CN107576555A - 分离收集液体样本中目标微粒的装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种分离收集液体样本中目标微粒的装置，包括提取单元和收集单元，该提取单元可拆卸地连接于该收集单元，该提取单元包括第一过滤层和第二过滤层，该第一过滤层的第一孔径大于该第二过滤层的第二孔径，该装置包括第一工作模式和第二工作模式，当该装置处于第一工作模式时，该第二过滤层位于靠近该收集单元的一侧使液体样本先流经第一过滤层再流经第二过滤层；当该装置处于第二工作模式时，该第一过滤层位于靠近该收集单元的一侧使清洗液先流经第二过滤层再流经第一过滤层。本发明还提供一种分离收集液体样本中目标微粒的方法。本发明所提供的装置和方法可用于提取生物样本中的胞外囊泡，如外泌体。

Description

分离收集液体样本中目标微粒的装置及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种分离收集液体样本中特定组分的装置及方法。

背景技术

在细胞生物学中，囊泡(vesicles)指一类体积相对较小的细胞内囊状构造，这些囊泡外围由至少一层的脂质双层分子膜构成，用来存放、消化或传送物质。哺乳动物细胞产生和释放大量的胞外囊泡(extracellular vesicles)，在细胞来源、形成途径、物质组成和生物功能等方面各有不同。胞外囊泡多数起源于内吞体或质膜，目前至少包括三种主要类型：外泌体(exosome)、微泡(microvesicle)及凋亡小体(apoptotic body)。

每一种胞外囊泡均可从正常或癌变细胞产生，向邻近或远处细胞运输生物活性物质，调控生理学或病理学相关的细胞行为，如肿瘤的发生和发展。因此，胞外囊泡实际上代表了一种十分重要的细胞间通讯的模式。胞外囊泡携带着多种具有病理生理学意义的生物标记，包括但不限于癌基因、突变的抑癌基因、低氧相关分子、血管生成因子、免疫调节蛋白、胆固醇、鞘磷脂、酸神经酰胺、非编码RNA以及各种细胞代谢中间物和/或产物。胞外囊泡成为了癌症研究和癌症标志物研究的主要对象之一，通过提取和分析体液中的胞外囊泡，如外泌体，可以对肿瘤疾病进行监控和诊断。

从体液样本(如血液、唾液、尿液等)中提取某一类胞外囊泡，如外泌体，的方法主要包括超速离心法、密度梯度离心法、PEG-base共沉淀法和免疫磁珠法。超速离心法因具有操作简单，获得的外泌体数量较多的优点，是目前最常用的提取外泌体的方法。然而，超速离心法所需的样本体积相对较大，操作比较繁琐耗时，回收率不稳定，提取所得的外泌体纯度也备受质疑。而且，重复的离心操作还可能对外泌体造成损害，对提取后的检测结果造成影响。采用密度梯度离心法可以获得纯度较高的外泌体，但操作繁琐耗时，得到的外泌体数量较少。PEG-base沉淀法利用聚乙二醇(PEG)沉淀外泌体，其原理与竞争性结合游离水分子有关，该方法提取的外泌体纯度和回收率低，颗粒大小不均一，常含有较多的杂蛋白及化学添加物，在后续检测中容易造成假阳性的结果。磁珠免疫法采用包被有单克隆抗体的球型磁性磁粒，可特异性地与靶物质结合，具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点。但是，外泌体的生物活性可能会受到非生理性pH和盐浓度的影响，不利于后续步骤的实验。而且，磁珠免疫法强烈地依赖于抗体的特异性，造成提取外泌体的成本较高。

发明内容

鉴于以上内容，有必要提供一种操作简单且成本较低的分离收集装置及方法。

本发明首先提供了一种分离收集液体样本中目标微粒的装置，包括提取单元和收集单元，所述提取单元可拆卸地连接于所述收集单元，所述提取单元包括第一过滤层和第二过滤层，所述第一过滤层的第一孔径大于所述第二过滤层的第二孔径，所述装置包括第一工作模式和第二工作模式，当所述装置处于第一工作模式时，所述第二过滤层位于靠近所述收集单元的一侧使液体样本先流经所述第一过滤层再流经所述第二过滤层；当所述装置处于第二工作模式时，所述第一过滤层位于靠近所述收集单元的一侧使清洗液先流经所述第二过滤层再流经所述第一过滤层。

进一步地，所述装置还包括预处理单元，所述预处理单元可拆卸地连接于所述提取单元，所述预处理单元包括过滤结构，当所述装置处于第一工作模式时，所述第一过滤层位于靠近所述预处理单元的一侧使所述液体样本依次流经所述过滤结构、第一过滤层和第二过滤层。

进一步地，所述装置还包括加样单元，所述提取单元可拆卸地连接于所述加样单元，当所述装置处于第一工作模式时，所述液体样本从所述加样单元进入所述提取单元，依次流经所述第一过滤层和第二过滤层，进入所述收集单元。

进一步地，所述第一过滤层的第一孔径为20-500纳米，所述第二过滤层的第二孔径为10-100纳米。

进一步地，所述第一过滤层和所述第二过滤层为多孔阳极氧化铝膜。

进一步地，所述目标微粒为外泌体。

可选地，所述第一过滤层和所述第二过滤层表面修饰有识别分子，所述识别分子选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗原和半抗原中的一种或几种的组合。

本发明进一步提供了一种分离收集液体样本中目标微粒的方法，包括如下步骤：

(a)提供如上所述的装置；

(b)将所述装置组合为第一工作模式；

(c)向所述装置加入液体样本；

(d)通过外力作用使所述液体样本依次流过所述第一过滤层和所述第二过滤层，进入所述收集单元。

进一步地，该方法还包括如下步骤：

(e)将所述装置的提取单元和收集单元分拆，组合为所述装置的第二工作模式；

(f)向所述装置加入第一清洗液；

(g)通过外力作用使所述第一清洗液依次流过所述第二过滤层和所述第一过滤层，使液体样本中的目标微粒进入所述收集单元。

进一步地，在步骤(d)之后还包括如下步骤：

(h)向所述加样单元加入第二清洗液，所述第二清洗液中包括生物酶；

(i)通过外力作用使所述第二清洗液依次流过所述第一过滤层和所述第二过滤层，进入所述收集单元。

优选地，所述生物酶为DNA酶、RNA酶和蛋白酶中的一种或几种的组合。

相较现有技术，本发明所提供的分离收集装置及方法，成本较低，操作简单，对目标微粒的损伤较小，有利于对液体样本特别是生物样本的分析及研究。本发明所提供的装置通过可拆卸的提取单元实现了不同工作模式之间转换，即可以在第一工作模式下分离液体样本的不同组分，又可以在第二工作模式下将液体样本中的目标微粒从提取单元洗脱，降低了处理液体样本的成本。

附图说明

图1示出了本发明所提供的装置的第一实施方式。

图2示出了本发明所提供的装置的第一实施方式在第一工作模式下的剖面图。

图3示出了本发明所提供的装置的第一实施方式在第二工作模式下的剖面图。

图4示出了本发明所提供的提取器的另一实施例。

图5示出了本发明所提供的装置的第二实施方式。

图6示出了本发明所提供的装置的第二实施方式在第一工作模式下的剖面图。

图7示出了本发明所提供的装置的第二实施方式在第二工作模式下的剖面图。

图8示出了本发明所提供的装置的第三实施方式在第一工作模式下的剖面图。

图9A及图9B示出了本发明所提供的装置的第三实施方式的一实施例。

图10示出了一种用本发明所提供的装置分离收集液体样本中的目标微粒的方法流程图。

图11示出了另一种用本发明所提供的装置分离收集液体样本中的目标微粒的方法流程图。

图12示出了纯化目标微粒的一实施例。

图13示出了又一种用本发明所提供的装置分离收集液体样本中的目标微粒的方法流程图。

主要元件符号说明

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，当一个单元被描述为“连接”于另一个单元，它可以是直接连接到另一个单元或者可能同时存在居中单元。当一个单元被被描述为“设置于”另一个单元，它可以是直接设置在另一个单元上或者可能同时存在居中单元。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的元件的名称只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明首先提供了一种用于分离收集液体样本中的目标微粒的装置。该装置包括可双向使用的提取单元，该提取单元包括第一过滤层和第二过滤层，该第一过滤层的第一孔径大于该第二过滤层的第二孔径。在本文中，一过滤层的“孔径”被定义为该过滤层上所有圆孔的直径的平均值。优选地，在本发明中同一过滤层上各个圆孔的直径相对于该过滤层上所有圆孔的直径的平均值的偏差不超过15％。该装置还包括收集单元，该提取单元可拆卸地正向连接于该收集单元，且该提取单元可拆卸地反向连接于该收集单元。该装置具有第一工作模式和第二工作模式。在第一工作模式下，该提取单元正向地连接于该收集单元，使该第二过滤层位于靠近收集单元的一侧。在这种情况下，液体样本可以在外力作用下依次通过该提取单元的第一过滤层和第二过滤层，然后进入该收集单元，液体样本中的目标微粒被提取单元捕获。在第二工作模式下，该提取单元反向地连接于该收集单元，使该第一过滤层位于靠近该收集单元的一侧。在这种情况下，缓冲溶液可以在外力作用下依次通过该提取单元的第二过滤层和第一过滤层，使被该提取单元捕获的目标微粒随缓冲溶液流出提取单元，进入收集单元。可以理解地，该提取单元的第一过滤层和第二过滤层可以是相互连结的，也可以是分开设置于该提取单元内的。

可以理解地，该提取单元与该收集单元之间的连接可以通过接口卡合，也可以通过在该提取单元与该收集单元的外部设置台阶卡合，也可以通过螺纹卡合。进一步地，各单元之间的卡合方式并不限于该提取单元的两个端口可拆卸地卡合于该收集单元的端口，也可以是该提取单元的中部可拆卸地卡合于该收集单元的开口。

该液体样本可以是生物样本，包括但不仅限于细胞培养液，尿液，唾液，腹腔液，组织灌洗液，眼泪，血浆和血清。

该目标微粒可以是生物样本中具有特定性质的微粒，所述特定性质可以是微粒的体积性质、带电荷性质、生物特异性等。该目标微粒包括但不仅限于生物样本中的胞外囊泡和外泌体。该目标微粒可以是肿瘤或癌症标志物，用于跟踪肿瘤和癌症的研究和监控。

该外力作用包括但不仅限于离心作用、真空负压作用、电场作用、磁场作用和声波场作用。

在该装置的提取单元中，该第一过滤层的第一孔径在20-500纳米之间，该第一孔径可以是20、25、30、50、80、100、200或500纳米。该第二过滤层的第二孔径可以在10-100纳米之间，如10、15、20、25、30、50、80或100纳米。可以理解地，该第一过滤层与第二过滤层的平均孔径尺寸可根据目标微粒的体积信息进行设计，在某些情况下，该第二过滤层的第二孔径也可以大于100纳米。

该第一过滤层和该第二过滤层可以是多孔材料。该多孔材料可以是多孔陶瓷材料、多孔塑料材料、多孔金属材料或它们的组合。可以理解地，为降低多孔材料对被测液体样本中的蛋白或基因的吸附，该多孔材料的表面可以是被化学修饰的。可以理解地，为特异性地分离目标微粒，该多孔材料的表面可以是被特异性生物大分子修饰的，该特异性生物大分子可以是特定的一种或几种抗体、抗原、多肽或碱基序列。

该装置的主体部分可以由塑料、玻璃、金属或复合材料制成。

在本发明中，该提取单元在该装置是可双向设置的，如可转动的或可拆卸的。在该装置的第一工作模式，该提取单元正向置于该装置中，用于捕获液体样本中的目标微粒；而在该装置的第二工作模式，该提取单元反向置于该装置中，所捕获的目标微粒在外力作用下离开该提取单元。当该提取单元从该装置中拆出时，可以直接用酶联免疫分析法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)、表面等离子共振法(Surface PlasmonResonance,SPR)等检测载有目标微粒的提取单元。

图1示出了本发明所提供的分离收集装置的第一实施方式。如图1所示，分离收集装置10包括加样单元110、提取单元150和收集单元170。该加样单元110的上端和下端分别设有相互连通的进液口及出液口，且该加样单元110的下端设有接口部。该提取单元150的上端和下端分别设有相互连通的进液口及出液口，且该提取单元150的上端和下端均可拆卸地卡设于该加样单元110的接口部。该收集单元170的上端设有开口，且该收集单元170的上端也设有接口部。该提取单元150的两端均可拆卸地卡设于该收集单元170的接口部。可以理解地，该提取单元150的两端与该加样单元110的下端、该提取单元150的两端与该收集单元170的下端，也可以通过内螺纹与外螺纹等其他卡持结构实现相互连接。当加样单元110、提取单元150和收集单元170依次连接在一起时，形成的分离收集装置10一端具有进液口，另一端封闭，中空内腔为液体流道。优选地，组装后该分离收集装置10的容积可以在1-100毫升之间。

该分离收集装置10的提取单元150的内部设有提取器1501。该提取器1501包括具有不同孔径尺寸的第一过滤层1513和第二过滤层1517，其中第一过滤层1513的第一孔径大于第二过滤层1517的第二孔径。该第一过滤层的孔径在20-500纳米之间。可选地，该第一孔径约为20、25、30、50、80、100、150、200或500纳米。该第二过滤层的第二孔径在10-100纳米之间，如10、15、20、25、30、50、80或100纳米。在某些实施例中，该第二过滤层的第二孔径也可以大于100纳米。

可以理解地，该分离收集装置10的加样单元110、提取单元150和收集单元170各单元均为可更换的。在实际使用中根据具体情况，可以更换该分离收集装置10中的一个或多个单元。

可选地，分离收集装置10还包括盖体1105，用于防止液体样本在分离收集过程中流出分离收集装置10。该盖体1105可拆卸地连接于该加样单元110的一端，将进液口封闭。也即是说，盖体1105、加样单元110、提取单元150和收集单元170依次卡接在一起时可以形成密闭的腔体。优选地，组装后该分离收集装置10的总容积为1-100毫升，每次可以处理的液体样品的体积为10微升-50毫升。

图2和图3分别示出了本发明的第一实施方式中该分离收集装置10在第一工作模式和第二工作模式下的剖面图。

如图2所示，在第一工作模式下，加样单元110、提取单元150和收集单元170a被依次卡接在一起，且该提取单元150中提取器1501在该分离收集装置10中的连接方向使得第一过滤层1513位于靠近加样单元110的一侧，而第二过滤层1517位于靠近收集单元170a的一侧。在第一工作模式下使用分离收集装置10时，向分离收集装置10的加样单元110加入含有目标微粒991的液体样本99，然后通过外力作用使该液体样本99从加样单元110流向收集单元170a。具体地，该液体样本99在外力作用下先后通过提取器1501的第一过滤层1513和第二过滤层1517。该液体样本99中体积大于第一过滤层1513孔径尺寸的微粒被截留在该第一过滤层1513的上表面，该液体样本99中体积小于第一过滤层1513孔径尺寸但大于第二过滤层1517孔径尺寸的目标微粒991被截留在该第二过滤层1517的上表面，该液体样本99中体积小于第二过滤层1517孔径尺寸的微粒将随着液流进入收集单元170a。也即是说，在第一工作模式下，受外力作用，液体样本99中的目标微粒991被提取器1501捕获，该目标微粒991被留存于第一过滤层1513和第二过滤层1517之间。

如图3所示，在第二工作模式下，加样单元110、提取单元150和收集单元170b被依次卡接在一起，且该提取单元150中提取器1501在该分离收集装置10中的连接方向使得第二过滤层1517位于靠近加样单元110的一侧，而第一过滤层1513位于靠近收集单元170b的一侧。也即是说，在第二工作模式下提取单元150在该分离收集装置中的方向与第一工作模式时的安装方向相反。使用时，向处于第二工作模式下的分离收集装置10加入第一清洗液90，然后通过外力作用使该第一清洗液90从加样单元110流向收集单元170b。具体地，该第一清洗液90在外力作用下先后通过提取器1501的第二过滤层1517和第一过滤层1513。当提取器1501的第一过滤层1513和第二过滤层1517之间留存有目标微粒991时，由于目标微粒991的体积大于第二过滤层1517孔径尺寸但小于第一过滤层1513孔径尺寸，该目标微粒991随第一清洗液90从第一过滤层1513中流出，进入该收集单元170b。也即是说，在第二工作模式下，受外力作用，被提取器1501捕获目标微粒991被洗脱并收集于收集单元170b。优选地，在第二工作模式下，分离收集装置10中的收集单元170a被更换为新的收集单元170b，以避免原用于第一工作模式下的收集单元170a中的杂质污染目标微粒991。

在本发明的第一实施方式中，如图2及图3中局部放大剖面图所示，该提取器1501具有两段式的管状过滤结构。该提取器1501中第一过滤层1513的第一孔眼向第二过滤层1517延伸并收窄为第二孔眼，即第一过滤层1513与第二过滤层1517直接连接形成该提取器1501。该提取器1501中第一过滤层1513的厚度为在50-1000微米之间，第二过滤层1517的厚度在50-500微米之间。可以理解的，随着每一过滤层的厚度的增加，流体通过过滤层的阻力增大，影响过滤过程的效果。为了防止过滤层因流体作用力过大而损坏，在一较佳实施例中，将第一过滤层1513及第二过滤层1517置于一大孔径滤膜的夹层中，从而保护第一过滤层1513及第二过滤层1517。制备该提取器1501的多孔材料可以是陶瓷多孔膜、高分子多孔膜或金属多孔膜，也可以是复合材料膜。优选地，该提取器1501是透明的，或至少在湿润状态下是透明的。在一优选实施例中，该提取器1501为多孔阳极氧化铝薄膜。虽然在附图中示出的提取器1501的上表面与下表面相互平行，为两个圆形的平面，本领域技术人员可以理解地，提取器1501的形状并不受限于本申请说明书和附图所披露的内容。例如，该提取器1501的上表面和/或下表面还可以设计为具有一夹角的两个平面，从而增加与液体样本接触的表面积。相似地，该提取器1501的上表面和/或下表面也可以设计为弧面，从而增加与液体样本接触的表面积。

进一步地，可以通过在该提取器1501的第二过滤层1517的外表面通过镀金属材料(例如，金、银、铝等)，进一步控制第二过滤层1517的孔径尺寸，从而满足对不同尺寸和不同类型的目标微粒的分离提取需求。在过滤层表面镀金属膜的方法可采用物理蒸镀、电镀或化学溶液镀膜等方法。进一步地，可以采用生物分子修饰第一过滤层1513与第二过滤层1517的多孔膜材料，捕捉表面具有相应的生物特异性的目标微粒991。比如，为分离提取某一肿瘤/癌细胞外泌体，可根据肿瘤/癌细胞外泌体表面抗原分子的特性，用相应的抗体分子修饰该提取器1501的多孔膜材料，从而通过抗原-抗体的特异性结合提取特定的肿瘤/癌细胞外泌体。本领域技术人员可以理解的，生物分子与多孔膜材料之间的连接方式可以通过共价键作用也可以通过非共价键作用实现。

进一步地，可以对第一过滤层1513与第二过滤层1517的多孔膜材料进行化学修饰(如在多孔膜材料表面修饰Tween 20或PEG等)，从而减弱该提取器1501对生物样本中蛋白和或基因的吸附作用。

在图1-3中所示的该分离收集装置10中的提取单元150是可拆卸式的，可以理解地，在某些实施例中该提取器1501可以是可拆卸地或可转向地设置于该分离收集装置10中的。也即是说，该分离收集装置10从第一工作模式转换为第二工作模式可以通过翻转该提取器1501实现。

图4示出了提取单元150的另一实施例。如图4所示，提取单元150的上端和下端分别设有相互连通的进液口及出液口。该提取单元150的上端和下端均可拆卸地卡设于加样单元110的接口部，该提取单元150的上端和下端也均可拆卸地卡设于收集单元170的接口部。该提取单元150包括第一过滤层1513，第二过滤层1517及由第一过滤层1513、第二过滤层1517及该提取单元150的一部分内壁构成的过滤空间1515。

相似地，在图4所示的实施例中，该第一过滤层1513的第一孔径大于第二过滤层1517的第二孔径。该第一过滤层的孔径在20-500纳米之间。可选地，该第一孔径约为20、25、30、50、80、100、150、200或500纳米。该第二过滤层的第二孔径在10-100纳米之间，如10、15、20、25、30、50、80或100纳米。在某些实施例中，该第二过滤层的第二孔径也可以大于100纳米。该第一过滤层1513与该第二过滤层1517可以是陶瓷多孔膜、高分子多孔膜或金属多孔膜，也可以是复合材料多孔膜。该第一过滤层1513与该第二过滤层1517可以采用相同类型的多孔膜材料，也可以采用不同类型的多孔膜材料。优选地，该第一过滤层1513，第二过滤层1517及过滤空间1515所构成的提取器1501是透明的，或至少在湿润状态下透明的。在一优选实施例中，该第一过滤层1513与第二过滤层1517均为多孔阳极氧化铝薄膜。

相似地，在图4所示的实施例中，可以通过在该提取器1501的第二过滤层1517的表面镀金属材料，进一步控制第二过滤层1517的孔径尺寸，从而满足对不同尺寸和不同类型的目标微粒的分离提取需求。

进一步地，在图4所示的实施例中，可以对第一过滤层1513和第二过滤层1517的多孔膜材料及位于过滤空间1515内的提取单元150的内壁进行化学修饰，从而降低该提取单元150对生物样本中的蛋白和或基因的吸附作用。

虽然在图4中示出的提取单元150的第一过滤层1513和第二过滤层1517所在的平面相互平行，本领域技术人员可以理解地，第一过滤层1513和第二过滤层1517的形状以及在提取单元150中的位置和角度并不受限于图4所披露的内容。例如，第一过滤层1513和/或第二过滤层1517还可以设计为具有一夹角的平面，又或，第一过滤层1513和/或第二过滤层1517也可以设计为弧面，从而增加与液体样本接触的表面积。

图5示出了本发明所提供的分离收集装置的第二实施方式。如图5所示，分离收集装置20包括加样单元210、预处理单元230、提取单元250和收集单元270。

在本发明所提供的分离收集装置的第二实施方式中，该预处理单元230用于滤除液体样本中体积较大的微粒。该预处理单元230的上端和下端分别设有相互连通的进液口及出液口，且该预处理单元230的上端可拆卸地卡设于加样单元210的接口部内。该预处理单元230的下端设有接口部，从而使该提取单元250的上端和下端均可拆卸地卡设于该预处理单元230的接口部内。该预处理单元230内设一过滤结构2301，该过滤结构2301的孔径可以在100-5000纳米之间，优选地，该过滤结构2301的孔径在400-1000纳米之间。该过滤结构2301的孔径可以是400，500，600，800或1000纳米。该过滤结构2301可以是陶瓷多孔膜、高分子多孔膜或金属多孔膜，也可以是复合材料多孔膜。优选地，该过滤结构2301为阳极氧化铝多孔膜。可替代地，该预处理单元230中的过滤结构2301也可以是玻璃纤维。虽然在图5中示出的该过滤结构2301为圆形的平面并内设于预处理单元230的上端，本领域技术人员可以理解地，该过滤结构2301的形状及位置并不受限于图5所披露的内容。例如，还可以通过支架结构使该过滤结构2301成为具有一夹角的两个平面，又或是，将该过滤结构2301设计为弧面，从而增加与液体样本接触的表面积。

在本发明所提供的分离收集装置的第二实施方式中，与第一实施方式相似地，该提取单元250的内部设有提取器2501。该提取器2501包括具有不同孔径尺寸的第一过滤层2513和第二过滤层2517，其中第一过滤层2513的第一孔径大于第二过滤层2517的第二孔径。该第一过滤层的孔径在20-500纳米之间。可选地，该第一孔径约为20、25、30、50、80、100、150、200或500纳米。该第二过滤层的第二孔径在10-100纳米之间，如10、15、20、25、30、50、80或100纳米。在某些实施例中，该第二过滤层的第二孔径也可以大于100纳米。

当加样单元210、预处理单元230、提取单元250和收集单元270依次卡接在一起时，形成一端具有进液口，另一端封闭，中空内腔为具有过滤结构2301及提取器2501的液体流道的分离收集装置20。优选地，组装后该分离收集装置20的总容积为1-100毫升，每次可以处理的液体样品的体积为10微升-50毫升。

可以理解地，该分离收集装置20的加样单元210、预处理单元230、提取单元250和收集单元270各单元均可更换。在实际使用中根据具体情况，可以更换该分离收集装置20中的一个或多个单元。

可选地，分离收集装置20还包括盖体2105，用于防止液体样本在分离收集过程中流出分离收集装置20。该盖体2105可拆卸地连接于该加样单元210，将进液口封闭。也即是说，盖体2105、加样单元210、预处理单元230、提取单元250和收集单元270依次卡接在一起时可以形成密闭的腔体。

与第一实施方式相似地，在第二实施方式中，该分离收集装置20的加样单元210、提取单元250和收集单元270也可以依次卡接在一起，在此不再赘叙。

图6和图7分别示出了本发明的第二实施方式中该分离收集装置20在第一工作模式和第二工作模式下的剖面图。

如图6所示，在第一工作模式下，分离收集装置20的加样单元210、预处理单元230、提取单元250和收集单元270被依次卡接在一起，且该提取单元250中提取器2501在该分离收集装置20中的连接方向使得第一过滤层2513位于靠近预处理单元230的一侧，而第二过滤层2517位于靠近收集单元270的一侧。在第一工作模式下使用分离收集装置20时，向分离收集装置20的加样单元210加入含有目标微粒991的液体样本99，然后通过外力作用使该液体样本99从加样单元210流向收集单元270。具体地，该液体样本99在外力作用下先后通过该预处理单元230的过滤结构2301、该提取单元250的第一过滤层2513和第二过滤层2517。该液体样本99中体积大于该过滤结构2301孔径的微粒被截留在该过滤结构2301的上表面，之后该液体样本99中体积大于该第一过滤层2513孔径尺寸的微粒被截留在该第一过滤层2513的上表面，该液体样本99中体积小于第一过滤层2513孔径尺寸但大于第二过滤层2517孔径尺寸的目标微粒991被截留在该第二过滤层2517的上表面，该液体样本99中体积小于第二过滤层2517孔径尺寸的微粒将随着液流进入收集单元270。也即是说，在第一工作模式下，受外力作用，液体样本99中的目标微粒991被提取器2501捕获，该目标微粒991被留存于第一过滤层2513和第二过滤层2517之间。在第二实施方式中，通过采用预处理单元230，可以在分离提取之前预先去除液体样本99中体积较大的微粒，避免堵塞提取器2501。可以理解地，该预处理单元230的过滤结构2301孔径略大于提取器2501的第一过滤层2513的孔径。

如图7所示，在第二工作模式下，分离收集装置20的加样单元210、提取单元250和收集单元270被依次卡接在一起，且该提取单元250中提取器2501在该分离收集装置20中的连接方向使得第二过滤层2517位于靠近加样单元210的一侧，而第一过滤层2513位于靠近收集单元270的一侧。也即是说，在第二工作模式下提取单元250在该分离收集装置20中的方向与第一工作模式时的安装方向相反，且在第二工作模式下无需在该分离收集装置20中置入预处理单元230。在第二工作模式下使用该分离收集装置20时，向处于第二工作模式下的分离收集装置20加入第一清洗液90，然后通过外力作用使该第一清洗液90从加样单元210流向收集单元270。具体地，该第一清洗液90在外力作用下先后通过提取器2501的第二过滤层2517和第一过滤层2513。当提取器2501的第一过滤层2513和第二过滤层2517之间留存有目标微粒991时，由于目标微粒991的体积大于第二过滤层2517孔径尺寸但小于第一过滤层2513孔径尺寸，该目标微粒991随第一清洗液90从第一过滤层2513中流出，进入该收集单元270。也即是说，在第二工作模式下，受外力作用，被提取器2501捕获目标微粒991被洗脱并收集于收集单元270。优选地，在第二工作模式下，该分离收集装置20中的收集单元270被更换为新的收集单元270，以避免原用于第一工作模式下的收集单元270中的杂质污染目标微粒991。可以理解地，也可以在该分离收集装置20由第一工作模式转换为第二工作模式之间，用第一清洗液90多次清洗该收集单元270，从而可以在不更换收集单元270的情况下避免杂质污染目标微粒991。

相似地，分离收集装置20中的提取单元250也可以采用如图4所示的实施例，具体内容在此不再赘叙。

图8示出了本发明所提供的分离收集装置的第三实施方式在第一工作模式下的剖面图。如图8所示，分离收集装置30包括提取单元350和收集单元370。该提取单元350的上端和下端分别设有相互连通的进液口及出液口，且该提取单元350的上端和下端均可拆卸地卡设于该收集单元370上端的接口部。可选地，分离收集装置30还包括盖体3105，该提取单元350的上端和下端均可与该盖体3105相连接，并与收集单元370构成一密闭的空间，防止液体样本在处理过程中流出分离收集装置30。

与第一及第二实施方式相似地，该提取单元350的内部设有提取器3501。该提取器3501包括具有不同孔径尺寸的第一过滤层和第二过滤层，其中第一过滤层的第一孔径与第二过滤层的第二孔径可根据目标微粒的体积设置。在一较佳实施例中，第一过滤层的第一孔径大于第二过滤层的第二孔径。在第一工作模式下，该提取单元350与该收集单元370的连接方式使第二过滤层更靠近该收集单元370。也即是说，在外力作用下，液体样本将先后依次通过第一过滤层及第二过滤层，进入收集单元。第一过滤层与第二过滤层的孔径设计可以使该分离收集装置30在第一工作模式下，在外力作用下通过该提取器3501捕获液体样本中的目标微粒，并使液体样本中体积大于第一孔径的微粒被第一过滤层截留，而体积小于第二孔径的微粒通过第二过滤层进入收集单元370。可以理解地，为使一定体积的液体样本能够加入该分离收集装置30，优选地，该提取器3501位于该提取单元350中的中间。

进一步地，为收集被捕获的目标微粒，在第二工作模式下，该提取单元350与该收集单元370的连接方式使第一过滤层更靠近该收集单元370。也即是说，在外力作用下，第一清洗液将先后依次通过第二过滤层及第一过滤层，目标微粒流出提取器3501，进入收集单元。

该提取单元350及其第一过滤层和第二过滤层的具体技术方案可采用如上所述的任何一种实施方式，请参考第一实施方式及第二实施方式的内容，在此不再赘叙。

图9A示出了本发明所提供的分离收集装置的第三实施方式的一实施例，图9B示出了该实施例的剖面图。如图9A所示，分离收集装置40包括盖体4105，提取单元450和收集单元470。该收集单元470为一96孔板，具有96个孔位，每个孔位的底面可以是平面，也可以是一凹面。该96孔板可以是由透明塑料材料制成的，也可以是有色(如黑色、白色、蓝色、黄色等颜色)塑料材料制成的。商品化的96孔板的每个孔位可以载有约300微升的液体，可以理解的，本发明所提供的收集单元470的尺寸及每一孔位的容积可以根据具体需求设置。相应于该收集单元470，该提取单元450包括96个开孔，每个开孔的上端和下端相互连通形成液体流道。在该提取单元450的96个开孔中均设有一提取器4501。优选地，如图9B所示，每一提取器4501均位于该提取单元450的中部位置。该提取器4501包括具有不同孔径的第一过滤层和第二过滤层，其中第一过滤层的第一孔径大于第二过滤层的第二孔径。该盖体4105和收集单元470均可可拆卸地连接于该提取单元450的两端。将收集单元470连接于提取单元450的一侧，则该提取单元450的每一个开孔与该收集单元470的每一个孔位相互对应，从而使该分离收集装置40具有96个“小过滤器”，每个“小过滤器”的一端为用于进液的开口，中间为提取器4501，另一端为封闭的孔位底面。为防止液体样本在处理过程中流出分离收集装置40，可将盖体4105连接与提取单元的另一侧。

当该分离收集装置40处于第一工作模式时，该提取单元450与该收集单元470的连接方式使第二过滤层更靠近该收集单元470。在外力作用下，如采用96孔板离心机，液体样本将依次通过第一过滤层及第二过滤层，液体样本中体积大于第一孔径的微粒被第一过滤层截留，液体样本中的目标微粒被提取器4501捕获，液体样本中体积小于第二孔径的微粒随液流通过第二过滤层进入收集单元470。

当该分离收集装置40处于第二工作模式时，该提取单元450与该收集单元470的连接方式使第二过滤层更靠近该收集单元470。也即是说，处于第一工作模式的该分离收集装置40拆开，将该提取单元450翻面，更换新的收集单元470，再将盖体4105，提取单元450和新的收集单元470依次连接在一起。在外力作用下，第一清洗液或一提取液将依次通过第二过滤层及第一过滤层，使之前捕获的目标微粒流出提取器4501，进入收集单元470。

该实施例提供了一种可以同时分离收集96个液体样本中的目标微粒的装置，实现了高通量的分离提纯。优选地，该分离收集装置40是透明的，便于对目标微粒进行后续检测。

可以理解地，该提取单元450及其第一过滤层和第二过滤层的具体技术方案可采用如上所述的任何一种实施方式，请参考第一、第二及第三实施方式的内容，在此不再赘叙。可以理解地，该提取单元450也可以采用类似于图4所示的结构，具体内容在此不再赘叙。

本发明进一步提供了一种分离收集液体样本中目标微粒的方法。该液体样本可以是生物样本，包括但不仅限于细胞培养液，尿液，唾液，腹腔液，组织灌洗液，眼泪，血浆和血清。该目标微粒可以是生物样本中具有特定性质的微粒，所述特定性质可以是微粒的体积性质、带电荷性质、生物特异性等。该目标微粒包括但不仅限于生物样本中的胞外囊泡和外泌体。该目标微粒可以是肿瘤或癌症标志物，用于跟踪肿瘤和癌症的研究和监控。可以理解地，对于生物样本，该方法各步骤的操作温度在4-37℃之间进行。

图10示出了该分离收集方法的一实施方式，主要包括以下步骤：

S500，提供分离收集装置；

S510，将该分离收集装置组合为第一工作模式；

S520，向该分离收集装置加入液体样本；

S530，使液体样本的不同组分在外力作用下分离。

下面对该方法进行具体的描述。

步骤S500提供本发明所披露的分离收集装置，该分离收集装置包括提取单元和收集单元，该提取单元包括具有不同孔径尺寸的第一过滤层和第二过滤层。该分离收集装置的相关技术方案在本发明的第一实施方式及第二实施方式中已经进行了详细的阐述，此处不再赘叙。

步骤S510，将该分离收集装置组合为第一工作模式，使提取单元在该分离收集装置中的连接方向使得第一过滤层位于靠近进液口的一侧，而第二过滤层位于靠近收集单元的一侧。该分离收集装置的第一工作模式已在本发明的第一实施方式及第二实施方式中已经进行了详细的阐述，此处不再赘叙。

步骤S520，向该分离收集装置中加入一定量的液体样本。可选地，对于具有盖体的分离收集装置，在加入液体样本后，可盖上盖体。该液体样本的体积可以在10微升-50毫升之间，可以理解地，加入液体样本的体积，也即是每次可处理的液体样本的体积，是由该分离收集装置的体积和结构参数确定的。

步骤S530，使液体样本的不同组分在外力作用下分离。在一实施例中，将该分离收集装置放入离心机中进行离心，转速设置在100-10000rpm之间，离心时间在1-30分钟之间。可以理解地，离心过程所采用的转速和离心时间取决于液体样本的特性及目标微粒的尺寸，例如，可以通过观察离心完成后仍然留在提取单元上方的液体样本的体积，判断是否需要再次进行离心。一般而言，进行S530步骤之后，大部分液体样本进入收集单元，粒径大于第一过滤层孔径的杂质微粒将留在第一过滤层上，粒径大于第二过滤层孔径的目标微粒将富集在第二过滤层上。可选地，也可以将该分离收集装置以一特定方向置于预先设置的电场、磁场或声波场中，从而使液体样本中的各组分从分离收集单元的开口向收集单元移动，在移动过程中通过收集单元，使收集单元捕获目标微粒。相似的，也可以通过加压的方式进行该分离步骤。

图11示出了该分离收集方法的另一实施方式，主要包括以下步骤：

S600，提供分离收集装置；

S610，将该分离收集装置组合为第一工作模式；

S620，向该分离收集装置加入液体样本；

S630，使液体样本的不同组分在外力作用下分离；

S640，清洗目标微粒；

S650，纯化目标微粒；

S690，分析目标微粒。

步骤S600-S630与前一实施方式相似，在上文中已经进行了详细的阐述，此处不再赘叙。

步骤S640，清洗目标微粒。具体地，在步骤S640中，向已完成S630分离步骤的分离收集装置中加入第一清洗液，清洗提取单元及提取单元中捕获的目标微粒，清除被提取单元截留的体积较大的杂质微粒。该第一清洗液可以是去离子水也可以是缓冲溶液，该缓冲溶液包括但不仅限于PBS或PBS TWEEN 20(PBST)。可选地，步骤S640还可以包括使第一清洗液在外力作用下从分离收集单元的开口移动至收集单元的步骤。例如，将加入第一清洗液的分离收集装置再次离心。可以理解的，步骤S640可以反复循环进行多次，以实现更好的清洗效果，同时也进一步将残留在分离收集装置的加样单元(和/或预处理单元)及提取单元中的目标微粒进行收集。

步骤S650，纯化目标微粒。具体地，在步骤S650中，向分离收集装置中加入第二清洗液，纯化提取单元中捕获的目标微粒。该第二清洗液可以是含有生物酶的缓冲溶液，该生物酶包括但不仅限于核酸酶和蛋白酶中的一种或几种。可以理解的，核酸酶可以是只作用于DNA的脱氧核糖核酸酶(DNA酶)，也可以是只作用于RNA的核糖核酸酶(RNA酶)，也可以是既能作用于DNA也能作用于RNA的酶。该第二清洗液用于去除提取器中吸附在目标微粒(如外泌体)表面或游离于提取器中的生物分子。例如，通过核酸酶去除所捕获的目标微粒表面和周围的基因(如RNA,microRNA，DNA等)，实现无自由基因(RNA和DNA)的外泌体的提纯。又如，通过蛋白酶去除所捕获的目标微粒表面和周围的多肽或蛋白，得到无自由蛋白或多肽(包括吸附在外泌体表面的多肽或蛋白)的高纯度外泌体。可选地，步骤S550还可以包括使第二清洗液在外力作用下从分离收集单元的开口移动至收集单元的步骤。例如，将加入第二清洗液的分离收集装置再次离心。在某些实施例中，可以略去清洗步骤S640，将该步骤S650在步骤S630之后进行。

图12示出了用于纯化目标微粒的步骤S650的一具体实施例。首先，在步骤S6510向分离收集装置中加入一定量的第二清洗剂，该第二清洗剂为包括DNA酶、RNA酶及蛋白酶K的PBS缓冲溶液。在步骤S6530，将载有第二清洗剂的分离收集装置置于37℃的水浴中孵育5分钟。在步骤6550，将孵育后的分离收集装置离心，使大部分的第二清洗液在离心作用下进入收集单元。之后，在步骤S6570，向分离收集装置中加入一定量的第一清洗剂，如PBS缓冲溶液、PBST缓冲溶液或去离子水，用于进一步清洗纯化后的目标微粒。然后，在步骤S6590，再次离心，使第一清洗剂在离心作用下进入收集单元，从而实现对提取单元中的目标微粒的提纯。可以理解的，步骤S6570-S6590可以反复循环进行多次，以实现更好的纯化及清洗效果。通过蛋白酶及核酸酶的处理，可以充分去除外泌体外和吸附在外泌体上的蛋白多肽或自由基因成分，使得分离得到的囊泡更纯，有利于研究囊泡内的分子组成。

步骤S690，分析目标微粒。具体地，该分析方法可以是光学检测，如光学显微镜、荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜，也可以是外加化学试剂是目标微粒与该化学试剂反应，观察反应现象或反应所得产物的物化性质。本领域技术人员可以理解的，步骤S690所采用的分析方法可以是任何一种常规的物理、化学和生物学领域的检测方法。

例如，在步骤S690，保持分离收集装置处于第一工作模式，更新收集单元，然后向分离收集装置中加入特定的生化试剂。通过外力作用(如，离心作用力)使该生化试剂与所捕获的目标微粒充分接触，使目标微粒中携带有特定信息的成分析出并进入收集单元，然后检测收集单元中的成分。在一实施例中，该目标微粒为外泌体，该生化试剂为具有荧光标记的抗体，该抗体可以识别外泌体表面特定的蛋白，该携带有特定信息的成分可以是外泌体蛋白、外泌体多糖、外泌体磷脂、外泌体多肽或外泌体核酸(RNA或/和DNA)等。又如，在步骤S690，向分离收集装置中加入具有特异性的染色剂，过外力作用(如，离心作用力)使该生化试剂与所捕获的目标微粒充分接触，使目标微粒被染色。然后取出分离收集装置中的提取单元或提取器，在提取单元或提取器是透明的情况下，将该提取单元或该提取器直接置于光学显微镜下，观察被染色的目标微粒。可以理解地，也可以省略步骤S650，在清洗步骤S640之后进行分析步骤S690。

图13示出了该分离收集方法的又一实施方式，主要包括以下步骤：

S700，提供分离收集装置；

S710，将该分离收集装置组合为第一工作模式；

S720，向该分离收集装置加入液体样本；

S730，使液体样本的不同组分在外力作用下分离；

S740，清洗目标微粒；

S750，纯化目标微粒；

S760，将分离收集装置组合为第二工作模式；

S770，向该分离收集装置加入第一清洗液；

S780，通过外力作用收集目标微粒；

S790，分析目标微粒。

步骤S700-S740及S790与前述实施方式相似，在上文中已经进行了详细的阐述，此处不再赘叙。下面对该实施方式中的步骤S760-S780进行具体的描述。

步骤S760，将该分离收集装置从第一工作模式转换为第二工作模式。对于本发明第一实施方式中所披露的分离收集装置10，将第一工作模式的分离收集装置10拆为加样单元110、提取单元150和收集单元170a，翻转提取单元150，将收集单元170a更换为收集单元170b，将分离收集装置10组合为第二工作模式，用于收集提取单元150中的目标微粒。对于本发明第二实施方式中所披露的分离收集装置20，将第一工作模式的分离收集装置20拆为加样单元210、预处理单元230、提取单元250和收集单元270，丢弃预处理单元230，翻转提取单元250，更新或清洗收集单元270，将分离收集装置20组合为第二工作模式，用于收集提取单元250中的目标微粒。对于本发明第三实施方式中所披露的分离收集装置30，将第一工作模式的分离收集装置30拆为提取单元350和收集单元370，翻转提取单元350，更新或清洗收集单元370，将分离收集装置30组合为第二工作模式，用于收集提取单元350中的目标微粒。关于提取单元在分离收集装置中的方向，在本发明的第一、第二及第三实施方式中已经进行了详细的阐述，此处不再赘叙。

步骤S770，向处于第二工作模式的分离收集装置中加入第一清洗液。该第一清洗液的体积可以为1-10毫升，可以理解地，加入第一清洗液的体积，与该分离收集装置及其提取单元的体积和结构参数相关。可选地，对于具有盖体的分离收集装置，在加入第一清洗液后，可盖上盖体。该第一清洗液可以是去离子水也可以是缓冲溶液，该缓冲溶液包括但不仅限于PBS或PBS TWEEN 20(PBST)。

步骤S780，使第一清洗液在外力作用下从分离收集单元的开口移动至收集单元。由于此时分离收集装置处于第二工作模式，目标微粒可以随着第一清洗液的液流流出提取单元，与第一清洗液一同进入收集单元。从而通过步骤S780，在收集单元得到目标微粒。例如，将加入第一清洗液的分离收集装置进行离心，转速设置在100-10000rpm之间，离心时间在1-30分钟之间。可以理解地，离心过程所采用的转速和离心时间取决于液体样本的特性及目标微粒的尺寸，可以通过观察离心完成后仍然留在提取单元上方的液体样本的体积，判断是否需要再次进行离心。

本发明所提供的分离收集装置生产成本较低，该装置的各单元可以重复使用。本发明所提供的分离收集方法操作简单方便，成本低廉，提取所得的目标微粒纯度较高，可以应用于临床上外泌体的提纯，并进一步结合ELISA、SPR等技术可以对外泌体同时进行定量分析。

上述实施方式为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，以上实施方式仅是用于解释权利要求书。然本发明的保护范围并不局限于说明书。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或者替换，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种分离收集液体样本中目标微粒的装置，包括提取单元和收集单元，所述提取单元可拆卸地连接于所述收集单元，所述提取单元包括第一过滤层和第二过滤层，所述第一过滤层的第一孔径大于所述第二过滤层的第二孔径，所述装置包括第一工作模式和第二工作模式，当所述装置处于第一工作模式时，所述第二过滤层位于靠近所述收集单元的一侧使液体样本先流经所述第一过滤层再流经所述第二过滤层；当所述装置处于第二工作模式时，所述第一过滤层位于靠近所述收集单元的一侧使清洗液先流经所述第二过滤层再流经所述第一过滤层。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述装置还包括预处理单元，所述预处理单元可拆卸地连接于所述提取单元，所述预处理单元包括过滤结构，当所述装置处于第一工作模式时，所述第一过滤层位于靠近所述预处理单元的一侧使所述液体样本依次流经所述过滤结构、第一过滤层和第二过滤层。

3.如权利要求1或2所述的装置，其特征在于：所述装置还包括加样单元，所述提取单元可拆卸地连接于所述加样单元，当所述装置处于第一工作模式时，所述液体样本从所述加样单元进入所述提取单元，依次流经所述第一过滤层和第二过滤层，进入所述收集单元。

4.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述第一过滤层的第一孔径为20-500纳米，所述第二过滤层的第二孔径为10-100纳米。

5.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述第一过滤层和所述第二过滤层为多孔阳极氧化铝膜。

6.如权利要求1所述的装置，其特征在于：所述目标微粒为外泌体。

7.一种分离收集液体样本中目标微粒的方法，包括如下步骤：

(a)提供如权利要求1所述的装置；

(b)将所述装置组合为第一工作模式；

(c)向所述装置加入液体样本；

(d)通过外力作用使所述液体样本依次流过所述第一过滤层和所述第二过滤层，进入所述收集单元。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：还包括如下步骤：

(e)将所述装置的提取单元和收集单元分拆，组合为所述装置的第二工作模式；

(f)向所述装置加入第一清洗液；

(g)通过外力作用使所述第一清洗液依次流过所述第二过滤层和所述第一过滤层，使液体样本中的目标微粒进入所述收集单元。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(d)之后还包括如下步骤：

(h)向所述加样单元加入第二清洗液，所述第二清洗液中包括生物酶；

(i)通过外力作用使所述第二清洗液依次流过所述第一过滤层和所述第二过滤层，进入所述收集单元。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述生物酶为DNA酶、RNA酶和蛋白酶中的一种或几种的组合。