイクルしてサンプル由来の残りのＤＮＡを１ｍＬチップに結合させる。
５．２８ フィルターチップを位置１０のカラム４に移動し洗浄ＣＮ−Ｗ３中で１回サイクルして残余阻害物質をすべて除去する。
５．２９ フィルターチップを位置１０のカラム５に移動し洗浄ＣＮ−Ｗ４中で１回サイクルしてＣＮ−Ｗ３由来の残余のグアニジンを除去する。
５．３０ フィルターチップを位置１０のカラム５の上に持ち上げし、３５回通気サイクルしてマトリクスを乾燥させる。
５．３１ フィルターチップを位置１０のカラム６に移動し、ＥＢＡ２中で１０回サイクルして精製、サイズ選択および濃縮した核酸を溶離させる。
５．３２ ピペットチップを廃棄する。
５．３３ 溶離したサンプルをカラム６から位置１１の１．５ｍＬチューブに移す。
抽出したサンプルは保存または下流処理できる状態である。

表９は、実施例５で用いる試薬および装置のリストを提供する。

（代表的な結果）
大量フィルターチップ手順で処理したプール母体血漿サンプルの８回反復実施サンプルのリアルタイムの結果を図１１Ａに示す。プロトコルの全体（オフラインでのプロテイナーゼＫ前処理を含む）は約２時間で完了する。すべての反復実施にわたる平均Ｃ_ｔ値は胎児男性（ＣＨＹ）および総（ＣＨ１）ＤＮＡについてそれぞれ３４．５８±０．６６および２９．７６±０．５０であり、これは自動化抽出法の優れた反復性を証明する。標準に対するフィットポイント分析比較に基づき、総ＤＮＡプール中の胎児ＤＮＡ濃度（ゲノム当量）を算出した結果、全サンプルを通じた％胎児ＤＮＡの平均は２．８％であった。サンプルは抽出を実施する前にプールされていたので、このサンプルについての実際の％胎児ＤＮＡは不明である。

図１１Ｂは、上記の抽出手順にしたがってアコーニＴｒｕＴｉｐ（登録商標）を採用した自動化システム（左カラム／対）と、キアゲンのマニュアル循環核酸キット（右カラム／対）を用いた、１１の異なる母体血漿サンプルから２回ずつ回収した胎児ＤＮＡの百分率の比較を示す。

本発明は、いかなる特定の理論または作用とも無関係に、高い結合能力を目的として比較的厚い硬質自立型マトリクス構造物を実装することによって上記のニーズを満たし、低い流体抵抗、より速い流量、および臨床および環境サンプル中の粒子に対するより高い耐性を目的として比較的大きな空隙を含み、かつ遊離性の材料（例：シリカゲル、珪藻土、ガラスビーズなど）から構成されない。

結合マトリクスおよびチップフォーマットは：ｉ）高い抽出効率および濃縮を目的とした高表面積、ｉｉ）大きなサンプル体積および汚染サンプルのための大きな空隙率、ｉｉｉ）遠心分離または真空マニフォールドの必要性を回避する単純な構想；およびｉｖ）抽出生成物の任意の下流増幅検出系との適合性を含む、現在の技術では実現されない数多くの利点を提供する。本願に記載のシステムは、ロボット液状物操作システム上でより高いスループットの処理のために、十分に特性決定されかつ容易にスケールアップされる堅牢な操作と簡素化された製造を提供するよう、壊れやすく繊細な材料（例：ファイバーフィルター、メンブランフィルター、シリコン微細構造）の使用を回避する。

本願で用いられる用語および記述は、例示のみを目的として記載されかつ制限を意味しない。当業者は、特に指示がない限りすべての用語が可能なその最も広い意味で理解されるべきである、以下の請求項に定義される本発明の趣旨および範囲内の数多くの変法、およびその同義のものが可能であることを認識するであろう。

Claims (18)

1. 血漿サンプルにおいて高分子量（ＨＭＷ）核酸から低分子量（ＬＭＷ）核酸を分別および分離するための方法であって：
   （ａ）該ＬＭＷ核酸および該ＨＭＷ核酸の第１のフィルターとの特異的結合を可能とする条件下で該ＬＭＷ核酸および該ＨＭＷ核酸を含む血漿サンプルを前記第１のフィルターに流すこと；
   （ｂ）結合した該ＬＭＷ核酸および該ＨＭＷ核酸を前記第１のフィルターから溶離させて該ＬＭＷ核酸および該ＨＭＷ核酸を含む濃縮核酸サンプルを形成すること；
   （ｃ）前記ＨＭＷ核酸が第２のフィルターと特異的に結合しかつ該ＬＭＷ核酸が前記第２のフィルターを通過することを可能とする条件下で前記濃縮核酸サンプルを前記第２のフィルターに流すこと；および
   （ｄ）前記第２のフィルターからの前記フロースルー分画が該ＬＭＷ核酸を含有することを特徴とする、前記第２のフィルターからの前記フロースルー分画を捕集することを含み、
   但し、該ＬＭＷ核酸は６００ｂｐ以下、且つ、該ＨＭＷ核酸は６００ｂｐより大きい、前記方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、手順（ａ）における前記ＬＭＷ核酸および前記ＨＭＷ核酸の前記第１のフィルターとの特異的結合を可能とする前記条件が前記血漿サンプル、１７〜２５％（ｖ／ｖ）の間の範囲の脂肪族アルコールおよび０．５Ｍから４．０Ｍの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第１の結合混合物を形成することを含むことを特徴とする前記方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、手順（ｃ）において前記ＨＭＷ核酸を前記第２のガラスフリットフィルターと結合させるための前記条件が前記濃縮核酸サンプル、０〜１０％（ｖ／ｖ）の間の範囲の脂肪族アルコールおよび１Ｍから４．０Ｍの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第２の結合混合物を形成することを含むことを特徴とする前記方法。
4. 請求項１に記載の方法であって：
   （ｅ１）結合した前記ＨＭＷ核酸を前記第２のフィルターから溶離させて再生された第２のフィルターを生成すること；
   （ｆ１）前記ＬＭＷ核酸の前記第２のフィルターとの結合を可能とする条件下で前記第２のフィルターからの前記フロースルー分画を前記の再生された第２のフィルターに流すこと；および
   （ｈ１）結合した前記ＬＭＷ核酸を手順（ｆ１）における前記第２のフィルターから溶離させることという手順をさらに含む前記方法。
5. 請求項４に記載の方法であって、手順（ｆ１）における前記ＬＭＷ核酸を前記第２のフィルターと結合させるための前記条件が前記第２のガラスフリットフィルターからの前記フロースルー分画、１０〜２５％（ｖ／ｖ）の間の範囲の脂肪族アルコールおよび１Ｍから５．０Ｍの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第３の結合混合物を形成することを含むことを特徴とする前記方法。
6. 請求項１に記載の方法であって：
   （ｅ２）前記ＬＭＷ核酸の前記第１のフィルターとの結合を可能とする条件下で前記第２のフィルターからの前記フロースルー分画を前記第１のフィルターに流すこと；および
   （ｆ２）結合した前記ＬＭＷ核酸を手順（ｅ２）における前記第１のフィルターから溶離させることという手順をさらに含む前記方法。
7. 請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２のフィルターが自立型ガラスフリットであることを特徴とする前記方法。
8. 請求項７に記載の方法であって、前記ガラスフリットが焼結ガラスフリットであることを特徴とする前記方法。
9. 請求項７に記載の方法であって、前記第１のガラスフリットフィルターが１６〜４０ミクロンの孔径を有しかつ前記第２のガラスフリットフィルターが４〜１０ミクロンの孔径を有することを特徴とする前記方法。
10. 請求項１に記載の方法であって：
    （ｅ３）前記ＬＭＷ核酸の第３のフィルターとの結合を可能とする条件下で前記第２のフィルターからの前記フロースルー分画を前記第３のフィルターに流すこと；および
    （ｆ３）結合した前記ＬＭＷ核酸を前記第３のフィルターから溶離させることという手順をさらに含む前記方法。
11. 請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２のフィルターの一方または両者が第１の孔径を有する第１の区分および第２の孔径を有する第２の区分を含むガラスフリットを含むことを特徴とし、前記第１の孔径が前記第２の孔径と異なることを特徴とする前記方法。
12. 請求項１に記載の方法であって、前記第１のフィルターおよび前記第２のフィルターが同じフィルターであることを特徴とする前記方法。
13. 血漿サンプルにおいて高分子量（ＨＭＷ）核酸から低分子量（ＬＭＷ）核酸を分離するためのキットであって：
    自立型ガラスフリットフィルターを含むピペットチップであって、前記ガラスフリットフィルターが２〜２２０ミクロンの孔径を有しかつ核酸の前記ガラスフリットとの結合を促進する薬剤によって処理またはコーティングされていないことを特徴とするピペットチップ；
    血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール１７〜２５％ｖ／ｖおよび０．５Ｍから４．０Ｍの濃度のカオトロピック塩を有する第１の結合混合物を提供するよう配合された第１の結合バッファー；および
    濃縮核酸サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール０〜１０％ｖ／ｖおよび１Ｍから４．０Ｍの濃度のカオトロピック塩を有する第２の結合混合物を提供するよう配合された第２の結合バッファーを含み、
    但し、該ＬＭＷ核酸は６００ｂｐ以下、且つ、該ＨＭＷ核酸は６００ｂｐより大きい、前記キット。
14. 請求項１３に記載のキットであって、前記ピペットチップが０．５〜５０ｍＬのチップ体積を有することを特徴とする前記キット。
15. 請求項１４に記載のキットであって、自立型ガラスフリットフィルターを含む追加的ピペットチップをさらに含み、前記追加的ピペットチップが０．５〜５０ｍＬのチップ体積を有することを特徴とする前記キット。
16. 請求項１５に記載のキットであって、前記ガラスフリットフィルターが１６〜４０ミクロンの孔径を有しかつ前記追加的ピペットチップ内の前記ガラスフリットフィルターが４〜１０ミクロンの孔径を有することを特徴とする前記キット。
17. 請求項１４に記載のキットであって、前記ガラスフリットフィルターが第１の孔径を有する第１の区分および第２の孔径を有する第２の区分を含む融着ガラスフリットを含むことを特徴とする前記キット。
18. 請求項１７に記載のキットであって、前記第１の区分が１００〜１６０ミクロンの孔径を有しかつ前記第２の区分が１６〜４０ミクロンの孔径を有するか、または前記第１の区分が１６〜４０ミクロンの孔径を有しかつ前記第２の区分が４〜１０ミクロンの孔径を有することを特徴とする前記キット。