CN109212211A - 一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片 - Google Patents

Abstract

本发明属于循环肿瘤细胞检测领域，公开了一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，芯片设有至少三个进样孔和至少三个出样孔所述；进样孔和出样孔之间为三角形微柱阵列，所述三角形微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列；所述微阵列表面修饰特异性识别分子，所述的特异性识别分子包括核酸适体或者抗体。本发明芯片可提高循环肿瘤细胞的捕获效率和纯度，使循环肿瘤细胞在缓冲溶液及血液中捕获效率达到95％以上；此外，该芯片结构简单，使用方便。

Description

一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片

技术领域

本发明属于循环肿瘤细胞检测领域，具体涉及到一种用于检测循环肿瘤细胞 的芯片。

背景技术

分子生物学以及临床研究显示，肿瘤的侵袭和微转移很有可能在肿瘤发生的 早期就已经出现。通过血管壁进入外周血的肿瘤细胞通常也被叫做循环肿瘤细 胞(circulating tumor cell，CTC)。据估计每1000个CTC中就有1个能够 形成转移癌，因此通过检测CTC，及早发现肿瘤的微转移不仅对肿瘤复发和预 后的判断有重要意义，而且对指导临床治疗也有很大价值：能有效地对肿瘤转 移进行早期诊断；能对化疗药物的疗效进行快速有效的评估，进而确定最佳的 个体化治疗方案；能实现对治愈患者的长期跟踪及肿瘤复发监测等等。现今， 越来越多的现代检测技术发展应用到循环肿瘤细胞的检测领域中，但是，循环 肿瘤细胞的检测面临最大挑战即是在血液中含量稀少——1mL外周血中可能只含有1-10个循环肿瘤细胞，却有10 9个红细胞，10 6个白细胞的高背景干 扰。如何从含有数亿个非靶标细胞的复杂血液环境中准确分离出几个肿瘤细胞， 发展一种高灵敏、高准确度、高通量、保持捕获细胞活性、经济的富集外周血 循环肿瘤细胞的方法是目前需要突破的瓶颈。

目前循环肿瘤细胞检测主要存在的问题包括：1、捕获效率低，容易出现假 阴性。主要原因是多数捕获依赖于抗体和抗原的相互识别，然而抗体存在着特 异性差、结合能力低、易失活、寿命短的缺点，导致CTC无法达到理想的富集 效率。例如，CellSearch系统有105的富集率，但是CTC在血液中的存在比 例是1∶10 9～10 10，相差了四个数量级。另外，大量高生产成本，高储运 成本的抗体的使用，直接导致最终测试成本的增加，Cell Search的一次测试 费就高达600美元。2、在高背景的血液细胞背景下，容易产生非特异的细胞捕获，产生假阳性。3、对捕获的细胞伤害较大，释放效率低，难以对捕获的循环 肿瘤细胞进行单细胞分析。微流控芯片具有高通量、高比表面积、体积小和消 耗少等特点，因此可以设计成具有低成本、高富集效率、高选择性等优点的循 环肿瘤细胞捕获微流控芯片。目前利用微流控芯片进行循环肿瘤细胞检测的方 法主要有两种：1)利用亲和性识别捕获；2)利用物理特性差异，比如利用微孔 过滤循环肿瘤细胞和其他细胞或者确定横向位移方式根据细胞大小对细胞进行 分离。但是这些方式仍然存在捕获效率低，非特异性吸附非靶细胞，细胞活性 差等问题。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中存在的缺陷，而设计出一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片。

其具体实现方案如下：

一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于：芯片设有至少三个进样孔 和至少三个出样孔所述；进样孔和出样孔之间为三角形微柱阵列，所述三角形 微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列；所述微阵列表面修饰特异性识别分子， 所述的特异性识别分子包括核酸适体或者抗体。

优选地，所述的抗体优选为EpCAM抗体或者其他循环肿瘤细胞标志物抗体。

优选地，所述的核酸适体可以通过筛选得到，优选的序列包括EpCAM或者其 他循环肿瘤细胞标志物核酸适体。

优选地，所述三角形微柱阵列的每个三角形的旋转角度θ为0-180度、临界 直径为0-50μm。

优选地，所述循环肿瘤细胞捕获检测的方法，包括如下步骤：

1)将含有循环肿瘤细胞的血液样品或者缓冲溶液通过进样孔注入，缓冲溶液 通过另两个进样孔注入；

2)细胞进入捕获微阵列，由于表面标志物以及尺寸不同，循环肿瘤细胞和微 阵列实现多次接触，最终进行捕获；

3)通过核酸酶水解核酸适体或者消化细胞膜表面蛋白对捕获的循环肿瘤细 胞进行释放。

本发明的优点和有益效果在于：

1.本发明的芯片在特定旋转角度的三角形微柱阵列上修饰靶向识别分子包 括核酸适体或者抗体并以基于DLD(确定性侧向位移)原理排列，结合了确定性 侧向位移及特异性识别两种捕获原理，既利用物理性质差异，同时也利用循环 肿瘤细胞表面标志物不同。

2.本发明的芯片调控了用于循环肿瘤细胞捕获确定性侧向位移芯片的参数， 使循环肿瘤细胞按三角形微柱阵列偏移方向运动，而小尺寸细胞按液流方向移 动，既提高了尺寸大于临界直径的循环肿瘤细胞与三角形微柱阵列的碰撞概率， 又减少了尺寸小于临界直径的血液细胞的碰撞概率。

3.本发明芯片设计的旋转三角形呈特定角度，使三角形微柱阵列的三面呈现 梯度剪应力，增加靶标细胞和微阵列上识别分子的接触时间，提高捕获效率和 纯度，使循环肿瘤细胞在缓冲溶液及血液中捕获效率达到95％以上。

附图说明

图1为芯片设计及工作原理示意图；图1A为基于微三角柱阵列、微漩涡碰 撞、侧面高效捕获的细胞捕获芯片及细胞流动速度模拟结果；图1B为循环肿瘤 细胞、白细胞及红细胞流动路径，其中大颗粒代表循环肿瘤细胞，中等颗粒代 表白细胞，扁平颗粒代表红细胞。

图2为不同尺寸颗粒通过三角形微阵列的路径；图2A为20微米和10微米 颗粒理论模拟路径，20微米颗粒移动路径在下方，10微米颗粒移动路径在上方； 图2B为不同颗粒实际运动路径，上方路径为小颗粒路径，下方路径为大颗粒路 径。

图3A为10、15、20微米颗粒和三角形微阵列碰撞概率计算结果；图3B为 循环肿瘤细胞及血液细胞对三角形微阵列碰撞概率趋势，其中左、中、右分别 代表循环肿瘤细胞、白细胞和红细胞。

图4为循环肿瘤细胞捕获芯片的捕获效率及纯度；图4A为芯片表面修饰核 酸适体芯片对循环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率， 中柱代表血液中捕获效率，右柱代表捕获纯度；图4B为芯片表面修饰抗体对循 环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率，中柱代表血液 中捕获效率，右柱代表捕获纯度。

图5为通过气压控制液流的循环肿瘤细胞进样系统实物图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明：

以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本 发明创造的保护范围。

实施例1 循环肿瘤细胞捕获芯片及捕获装置

参见图1，制作芯片，芯片包括两层PDMS和一层玻璃芯片，将PDMS、PDMS、 玻璃芯片依次键和；芯片设有三个进样孔和三个出样孔；进样孔和出样孔之间 为三角形微柱阵列，三角形微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列。

在本实施例中，三个进样孔设于左侧一端，三个出样孔设于右侧一端，微 流控芯片捕获循环肿瘤细胞的气驱动控制进样装置，包括：芯片左侧的前后两 个进样口分别和一缓冲液容器通过管道连接，左侧中间的进样口和血液样品容 器通过管道连接。缓冲液容器和血液样品容器分别和图5所示的气压装置连接， 气压装置能够通过气体驱动缓冲液容器和血液样品容器中的缓冲液或血液进入 芯片。芯片右端的三个出样孔连接至一收集容器中。

参见图1，芯片中的三角形微柱外接圆半径为rp，行间距为λ，列间距G， 依次递增Δλ排列微阵列，循环肿瘤细胞尺寸大于普通血液细胞，微柱阵列可 以和循环肿瘤细胞多次接触，提高捕获效率。大于临界直径大的循环肿瘤细胞 更大的几率被免疫捕获，而小于临界直径的血液细胞比较小的接触几率。旋转 θ角度三角形微阵列，使三角形微柱阵列的三面呈现梯度剪应力，增加靶标细 胞和微阵列上识别分子的接触时间，提高捕获效率和纯度。

实施例2

图2为不同尺寸颗粒通过三角形微阵列的路径。图2A为20微米和10微米 颗粒理论模拟路径，20微米颗粒移动路径在下方，10微米颗粒移动路径在上方； 通过COMSOLMultiphysics软件进行模拟。图2B为不同颗粒实际运动路径， 上方路径为小颗粒路径，下方路径为大颗粒路径。此时三角柱上没有结合抗体 或核酸适体。

实施例3

通过COMSOL Multiphysics软件进行模拟。图3A为10、15、20微米颗粒 和三角形微阵列碰撞概率计算结果；图3B为循环肿瘤细胞及血液细胞对三角形 微阵列碰撞概率趋势，其中左、中、右分别代表循环肿瘤细胞、白细胞和红细 胞。

实施例4 循环肿瘤细胞捕获及释放

芯片上结合核酸适体sgc8aptamer，捕获效率CCRF-CEM 98％及白细胞 0.83％。EpCAM抗体修饰的捕获效率为99％SW480及0.004％白细胞。

对于血液样品，向1mL正常血液中计入1000个CCRF-CEM细胞，对于核酸 适配体修饰的芯片平均捕获效率为95.6％，抗体修饰的芯片捕获效率为95％。 1)荧光预染色的靶细胞或者对照细胞通过细胞计数后重悬到1％FBS的DPBS缓 冲溶液或者健康人血液；

2)将样品通过进样系统从进样孔a注入，缓冲溶液通过b、c注入；

3)捕获后可以通过加入核酸适体的互补序列或者核酸酶针对以核酸适体为 靶向识别分子的芯片进行释放，或者加入蛋白酶或者EDTA针对以抗体修饰的芯 片进行释放；

4)释放后细胞通过计数统计，与注入的细胞数相除，计算捕获效率；

5)对释放细胞进行活细胞染色，计算活细胞比率；

6)对释放细胞进行免疫荧光成像，进行细胞角蛋白抗体，上皮细胞粘附因 子抗体，

图4为循环肿瘤细胞捕获芯片的捕获效率及纯度，图4A为芯片表面修饰核 酸适体芯片对循环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率， 中柱代表血液中捕获效率，右柱代表捕获纯度；图4B为芯片表面修饰抗体对循 环肿瘤细胞捕获效率及纯度，其中左柱代表缓冲溶液捕获效率，中柱代表血液 中捕获效率，右柱代表捕获纯度；

本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与 原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包 含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.本发明为一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，芯片设有至少三个进样孔和至少三个出样孔所述；进样孔和出样孔之间为三角形微柱阵列，所述三角形微柱阵列按照确定性侧向位移原理排列；所述微阵列表面修饰特异性识别分子，所述的特异性识别分子包括核酸适体或者抗体。

2.根据权利1所述的一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，所述的抗体优选为EpCAM抗体或者其他循环肿瘤细胞标志物抗体。

3.根据权利1所述的一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，所述的核酸适体可以通过筛选得到，优选的序列包括EpCAM或者其他循环肿瘤细胞标志物核酸适体。

4.根据权利1所述的一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，所述三角形微柱阵列的每个三角形的旋转角度θ为0-180度、临界直径为0-50μm。

5.根据权利1所述的一种用于检测循环肿瘤细胞的芯片，其特征在于，所述循环肿瘤细胞捕获检测的方法，包括如下步骤：

1)将含有循环肿瘤细胞的血液样品或者缓冲溶液通过进样孔注入，缓冲溶液通过另两个进样孔注入；

2)细胞进入捕获微阵列，由于表面标志物以及尺寸不同，循环肿瘤细胞和微阵列实现多次接触，最终进行捕获；

3)通过核酸酶水解核酸适体或者消化细胞膜表面蛋白对捕获的循环肿瘤细胞进行释放。