CN113649094B - 一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，包括对应设置且相互连通的上层芯片、中层芯片和下层芯片，上层芯片、中层芯片和下层芯片内均设有不同的微柱阵列以实现对肿瘤细胞的多次捕获；上层采用亲和性的捕获方法，中层芯片和下层芯片均采用物理特性的方法进行拦截捕获。上层芯片由两侧突出微柱结构组成，蜿蜒曲折的流动增加肿瘤细胞与微柱的接触面积，中层芯片有凹三角形微结构组成，下层芯片由底部有细通道的碗形微柱结构组成。本发明结构设计巧妙可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行多层结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏，并利用光谱仪对肿瘤细胞进行检测，能有效判定肿瘤细胞的类型和数量。

Description

一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片

技术领域

本发明属于微流控技术领域，更具体地说，涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片。

背景技术

癌症是威胁人类健康的第一大疾病。由具有权威世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)报道，2020年全球最新癌症数据显示，在2020年，全世界癌症总共有1929万例新发生的癌症病例，其中男性患癌症人数是1006万例，女性患癌症的人数是923万例；全世界因为患癌症而死亡的患者人数总共是996万例，其中男性患者死亡人数大约是553万例，女性患者死亡人数大概是443万例。随着近年我国老龄人口的快速增长和实现人口老龄化,癌症的早期发病和癌症死亡率正在逐年快速提高,估计到达2040年,癌症的临床负担将可能会每年大幅增加50％,肿瘤的从原生瘤转移到其他位置并形成新的瘤，即早期转移，被普遍研究认定为是可能导致我国癌症早期发病和癌症死亡率居高不下的重要直接影响风险因素。

在全球癌症发病率中排在前三是肺癌、乳腺癌和结肠癌，同时它们分别在各类癌症死亡率排行榜上排第一、第五和第二。综合看来，这三类癌症发病率和死亡率占据了全球癌症的1/3。90％的癌症病人死于癌转移，攻克癌症是人类孜孜以求不停追求的目标。传统的切除、化疗、放射线治疗等方法成本高，给病人带来较大痛苦且具有复发性。循环肿瘤细胞(CTCs)是从原生瘤或再生瘤脱落，进入血液循环系统或淋巴系统中的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞定植远端组织，最终形成癌症转移，导致病人死亡。然而，对循环肿瘤细胞的分离及后续分子生物学、基因分析等对肿瘤的检测诊断、肿瘤的进展转移研究和疗效评价具有重要意义。血液循环系统CTCs的数目是极其稀少的，癌症病人血液中分离循环肿瘤细胞具有高技术的难度。CTCs的数目与癌症的严重程度有着密切的联系。数目多，病情严重，数目少病情轻或治疗有效。

微型全分析系统(Miniaturized Total Analysis Systems,TAS)也叫微型实验室(Laboratory-on-a-Chip,简称LOC)它是一个目前热门研究的新领域，是一种通过微加工为基础，通过设计不同的设计结构，通过技术手段将正常一个实验室所需要的步骤集成到几微米大小的一块芯片上，最终实现目前我们所需要的芯片的微型化和集成化，以满足我们目前所需要的要求。微流控芯片的微通道与细胞的尺寸相当，是一种体积小、成本低、试剂消耗低、便携性好的新技术，被称为“液体活检”。现有的利用微流控芯片研究CTCs的捕获分离方法大体可分为三类：

一类利用亲和性(Affinity-based)原理进行细胞的捕获与分离，该捕获方法就是利用了生物上的抗原与抗体的特异性结合，每种细胞的表面都有特殊的、唯一的抗原物质。该物质可以帮助我们分辨该细胞与其它细胞，通常细胞的抗原都有唯一对应的抗体能够与之结合，从而实现特定细胞的捕捉。该方法就是利用生物学原理，事先在微流控芯片成品前，利用生物修饰，在微流控芯片内部的区域表面修饰上一层与特定细胞对应的抗体结构如anti-EpCAM如CTC-chip，或者适配体，当含有细胞的血样流经该处时，特定细胞会与该抗体特异性结合，从而实现捕获，而其它细胞与血样则会流走，从而实现捕获。Herringbone-chip(HB-Chip)的微漩产生的鱼鳞形芯片改变微柱阵列(CTC-Chip设计78,000圆柱形微柱)为鱼鳞形，提高了细胞与抗体修饰的微结构碰撞几率，提高了捕获效率与纯度。但这种微流控芯片的结构通常非常复杂，修饰时间长，抗体昂贵且依赖于EpCAM的不同表达。当肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)时，肿瘤细胞的EpCAM的表达降低。因此依赖于该方法捕获CTCs有可能会失去一部分不表达或低表达EpCAM的肿瘤细胞。该捕获方法依赖于细胞与抗体修饰的柱子的碰撞几率，加速流速时，细胞与抗体修饰柱子的碰撞几率降低且相互作用的时间减少，捕获率下降。典型的基于亲和性微流控芯片结构有CTC-chip、HB-Chip、氧化石墨烯芯片(a graphene oxide chip)、HTMSU、Onco-Bean Chip和a GO-polymer device。

另一类是基于物理特性比如尺寸和形变(ISET：isolation by size ofepithelial tumor cells)进行捕获，利用CTCs比血细胞大且不易形变的特征，滤过血细胞。该方法操作简单，结构勿需过于复杂、不需修饰且不依赖于任何表面的标志物。但由于CTCs与白细胞的尺寸有重叠的部分，所以一部分CTCs可能会通过滤网或微柱间隙导致损失一部分和白细胞尺寸有重叠部分的CTCs，尤其是那些尺寸较小的CTCs。因为经历了EMT的转变，所以漏掉的CTCs恶性程度更高，且容易破裂、纯度不高，容易发生堵塞。但与亲和性或其他如双向电泳等方法相比较，该方法简易切实可行，更适于临床应用如利用惯性分离的圆形螺旋形芯片、CTC聚合芯片、MOA过滤器和微流棘齿。

CTCs微流控芯片的设计应满足以下几点要求：(1)高捕获率：1ml的血液中仅有1-10个肿瘤细胞却有10⁷个白细胞和10⁹个红细胞，所以高捕获率的检测到血样中的每一个肿瘤细胞具有至关重要的意义；(2)高纯度：分离的CTCs没有掺杂其他的细胞如白细胞与红细胞等血细胞，更利于检测如光学检测、识别与计数；(3)保持细胞的活性：捕获后肿瘤细胞的富集、活性，以便于分子生物学基因分析，从而确定病人的病情与治疗方案。(4)高通量：高效快速地分离出肿瘤细胞以满足临床的需求；目前唯一应用于临床的只有捕获率不高的得到美国FDA认证的Cell Search，仅局限于乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌，但仍存在效率低、半自动化的缺陷。

发明人此前基于微流控技术设计一种肿瘤细胞捕获微流控芯片，专利申请号为201610044106.0，申请日为2016年1月22日，该方案中的微流控芯片包括基材、以及形成于所述基材内的微通道，该微通道沿平滑曲线方向延伸，其两端分别形成有入口和出口，所述微通道内沿竖直方向凸伸有微柱阵列，该微柱阵列沿所述微通道的延伸方向阵列分布，其位于入口处的一端贴合于所述微通道的一侧壁，其位于出口处的一端贴合于所述微通道的另一侧壁，所述微柱阵列的中部等间距阵列分布有三角形横截面的捕获腔体，该捕获腔体的三个顶角分别形成三个5微米的间隙，用于一个肿瘤细胞的2-3次捕获。该方案中的芯片结合了2种捕获方法，实用于表达EpCAM与不表达EpCAM的CTCs，不表达和低表达EpCAM的CTCs及未连接上磁珠的CTCs可利用5微米间距的微柱阵列进行捕获，但是该方案对于循环肿瘤细胞的捕获率并不高，有待进一步提高和改进。

再如发明创造名称为一种用于肿瘤细胞分选的双层微流控芯片，专利申请号为201510230598.8，申请日为2015年5月8日，其包括第一芯片和位于第一芯片下方的第二芯片，所述第一芯片的表面具有样品通道，与所述样品通道相对的第二芯片的表面具有缓冲液通道，所述样品通道与缓冲液通道交叉相通。相对于CellSearch检测方法，利用该方案中的双层微流控芯片分析肿瘤细胞的技术不需要多步操作，可一步连续完成，操作简单，检测速度更快，富集的CTCs纯度更高。但是由于该方案中的微流控芯片不使用抗体，只是单一地采用物理尺度筛选方法，难以实现对血液内循环肿瘤细胞的精准捕获。因此，针对上述问题，亟需设计一种高精度并且能够实现快速捕获循环肿瘤细胞的微流控芯片，以满足临床上对于血液中循环肿瘤细胞的检测。

发明内容

本发明提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，克服了现有技术中肿瘤细胞捕获率不高的不足，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，如图1至图7所示，包括上下对应设置且相互连通的正三角状的上层芯片(1)、中层芯片(2)和下层芯片(3)，所述上层芯片(1)在圆心处设有上层入口(100)，在三个顶角处设有上层出口(101)，所述上层入口(100)分别向三个上层出口(101)延伸形成三个呈蛇状迂回结构的上层通道(102)，所述三个蛇状迂回结构分别占据正三角状的一个角，上层通道锲合三角状呈入口和出口两端窄中间宽的特征；所述上层通道(102)设有上层微柱阵列(110)；

所述中层芯片(2)在三角形三个顶角处设置中层入口(200)，在圆心处设置中层出口(201)，所述三个中层入口(200)分别向中层出口(201)汇聚形成三个呈树叶放射状结构的中层通道(202)，所述三个树叶放射状结构分别占据正三角状的一个角，中层通道契合三角状从入口到出口呈逐步放射增大的特征，所述中层通道(202)设有中层微柱阵列(203)；

所述下层芯片(3)在三角形圆心处设有下层入口(300)，在三个顶角处设有下层出口(301)，所述下层入口(300)分别向三个下层出口(301)延伸形成一个呈圆形螺旋状结构的下层通道(302)，所述下层通道(302)设有三个微通道(3021)与三个下层出口(301)连接；所述下层通道(302)设有下层微柱阵列(303)；

所述上层出口(101)与中层入口(200)相连接，所述中层出口(201)与下层入口(300)相连接，其中肿瘤血样从上层入口(100)通过上层通道(102)，经上层微柱阵列(103)进行肿瘤细胞的一次捕获；再从上层出口(101)入中层入口(200)通过中层通道(202)，经中层微柱阵列(203)进行肿瘤细胞的二次捕获；再从中层出口(201)入下层入口(300)通过下层通道(302)，经下层微柱阵列(303)进行肿瘤细胞的三次捕获。

优选的：所述上层微柱阵列(103)位于上层入口(100)的一端与上层通道(102)外侧相贴合，上层微柱阵列(103)位于上层出口(102)的一端与上层通道(102)内侧相贴合，上层微柱阵列(103)与上层通道(102)平行，血样沿上层通道(102)内侧向上层通道(102)外侧流动并穿过上层微柱阵列(103)；所述上层通道(102)直径为宽度为50-100微米，上层微柱阵列(103)高度小于上层通道(102)直径。

优选的，所述上层微柱阵列(103)由多个凸起状微柱(104)组成，所述凸起状微柱沿上层通道(102)道壁的延伸方向等间距交错阵列排布，所述凸起状微柱(104)高度为35-75微米，宽度为15-50微米；所述凸起状微柱(104)上及通道内修饰上肿瘤抗体。

优选的，所述中层入口(200)连接中层出口(201)形成的中心线与中层微柱阵列(203)呈一个夹角，夹角度数为45-75度。

优选的，所述中层微柱阵列(203)是由多个凹三角状微柱(204)组成，所述凹三角状微柱(204)沿中层通道(202)道壁的延伸方向等间距阵列排布，其中相邻的两个凹三角状微柱形成一个底部开口的碗形结构；所述凹三角状微柱(204)边长15-50微米，相邻的两个凹三角状微柱(204)底角之间的间距为5-8微米。

优选的，所述下层微柱阵列(303)是由多个碗状微柱(304)组成，所述碗状微柱(304)沿下层通道(302)道壁的延伸方向等间距阵列排布；所述碗状微柱底部设有开口(3041)，所述开口连接有微支道(3042)，相邻的两个微支道(3042)之间的距离为100-250微米。

优选的，所述碗状微柱底部的开口(3041)曲率半径为20-60微米；所述微支道(3042)长度为15-35微米，直径为6-10微米。

优选的，所述微流控芯片还包括相匹配的第一盖板(4)、第二盖板(5)和底板(6)；所述第一盖板(4)位于上层芯片(1)上方，所述第一盖板(4)设有第一盖板入口(400)与上层入口(100)连接；所述第二盖板(5)位于上层芯片(1)和中层芯片(2)之间，所述第二盖板(5)在三个顶角处设有第二盖板入口(500)，分别与上层出口(101)以及中层入口(200)相连接；所述底板(6)位于下层芯片(3)下方，所述底板(6)在三个顶角处设有底板出口(600)，与下层出口(301)连接。

本发明还提出了一种基于上述的用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的肿瘤细胞检测方法，包括如下：

1)将整合型多层微流控芯片的上层芯片(1)、中层芯片(2)和下层芯片(3)捕获的循环肿瘤细胞富集后，利用红外光谱仪或者高光谱仪对肿瘤细胞进行光谱检测，以获得循环肿瘤细胞的特征光谱信息，并根据光谱信息的特征峰位置和强度，判定肿瘤细胞的类型和数量，以确定循环肿瘤细胞簇的存在；

2)再将肿瘤细胞的光谱信息和病人正常细胞的光谱信息进行比较，得到肿瘤细胞和正常细胞的特征峰位置位移情况，为细胞基因的突变和分子基因学的诊断提供依据。

采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：

(1)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的上层芯片、中层芯片和下层芯片，上层芯片、中层芯片和下层芯片内均设有微柱阵列，上层芯片设有凸起状微柱，蜿蜒曲折的流动增加肿瘤细胞与微柱的接触面积，中层芯片设有凹三角状微柱，下层芯片设有碗状微柱，上层芯片采用亲和性的捕获方法，中层芯片和下层芯片均采用物理特性的方法进行拦截捕获，以实现对肿瘤细胞的多次捕获，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

(2)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，上层芯片通道内两内侧还设置突出的柱状微结构突起，血样从中心注入时，首先蛇形弯曲的上层通道结构有益于抗体与抗原的结合。另该凸起状微柱结构突起有益于不停打乱流体流动方向，血样在微通道内弯曲迂回流动更进一步有益于抗体与抗原相结合。从而实现循环肿瘤细胞的高捕获率。

(3)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，中层微柱阵列还包括三块数组沿树叶状结构排列的凹三角状微柱阵列。三角形三个顶点即为中层芯片的入口(上层芯片的出口)。经过第一层捕获的血样从三个入口流入，被树叶放射状结构的中层通道内的凹三角状微柱阵列结构捕获住，实现循环肿瘤细胞的二次捕获。捕获住从上层芯片漏出的循环肿瘤细胞，再次实现高捕获率与高纯度。

(4)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，下层芯片内设置圆形螺旋状结构下层通道，从中层中间出口流出的血样在第三层芯片的中间流入，该层芯片由一圈一圈的圆形通道结构组成。相邻两个通道由宽度少于6-10微米的细长通道连接。细长通道的入口形成一个小的碗形结构。肿瘤细胞恰好被捕获在碗形结构内，弯曲的曲线结构不会对捕获的肿瘤细胞造成任何伤害。血细胞则可以通过细长的微通道流走。被捕获的肿瘤细胞很少有可能从第三层芯片漏走。捕获率进一步极大提高。纯度不受影响。

(5)本发明的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，循环肿瘤细胞经过三层微流控芯片的捕获，被捕获在三层芯片的不同位置处，当用红外光谱或者高光谱照射到被捕获的循环肿瘤细胞(聚焦在不同层的被捕获的循环肿瘤细胞)，即可获得该肿瘤病人循环肿瘤细胞的特征光谱，根据特征峰的位置，即可判定是何种肿瘤细胞和肿瘤类型。根据该种肿瘤的正常细胞的特征光谱，对比正常细胞和循环肿瘤细胞特征峰位置的移动，即可推断出基因的突变，从而为分子基因学的诊断提供依据。与此同时，根据特征峰的强度，可以确定肿瘤细胞的数量，是否有循环肿瘤细胞簇。

附图说明

图1为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的结构示意图

图2为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的上层芯片以及上层通道、上层微柱阵列的结构示意图。

图3为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的上层芯片俯视图以及上层通道、上层微柱阵列的平面示意图。

图4为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的中层芯片以及中层通道、中层微柱阵列的结构示意图。

图5为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的中层芯片俯视图以及中层通道、中层微柱阵列的平面示意图。

图6为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的下层芯片以及下层通道、下层微柱阵列的结构示意图。

图7为本发明用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的下层芯片俯视图以及下层通道、下层微柱阵列的平面示意图。

图8为本发明中用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片基于亲和性的抗体修饰图。

具体实施方式

为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。

结合图1至图7，本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的正三角状的上层芯片1、中层芯片2和下层芯片3，其中所述上层芯片1在圆心处设有上层入口100，在三个顶角处设有上层出口101，所述上层入口100分别向三个上层出口101延伸形成三个呈蛇状迂回结构的上层通道102，所述上层通道102设有上层微柱阵列103；所述中层芯片2在三角形三个顶角处设置中层入口200，在圆心处设置中层出口201，所述三个中层入口200分别向中层出口201汇聚形成三个呈树叶放射状结构的中层通道202，所述中层通道202设有中层微柱阵列203；所述下层芯片3在三角形圆心处设有下层入口300，在三个顶角处设有下层出口301，所述下层入口300分别向三个下层出口301延伸形成一个呈圆形螺旋状结构的下层通道302，所述下层通道302设有三个微通道3021与三个下层出口301连接；所述下层通道302设有下层微柱阵列303；

具体在本实施例中，所述上层微柱阵列103由多个凸起状微柱104组成，所述凸起状微柱沿上层通道102道壁的延伸方向等间距交错阵列排布。该柱状突起置于微通道两侧，互相错落分开，当血样在微通道内流动时，被柱状突起阻挡，在微通道内迂回流动，不停地与柱状突起碰撞，增加了肿瘤细胞与微结构碰撞的机会，从而实现抗原与抗体的结合。

为了进一步地分选循环肿瘤细胞，本实施例中层芯片自中心位置向三角形三个顶角处形成三块树叶状中层微柱阵列203。所述中层微柱阵列203是由多个凹三角状微柱204组成，相邻凹三角形微柱204形成一个半碗形结构，两个凹三角形微柱底角顶点间距为5-8微米。微柱阵列与半径竖线的夹角为60度，该层芯片实现的是基于物理特性的捕获。血样自第一层的亲和性捕获后，自三个顶点流向中心，血样及漏掉的CTCs被树叶状倾斜的微柱阵列捕获，CTCs恰好能坐在碗形结构内，不损伤任何细胞活性，而相邻两个凹三角形底角顶点形成间隙，血细胞白细胞和红细胞则能通过间隙漏走。经过中层芯片捕获后，CTCs被微柱阵列捕获住，血细胞从中间出口流走，流向第三层下层芯片。

具体地，本实施例中下层微柱阵列303是由多个碗状微柱304组成，所述碗状微柱底部设有开口3041，所述开口连接有微支道3042。从前两层捕获的血样及漏掉的CTCs在该层圆形螺旋形通道内流动，被碗形微结构捕获，恰好斜倚在碗形结构内，不损伤任何细胞活性，碗形结构的底部设置细长的微支道，被捕获的肿瘤细胞不易从底部细长的通道内流走，确保了较高的捕获效率，而血细胞则可以通过细长的通道流走，确保了较高的捕获纯度。

利用上述整合型多层微流控芯片捕获循环肿瘤细胞，捕获方法可以分为四种：

(1)表达和不表达EpCAM的循环肿瘤细胞的捕获测试：对于表达EpCAM(上皮粘附分子)的循环肿瘤细胞，将微流通道内修饰上各种抗体如三甲基硅氧烷(3mt),偶联剂(GMBS),亲和素(Ntra-aviden)，最后修饰上抗上皮粘附分子(anti-EpCAM)或者修饰适配体(aptamer)；当稀释后的病人血样流经微流控芯片时，肿瘤细胞的抗原与抗体相结合，肿瘤细胞被捕获住；同时基于物理尺寸的微柱间隙发挥作用，尺寸较大的肿瘤细胞被捕获，尺寸略小的血细胞从上层微柱阵列200中流过，这是利用亲和性和尺寸相结合的捕获方法。

图8是微流控芯片基于亲和性的抗体修饰图，本实施例首先将微流通道修饰4％的三甲基硅氧烷(3mt,3-mercaptopropyl trimethoxysilane,溶入在酒精里)45分钟，然后用1μM的偶联剂GMBS(the coupling agent N-y-maleimidobutyryloxy succinimide ester)处理,再用10μg ml^-1亲和素(neutravidin)室温处理30分钟，最后用PBS里的10μg ml^-1抗上皮粘附分子(biotinylated EpCAM)4℃过夜处理即可实现微流通道的抗体修饰。

(3)对于不表达EpCAM或低表达EpCAM的肿瘤细胞，直接利用细胞的尺寸与形变进行捕获。

(4)CTCs被捕获并富集在中层芯片碗形微柱210形成的捕获腔211内，CTCs亦可被捕获在下层芯片碗形结构313内，由于CTCs被富集数量增多，用激光检测富集CTCs的特征光谱信号增强，可以获得该肿瘤病人的肿瘤类型及基因蛋白质光谱特征。

综上，本实施例的一种用于捕获循环肿瘤细胞的双层微流控芯片，其结构设计巧妙，可以根据需求对循环肿瘤细胞的捕获方法进行结合选用，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。

本发明还提出了一种基于上述的用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的肿瘤细胞检测方法，包括如下：

1)将整合型多层微流控芯片的上层芯片(1)、中层芯片(2)和下层芯片(3)捕获的循环肿瘤细胞富集后，利用红外光谱仪或者高光谱仪对肿瘤细胞进行光谱检测，以获得循环肿瘤细胞的特征光谱信息，并根据光谱信息的特征峰位置和强度，判定肿瘤细胞的类型和数量，以确定循环肿瘤细胞簇的存在；

2)再将肿瘤细胞的光谱信息和病人正常细胞的光谱信息进行比较，得到肿瘤细胞和正常细胞的特征峰位置位移情况，判断细胞基因的突变，为分子基因学的诊断提供依据。

采用本发明所述的整合型多层微流控芯片捕获循环肿瘤细胞，并利用红外光谱仪或者高光谱仪进行光谱检测，能够有效和快速的识别肿瘤细胞的类型和数量，为判断细胞基因的突变和分子基因学的诊断提供依据。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，包括上下对应设置且相互连通的正三角状的上层芯片(1)、中层芯片(2)和下层芯片(3)，其特征在于：

所述上层芯片(1)在圆心处设有上层入口(100)，在三个顶角处设有上层出口(101)，所述上层入口(100)分别向三个上层出口(101)延伸形成三个呈蛇状迂回结构的上层通道(102)，所述三个蛇状迂回结构分别占据正三角状的一个角，上层通道锲合三角状呈入口和出口两端窄中间宽的特征；所述上层通道(102)设有上层微柱阵列(103 )；所述上层微柱阵列(103)由多个凸起状微柱(104)组成，所述凸起状微柱沿上层通道(102)道壁的延伸方向等间距交错阵列排布；

所述中层芯片(2)在三角形三个顶角处设置中层入口(200)，在圆心处设置中层出口(201)，所述三个中层入口(200)分别向中层出口(201)汇聚形成三个呈树叶放射状结构的中层通道(202)，所述三个树叶放射状结构分别占据正三角状的一个角，中层通道契合三角状从入口到出口呈逐步放射增大的特征，所述中层入口(200)连接中层出口(201)形成的中心线与中层微柱阵列(203)呈一个夹角，夹角度数为45-75度；所述中层通道(202)设有中层微柱阵列(203)；所述中层微柱阵列(203)是由多个凹三角状微柱(204)组成，所述凹三角状微柱(204)沿中层通道(202)道壁的延伸方向等间距阵列排布,其中相邻的两个凹三角状微柱形成一个底部开口的碗形结构；

所述下层芯片(3)在三角形圆心处设有下层入口(300)，在三个顶角处设有下层出口(301)，所述下层入口(300)分别向三个下层出口(301)延伸形成一个呈圆形螺旋状结构的下层通道(302)，所述下层通道(302)设有三个微通道(3021)与三个下层出口(301)连接；所述下层通道(302)设有下层微柱阵列(303)；

所述上层出口(101)与中层入口(200)相连接，所述中层出口(201)与下层入口(300)相连接，其中肿瘤血样从上层入口(100)通过上层通道(102)，经上层微柱阵列(103)进行肿瘤细胞的一次捕获；再从上层出口(101)入中层入口(200)通过中层通道(202)，经中层微柱阵列(203)进行肿瘤细胞的二次捕获；再从中层出口(201)入下层入口(300)通过下层通道(302)，经下层微柱阵列(303)进行肿瘤细胞的三次捕获。

2.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，其特征在于：所述上层微柱阵列(103)位于上层入口(100)的一端与上层通道(102)外侧相贴合，上层微柱阵列(103)位于上层出口(101 )的一端与上层通道(102)内侧相贴合，上层微柱阵列(103)与上层通道(102)平行，血样沿上层通道(102)内侧向上层通道(102) 外侧流动并穿过上层微柱阵列(103)；所述上层通道(102)直径为宽度为50-100微米，上层微柱阵列(103)高度小于上层通道(102)直径。

3.根据权利要求2所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，其特征在于：所述凸起状微柱(104)高度为35-75微米，宽度为15-50微米；所述凸起状微柱(104)上及通道内修饰上肿瘤抗体。

4.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，其特征在于：所述凹三角状微柱(204)边长15-50微米，相邻的两个凹三角状微柱(204)底角之间的间距为5-8微米。

5.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，其特征在于：所述下层微柱阵列(303)是由多个碗状微柱(304)组成，所述碗状微柱(304)沿下层通道(302)道壁的延伸方向等间距阵列排布；所述碗状微柱底部设有开口(3041)，所述开口连接有微支道(3042)，相邻的两个微支道(3042)之间的距离为100-250微米。

6.根据权利要求5所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，其特征在于：所述碗状微柱底部的开口(3041)曲率半径为20-60微米；所述微支道(3042)长度为15-35微米，直径为6-10微米。

7.根据权利要求1所述的一种用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片还包括相匹配的第一盖板(4)、第二盖板(5)和底板(6)；所述第一盖板(4)位于上层芯片(1)上方，所述第一盖板(4)设有第一盖板入口(400)与上层入口(100)连接；所述第二盖板(5)位于上层芯片(1)和中层芯片(2)之间，所述第二盖板(5)在三个顶角处设有第二盖板入口(500)，分别与上层出口(101)以及中层入口(200)相连接；所述底板(6)位于下层芯片(3)下方，所述底板(6)在三个顶角处设有底板出口(600)，与下层出口(301)连接。

8.一种基于权利要求1-7所述的用于捕获循环肿瘤细胞的整合型多层微流控芯片的肿瘤细胞检测方法，其特征在于，包括如下：

1)将整合型多层微流控芯片的上层芯片(1)、中层芯片(2)和下层芯片(3)捕获的循环肿瘤细胞富集后，利用红外光谱仪或者高光谱仪对肿瘤细胞进行光谱检测，以获得循环肿瘤细胞的特征光谱信息，并根据光谱信息的特征峰位置和强度，判定肿瘤细胞的类型和数量，以确定循环肿瘤细胞簇的存在；

2)再将肿瘤细胞的光谱信息和病人正常细胞的光谱信息进行比较，得到肿瘤细胞和正常细胞的特征峰位置位移情况，为细胞基因的突变和分子基因学的诊断提供依据。

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