CN107148468A - 用于从生物流体中富集稀有细胞和生物标志物的具有平滑表面的微流体装置 - Google Patents

用于从生物流体中富集稀有细胞和生物标志物的具有平滑表面的微流体装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了微流体装置和来自生物流体样品的稀有细胞例如循环肿瘤细胞(CTC)以及包括蛋白质和DNA/RNA的其他生物标记物的富集和检测方法。所述装置通过对其细胞捕获室微流体在微米水平上进行优化设计以模拟天然光滑曲面例如海底或河床的平滑表面而相对现有微流体装置做出改进。所述平滑表面的特征在于创造温和的环境和增强样品混合以提高持续性的细胞‑抗体接触和稀有细胞的捕获，同时降低剪切力引起的细胞损伤。细胞捕获模块用细胞捕获配体包被。第二个可选配模块以高灵敏度结合非细胞生物标记物，在富集细胞生物标记物的同时富集非细胞生物标记物100至1000倍。

Description

用于从生物流体中富集稀有细胞和生物标志物的具有平滑表 面的微流体装置
技术领域
本发明涉及微流体装置、细胞检测、细胞分离和分子生物标记物领域。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)起源于原发性肿瘤并且可能来自转移部位。癌细胞从原发性肿瘤扩散到循环系统中作为向远端器官中转移的第一步。平均肿瘤每天可将估计数以百万计的细胞释放到血流中。Butler等，“The Physical and functional behavior ofcapture antibodies adsorbed on polystyrene”，“Immunol.Meth.,150：77-90(1992)”。大多数CTC不存活，但存活的那些CTC对宿主生物造成进一步癌症转移扩散的风险。转移是癌症患者死亡的首要原因。对于实体瘤，CTC的存在在疾病晚期是明显的，并且当转移性疾病位点已经建立时是最明显的。CTC的识别和表征提供了研究、监测和最终改变转移过程的机会。
血液中未损伤的CTC是非常稀有的细胞，以每毫升(mL)全血存在1-10个CTC。相比之下，普通类型的血细胞以巨大的数目存在血液中，并且癌症可能改变其他类型血细胞的水平。这些其他类型细胞可以包括白细胞(正常约7百万/mL血液)和红细胞(正常约50亿/mL血液)。
存在相当多这样的证据：CTC亚群可以指定为肿瘤进展和转移中的选定位点。(Norton等，“Is Cancer a Disease of Self-Seeding？，Nat.Med.,12(8)：875-878(2006)；Attard等，“Characterization of ERG，AR and PTEN gene status in circulatingtumor cells from patients with castration-resistant prostate cancer.CancerRes.69(7)：2912-2918(2009)”)。
治疗前循环肿瘤细胞的数目是转移性乳腺癌患者的无进展生存期和总生存期的独立预测因子。Cristofanilli等，“Circulating tumor cells，disease progression，andsurvival in metastatic breast cancer，N Engl J Med,2004；351(8):781-91”。
关于血液组分的表征的进一步报告表明，在癌症患者的循环系统中存在更大数目的细胞碎片以及未损伤的CTC。肿瘤细胞碎片和完整CTC的计数可用于准确预测癌症患者的生存期。(Ann Oncol.2010；21:1851-1857)
一种现有的CTC芯片是蚀刻有78,000个具有50μm间距的交错排列的微柱的硅腔室。柱子涂有抗EpCAM抗体。CTC捕获产率限于约60％(Nagrath等，“Isolation of rarecirculating tumor cells in cancer patients by microchip technology，Nature，450：1235-1239(2007”)。由于短的细胞柱接触时间造成的低捕获率和高剪切力导致的严重目标细胞损伤，“柱”样结构具有重大缺点。
CTC的识别和表征可为研究、监测和最终改变转移过程提供了机会。然而，从血液中分离CTC而不造成破裂或其他损伤是困难的。大多数现有微流体系统的主要限制是，装置效率受到装置施加在血细胞和CTC上的剪切应力的限制。太大的剪切应力将破坏血细胞和CTC。当CTC破裂时，目标分离物(CTC本身)流失，CTC内部组分散落到流体中。当血细胞(主要是白细胞)破裂释放的细胞内物质进一步复杂化血液内的物种间的非特异性相互作用,使高纯度CTC提取变得更加困难。一些现有装置已经试图通过使用低通道微流体装置来减小剪切应力来避免破坏细胞，包括血细胞和CTC。然而，低通道导致流过通道的流体体积减小，进而导致非常低的流速。这样的装置不足以快速处理大量的血液以使其实用和有用。鉴于血液中未损伤CTC的极低丰度，快速处理大量(7-30mL)的血液(即，在24小时的窗口中[Stott等，“Isolation and Characterization of Circulating Tumor Cells fromPatients with Localized and Metastatic Prostate Cancer，”Sci.Transl.Med.,2：25ra23(2010)；Meng等，“Circulating tumor cells in patients with breast cancerdormancy，”Clin Cancer Res.,10：8152-8162(2004)])是高产率分离完整CTC的先决条件。
除了CTC，血液中循环的游离DNA(cfDNA)和肿瘤DNA(ctDNA)也已成为各种临床条件的癌症诊断和检测中的重要生物标志物。研究表明，cfDNA也许可用于转化基因组研究和监测基于特定肿瘤分布的个性化治疗。为了提取有价值的信息，至关重要的是能够从全血样品中高纯度提取和检测低水平的cfDNA。目前的研究集中于基于同时检测和表征CTC和cfDNA的血液分析。研究表明，在血液中检测到ctDNA的频率要比CTC高，ctDNA在检测突变中或许更有价值。和CTC作为预后生物标记不同的是，ctDNA能够提供治疗靶标(Madic等，Int.J.Cancer，136:2158-2165(2015))。上述微创、实时“液体活检”检测技术提供互补信息，可结合起来多次使用，，以监测疾病进展和定制癌症治疗方案。(Pantel等，CancerRes.,73(21):1-5(2013)；Haber等，Cancer Discov；4(6)：650-61(2014)；Kidess等，GenomeMedicine，5:70(2013))。
发明内容
作为本发明的一个方面，微流体装置包括：一个入口，一个出口，一个流体通道，和一个稀有细胞捕获模块；
所述流体通道，在使用中流体在所述通道内流动，所述流体含有稀有量的全生物细胞分析物和非细胞生物标记物；
所述细胞捕获模块，流体在所述入口与所述出口之间经由所述流体通道连通，所述稀有细胞捕获模块包括至少一个细胞捕获室，所述细胞捕获室底部由平滑轮廓特征的结构表面组成，所述平滑轮廓结构特征的表面的特征在于模拟天然流体自然形成的平滑表面形状分布及地貌轮廓。
作为实施例的一种情形，所述稀有细胞捕获模块包括多于一个的所述细胞捕获室；每个所述细胞捕获室通过与其连通的通道与所述入口连通。
作为实施例的一种情形，所述细胞捕获室具有等效尺寸和等效流速，或者，所述细胞捕获室中的至少一个细胞捕获室与其他细胞捕获室尺寸和流速不同。
作为实施例的一种情形，所述天然流体自然形成的平滑表面形状分布及地貌轮廓包括海底、海洋地、河床；所述平滑轮廓结构特征的表面呈阵列；
所述阵列分布包括微型凹谷阵列、微漏斗和微裂片阵列；其中：
所述微型凹谷阵列具有10至1000微米宽、20至1000微米长和20至1000微米高的尺寸范围；阵列相对位置呈规律或不规律分布，间隙大小为5至500微米；
所述微漏斗和微裂片阵列具有10至100微米宽、20至200微米长和20至200微米高的尺寸范围；所述阵列呈外切圆分布。
作为本发明的微流体装置的表面特征的表面分布还可以包括如下表面特征：最佳峰高度(“山”)、最佳谷深度(“凹谷”的深度)以及峰与谷之间的最佳斜率和曲率。这样的表面促进细胞捕获室中的局部血液混合，并且促进捕获的稀有细胞的容易释放，同时维持细胞活力和完整性。
作为实施例的一种情形，所述模拟是基于数学上的平滑函数实现的；所述平滑函数包括高斯函数、正弦波、二次或更高次数的多项式和三次样条曲线；所述模拟出的平滑形貌的半峰宽度为10至5000微米。
作为实施例的一种情形，所述细胞捕获室的结构表面包被有靶细胞捕获配体；所述细胞捕获室的顶表面包括平滑轮廓特征的结构表面；所述微流体装置具有1至20毫升/小时的样品通量；所述微流体装置具有0.25毫升至50毫升的可变样品体积；所述稀有细胞包括循环肿瘤细胞。
作为实施例的一种情形，所述细胞捕获模块与所述出口的连接通道上，还设有非细胞生物标记物检测模块；用于结合流体中的非细胞生物标记物的捕获配体，所述非细胞生物标记物选自DNA标志物，例如ctDNA或cfDNA、RNA标志物、肽标志物和蛋白质、携带生物标志物的微粒，例如微囊泡、外来体和凋亡体；所述非细胞生物标记物检测模块具体为由微通道构成的蜿蜒结构；所述蜿蜒结构的微通道内壁上设有靶非细胞生物标记物捕获配体包被带；所述捕获配体的种类多于一种。
作为实施例的一种情形，将所述流体装置组装成新片时，所述细胞捕获模块与所述非细胞生物标记物检测模块组装在同一芯片上，或者分别组装在通过连接单元连接在一起的两个芯片上。
作为本发明的另一个方面，提供一种用于从生物流体中富集稀有全细胞的方法，包括：
采用如上所述的微流体装置；
在推动力或者拉力的作用下使生物流体样品通过所述微流体装置。
作为实施例的一种情形，所述方法还包括释放所富集获得的稀有全细胞。所述释放包括经由机械、化学和生物机制的组合释放。
作为本发明的微流体装置的表面特征，增强了表面上的细胞滚动时间和长度。该表面分布延长细胞表面的相互作用、促进基于亲和力的稀有细胞分离并减小剪切应力；同时减少光学干扰、增强可视化并改善稀有细胞识别。
“分析物”是指作为检测、分离、浓缩或提取的方法的目标的流体中的分子或组分。示例性分析物包括细胞、病毒、核酸、蛋白质、碳水化合物和有机小分子。
“血液组分”是指全血的任何组分，包括宿主红细胞、白细胞和血小板。血液组分还包括血浆组分，例如蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物，以及例如由于当前或过去怀孕、器官移植或感染而可能存在于血液中的任何其他细胞。
“生物流体”意在包括天然流体(例如血液、淋巴、脑脊液、尿、子宫颈灌洗液、唾液和水样品)，这些流体的一部分和已经引入细胞的流体(例如，培养基和液态组织样品)。该术语还包括裂解物。
“捕获单元”或“捕获配体”根据情况可能是指分析物结合用化学样品、或者全细胞凭借的其表面的组分结合物质。捕获单元可以是偶联到表面的化合物或构成表面的材料。典型的捕获单元包括抗体、寡核苷酸或多肽、核酸、其他蛋白质、合成聚合物和碳水化合物。
“通道”是指流体可以流过的间隙。通道可以是疏水表面上的毛细管、导管或含水液体可被限制的疏水表面的亲水纹理。
“循环肿瘤细胞”(CTC)是指从受试者的实体肿瘤剥离并且在受试者的循环血液中检测到的癌细胞。
细胞的“组分”是指能够在细胞溶解液中分离到的任何组分。细胞组分可以是细胞器(例如，细胞核、近核区室、核膜、线粒体、叶绿体或细胞膜)、聚合物或分子复合物(例如，脂质、多糖、蛋白质(膜、跨膜或细胞质)、核酸(天然的、治疗性的或病原性的)、病毒颗粒或核糖体)或其他分子(例如，激素、离子、辅因子或药物)。细胞样品的“组分”是指样品中包含的细胞组分子集。
“富集的样品”是指含有这样分析物的样品：相对于通常存在的样品，其已经被处理从而增加分析物的相对含量。例如，可以通过将目标分析物的量增加至少10％、25％、50％、75％、100％或至少1000、10,000、100,000或1,000,000的系数来富集样品。
“耗尽的样品”是指含有这样的分析物的样品：相对于通常存在于样品，其已被处理从而减少分析物的量。例如，可以通过将目标分析物的量减少至少5％、10％、25％、50％、75％、90％、95％、97％、98％、99％甚至100％来耗尽样品。
“间隙”是指流体可以流过的开放通道。
“微”是指具有至少小于1毫米的尺寸。
“天然水体”是指海、海洋、河流或溪流。
“剖面”是指轮廓侧视图图像。
“稀有量”的细胞指少于100个细胞/毫升流体、少于10个细胞/毫升流体、或甚至少于1个细胞/毫升流体。
“规律”是指重复、有序、有条理或以固定、均匀或正常间隔发生的模式；“不规律”是指不正常的。
“表面形貌”是指在与细胞捕获室的底部共面的表面的平面上方或下方的表面摄动。术语“微山”、“微凹谷”、“微漏斗”和“微裂片”分别通过类似于常规山、凹谷、漏斗或裂片的预期轮廓来描述表面特征的轮廓。
其他特征和优点将从以下描述和权利要求显而易见。
附图说明
在附图中示出了本发明的优选实施方案，连同其描述将用于例示本发明。在不脱离本发明的宽范围的情况下，本领域技术人员可以修改所示的特定结构。
图1示出了具有两室细胞捕获模块1和两个曲折非细胞捕获模块2的微流体装置的俯视布局。
图2是海底(A、B和C)和河床(D)的表面形状的图示说明。流动的方向从左到右。
图3是具有二维域的高斯曲线的三维表示。
图4是两个芯片的侧视图：(A)具有平顶的表面形状室底；和(B)表面形状底和表面形状顶。
图5是用于从血液样品中分离稀有全细胞的微型凹谷阵列的底表面的表面形状图(A)和侧视图(B)。
图6A是具有设计控制参数a、b、c、σ和A的微型凹谷底表面上的表面形状特征的图示。
图6B是考虑相对于彼此定位微型凹谷的阵列设计参数的图示。
图6C-6H分别是不同凹谷布置的图示，其中6C：矩形定位；6D.A-B-A错位布置；6E.短间隙-长间隙沿着流动方向；6F.短间隙长间隙垂直于流动方向；6G.短间隙垂直于流动方向；6H.短间隙沿着和垂直于流动方向。
图7是组装微型凹谷芯片的不同方式的示意图，其中：图7A是具有平坦顶部的常规微型凹谷芯片的图示；图7B是组装在一起的两个匹配微型凹谷芯片的图示；图7C是组装在一起的两个不匹配的微型凹谷芯片的图示；图7D、7E和7F分别是相对于图7A-7C的变型的图示，其中微型凹谷芯片是不规律的。
图8是说明本发明的具有微型凹谷表面的微流体装置上的血液样品中稀有全细胞的进展的过程图，其中图8A：流动；图8B：捕获；图8C：洗涤；图8D：释放。
图9是本发明的微流体装置的底表面上的微漏斗和微裂片表面特征的图案的俯视示意图。表面特征之间的箭头示出了表面特征之间的生物流体的流动方向。
图10A和10B是单个微漏斗的俯视图(图10A)和分布(图10B)的图示。
图10C和10D是单个微型裂片的俯视图(图10C)和升高型(图10D)的图示。
图11是微漏斗和微裂片的布局优化。
图12是来自全血的微漏斗和微裂片布局和CTC捕获的实例。
图13是用于从生物流体捕获全细胞和生物标志物的四种表面化学物质的侧视示意图，其中每个捕获配体通过间隔物连接到基底，四种捕获配体是完全抗体(图13A)；F(ab’)2(图13B)；rIgG(图13C)；和Fab'(图13D)。
具体实施方式
公开了用于处理稀有全细胞(例如，循环肿瘤细胞)的改进的微流体装置。改进包括1)细胞捕获模块中的平滑表面设计；2)细胞和生物标记物组合捕获机制；以及，3)在非细胞生物标记物模块中分离的条带中不同生物标记物的“多重”捕获。
概括而言，微流体装置具有两个集成捕获模块。第一捕获模块包含具有内表面的捕获区。第一捕获模块的内表面的底部包括微米(μm)至毫米(mm)水平的海底或河床模拟平滑形貌，该形貌能够促进细胞-装置内表面相互作用。上述平滑形貌是采用高斯或其他平滑数学函数来模拟出来的。平滑特征创造了温和的环境以增强样品混合、连续细胞-抗体接触和稀有细胞捕获。平滑表面设计还降低了施加于细胞的剪切力，以防止在富集处理期间的细胞损伤。这些形貌的布局是利用基于高斯或其他平滑函数的计算机模拟优化而来。结果是提高了细胞-内表面接触效率、降低了剪切应力、增加了通量。第一捕获模块被用结合靶细胞的配体覆盖。当生物流体流过装置时，靶细胞通过配体-细胞结合捕获在这些海底或河床模拟形貌上。第二捕获模块包括化学分离区域，该化学分离区域被非细胞生物标记物的捕获分子覆盖。该捕获模块将稀有细胞被分离后的大量血液样品用于非细胞生物标记物的富集，使其在后续检测之前提升至少100至1000倍。富集所得稀有细胞和非细胞生物标记物通过免疫染色的检测标签进行检测。被捕获稀有细胞可以通过逆转流体方向进行释放和收集，并采用机械、化学和生物释放机制的组合洗涤。
具有不同尺寸的平滑曲线或结构可以随机放置在微流体室中以形成平滑的捕获表面(模拟血管或模拟天然水体的底部)，1)促进高流速；2)增加流体混合和3)降低对细胞的剪切应力。平滑表面的设计避免了出现如下缺点：依赖于“柱”或现有技术“微结构”或现有技术“障碍”(下文称为现有技术微结构)。现有技术微结构的主要的缺点归结于短的细胞-柱接触长度、高的剪切应力和低的捕获率。相比之下，本文公开的平滑表面设计被优化成在不牺牲整个模块室的较大的总捕获表面积的条件下实现了细胞-表面的温和接触。在微结构“柱”设计中，通过放置大量微结构(柱)来获得更大的表面积。然而，细胞可能接触许多柱，但由于在每个柱中非常短的细胞-柱接触距离(滚动长度)，细胞仍然可能不被捕获。相比之下，本发明的平滑表面设计延长了滚动距离(例如，几倍细胞周长)，从而提供了连续性的细胞-抗体接触。此外，平滑表面设计模拟血管中的血流，从而减小了微流体装置表面对细胞的剪切应力而防止细胞损伤。
参照图1所示的实施方案，微流体装置100配备有两个模块：细胞捕获模块1和非细胞生物标记物检测模块2。流体样品在入口10处进入微流体装置100。流体样品可以是生物流体样品，例如，全血。通过由泵或真空(未示出)施加的流动力推动或拉动流体通过微流体装置100。
细胞捕获模块1由一个或多个细胞捕获室5构成。每个细胞捕获室5通过长度相等的通道11连接到入口10。每个通道11具有相同的深度和宽度。因此，样品流体在一个或多个细胞捕获室5之间的体积中均匀分配。血液样品的每个部分同时移动通过每个细胞捕获室5。细胞捕获室5填充有计算机模拟优化的形貌和布局，其促进和延长细胞表面接触，同时使细胞经历的剪切应力最小化。细胞捕获室5的表面6包被有特异性配体或配体组合(未示出)，例如结合一种或更多种细胞表面抗原的一种或更多种抗体或抗体组合，并且因此通过Ab-Ag相互作用捕获细胞。靶稀有细胞(例如，CTC)被捕获在该细胞捕获模块1中。非靶细胞流过细胞捕获室5并在捕获模块出口3处离开细胞捕获室5。捕获的稀有细胞通过免疫-染色后进行识别和定量。
在样品流体离开细胞捕获室5之后，样品流体进入非细胞生物标记物检测模块2。该非细胞生物标记物检测模块2由微通道构成的蜿蜒结构(meander)7构成。微通道构成的蜿蜒结构7的内壁8涂覆有特异性受体12、13和14的带。当样品流过微通道构成的蜿蜒结构7时，这些受体从样品流体中捕获相应的生物标记物。捕获的生物标记物通过免疫染色后进行识别和定量。
上述实施方案的变型是细胞捕获模块1和非细胞生物标记物检测模块2可以被设置在一个芯片上，或者通过连接单元连接在一起的两个芯片上。
细胞捕获模块1
CTC分离芯片的“海底”和“河床”平滑表面设计。图2示出海底(图2A和2B、图2C)和河床(图2D)的典型表面形貌。图3示出具有二维域的高斯曲线。除了高斯曲线之外，用于模拟天然水体的表面形貌的合适的数学函数包括正弦波、2次或更高阶的多项式和三次样条曲线。
在本文所述的所有实施方案中，微流体装置100的细胞捕获模块1的内表面或最低至少细胞捕获模块1的底表面被设计成以微米水平模拟天然水道(例如，海底、海洋底或河床)底表面的表面形貌(以下称为“本发明的表面设计”)。本发明的这些表面设计用于细胞捕获室5的底表面和顶表面。可以用基于高斯函数的计算机模拟来使表面平滑，从而在以下方面优化表面：
1)应当使细胞捕获室5的总表面积最大化，以增强稀有细胞与表面6之间的接触。
2)本发明的表面设计增强了芯片表面上的细胞滚动和基于亲和力的稀有细胞分离。
3)本发明的表面设计使细胞上的剪切应力最小化并减少对捕获的稀有细胞的损伤。
4)本发明的表面设计促进样品流体的混合，例如，血液混合，防止样品中的成分(例如，全血中的CTC)沉降或区域化。通过改变高斯“山”的高度和斜率以及其间的“凹谷”的深度来优化混合。
5)本发明的表面设计平衡了样品处理通量和捕获效率。
6)这样的设计的其他益处包括由于捕获机制而容易释放捕获的稀有细胞，捕获机制主要依赖于通过细胞在表面上滚动而增强的亲和捕获。依据经验，现有细胞捕获装置在释放细胞中存在小的物理障碍。本发明的表面设计还易于通过光学方法(例如，荧光成像)实现可视化和检测，这是因为倾斜的表面形貌可以大大减少了光学干扰的事实。
芯片组装。存在两种可以组装细胞捕获模块1的不同方式，组装成的芯片分别如图4中20、30所示。图4A所示的实施方案使用平的腔室盖21，其可以是通过粘合剂施加的条带，或者通过热或化学接合施加的薄的塑料平板。可以改变室壁的高度以调节室底部22与室顶部(平的室盖21的下侧)之间的室间隙23的尺寸，以在捕获效率和通量之间实现最佳平衡。
在图4B中，一个芯片可以在第二芯片上反扣并且经组装架保持在一起。同样，这可以用可变尺寸的腔室间隙33来完成。益处是双重的。一个益处是双倍的捕获面积，因为捕获配体可以固定到顶部芯片31的下侧(内侧)以及底部芯片32的上(内)侧。另一个益处是易于后分离处理，例如作为双芯片组装的分子分析可以反转并打开用于CTC收集或DNA/RNA分析。
高斯模拟优化的海底设计特例1：用于稀有细胞分离的微型凹谷阵列。高斯模拟优化的海底设计的简化版本由在典型海底上看到的微型凹谷阵列组成。这些微型凹谷促进血液样品的平滑流动、低混合、表面上的细胞滚动，并导致稀有细胞(例如，CTC)的高效捕获。图5示出了稀有细胞捕获室的顶视图(图5A)和侧视图(图5B)。图5A是细胞捕获室5的表面6。插图显示表面6的微型凹谷阵列。
通常对于本发明的表面设计而言，在三个方面执行阵列设计：单个微型凹谷上的深度和表面分布、微型凹谷在阵列中的相对定位以及上述两个方面的优化组合。图6A和6B示出了微型凹谷阵列优化的参数。图6C-H是许多可行阵列设计中的六个实例。参数a、b、c、σ、A、X1、X2、Y1、Y2、D被标识如下：
A、b、c、σ、A：定义二维椭圆高斯函数的参数，其是典型的平滑微结构。
一般来说，二维椭圆高斯函数表示为：
f(x，y)＝A exp(-(a(x-x0)2+2b(x-x0)(y-y0)+c(y-y0)2))
其中A是高斯函数的高度，参数a、b、c定义椭圆高斯函数的形状；此外，参数a、b、c可以从椭圆高斯的标准偏差(σ)导出。X1、X2、Y1、Y2和D是限定微结构(微型凹谷)的布置图案的参数：
X1和X2-定义微结构的列对准宽度
Y1和Y2-定义微结构的行对准宽度
D-中心列移位距离
芯片组装可以遵循如图7所示的几条途径。微型凹谷阵列芯片可以用平顶或其他微型凹谷芯片组装。当组装两个微型凹谷芯片时，不同的对准是另一个参数，其可以优化用于最有效的稀有细胞隔离。
一旦用稀有细胞捕获配体将微型凹谷芯片功能化并组装。可如图8所示进行稀有细胞分离。当血液样品流过微型凹谷芯片时，通过表面固定的捕获配体(例如，针对稀有细胞表面抗原的抗体)捕获稀有细胞。与稀有细胞一起，少量的血细胞通过弱的物理吸附而粘附到芯片表面。用适当的缓冲液洗涤将除去绝大多数血细胞并留下高度纯化的稀有细胞。可以对这些稀有细胞进行免疫染色以进行计数或释放和再收集用于分子分析。
高斯模拟优化的海底设计的特例2：微漏斗和微裂片。图9示出了用于高斯模拟优化的海底设计的简化版本的设计方案。该设计由具有平滑结构的微型漏斗和微型裂片的许多模块组成，其有益于平滑流动、通过增强细胞表面接触促进细胞捕获，同时减小对细胞的剪切应力。
微型漏斗和微型裂片的优化。参照图10，微型漏斗和微型裂片两者的形状、曲率和尺寸是由计算机模拟优化而来，以便增强细胞沿着微型漏斗、微型裂片的壁滚动性。图10A示出了每一半优化微型漏斗的顶视图。其轮廓是由一系列各种半径的外切圆构成的骨架。沿着流动方向，半径逐渐增加以缩小微型漏斗的宽度，然后减小以放宽开口。相邻圆的半径(例如，r1、r2)及其对准依据相关类型细胞(例如，R1、R2)的典型尺寸优化得到。图10B示出微型裂片的侧视截面分布或微型漏斗的一半。相应地，图10D是微型裂片的3-D呈现或一半微漏斗的3-D呈现。图10C是微型裂片的顶视图。
微型漏斗和微型裂片相对位置的优化。如图11A所示，微型漏斗开角(2α)被优化的目的是，在流速足够高以维持期望通量的情况下，增强细胞-漏斗壁相互作用。相对于靶细胞的尺寸优化微型漏斗的出口开口(d0)。根据(微型漏斗体积/2X微型漏斗体积)之比调节两个微型漏斗之间的距离(d1)。调节微型裂片相对于周围微型漏斗(L1、L2、U1和U2)的相对位置，以将上游血流分流并分配到微型漏斗的内壁。
单个微型漏斗和微型裂片的三维(3-D)分布也在增强细胞-表面相互作用中起作用，因此也包括在微型漏斗与微型裂片相对位置的优化中。图11B示出了这样的芯片布局的高程图。
CTC分离方案。图12示出了从全血中分离CTC的方案。用结合CTC的细胞表面上的靶标的捕获分子包被芯片表面。该设计有助于CTC在芯片表面上的平滑滚动。CTC通过捕获-靶分子结合而捕获。模块不包括识别样品中其他类型细胞(例如，血细胞)上的靶标的捕获配体。由于血细胞缺乏靶结合模块，它们流过芯片而没有被捕获。
表面化学。用氧(O2)等离子体或紫外线(UV)处理塑料装置表面以产生活性结合位点。任一种处理也将塑料表面从疏水性改变为亲水性，这对于塑料表面上的抗体或其他捕获涂层是有益的。用基于碳水化合物的底物包被活化的表面以使血细胞、蛋白质和核苷酸的非特异性最小化。然后将细胞结合配体(例如，细胞表面抗原的抗体)经由亲水性间隔物(例如，在两端具有官能团的聚乙二醇(PEG))固定至碳水化合物底物。单克隆抗体可以以不同的形式固定。可以将全抗体固定到表面(图13A)。可以固定抗体片段以更好地定位结合位点或与血细胞的较低非特异性结合(图13B-D)。在使用前，用稳定剂保存抗体包被剂。
释放机制构建入表面化学。被捕获CTC的释放和收集可以通过机械力、化学力和生物力的组合实现。机械地讲，芯片的设计无法单独通过物理力(尺寸陷阱和物理吸附)实现CTC捕获。当在捕获后释放CTC时，存在几种化学和生物学机制起作用。释放缓冲液的pH和化学调节组分显著削弱芯片表面上的捕获分子与细胞表面上的靶分子之间的结合。塑料表面上的包被的碳水化合物底物可以溶解在酶溶液中，酶溶液消化底物并释放捕获的CTC。在某些实施方案中，其中在底物(表面)与捕获分子之间使用交联剂，底物与捕获分子之间的交联剂可以被酶解或化学裂解，以释放CTC。
这可以通过反向流动方向和用组合优化的化学因子和生物因子的释放缓冲剂洗涤来实现。
多室形式。在多个实施方案中，细胞捕获模块1可以包括同时运行的一个或多个细胞捕获室5。使用单室形式，在一个单一条件下处理整个样品，例如全血样品。在具有多于一个细胞捕获室5(“多室形式”)的实施方案中，样品最佳地在所有细胞捕获室5中以等量同时处理。
这可以以两种方式发生。首先，多个细胞捕获室5(n室)具有相同的布局和表面涂层。益处是双重的。一个益处是减少故障，因为一个细胞捕获室5的故障只是总样品的一部分(1/n)。另一个益处是能够通过在每个细胞捕获室5中使用不同的捕获和检测技术来获得捕获的CTC的额外异质信息。当样品流体中的靶细胞显示多种分析物和/或表面配体时，这可以产生有价值的信息。举例来说，鉴于CTC的众所周知的异性性质，多室形式的实施方案可以产生有价值的信息。
第二种方式是在每个细胞捕获室5中具有不同的布局或不同的表面涂层或不同的布局和表面化学性质。例如，在两室形式中，用不同的捕获抗体包被每个室。两个细胞捕获室5将捕获不同表面标志物的CTC的两个亚群。两种类型的CTC的组合信息可以比单独的每个亚群或一个室中的两个亚群具有更大的临床价值。当两个室具有相同的捕获分子和不同的布局时，两个室捕获具有不同物理性质的CTC的2个亚群。当将多种布局和多个捕获分子组合时，CTC可以被分离、分类出许多小的亚群。
此外，每个细胞捕获室5可以在捕获后单独处理。例如，当使用两个相同的细胞捕获室5来分离CTC时，可以列举来自一个室的CTC用于CTC计数，而可以将来自其他细胞捕获室5的CTC用于分子分析。
非细胞生物标记物检测模块2。
常规CTC富集用血液样品的体积比非细胞标记物用常规样品大100至1000倍。微流体装置100的一个优点是，大的血液体积导致对非细胞生物标记物(例如，DNA、RNA、肽、蛋白质等)的检测的增强，表现出100至1000倍增益的灵敏度的增加。
芯片设计。参照回图1，非细胞生物标记物检测模块2紧接在细胞捕获模块1的下游。非细胞生物标志物检测模块2由微通道构成的蜿蜒结构7构成。微通道的直径及蜿蜒密度被优化，以便在一点也不影响流速的情况下实现非细胞生物标记物的捕获。
在另一些实施方案中，非细胞生物标记物模块2是包括稀有细胞捕获模块1的整个芯片的一部分，或者，非细胞生物标记物模块2设置在一个独立的芯片上，而该芯片与包含稀有细胞捕获模块1的芯片连接。两个芯片将依次连接，其中样品(例如，血液样品)流过第一芯片中的稀有细胞捕获模块1，然后流过第二芯片中的非细胞生物标记物模块2。
表面化学。在本文公开的任意多种实施方案中，用靶非细胞生物标记物及其相应的阳性和阴性对照的受体带包被微通道表面。受体带之间的间隙足够长以防止交叉污染。包被的方式可以是受体分子的物理吸附或共价结合。在共价结合的情况下，用氧(O2)等离子体或紫外线(UV)处理塑料表面以产生结合位点。然后可以固定受体分子。在一些情况下可能需要间隔物。也可能需要基底涂层，这可能是因为大量的加工血液可能导致高背景信号。
多重化。通过增加非细胞生物标记物模块2中的受体条带的数目可以容易地实现多重化。可以用不同的捕获分子包被非细胞生物标记物检测模块2的几个区域或区段(条带)以捕获不同的生物标记物(多重化)。针对各种靶生物标记物的每一种的捕获配体固定在微通道构成的蜿蜒结构7内部，其在非细胞生物标记物检测模块中是弯曲的微通道。在图1中，例如，带12、带13和带14分别表示不同的带(区域)和不同生物标志物的“多重”捕获的“带”之间的“间隙”。

Claims (42)

1.一种微流体装置，包括：
a.入口；
b.出口；
c.封闭的流体通道和在操作中在所述通道内流动的生物流体，所述生物流体含有稀有量的全生物细胞分析物；和
d.细胞捕获模块，其经由所述通道在所述入口与所述出口之间流体连通，所述细胞捕获模块包括至少一个细胞捕获室，所述细胞捕获室包括在所述室的底部的平滑特征表面，所述平滑特征表面的特征在于模拟天然水体的表面形状表面分布的平滑表面形状表面分布。
2.根据权利要求1所述的微流体装置，其中所述细胞捕获模块包括多于一个具有平滑特征表面的细胞捕获室，每个捕获室通过所述通道与所述入口流体连通，并且所述平滑特征表面的特征在于模拟天然水体的表面形状表面分布的平滑表面形状表面分布。
3.根据权利要求2所述的微流体装置，其中每个所述细胞捕获室具有相等的尺寸。
4.根据权利要求2所述的微流体装置，其中所有所述细胞捕获模块具有相等的流速。
5.根据权利要求2所述的微流体装置，其中所述细胞捕获室中的至少一个具有与其他细胞捕获室的尺寸不同的尺寸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微流体装置，其中所述细胞捕获室还包括在所述室的顶部的平滑特征表面。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中，天然水体的所述表面形状表面选自海底、海洋底和河床。
8.根据权利要求7所述的微流体装置，其中所述平滑特征表面包括平滑特征阵列，每个所述平滑特征的特征在于分布。
9.根据权利要求8所述的微流体装置，其中所述模拟基于数学上的平滑函数。
10.根据权利要求9所述的微流体装置，其中所述模拟基于高斯函数。
11.根据权利要求10所述的微流体装置，其中所述表面分布包括半峰宽度为10至5000微米的表面特征。
12.根据权利要求8所述的微流体装置，其中所述表面分布增强所述表面上的细胞滚动。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布延长细胞表面相互作用。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布促进基于亲和力的稀有细胞分离。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布降低剪切应力。
16.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布包括如下表面特征：最佳峰高度(“山”)、最佳谷深度(“凹谷”的深度)以及峰与谷之间的最佳斜率和曲率。
17.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布促进所述细胞捕获室中的局部血液混合。
18.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布有助于容易释放捕获的稀有细胞，同时维持细胞活力和完整性。
19.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述微流体装置具有1至20毫升/小时的样品通量。
20.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述微流体装置具有0.25毫升至50毫升的可变样品体积。
21.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布减少光学干涉。
22.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布增强了可视化。
23.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述底表面分布改善稀有细胞识别。
24.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述底表面包括附着于其上的捕获配体。
25.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中，在操作中，所述全生物细胞结合所述捕获配体，以使所述分离细胞将所述细胞呈现于所述表面的顶部。
26.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布包括微型凹谷特征，并且所述微型凹谷具有10至1000微米宽、20至1000微米长和20至1000微米高的尺寸范围。
27.根据权利要求26中任一项所述的微流体装置，其中所述表面包括微型凹谷阵列，其特征在于具有规律的相对位置，间隙大小为5至500微米。
28.根据权利要求27中任一项所述的微流体装置，其中所述微型凹谷具有规律形状分布。
29.根据权利要求27所述的微流体装置，其中所述微型凹谷具有不规律形状分布。
30.根据权利要求27所述的微流体装置，其中所述微型凹谷在微型凹谷列中，并且所述阵列不规律地布置。
31.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述表面分布包括微漏斗特征和微裂片特征的阵列，所述阵列具有10至100微米宽、20至200微米长和20至200微米高的尺寸范围。
32.根据权利要求31所述的微流体装置，其中所述阵列布置成优化的外切圆布局。
33.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，其中所述细胞捕获模块足够大以在1小时至24小时之间处理7.5mL血液。
34.根据权利要求2至6中任一项所述的微流体装置，其中所述细胞捕获室的特征在于匹配表面分布。
35.根据权利要求1至6中任一项所述的微流体装置，还包括非细胞生物标记物模块，其中所述非细胞生物标记物模块在所述细胞捕获模块与所述出口之间流体连通。
36.根据权利要求35所述的微流体装置，其中所述非细胞生物标记物模块包括用于结合样品流体中的分析物的捕获配体，所述分析物选自DNA标记物，例如ctDNA或cfDNA、RNA标记物、肽标记物和蛋白质。
37.一种用于针对稀有全细胞富集流体样品的方法，包括使包含稀有量的所述全细胞的流体样品流过上述权利要求中任一项所述的微流体装置。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述稀有全细胞为循环肿瘤细胞。
39.根据权利要求37所述的方法，还包括从所述细胞捕获模块释放所述全细胞，所述释放通过机械、化学和生物机制的组合进行。
40.一种用于针对稀有全细胞富集流体样品的方法，其包括使包含稀有量的所述全细胞的流体样品流过权利要求35和权利要求36中任一项所述的微流体装置。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述非细胞生物标记物检测模块包含多于一种类型的捕获配体。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法包括从所述出口收集流体，其中针对从固定于所述非细胞生物标记物检测模块的捕获配体释放的分析物富集所述流体。
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