CN112391263A - 一种神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

一种神经母细胞瘤循环肿瘤细胞(CTCs)的捕获芯片及其制作方法，本发明提供的神经母细胞瘤CTC的捕获芯片，包括玻璃基底层和带有微柱阵列图案的聚合物层，玻璃基底层表面修饰有能特异性捕获神经母细胞瘤CTCs的CD56抗体。本发明的有益效果在于：1、提高了分离通量；2、提高了分离效率和纯度；3、CTC原位捕获；4、分离细胞活性的提高；5、成本的降低：集成操作减少了人工劳动和耗材使用，显著降低了检测成本。

Description

一种神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片及其制作方法
技术领域
本发明涉及一种循环肿瘤细胞(CTCs)的捕获芯片，具体来说涉及一种神经母细胞瘤循环肿瘤细胞(CTCs)的捕获芯片及其捕获方法。
背景技术
神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童最常见的颅外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤，有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。该病是由身体多个部位的未成熟神经细胞发展而来的一种癌症，通常起源于腹部或胸部的交感神经，最常起源于肾上腺。不同疾病起源及扩散部位的患者会表现出不同症状，如腹胀、腹痛、便秘或腹泻、呼吸困难、皮肤肿块、骨痛、疲乏等。神经母细胞瘤误诊率很高，易误诊为白血病、生长痛、风湿性关节炎、肺炎及腹泻病等。当肿瘤细胞类似原始粒细胞或原始淋巴细胞时，常与白血病、恶性淋巴瘤、尤文肉瘤、小细胞未分化癌等混淆。因为神经母细胞瘤的初发症状不典型，所以在早期诊断有所困难，但是研究发现，肿瘤发生的早期就有肿瘤细胞或者肿瘤DNA片段释放到血液中，因此检测血液中的肿瘤循环细胞(circulation tumor cells，CTCs)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)有助于肿瘤的早期诊断。
传统的神经母细胞瘤检测方法有：组织病理学检查(HE染色)、蛋白质组检测(免疫组化IHC)、生化检测和影像学检查等。HE染色操作简易，成本低，IHC灵敏度较高，但这两种方法与其他一些恶性肿瘤在鉴别上有重叠，鉴别诊断困难，且不能指导预后判断。生化检测主要是检测血液或尿液里儿茶酚胺及其代谢产物(多巴胺，高香草酸、香草扁桃酸)的浓度，一般神经母细胞瘤患者中其含量较正常人群有显著升高。影像学检查是利用间位腆代苄胍扫描。传统的肿瘤组织活检存在给患者带来很大痛苦，不能频繁操作，且只能对单一器官进行检测，容易激发癌细胞快速增长等许多局限。
循环肿瘤细胞是近30年来研究应用的仅有的几个新型肿瘤分子标志物之一。现阶段循环肿瘤细胞的捕获方法主要有免疫磁珠吸附法、密度梯度离心法、膜过滤法和流控芯片法。其中一些捕获方法存在操作复杂、成本高、捕获难度大等问题，另外由于肿瘤的异质性，很多肿瘤标志物特异性并不高。
发明内容
为辅助诊断神经母细胞瘤，克服当前CTCs检测技术操作复杂、特异性低、尚不成熟等问题，本发明提供了一种神经母细胞瘤CTCs的捕获芯片及其制作方法和捕获方法；本发明提供的技术方案如下文所述。
本发明的目的之一在于提供一种神经母细胞瘤CTCs的捕获芯片的制作方法，该制作方法包括有如下的步骤：
1)使用光刻技术，在硅衬底上制造微柱阵列图案，然后在图案化的硅基板倒入聚合物，加热固化后形成聚合物层；
具体的为：使用标准光刻和软光刻技术，制造出可以捕获神经母细胞瘤CTCs的微流体装置：使用光掩模，在硅衬底上制造微柱阵列图案，然后在图案化的硅衬底上倒入聚合物，然后在70-90℃，优选80-85℃下固化，优选的固化时间为0.5小时，形成聚合物层；
所述的微柱阵列图案的排列方式可以和CN110564588相同。
所述聚合物，可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙醇乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚二甲基硅氧烷(PDMS)等的一种或多种，优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
2)将经步骤1)固化后从硅衬底上剥离的聚合物层打孔以形成入口孔和出口孔；
3)取一玻璃基底，清洗后对玻璃基底和聚合物层的接触面进行氧等离子体表面活化处理，处理时间可以为20-30s，聚合物层与玻璃基底通过化学键强相互作用牢固粘连，形成捕获芯片的原型；
4)对步骤3)处理的捕获芯片的内部用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(4％v/v的乙醇溶液)于室温下反应30分钟，反应后用乙醇清洗；
5)对步骤4)处理过的捕获芯片的内部用N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS，0.1mM的二甲基亚砜(DMSO))室温下反应30分钟，反应后分别用乙醇和磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗；
6)继续向芯片内部通入抗生物素蛋白(10μg/ml的磷酸盐缓冲溶液(PBS)室温下反应1小时)；
7)最后向芯片内部通入生物素包被的CD56抗体溶液(10μg/mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，含1.0％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.1％(w/v)的叠氮化钠)，室温下反应30分钟，即得到了可以原位捕获神经母细胞瘤CTC的捕获芯片。
本发明提供的神经母细胞瘤CTC的捕获芯片，该捕获芯片包括玻璃基底层和设于所述的玻璃基底层上方的有微柱阵列图案的聚合物层，所述聚合物，可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙醇乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮等的一种或多种，优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，所述的玻璃基底层通过氧等离子键合与带有微柱阵列图案的聚合物层牢固连接，所述的玻璃基底层表面修饰连接有能特异性捕获神经母细胞瘤CTCs的CD56抗体。
作为优选的，微柱可以为三角形、圆形、长方形、棱形和“工”字形结构中的一种或几种，微柱的边长或直径在10-30微米之间，两个相邻微柱之间的横向间隔为20-30微米，纵向间隔为7-15微米，微柱高度为30微米，优选的边长或直径尺寸是12-15微米，间隔为8-12微米。
作为优选的，所述的微柱阵列呈错位排列，其排列方向与血液流动方向成10-45度夹角，错位排列使血液在阵列间呈波浪形流动，增加大尺寸细胞被拦截的阻力。
本发明的第三个目的在于提供一种神经母细胞瘤细胞的捕获方法，所述的捕获方法如下：将外周血以小于10ml/h的流速，更优选的是5ml/h的流速从入口孔通入芯片，流经芯片内部捕获后，废血从出口孔流出；血液中的神经母细胞瘤CTC因微柱阵列的拦截及与基底上连接的CD56抗体发生细胞表面的特异性抗原-抗体结合，被捕获在芯片内部，而其他血细胞则不被拦截，且不与CD56抗体发生结合，会沿着液体流动的方向被冲出芯片。
本发明的第四个目的在于提供一种原位捕获CTC后的鉴定方法，对捕获后芯片进行如下步骤：
1)通入磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤至芯片颜色透明；
2)连续通15min的4％多聚甲醛溶液对所捕获的细胞进行固定；
3)通5min磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤残余的多聚甲醛；
4)通10min的0.2％Triton X-100溶液对细胞膜进行通透处理；
5)再次通入5min的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤残余的Triton X-100；
6)通入4％牛血清白蛋白(BSA)溶液孵育30-60min，防止抗体发生非特异性吸附；
7)再次通入5min磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤多余的BSA；
8)加入抗体染色试剂；
9)4℃条件下避光放置过夜；
10)避光条件下通入5-10min磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤多余的抗体试剂，降低背景颜色值，使染色结果较为清晰直观；
12)用荧光显微镜对芯片染色结果进行观察鉴定，判断其是否有神经母细胞瘤细胞CTC及其抗体表达情况。
本发明的有益效果在于：
1、提高了分离通量：分离通量的提高是由细胞富集区实现的，本发明设计了按临界分选尺寸分布的多组微柱阵列结构，全血一步上样，不需红细胞裂解、离心等前处理操作，血液中大尺寸的细胞将被按临界尺寸排列的微柱阵列截留，捕获于阵列间较大的间隙内，小尺寸细胞则不受影响，从阵列间呈波浪形行驶通过。按照不同肿瘤类型的尺寸特性可以设计不同的临界尺寸，相邻微柱间较大的间隙即成为一个个的捕获单元，由于捕获单元数目足够多，而1mL血液当中可能只有个位数的CTC，即使前面没有被捕获到，也能被后面相邻的捕获单元捕获，因此不同尺寸的细胞在芯片内形成了不同的流速，提高了细胞分离通量。
2、提高了分离效率和纯度：血液在芯片内通过时，神经母细胞瘤CTC不仅受到微柱阵型的拦截，且由于其细胞膜表面抗原能与连接在芯片基底上的CD56抗体发生特异性结合而被捕获在芯片内，其余血细胞则不与该抗体结合，顺利通行向出口流出，有助于提高CTC的分离效率和分离纯度。
3、细胞的原位捕获：采用按细胞临界尺寸分布的微流控微柱阵列和抗原-抗体的特异性结合双重作用实现细胞的原位捕获。
4、分离细胞活性的提高：现有技术设计的芯片只能实现细胞富集，需二次或多次纯化才能分离得到高纯度的细胞，多步操作会造成细胞的损失和损伤；与之对比，本发明的一步集成操作减少了操作步骤和人为干预，减少了对细胞造成的污染、损伤和损失等，显著提高了细胞活性。
5、成本的降低：集成操作减少了人工劳动和耗材使用，显著降低了检测成本。
附图说明
图1为神经母细胞瘤细胞的捕获芯片结构示意图；
图2为捕获芯片的部分截面图；
图3为捕获芯片捕获原理示意图；
图4为神经母细胞瘤细胞的捕获芯片的制作流程图；
图5是捕获芯片的捕获效率图。
具体实施方式
第一：制作神经母细胞瘤细胞的捕获芯片
一种神经母细胞瘤细胞的捕获芯片的制作方法，请参照图4的流程图，该制作方法包括有如下的步骤：
1)使用标准光刻和软光刻技术，制造出可以捕获神经母细胞瘤细胞的微流控芯片模板：使用光掩模，在硅衬底上制造图案，然后在图案化的硅基板上倒入聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物(选自迈图RTV615，其中A胶和B胶以10：1的比例混合)并在80℃下加热固化，时间为0.5小时；
2)将经步骤1)固化后的PDMS芯片从硅基板上剥离下来，切割平整，打孔以形成入口孔和出口孔，如图1所示；
3)取一玻璃基底，清洗后对玻璃基底和PDMS的接触面进行氧等离子体表面活化改性，处理时间为20s，PDMS与玻璃基底表面通过化学键结合牢固粘连，形成捕获芯片的原型；
4)对步骤3)处理的捕获芯片的内部用3-巯基丙基三甲氧基硅烷溶液(用4％v/v的乙醇溶解)于室温下反应30分钟；
5)对步骤4)处理过的捕获芯片的内部用N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS，0.1mM的二甲基亚砜(DMSO))于室温下反应30分钟；
6)继续向芯片内部通入抗生蛋白链菌素(10μg/ml的磷酸盐缓冲溶液(PBS)),室温下反应1小时)；
7)最后向芯片内部通入生物素包被的CD56抗体，(10μg/mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，含1.0％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.1％(w/v)的叠氮化钠)，室温下反应30分钟，即得到了可以原位捕获神经母细胞瘤CTC的捕获芯片，如图1所示。
制备的神经母细胞瘤CTC的捕获芯片，如图2所示，捕获芯片包括玻璃基底(1)和设于所述的玻璃基底(1)上方的含有微柱阵列图案(21)的PDMS层(2)，所述的玻璃基底(1)通过氧等离子键合与含有微柱阵列图案(21)的PDMS接触面牢固连接，所述的捕获芯片内表面玻璃基底(1)层上修饰连接有能特异性捕获神经母细胞瘤CTC的CD56抗体层(3)。微柱可以为三角形、圆形、长方形、棱形和“工”字形结构中的一种或几种。
如图3所示，微柱的边长或直径a在15-20微米之间，两个相邻微柱之间的纵向b为20-25微米，纵向间隔c为7-10微米，微柱高度为30微米，微柱规则呈错位排列，其排列方向与血液流动方向的夹角β为20-30度。由于芯片内微柱阵列组成的捕获单元，除了会对大于临界尺寸的细胞进行拦截外，玻璃基底(1)上连接的CD56抗体还会特异性的结合神经母细胞瘤CTC，从而大幅度的提高神经母细胞瘤CTC捕获效果的捕获纯度。
一种神经母细胞瘤细胞的捕获方法，所述的捕获方法如下：将外周血以5ml/h的流速从芯片入口通入，血液中的神经母细胞瘤CTC由于尺寸较大，一方面会被微柱阵列组成的捕获单元拦截，另一方面会与芯片内修饰连接的CD56抗体发生特异性抗原-抗体结合，从而被原位捕获在芯片内，而其他血细胞则不会受这两个作用而沿着液体流动的方向从出口冲出芯片。
一种原位捕获CTC后的的鉴定方法，对捕获后芯片进行如下步骤：
1)通入磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤至芯片颜色透明；
2)连续通15min的4％多聚甲醛溶液对所捕获的细胞进行固定；
3)通5min磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤残余的固定液；
4)通10min的0.2％Triton X-100溶液对细胞膜进行通透处理；
5)再次通入5min的磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤残余的Triton X-100；
6)通入4％牛血清白蛋白(BSA)溶液孵育30-60min；
7)再次通入5min磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤多余的BSA；
8)加入抗体染色试剂；
9)4℃条件下避光放置过夜；
10)避光条件下通入5-10min磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤多余的抗体，降低背景颜色值，使染色结果较为清晰直观；
12)用荧光显微镜对芯片进行观察鉴定，判断其是否有捕获神经母细胞瘤CTC及其CD56的表达情况。
第二：捕获效果测试
采用上述方法制备的捕获芯片对目标血液进行捕获测试，将血液样品分为5组，每组3次的实验，每次实验模拟血液样品约10毫升血液(即非目标细胞主要为血液中的白细胞和红细胞)，作为目标细胞的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y直接加入到血液中，神经母细胞瘤细胞浓度约每毫升100个，5组实验通量分别为5mL/h、10mL/h、15mL/h、20mL/h和25mL/h，经芯片分离，观察并计算细胞捕获区捕获的细胞量，进而分析捕获效率，每组取3次结果平均后，得到如图5所示的结果，可以看出5mL/h的通量效果最佳。

Claims (9)

1.一种神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片，其特征在于，所述的捕获芯片包括玻璃基底层和设于所述的玻璃基底层上方的有微柱阵列图案的聚合物层，所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙醇乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种，所述的玻璃基底层通过氧等离子键合与带有微柱阵列图案的聚合物层牢固连接，所述的玻璃基底层表面修饰连接有能特异性捕获神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的CD56抗体。
2.如权利要求1所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片，其特征在于，所述的聚合物层为PDMS层。
3.如权利要求1所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片，其特征在于，所述的微柱为三角形、圆形、长方形和“工”字形结构中的一种或几种。
4.如权利要求1所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片，其特征在于，所述的微柱的边长或直径在10-30微米之间，两个相邻微柱之间的横向间隔20-30微米，纵向间隔为7-15微米，微柱高度为30微米。
5.如权利要求1-4任一所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片的制作方法，其特征在于，所述的制作方法包括如下的步骤：
1)使用光刻技术，在硅衬底上制造微柱阵列图案，然后在图案化的硅基板倒入聚合物，加热固化后形成聚合物层；
所述聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚乙醇乙烯酯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚醚酮、聚二甲基硅氧烷中的一种或多种；
2)将经步骤1)固化后的聚合物层从硅基板剥离，再对聚合物层打孔以形成入口孔和出口孔；
3)取一玻璃基底，清洗处理后对玻璃基底和聚合物层的接触面进行氧等离子体表面改性，然后将聚合物层与玻璃基底表面键合粘连，形成捕获芯片的原型；
4)对步骤3)处理的捕获芯片的内部用3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇溶液(5％)于室温下反应30分钟；
5)对步骤4)处理过的捕获芯片的内部用N-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)于室温下反应30分钟；
6)继续向芯片内部通入抗生物素蛋白的磷酸盐缓冲溶液于室温下反应1小时；
7)最后向芯片内部通入生物素包被的CD56抗体，室温反应30分钟，；即得到了可以原位捕获神经母细胞瘤CTC的捕获芯片。
6.如权利要求5所述的神经母细胞瘤CTC的捕获芯片的制作方法，其特征在于，所述的CD56抗体溶液浓度为10μg/mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，含有1.0％(w/v)牛血清白蛋白和0.1％的叠氮化钠。
7.如权利要求1-4任一所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片的使用方法，其特征在于，所述的使用方法包括如下步骤：将外周血以小于10ml/h的流速从入口孔通入芯片，流经芯片内部捕获后，废血从出口孔流出。
8.如权利要求7所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片的使用方法，其特征在于，所述的外周血的流速为5ml/h。
9.如权利要求1-4任一所述的神经母细胞瘤循环肿瘤细胞的捕获芯片的捕获CTC后的鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法包括如下的步骤：
1)通入磷酸盐缓冲溶液洗涤至芯片颜色透明；
2)通4％多聚甲醛溶液对所捕获的细胞进行固定；
3)通磷酸盐缓冲溶液洗涤残余的多聚甲醛；
4)通0.2％Triton X-100溶液对细胞膜进行通透处理；
5)再次通入磷酸盐缓冲溶液洗涤残余的Triton X-100；
6)通入4％牛血清白蛋白溶液孵育30-60min；
7)再次通入磷酸盐缓冲溶液洗涤多余的BSA；
8)加入抗体染色试剂；
9)4℃条件下避光放置过夜；
10)避光条件下通入磷酸盐缓冲溶液洗涤多余的抗体，降低背景颜色值，使染色结果较为清晰直观；
12)用荧光显微镜对芯片进行观察鉴定，判断其是否有捕获神经母细胞瘤CTC及其CD56的表达情况。
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