JP2015533480A - 核酸を精製するための方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年8月28日に出願された米国仮特許出願第61/693,963号および2012年9月5日に出願された米国仮特許出願第61/697,116からの優先権を主張する。
本発明のフィルターチップシステムは、それによってモノリス結合マトリクスフィルターがピペットチップに挿入される核酸抽出技術を提供する。多孔質モノリス材料は核酸と特異的に結合しかつ硬質、自立型、ほぼモノリス状の構造から構成される。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は核酸親和性を提供する追加的な材料を含まない。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、ガラスフリットなどのガラス基剤のモノリス材料である。一部の実施形態においては、ガラスフリットは焼結ガラスフリットである。ガラスフリットまたは焼結ガラスフリットなどの多孔質モノリス材料の多孔度は用途に依存する。一般に、多孔質モノリス材料は、個々の用途に対する所望のサンプル流量を可能にし、かつ所望のサイズ範囲の核酸を保持することのできる多孔度を持たなければならない。一部の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、2〜400ミクロン、2〜300ミクロン、2〜220ミクロン、2〜200ミクロン、2〜180ミクロン、2〜160ミクロン、2〜140ミクロン、2〜120ミクロン、2〜100ミクロン、2〜80ミクロン、2〜60ミクロン、2〜40ミクロン、2〜20ミクロン、2〜16ミクロン、2〜10ミクロン、2〜5.5ミクロン、4〜400ミクロン、4〜300ミクロン、4〜220ミクロン、4〜200ミクロン、4〜180ミクロン、4〜160ミクロン、4〜140ミクロン、4〜120ミクロン、4〜100ミクロン、4〜80ミクロン、4〜60ミクロン、4〜40ミクロン、4〜20ミクロン、4〜16ミクロン、4〜10ミクロン、4〜5.5ミクロン、10〜400ミクロン、10〜300ミクロン、10〜220ミクロン、10〜200ミクロン、10〜180ミクロン、10〜160ミクロン、10〜140ミクロン、10〜120ミクロン、10〜100ミクロン、10〜80ミクロン、10〜60ミクロン、10〜40ミクロン、10〜20ミクロン、10〜16ミクロン、16〜400ミクロン、16〜300ミクロン、16〜220ミクロン、16〜200ミクロン、16〜180ミクロン、16〜160ミクロン、16〜140ミクロン、16〜120ミクロン、16〜100ミクロン、16〜80ミクロン、16〜60ミクロン、16〜40ミクロン、40〜400ミクロン、40〜300ミクロン、40〜220ミクロン、40〜200ミクロン、40〜180ミクロン、40〜160ミクロン、40〜140ミクロン、40〜120ミクロン、40〜100ミクロン、40〜80ミクロン、40〜60ミクロン、100〜400ミクロン、100〜300ミクロン、100〜220ミクロン、100〜200ミクロン、100〜180ミクロン、100〜160ミクロン、100〜140ミクロン、100〜120ミクロン、160〜400ミクロン、160〜300ミクロン、160〜220ミクロン、160〜200ミクロン、160〜180ミクロン、200〜400ミクロン、200〜300ミクロン、または200〜220ミクロンの範囲の多孔度(すなわち平均孔径)を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。他の実施形態においては、多孔質モノリス材料は、異なる多孔度を有する2つの区分を有するガラスフリットまたは焼結ガラスフリットである。各区分は上記の範囲の多孔度(例:4〜10ミクロン区分と16〜40ミクロン区分、または16〜40ミクロン区分と100〜160ミクロン区分)を有しうる。
サンプル調製手順は、典型的には、細胞、細菌またはウイルスといった元の宿主から目的の核酸を遊離させる溶解手順を含む。細胞またはウイルス構造の溶解は、化学的(例:NaOHまたはチオシアン酸グアニジン)、機械的(例:ガラスビーズまたは超音波処理)、または物理的(例:凍結−解凍サイクル)に遂行することができる。組織サンプルについては、溶解手順の前に酵素消化手順を採用しうる。溶解したサンプルは、その後核酸の分離のために本願のモノリスフィルターに装填される。図2A〜2Dは本願のピペットチップ100を用いて核酸を精製する典型的なプロセスを示す。初めに、サンプル材料を、サンプル中の核酸がフィルター20上に保持されるよう内容物を濾過しながら、フィルター20を経てピペット器具に通過させる(または流す)。好ましくは、サンプル材料はフィルター20を経て入口16に向かって戻した後、結合効率を改善するためにフィルター20を経て複数回往復させる(例:2〜5回、2〜10回、2〜25回、2〜20回、5〜10回、5〜15回、5〜20回、10〜15回、10〜20回または15〜20回)。一部の例においては、サンプル材料はフィルター20を経て少なくとも2回、5回、少なくとも10回、少なくとも15回、または少なくとも20回またはそれ以上往復させる。典型的には、流動物はフィルターを通過して第1の方向に流れた後、対応するフィルターを横切って第1の方向と反対の方向に流れ、少なくとも2回フィルターを通過したフロースルー分画をもたらす(図2A)。
1つの態様においては、本願は、低分子量(LMW)核酸(例:胎児核酸)および高分子量(HMW)核酸(例:母体核酸)の両者を含有するサンプルから、LMW核酸および/またはHMW核酸と特異的に結合する1つまたはそれ以上のフィルターを用いてLMW核酸および/またはHMW核酸を濃縮および分別するための方法を提供する。方法は、LMW核酸およびHMW核酸の両者と結合する第1のフィルターにサンプルを通し、第1のフィルターから結合した核酸を回収し、HMW核酸の第2のフィルターとの結合が可能な条件下で回収した核酸を第2のフィルターに通してフロースルー分画を生成する手順であって、フロースルー分画がLMW核酸を含有することを特徴とする手順を含む。一部の実施形態においては、方法は、第2のフィルターからHMW核酸を溶離させ、その後LMW核酸の第2のフィルターとの結合を可能とする条件下でLMW核酸を含有するフロースルー分画を第2のフィルターに通し、さらに第2のフィルターからLMW核酸を溶離させる手順をさらに含む。代替的に、方法は、LMW核酸の第3のフィルターとの結合を可能とする条件下でLMW核酸を含有するフロースルー分画を第3のフィルターに通し、さらに第3のフィルターからLMW核酸を溶離させる手順をさらに含みうる。一部の実施形態においては、第1および第2のフィルターは同じフィルターである。他の実施形態においては、第1のフィルターおよび/または第2のフィルターは相異なる多孔度の2つのサブフィルターをそれぞれ含む。一部の実施形態においては、サブフィルターは互いに離れて配置される。他の実施形態においては、サブフィルターはサブフィルター間に全く空隙を伴うことなく互いに隣接して配置される。さらに他の実施形態においては、サブフィルターは互いに融着されて相異なる多孔度の2つの区分を有する単一のモノリス構造を形成する。他の実施形態においては、第1および第2のフィルターは相異なる多孔度の2つのサブフィルターを有する同じフィルターである。
本願の他の態様は、血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するためのキットを提供する。キットは上記の要素の任意の組み合わせを含みうる。1つの実施形態においては、キットは:円錐台形状を有しかつピペッティング機器の末端に契合するよう寸法取りされている1つまたはそれ以上のピペットチップを含む。1つまたはそれ以上のピペットチップは、約16ミクロンと約40ミクロンの間の孔径を有する硬質、自立型でほぼモノリスである焼結ガラス構造物を含むフィルターを含む1つのチップを含む。一部の実施形態においては、キットは、条件が0%を上回り10%未満のアルコールおよび約1.0Mから約4.0Mの間の範囲のグアニジンを含むことを特徴とする、母体核酸をフィルターに結合させるための条件を提供するよう配合された少なくとも1つの結合バッファー;および条件が約10〜25%の範囲のアルコールおよび約1.0Mから約5.0Mの間の範囲のグアニジンを含むことを特徴とする、胎児核酸をフィルターに結合させるための条件を提供するよう配合された少なくとも1つの結合バッファーをさらに含む。一部の実施形態においては、キットは、焼結ガラス構造物からDNAを溶離するために適切に配合された少なくとも1つの溶離バッファーおよび焼結ガラス構造物と結合しない異物を除去するために適切に配合された少なくとも1つの洗浄バッファーをさらに含む。一部の実施形態においては、1つまたはそれ以上のピペットチップは、その中に配置された2つまたはそれ以上のチップを含む。1つの実施形態においては、1つまたはそれ以上のピペットチップは、相異なる多孔度の2つの区分を有するガラスモノリスフィルターを有するチップを含む。他の実施形態においては、1つまたはそれ以上のピペットチップは多孔度の相異なる2つのフィルターを有するチップであって、一方のフィルターの末端が他方のフィルターの末端と融着されることを特徴とするチップを含む。
本願に従った方法を実施する任意の様態を採用することができる。しかし、フィルターチップの特性、適合性、簡素性、およびワークフローは、それが容易に適合化され、自動化され、かつ数多くの臨床サンプルマトリクス、装填サンプル体積、および液状物操作システムに対して有効となることを可能とする。したがって、好ましい実施形態においては、操作の様態はある種の自動化を含む。
エッペンドルフepMotion5070液状物操作ロボットを、1.2mLエッペンドルフピペットチップに包埋した大孔径アコーニTruTip(登録商標)マトリクス、2mL深型ウェルプレート(USAサイエンティフィック)、アコーニTruTip(登録商標)抽出試薬、およびサンプルマトリクスとしての鼻咽頭吸引物と共に用いた。epMotion5070液状物操作ロボットは8チップのみを同時に保持するので、ベースライン自動化プロトコルは8サンプル同時抽出用に記述した。しかし、1枚の96ウェル深型ウェルサンプルプレートでは1プログラムで24サンプルまで処理することができる。16または24サンプルの処理用に別のepMotionプログラムを入手することができる(また必要とされる)。以下に概要を示すプロトコルは、8サンプル自動化スクリプト用である。
1.1 抽出を開始する前に鼻咽頭サンプルを室温中に取り出す。
1.2.鼻咽頭吸引物100μL+非ヌクレアーゼ含有水150μLをサンプルプレートのカラム1に分注する;図3A)。
1.3 サンプルプレートをepMotionワークテーブルの位置B1に載置する(図3B)。
1.4 ピペットチップ、フィルターチップおよび30mL試薬トラフをepMotionワークテーブルのそれぞれの位置に載置する(図3B)。
1.5 エッペンドルフepBlueソフトウェアを開き、アコーニが8サンプル用に提供するRunファイルを選択し、RUNタブ上のRUNボタンをクリックして方法を読み込む。
1.6 Levelセンサー設定でLevelとTipを選択し、さらにRUNボタンをクリックする。
1.7 サンプル体積をソフトウェアに入力し、RUNをクリックする。
1.8 epMotionスクリプトが、ワークテーブルの位置B2に位置する試薬レザバーに抽出および溶離試薬を補充するようユーザーに要求する。各試薬の推奨体積をそれぞれのトラフに補充する。8サンプルに対する最小試薬体積を表1に示す。
1.10 RUNを選択して自動化法を開始する。自動化スクリプトは、ユーザーが介入することなく以下の手順(すなわち1.11〜1.23)を経て進行する。
1.11 溶解バッファーD 374μLをカラム1に分注すると共に10サイクル(吸引+分注=1サイクル)混合する。この手順から分解インキュベーションプロセスが開始し、同時に残りの試薬が分取される。
1.12 洗浄バッファーD 1.6μLをカラム2に分注する。
1.13 洗浄バッファーE 1.6μLをカラム3に分注する。
1.14 溶離バッファーA 50μLをカラム4に分注する。
1.15 6分間休止して分解バッファーD中での10分間のサンプルインキュベーションを完了する。
1.16 カラム1の各ウェルにエタノール375μLを加え、各サンプルを10ピペッティングサイクルでエタノールと混合する。
1.17 8本のフィルターチップをワークテーブル上の位置A2から装填し、図3Aおよび3Bに概要を示す抽出プロセスを開始する。
1.18 サンプル/溶解バッファー/エタノール混合液をサンプルプレートカラム1から7サイクル吸引および分注し、核酸をTruTip(登録商標)マトリクスと結合させる。TruTip(登録商標)マトリクスを流れるサンプル流量は変動することがあるものの(臨床サンプルの粘度の違いによる)、核酸収量は影響されない。サンプルの流動を改善するための選択肢は、考察において記載する。
1.19 フィルターチップをサンプルプレートカラム2に移動し、マトリクスを通して洗浄バッファーDで5回サイクルし、残留溶解バッファーおよびサンプルマトリクスを除去する。
1.20 フィルターチップをサンプルプレートカラム3に移動し、マトリクスを通して洗浄バッファーEで5回サイクルし、タンパク質およびその他の汚染物質を結合した核酸から除去する。
1.21 フィルターチップを(ワークテーブルの位置B2の)位置1の空の試薬レザバーに移動し、(高流量で)80回サイクルしてマトリクスを乾燥する。溶離する核酸標本中の残留溶媒は逆転写酵素およびTaqポリメラーゼなどの酵素に好ましくない影響を与えるので、フィルターチップを完全に乾燥することが重要である。
1.22 フィルターチップをサンプルプレートのカラム4に移動し溶離バッファーAで5回サイクルする。抽出および精製された核酸はこのときサンプルプレートカラム4のウェル内の溶離バッファー中に存在する。
1.23 フィルターチップをepMotionの廃棄物容器に押し出す。
鼻咽頭吸引物からのインフルエンザRNA抽出についてのリアルタイムPCRデータを図4に示す。平均Ct値における線形反応が104ゲノムコピーmL−1と106ゲノムコピーmL−1の間のインフルエンザで認められ(インフルエンザAおよびBについてそれぞれR2=0.99および0.98)、平均Ct値の標準偏差は1サイクル未満である。8、16および24サンプルについての総サンプル処理時間は、それぞれ16、28および40分である。典型的な鼻咽頭吸引物またはスワブはインフルエンザAまたはBを>104TCID50mL−1含有し、これは>107ゲノムコピーml−1(1TCID50あたり1000ビリオンと仮定)を表しているので、それゆえ自動化epMotionプロトコルは大半の臨床NPA検体に対して有効であると予測される。
ハミルトンSTAR液状物操作ロボットを用いて、全血からの96サンプルの自動化抽出を実証した。ハミルトンSTARは、デッキ上でオプションのヒーター/シェーカーユニットを利用できるという点でepMotionシステムと異なり、これは全血などのいくつかの臨床マトリクスの酵素的消化にとって重要である。システムは96チャネルピペットヘッドに嵌合することができるので、フィルターチップ手順および試薬のそれぞれに専用の96ウェルプレートがある。
2.1 STAR機器およびコンピュータの電源を入れる。
2.2 ハミルトンRun Controlソフトウェアを開く。
2.3 アコーニが96サンプル用に提供するRunファイルを開く。
2.4 実験器具を図5に示すようにSTARデッキに配置する。
2.5 表3に従い、対応するトラフに試薬を分注する(体積は96サンプルの処理に必要とされる最小量を示す):
2.7 サンプルキャリアーラック(図5のデッキ位置4)にサンプルチューブを配置する。サンプル1をキャリアーの左端の最後部に配置し、各キャリアーを連続的に下に移動し、正面右のサンプル96で終了する。
2.8 Runファイルウインドウの左上のPLAYボタンを選択する。自動化スクリプトはユーザーが介入することなく以下の手順で進行する。
2.9 各サンプルチューブから200μLをヒーター/シェーカーモジュール上の位置14にあるインキュベーションプレートに移す(図5)。
2.10 プロテイナーゼK80μLをインキュベーションプレートの各サンプルウェルに分注する。
2.11 溶解バッファーF 600μLをインキュベーションプレートの各ウェルに分注する。
2.12 フィルターチップで溶液を10サイクル混合し、さらにその後70℃かつ500rpmで20分間インキュベートする。サンプルをインキュベートすると同時に、液状物操作システムが試薬をその対応するプレートおよびウェルに分注して作動し続ける。
・位置10の深型ウェルプレートの各ウェルにエタノール800μL。
・位置11の深型ウェルプレートの各ウェルに洗浄バッファーJ 1.6mL。
・位置12の深型ウェルプレートの各ウェルに洗浄バッファーK 1.6mL。
・位置13の深型ウェルプレートの各ウェルに溶離バッファーA 100μL。
2.13 20分間インキュベートした後、サンプル混合物をインキュベーションプレートから位置10の深型ウェルプレートに移し、さらに12ピペッティングサイクルで混合される。
2.14 試薬チップを廃棄物容器に押し出す。
gDNA血液手順のこの部分は、洗浄試薬の組成とサイクル数以外は、epMotionインフルエンザのプロトコルと非常に類似している。ハミルトンTruTip(登録商標)チップは液状物レベルの感知を可能とするため炭素含浸されているので、ユーザーはTruTip内の液状物の流動を容易に目視できない。
2.15 デッキ位置3から96本のTruTip(登録商標)を装填する。
2.16 位置10のサンプル/溶解バッファー/エタノール混合液を10サイクル吸引および分注し、核酸をTruTip(登録商標)マトリクスと結合させる。
2.17 フィルターチップを位置11に移動し、マトリクスを通して洗浄バッファーJで5回サイクルし、残留溶解バッファーおよびサンプルマトリクスを除去する。
2.18 フィルターチップを位置12に移動し、洗浄バッファーKで5回サイクルしてタンパク質およびその他の汚染物質を結合した核酸から除去する。
2.19 フィルターチップを高速で40回サイクルして風乾する。
2.20 フィルターチップを位置13に移動し溶離バッファーA2中で5回サイクルする。抽出および精製された核酸はこのとき深型ウェルプレート中の溶離バッファー内に存在する。
2.21 フィルターチップを廃棄物容器に押し出す。
ヒトゲノムDNAに対して実施する分子的試験の範囲を考えると、全血からの核酸抽出の主要な目的は純度の高い高分子量ゲノムDNAを生成することである。96サンプル用自動化プロトコルは1時間以内に完了する。図6Aは、ハミルトンSTARプロトコルで45本の試薬ブランクと同時に処理した45本の陽性血液サンプルについてのUV/可視光吸光度プロフィールを示し、平均A260/280比は1.96でありかつ平均A260/230比は1.93である。1.7〜2.0の平均A260/280比および>1.7のA260/230比は、一般に、非常に純度の高いDNAである、残留塩、タンパク質または溶媒を含まない、および大半の下流の分子的用途に許容されることを示す。図6Bの1%アガロースゲルは、生成するgNDAが高分子量(>24Kb)で剪断が最小限であることを示す。全45本の陽性サンプル一式に由来するヒトDNAを、LightCycler(登録商標)480システム上でQuantifiler(登録商標)ヒトDNA定量キット(ライフテクノロジーズ)により定量し、全血200μLあたりヒトDNA5.26±0.46μgの平均収量をもたらした。
非侵襲的出生前診断(NIPD)は、胎児奇形および流産を含む多くのリスクを負う標準的な出生前診断法の代替となるその能力によって、革新的な医療の進歩を提供する、重要かつ急速に成長する市場である。そればかりか、母体の血漿中に存在する胎児DNAの遺伝的異常を検査することに必要なのは簡易な採血のみである。この方法は、出生前診断のよりリスクの低い手法を提供するものの、特殊な処理技術を必要とするサンプルの種類には多くの困難もある。第1に、妊娠初期の胎児DNAは母体血漿中に低濃度で存在するので、大量のサンプルを処理および濃縮して分析に適した量を達成できることが重要である。しかし、現在市販されているキットではわずか250μL〜5mLを装填して総核酸を分離することができる。第2に、循環胎児DNAは、母体血漿中で高い母体循環DNAバックグラウンド中で存在する(Lo 1997)。血液サンプルを適切な時点で(<24時間)処理しなければ、母体DNAバックグラウンドが時間と共に上昇して存在する%胎児DNAのさらなる低下を引き起こす(Barrett 2011)。この低比率は、胎児DNAに特異的な遺伝子の種々のコピー数を正確に定量することを困難にする。さらに、母体血漿サンプルは、どれだけ迅速に処理されるかに応じて、スピンカラム結合材料の目詰まりを引き起こす凝固因子および他のタンパク質および凝固剤を含有することがある。第3に、規制当局が承認する臨床診断測定法に移行する場合に自動化が容易であることは重要な能力であるが、現在のキットは自動化が容易でないシリカスピンカラム法を用いている。
3.1.1 プロテイナーゼKを5mLサンプルチューブに615μLずつ分注する(1サンプルにつき5mLサンプルチューブ2本)。
3.1.2 キャリアーRNAをサンプルチューブに1μg(0.2μg/μLを5μL)ずつ添加する。
3.1.3 溶解バッファーCN−L1をサンプルチューブに6.2mLずつ添加する。
3.1.4 血漿サンプルをサンプルチューブに5mL添加する。
3.1.5 サンプルチューブをボルテックスの最大スピードで30秒間振盪する。
3.1.6 水浴内で60℃で30分間インキュベートする。
3.1.7 結合バッファーCN−B1をサンプルチューブに12mL添加する。
3.1.8 BSA(20mg/mL)をサンプルチューブに10μL(20mg/mL)添加する。
3.1.9 サンプルチューブをボルテックスの最大スピードで15秒間振盪する。
3.1.10 サンプルチューブを氷上で5分間インキュベートする。
3.2.1 胎児および母体DNAのフィルターへの結合
3.2.1.1 20mLピペットチップをモーター駆動ピペットフィラーに着接する。
3.2.1.2 サンプルチューブA内で液状サンプルを18サイクルピペッティングする(サイクル=吸引+分注)。
3.2.1.3 サンプルチューブBについて手順3.2.1.2を繰り返す。
3.2.1.4 (液状サンプルの入った)サンプルチューブを廃棄するが、ピペットチップは保持する。
このとき核酸はピペットチップフィルターと結合している。
3.2.2 洗浄
3.2.2.1モーター駆動ピペットフィラーを用いて、ピペットチップにより洗浄バッファーを1サイクルピペッティングする。
3.2.2.2 洗浄バッファーは廃棄するがピペットチップは保持する。
3.2.2.3 手順3.2.2をさらに3回繰り返す。
核酸はまだピペットチップフィルターと結合している。
3.2.3 乾燥
3.2.3.1 モーター駆動ピペットフィラーを用いて、ピペットチップフィルターに15サイクル通気する。相当量の洗浄バッファーが残っている場合は、ピペットチップを穏やかに間欠的にタッピングする。
この手順は、過量の洗浄バッファーから発生しうるPCR阻害を回避するためのものである。
3.2.3.2 1分間待ってピペットチップフィルターを完全に乾燥させる。
核酸はまだピペットチップフィルターと結合している。
3.2.4 精製された母体および胎児核酸をピペットチップから溶離する。
3.2.4.1 溶離バッファーをピペットチップ内に吸い上げ、1分間待って溶離バッファーをフィルター上でインキュベートする。
3.2.4.2 液状物を溶離1チューブにピペッティングし、合計5サイクル繰り返す。
3.2.4.3 溶離2チューブで手順3.2.4.1および3.2.4.2を繰り返す。
3.2.4.4 チューブを遠心機に付して内容物を底に集め、溶離チューブ1および2のサンプルを合わせる。
3.2.4.5 溶離チューブに収容された総体積を測定し、溶離バッファーA2を加えて全量を450μLとする。
このとき抽出された核酸は溶離チューブ内に存在する。
3.2.4.6 ピペットチップを廃棄する。
このとき精製された核酸は排除および濃縮できる状態である。
3.1.1 準備
3.3.1.1 手順3.2.4.5からの溶離サンプルを、適切なサンプル番号をラベル表示した2mLマイクロ遠心チューブに移す。
3.3.1.2 結合バッファーCN−B2を495μL加える。
3.3.1.3 サンプルをボルテックスで10秒間振盪しさらにパルス遠心する。
3.3.2 HMW核酸をピペットチップと選択的に結合させる。
3.2.2.1 1mL4mmピペットチップを電子ピペットに着接する。
3.2.2.2 サンプルチューブの液状サンプルを20サイクルピペッティングする(サイクル=吸引+分注)。
3.3.2.3 サンプルチューブを閉じ、取り出す。
廃棄してはならない;サンプルチューブは胎児DNAを含んでいる。
3.3.2.4. ピペットチップを保持する。
このとき高MW核酸(母体DNA)はピペットチップフィルターと結合している。
3.3.3 (ピペットチップをすすぐ)
3.3.3.1 リンスチューブ内で液状物を5サイクルピペッティングする。
3.2.2.2 リンスチューブは廃棄するがピペットチップは保持する。
核酸はフィルターから遊離する。
3.4.1 準備
3.4.1.1 結合バッファーCN−B3をサンプルチューブに575μL加える。
3.4.1.2 サンプルチューブをボルテックスで10秒間振盪しさらにパルス遠心する。
3.4.2 LMW核酸を結合させる。
3.4.2.1 サンプルチューブ内で液状物を20サイクルピペッティングする。
3.4.2.2 サンプルチューブは廃棄するがピペットチップは保持する。
このとき核酸はフィルターと結合している。
3.4.3 LMW核酸の洗浄
3.4.3.1 レイニンピペットに対して上記と同じ条件を維持する。
3.4.3.2 洗浄1チューブ内で液状物を1サイクルピペッティングする。
3.4.3.3 洗浄1チューブは廃棄するがピペットチップは保持する。
3.4.3.4 溶離2チューブで手順3.4.3.2および3.4.3.3を繰り返す。
核酸はまだフィルターと結合している。
3.4.4 乾燥
3.4.4.1 ピペットチップを空の乾燥チューブに入れ、ピペットチップに15サイクル通気する。相当量の洗浄バッファーが残っている場合は、ピペットチップを穏やかに間欠的にタッピングする。
この手順は、過量の洗浄バッファーから発生しうるPCR阻害を回避するためのものである。
3.4.4.2 1分間待ってフィルターを完全に乾燥させる。
核酸はまだピペットチップフィルターと結合している。
3.4.5 溶離
3.4.5.1 溶離チューブ内の液状物をピペットチップ内に引き上げ、1分間待って溶離バッファーをフィルター上でインキュベートする。
3.4.5.2 溶離チューブ内で液状物を合計10サイクルピペッティングする。
3.4.5.3 溶離したサンプルを溶離チューブ内に保持する。
このとき抽出された核酸は溶離チューブ内に存在する。
3.4.5.4 ピペットチップを廃棄する。
このとき、精製された核酸はPCR増幅または−20℃(長期保存には−80℃)での保存ができる状態である。
(DNA回収効率)
男性および女性全長ゲノムDNA(プロメガ)を、ガラスビーズを有するPCRチューブの側壁でホーンソニケーターを用いてフラグメント化し、さらに女性および男性DNAについて超音波処理時間を最適化して所望のフラグメント範囲を生成し、プロトコルの排除手順用にサイズ間を識別する能力を開発および実証した。結果を図8Aに示す。男性DNAは<600bpのサイズ範囲にフラグメント化し(約150bp前後が中心)、血漿サンプル中の循環胎児DNAをシミュレーションした。女性DNAは約400bpから1200bpのサイズ範囲にフラグメント化し(約800bp前後が中心)、血漿サンプル中の母体DNAをシミュレーションした。フラグメント化女性DNA200ngおよび種々の量のフラグメント化男性DNA(1、3、10、30および100ng)の混合物を含有するサンプルを調製し、実施例3に記載のDNA抽出プロトコルで抽出した。図8Bは、フラグメント化男性DNA(Chrom Y)DNAおよび総DNA(Chrom1)の回収物のqPCR結果を示す。3回の抽出の平均であるデータを示す。各抽出サンプルはqPCRにより2回ずつ測定した。結果は、試験濃度範囲内で有効な男性DNA回収量が達成されかつキアゲン循環核酸キットを用いた収量と匹敵することを示す。キアゲン法と比較して低いTruTipについての総DNA回収量は、TruTipプロトコルの濃縮効果を証明している。
フラグメント化男性および女性DNAの混合物(装填)を、手順3.3によって、またはこれを用いない実施例3の基本的プロトコルを用いて抽出した。図9に示すように、排除手順3.3がない場合、濃縮手順3.4は男性DNAを80%回収し、装填量(約2.4%)と比較してわずかに濃縮することができた。排除手順3.3が濃縮手順に含められると、結果は男性DNA(CHY)についてわずかに低いが女性DNAについては著しく低い回収率がみられることを示し、その結果この場合の%胎児DNAは全体的に約8%上昇する(表7)。
ハミルトンSTARplus機器を用いて、母体血漿5mLより遊離循環胎児DNAを抽出するための自動化プロトコルを開発および実証した。STARplusシステムは、一方が8×5mLチャネルでかつ一方が8×1mLチャネルの、2台の自動化ピペットチャネルアームを支持することができる。これらのアームは、各8サンプルのバッチで交互処理を実施するために平行して作動することができる。初回の大量抽出には5mLフィルターチップを用いてよく、また抽出された核酸のサイズ分別およびさらなる濃縮には1mLフィルターを用いてよい。
5.1 STARplus機器およびコンピュータの電源を入れる。
5.2 ハミルトンRun Controlソフトウェアを開く。
5.3 アコーニより8サンプルの大量血漿サンプル用に提供されたRunファイルを開く。
5.4 実験器具を図10に示すようにSTARplusデッキに配置する。
5.5 表8に従い、試薬をその対応するレザバーに分注する。
5.7 サンプルキャリアーラック(図10Aのデッキ位置3)にサンプルチューブを配置する。再後部にサンプル1を配置し、デッキの前方に連続的に移動する。
装填サンプルの体積が大きいので、ハミルトンSTARplus機器の外で水浴中での前処理手順を実施しなければならない。自動化プロトコル中のユーザーの介入を要する手順は文頭の米印(*)(および太字)で表示する。
サンプルをプロテイナーゼKおよび溶解バッファーでインキュベートしてサンプルをホモジナイズしかつ細胞を溶解してDNAを遊離させる。
5.8 Runファイルウインドウの左上のPLAYボタンを選択する。
5.9 自動化スクリプトで血漿5mL、プロテイナーゼK 615μL、および溶解バッファーCN−L1 6.3mLを各50mLコニカルチューブに添加すると、その後PAUSEとなる。
5.10 *サンプルデッキより50mLコニカルチューブを取り出し、ボルテックスで30秒間高速振盪し、水浴またはヒートブロック上で30分間60℃でオフラインインキュベーションを実施する。コニカルチューブをハミルトンデッキから取り出した後、自動化スクリプトをRESUMEとして引き続き試薬をそれぞれのプレートおよびウェルに分注する(図10Bおよび10C)。
・CN−W1 2mLを位置9カラム1のウェルに1つおきに分注する。
・CN−W2 2mLを位置9カラム2のウェルに1つおきに分注する。
・CN−W4 2mLを位置9カラム3のウェルに1つおきに分注する。
・EA2 250μLを位置9のカラム4および5のウェルに1つおきに分注する。
・EBB 1mLを位置10カラム2の全ウェルに分注する。
・CN−W3 500μLを位置10カラム3の全ウェルに分注する。
・CN−W4 500μLを位置10カラム4の全ウェルに分注する。
・EBA2 50μLを位置10カラム5の全ウェルに分注する。
5mLチャネルは各サンプルを隣り合ったウェルで使用するには口径が大きすぎるので、自動化プログラムではデッキ位置9の深型ウェルプレートの1つおきのウェルに試薬を分注する。
試薬を分注すると、プログラムはPAUSEとなる。
5.11 *30分、60℃でのインキュベーション後、50mLコニカルチューブを氷上に5分間載置する。
5.12 *50mLコニカルチューブをデッキ位置4のサンプルキャリアーラック内の元の位置に戻し、自動化スクリプトをRESUMEとする。
5.13 結合バッファーCN−B1を各サンプルチューブに12mL添加し、10回混合する。
5mLフィルターチップを用いて溶解血漿サンプルから総DNAを抽出してもよい。
5.14 大量核酸抽出用に5mLフィルターチップを位置2から取り出す。
5.15 50mLコニカルチューブ中で、チューブの底から開始して各ピペッティングサイクル後に3mm上に移動しながら、サンプル混合物を15回サイクルする。この手順で総核酸を結合マトリクスと結合させる。
5.16 フィルターチップを位置6の深型ウェルプレートカラム1に移動し、洗浄バッファーCN−W1中で1回サイクルする。
5.17 フィルターチップを位置9のカラム2に移動し、洗浄CN−W2中で1回サイクルする。
5.18 フィルターチップを位置9のカラム3に移動し、洗浄CN−W4中で2回サイクルする。
5.19 フィルターチップを位置9のカラム4に移動し、高速で40回サイクルして結合マトリクスを乾燥する。
5.20 フィルターチップを位置9のカラム5に移動し、10回サイクルして結合した核酸を5mLフィルターチップから溶離させる。これは大量溶離物#1である。
5.21 フィルターチップをカラム6に移動し、溶離バッファーの第2の分取物を用いて手順を繰り返す。これは大量溶離物#2である。
5.22 溶離物#2を位置9のカラム5に移動して溶離物#1と合わせ、さらにフィルターチップを廃棄する。
高分子量DNAを抽出サンプルから除去し、残りのDNAを分離および濃縮する。
5.23 手順5.22の混合した溶離液を位置10のカラム1に添加し、完全に10回混合する。
5.24 位置13から1mLフィルターチップを取り出し、20回サイクルして高分子量DNAをマトリクスと結合させる。
5.25 フィルターチップを位置10のカラム2に移動し5回サイクルしてチップをすすぐ。フィルターチップは保持し、位置13のチップラックに戻す。
5.26 位置12の試薬チップを用いて、結合バッファーCN−B3を位置10カラム1のサンプルに575μL添加しさらに10回混合する。
5.27 手順5.25のフィルターチップを取り出し、位置10のカラム1に戻し、20回サイクルしてサンプル由来の残りのDNAを1mLチップに結合させる。
5.28 フィルターチップを位置10のカラム4に移動し洗浄CN−W3中で1回サイクルして残余阻害物質をすべて除去する。
5.29 フィルターチップを位置10のカラム5に移動し洗浄CN−W4中で1回サイクルしてCN−W3由来の残余のグアニジンを除去する。
5.30 フィルターチップを位置10のカラム5の上に持ち上げし、35回通気サイクルしてマトリクスを乾燥させる。
5.31 フィルターチップを位置10のカラム6に移動し、EBA2中で10回サイクルして精製、サイズ選択および濃縮した核酸を溶離させる。
5.32 ピペットチップを廃棄する。
5.33 溶離したサンプルをカラム6から位置11の1.5mLチューブに移す。
抽出したサンプルは保存または下流処理できる状態である。
大量フィルターチップ手順で処理したプール母体血漿サンプルの8回反復実施サンプルのリアルタイムの結果を図11Aに示す。プロトコルの全体(オフラインでのプロテイナーゼK前処理を含む)は約2時間で完了する。すべての反復実施にわたる平均Ct値は胎児男性(CHY)および総(CH1)DNAについてそれぞれ34.58±0.66および29.76±0.50であり、これは自動化抽出法の優れた反復性を証明する。標準に対するフィットポイント分析比較に基づき、総DNAプール中の胎児DNA濃度(ゲノム当量)を算出した結果、全サンプルを通じた%胎児DNAの平均は2.8%であった。サンプルは抽出を実施する前にプールされていたので、このサンプルについての実際の%胎児DNAは不明である。
Claims (28)
- 液状サンプルから核酸を精製するための自動化法であって:
(a)フィルターが核酸と特異的に結合することを特徴としかつ自動化ロボットプラットフォームが試薬を自動的に分注し、サンプル内容物を取出し、かつピペットチップおよび/またはサンプルチューブを移動することを特徴とする、各チップが第1の開口部と第2の開口部の間の流路を規定するハウジングおよび前記流路の1区分を占める前記フィルターを含む、複数の前記ピペットチップを前記ロボットプラットフォームに装填すること;
(b)核酸が前記ピペットチップを通過しかつその中の前記フィルターと結合するよう前記核酸を含む液状サンプルの少なくとも一部分を前記ピペットチップの第1の開口部から流し入れること;
(c)前記液状サンプルの一部分が前記ピペットチップ外に出る間に2回目に前記フィルターを通過することを特徴とする、前記液状サンプルの一部分を前記第1の開口部を経て前記ピペットチップから排除すること;
(d)溶離バッファーが前記ピペットチップに出入りする間に前記フィルターを通過することを特徴とする、前記溶離バッファーを前記ピペットチップの前記第1の開口部から流し入れかつ前記溶離バッファーを前記ピペットチップから前記第1の開口部を経て排除することによって前記核酸を前記フィルターから溶離させることを含む前記自動化法。 - 請求項1に記載の前記方法であって、手順(b)〜(d)が前記複数のピペットチップのそれぞれにおいて遂行されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の方法であって:
洗浄バッファーが前記ピペットチップに出入りする間に前記フィルターを通過することを特徴とする、前記洗浄バッファーを前記第1の開口部から前記ピペットチップに流し入れかつ前記洗浄バッファーを前記第1の開口部を経て前記ピペットチップから排除することによって前記フィルターを洗浄することをさらに含む前記方法。 - 請求項3に記載の前記方法であって、前記洗浄手順が2回またはそれ以上反復されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記サンプルを流しかつ排除する手順が前記の液状サンプルのすべてが前記フィルターを少なくとも1回通過するまで反復されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記フィルターが自立型ガラスフリットを含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項6に記載の前記方法であって、前記ガラスフリットが核酸の結合を促進する薬剤によって処理またはコーティングされていない焼結ガラスフリットであることを特徴とする前記方法。
- 請求項6に記載の前記方法であって、前記ガラスフリットが約2ミクロンと約220ミクロンの間の孔径を有しかつ約2mmと約20mmの間の厚さを有することを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記液状サンプルが母体および胎児核酸を含有する血漿を含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項9に記載の前記方法であって、前記ピペットチップが多孔度の相異なる2つまたはそれ以上のフィルターを含むことを特徴とし、前記2つまたはそれ以上のフィルターのそれぞれが核酸と特異的に結合することを特徴とする前記方法。
- 血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分別および分離するための方法であって:
(a)胎児および母体核酸の第1のフィルターとの特異的結合を可能とする条件下で前記胎児核酸および母体核酸を含む血漿サンプルを前記第1のフィルターに流すこと;
(b)結合した胎児および母体核酸を前記第1のフィルターから溶離させて胎児核酸および母体核酸を含む濃縮核酸サンプルを形成すること;
(c)前記母体核酸が第2のフィルターと特異的に結合しかつ前記胎児核酸が前記第2のフィルターを通過することを可能とする条件下で前記濃縮核酸サンプルを前記第2のフィルターに流すこと;および
(d)前記第2のフィルターからの前記フロースルー分画が胎児核酸を含有することを特徴とする、前記第2のフィルターからの前記フロースルー分画を捕集することを含む前記方法。 - 請求項11に記載の前記方法であって、手順(a)における前記胎児および母体核酸の前記第1のフィルターとの特異的結合を可能とする前記条件が前記血漿サンプル、約17〜25%(v/v)の間の範囲の脂肪族アルコールおよび約0.5Mから約4.0Mの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第1の結合混合物を形成することを含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項11に記載の前記方法であって、手順(c)において前記母体核酸を前記第2のガラスフリットフィルターと結合させるための前記条件が前記濃縮核酸サンプル、約0〜10%(v/v)の間の範囲の脂肪族アルコールおよび約1Mから約4.0Mの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第2の結合混合物を形成することを含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項11に記載の方法であって:
(e1)結合した母体核酸を前記第2のフィルターから溶離させて再生された第2のフィルターを生成すること;
(f1)胎児核酸の前記第2のフィルターとの結合を可能とする条件下で前記第2のフィルターからの前記フロースルー分画を前記の再生された第2のフィルターに流すこと;および
(h1)結合した胎児核酸を手順(f1)における前記第2のフィルターから溶離させることという手順をさらに含む前記方法。 - 請求項14に記載の前記方法であって、手順(f1)における前記胎児核酸を前記第2のフィルターと結合させるための前記条件が前記第2のガラスフリットフィルターからの前記フロースルー分画、約10〜25%(v/v)の間の範囲の脂肪族アルコールおよび約1Mから約5.0Mの間の濃度範囲のカオトロピック塩を含む第3の結合混合物を形成することを含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項11に記載の方法であって:
(e2)胎児核酸の前記第1のフィルターとの結合を可能とする条件下で前記第2のフィルターからの前記フロースルー分画を前記第1のフィルターに流すこと;および
(f2)結合した胎児核酸を手順(e2)における前記第1のフィルターから溶離させることという手順をさらに含む前記方法。 - 請求項11に記載の前記方法であって、前記第1および第2のフィルターが自立型ガラスフリットであることを特徴とする前記方法。
- 請求項17に記載の前記方法であって、前記ガラスフリットが焼結ガラスフリットであることを特徴とする前記方法。
- 請求項17に記載の前記方法であって、前記第1のガラスフリットフィルターが16〜40ミクロンの孔径を有しかつ前記第2のガラスフリットフィルターが4〜10ミクロンの孔径を有することを特徴とする前記方法。
- 請求項11に記載の方法であって:
(e3)前記胎児核酸の第3のフィルターとの結合を可能とする条件下で前記第2のフィルターからの前記フロースルー分画を前記第3のフィルターに流すこと;および
(f3)結合した胎児核酸を前記第3のフィルターから溶離させることという手順をさらに含む前記方法。 - 請求項11に記載の前記方法であって、前記第1および第2のフィルターの一方または両者が第1の孔径を有する第1の区分および第2の孔径を有する第2の区分を含むガラスフリットを含むことを特徴とし、前記第1の孔径が前記第2の孔径と異なることを特徴とする前記方法。
- 請求項11に記載の前記方法であって、前記第1のフィルターおよび前記第2のフィルターが同じフィルターであることを特徴とする前記方法。
- 血漿サンプルにおいて母体核酸から胎児核酸を分離するためのキットであって:
自立型ガラスフリットフィルターを含むピペットチップであって、前記ガラスフリットフィルターが2〜220ミクロンの孔径を有しかつ核酸の前記ガラスフリットとの結合を促進する薬剤によって処理またはコーティングされていないことを特徴とするピペットチップ;
血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール約17〜25%v/vおよび約0.5Mから約4.0Mの濃度のカオトロピック塩を有する第1の結合混合物を提供するよう配合された第1の結合バッファー;および
血漿サンプルと混合されかつ脂肪族アルコール約0〜10%v/vおよび約1Mから約4.0Mの濃度のカオトロピック塩を有する第1の結合混合物を提供するよう配合された第2の結合バッファーを含む前記キット。 - 請求項23に記載のキットであって、前記ピペットチップが0.5〜50mLのチップ体積を有することを特徴とする前記キット。
- 請求項24に記載のキットであって、自立型ガラスフリットフィルターを含む追加的ピペットチップをさらに含み、前記追加的ピペットチップが0.5〜50mLのチップ体積を有することを特徴とする前記キット。
- 請求項24に記載の前記方法であって、前記ガラスフリットフィルターが16〜40ミクロンの孔径を有しかつ前記追加的ピペットチップ内の前記ガラスフリットフィルターが4〜10ミクロンの孔径を有することを特徴とする前記方法。
- 請求項24に記載の前記キットであって、前記ガラスフリットフィルターが第1の孔径を有する第1の区分および第2の孔径を有する第2の区分を含む融着ガラスフリットを含むことを特徴とする前記キット。
- 請求項27に記載の前記キットであって、前記第1の区分が100〜160ミクロンの孔径を有しかつ前記第2の区分が16〜40ミクロンの孔径を有するか、または前記第1の区分が16〜40ミクロンの孔径を有しかつ前記第2の区分が4〜10ミクロンの孔径を有することを特徴とする前記キット。
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