CN104651315B - 一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法。本发明方法包括如下步骤:先在二氧化硅微球表面包裹一层明胶,再修饰上anti‑EpCAM,然后与含有肿瘤细胞的样品混合孵育,孵育后的混合样品通过可进行尺寸分选的微流控芯片分选收集后,用明胶酶降解二氧化硅球表面的明胶即可释放收集的肿瘤细胞。本发明通过抗原抗体特异性识别选择性的扩大了吸附肿瘤细胞的微球与其他细胞的尺寸差别,分选效率及纯度更高,并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养,活性不受影响。本发明的分选过程不需要对芯片进行修饰,具有简单、方便、易操作、特异性强、成本低等优势,具有良好的应用前景。

Description

一种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺 寸差别分选肿瘤细胞的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种分选肿瘤细胞的方法,具体涉及一种在微流控芯片中同时利用抗 原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法。
背景技术
[0002] 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)通常是指来自于原发肿瘤组织, 经脱落进入人体血液循环系统的肿瘤细胞。相当多的事实表明CTCs在转移过程中能够在不 同的组织上寄居并可以在许多转移后的固相肿瘤上发现。鉴于实体肿瘤患者因癌症导致死 亡的原因多数是因肿瘤转移这个事实,早期的循环肿瘤细胞诊断在人体肿瘤活组织检查和 判断疾病进展中起着关键作用。人体外周血中检测到的肿瘤细胞数量,对疾病分期、治疗评 估以及药物监控等方面起着重要作用。同时,对检测到的CTCs进行基因分子方面的研究对 于我们理解肿瘤转移与复发也具有重要意义。然而,CTCs是很稀少的,转移癌患者体内的每 1〇9个血液细胞中只有几个CTC,因此对于它们的分选是一个极大的技术挑战。
[0003]近年来,CTCs灵敏的、特异的检测技术已经建立,它们使用不同的工作机制,例如, 免疫磁性分离技术、增加细胞跟基底频繁接触而进行分选的微流控技术和基于不同细胞尺 寸来分选CTCs的微型过滤器设备。目前,CTCs的分选机理最常用的是利用特异性抗体对其 表面表达的肿瘤标记物,如上皮细胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM),进行特异性的抗原抗体吸附来进行分选。其次是利用CTCs与其他细胞的物理特性 差异进行非特异性的分选,如细胞尺寸、密度和形变等的差异性。其中基于尺寸大小的微流 控细胞分选技术是当前CTCs研究领域的一个热点。微流控芯片分析技术以其快速、高效、高 通量、低消耗、集成化和微型化等优势,将会更温和、快速地操控和分选活细胞,有利于更准 确高效地提取血液等体液样品中的信息,非常适用于血细胞、肿瘤细胞等体细胞的分选。 [0004]基于尺寸大小的肿瘤细胞分选是一种快速简便的细胞筛选技术,其分选原理是基 于肿瘤细胞尺寸通常比外周血细胞(如白细胞、红细胞和血小板等)略大这一事实。其中肿 瘤细胞粒径范围一般在10-30M1,血细胞尺寸在6-l6wn,由于它们之间存在着一个重叠的范 围,并且由于肿瘤细胞的异质性,不同的肿瘤细胞在尺寸及形变能力上都会有极大的不同, 从而直接影响了单纯基于细胞尺寸分选的技术在肿瘤细胞筛选上的纯度。因此本发明在微 流控技术和抗原抗体特异性识别的基础上引入了一种新的更有效的同时利用细胞尺寸大 小的分选技术,通过选择性的扩大肿瘤细胞的分选尺寸,从而扩大其与血细胞尺寸差异性, 提高了肿瘤细胞的筛选纯度。
发明内容
[0005]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足,提供一种新的在微流控芯片 中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细胞的方法。该方法通过抗原抗 体特异性识别选择性的扩大了肿瘤细胞的分选尺寸,对肿瘤细胞的区分、筛选效率及纯度 更高,并且分选出来的肿瘤细胞能够被释放及培养。
[0006]为了达到以上目的,本发明采用以下技术方案:
[0007] —种在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤细 胞的方法,包括如下步骤:
[0008] ⑴制备可进行尺寸分选的微流控芯片:该芯片主要包含一个宽度为300-800um的 主通道,连接在主通道一侧的3_6条宽度为200_5〇Own的宽支路以及另一侧的10-25条宽度 为20-30M1的窄支路。
[0009] (2)在35-100WI1的二氧化硅微球表面包裹一层的明胶,得到具有明胶表面的二氧 化硅微球(Si〇2@Gel)。
[0010] ⑶在Si02@Gel的明胶表面修饰上具有特异性免疫识别肿瘤细胞功能的抗体,得 到抗体修饰的Si〇2@Gel。
[0011] ⑷将含有肿瘤细胞的样品与抗体修饰的Si02@Gel混匀孵育(使Si02@Gel的抗体与 肿瘤细胞表面抗原特异性结合以捕获住肿瘤细胞)得混合样品,再通入微流控芯片的主通 道,同时从宽支路注入PBS,分别在主通道的另一侧及窄支路收集捕获住肿瘤细胞的微球与 未被微球捕获的细胞。
[0012] (5)将收集的捕获住肿瘤细胞的微球用明胶酶进行降解释放肿瘤细胞。
[0013] 步骤(1)中所述的微流控芯片优选为:高度100WI1,主通道宽度550wn,4条宽度为 400mi的宽支路,16条宽度为30mi的窄支路。
[0014] 步骤⑵中所述的二氧化硅微球的粒径优选为50ym。
[0015] 步骤⑵中所述的Si〇2@Gel表面的明胶的厚度优选为10-50nm。
[0016] 步骤(2)优选包括如下步骤:1)将二氧化硅微球加入到无水乙醇中,加热升温至 50-80°C后滴入氨基丙基三乙氧基桂焼(3-Aminopropyltriethoxysilane,APS)磁力搅拌 2-4h,然后经过无水乙醇、去离子水离心洗涤后得到了氨基修饰的二氧化硅微球(NH2-Si〇2)。2)将NH2-Si02重新分散到去离子水中,加入戊二醛,搅拌5-20h,然后经过去离子水离 心洗涤后得到了醛基修饰的二氧化硅微球(CH0-Si02)。3)将CH0-Si02再次分散到去离子水 中,加入明胶,搅拌3_5h后用去离子水离心洗涤得到表面均匀包裹上一层明胶的二氧化硅 微球(Si〇2@Gel)。
[0017] 步骤⑶中所述的抗体优选为anti-EpCAM〇
[0018] 步骤⑶优选包括如下步骤:1)将Si02@Ge 1浸泡在无水乙醇中进行消毒灭菌,再将 Si〇2@Gel浸入(3-疏基丙基)二甲氧基娃烧(3-mercaptopropyl-trimethoxysi lane,MTPMS) 溶液中反应45-120分钟,再用无水乙醇洗涤。2)将1)处理的微球浸入到4-马来酰亚胺基丁 酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)溶液中反应45-60分钟,分别用无水乙醇、DMS0洗涤。3)将2)处理 的微球浸入链霉亲和素(SA)溶液中,4°C过夜处理,用PBS洗涤。4)对3)处理的微球进行 anti-EpCAM修饰l_3h,用PBS洗涤得到抗体修饰的Si02@Gel。
[0019] 步骤⑷中所述的混合孵育的条件优选为通过细胞混匀仪室温下搅拌30min,转速 设定为l〇rpm。
[0020] 步骤⑷混合样品中抗体修饰的Si〇2@Gel的数量优选为1 • 6 X 105/mL。
[0021] 步骤(4)中主通道进样口混合样品的流速优选为70yL/h,主通道进样口混合样品 与宽支路注入口 PBS的流速优选为比值1:4-1:10。
[0022] 步骤⑸中所述的明胶酶优选为基质金属蛋白酶9 (MMP,。
[0023] 在步骤(4)中,含有肿瘤细胞的样品与经抗体修饰的Si〇2@Gel混匀孵育后流经主 通道,同时将PBS从宽的支路向下注入主通道中,当其与样品接触时,挤压样品从下边窄支 路流出,形成动态稳定的类层流界面。由于捕获有肿瘤细胞的二氧化硅微球(直径35—100tl m)形变可忽略,且尺寸远大于窄的支路通道,其会从样品中分离出来进入PBS相,在右边主 通道出口处收集起来,同时未被微球捕获的血细胞由于尺寸小于窄的支路通道,会被PBS挤 压到下边窄的支路通道中,在下边出口处收集起来,完成肿瘤细胞筛选纯化过程。
[0024] 所述的在微流控芯片中基于抗原抗体特异性识别和细胞尺寸分选肿瘤细胞的方 法中,二氧化硅微球还可以替换成其他羟基微球,如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球,相应的 具有明胶表面的二氧化硅微球(Si〇2@Gel)、抗体修饰的Si02@Gel为具有明胶表面的聚甲基 丙烯酸甲酯微球(PMMA@Gel)、抗体修饰的PMMMGel。
[0025]所述的在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞尺寸差别分选肿瘤 细胞的方法,还包括对收集的肿瘤细胞进行鉴定的步骤。
[0026] 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
[0027] (1)本发明用二氧化硅微球尺寸在5〇Wn左右,远大于肿瘤细胞和正常血细胞的尺 寸,且形变能力差,修饰上相应的抗体后对于靶细胞的捕获效率高,对一个微球而言只要捕 获住一个靶细胞就能达到分选目的。用二氧化硅微球捕获肿瘤细胞,通过选择性的扩大肿 瘤细胞分选物体的尺寸,大幅扩大了其与血细胞尺寸差异性,提高了肿瘤细胞的筛选纯度。 [0028] ⑵本发明用anti-EpCAM修饰的Si〇2@Gel能特异性吸附靶细胞,而不吸附血细胞, 从而实现了对CTCs的特异性识别和捕获。
[0029] (3)本发明是同时结合了基于细胞尺寸和抗原抗体特异性识别,区分、筛选肿瘤细 胞的方法。
[0030] (4)本发明在二氧化桂微球表面包裹了一层明胶,在收集到捕获肿瘤细胞的二氧 化硅微球后,通过明胶酶降解即可释放肿瘤细胞,释放的肿瘤细胞活性不受影响。
[0031] (5)本发明所用微球能够对肿瘤细胞进行特异性识别和捕获,而不吸附血细胞,通 过明胶酶降解释放下来的都是肿瘤细胞,进而可以实现对肿瘤细胞的可控释放。 ’
[0032] (6)本发明可以对释放下来的肿瘤细胞进行再培养,肿瘤细胞传代并未受到影响 且验证了肿瘤细胞相对血细胞极强的无限增殖能力。 ’
[0033] (7)本发明的分选过程不需要对芯片进行修饰,具有简单、方便、易操作、特异性 强、成本低等优势,具有良好的应用前景。
附图说明
[0034]图1是本发明Si〇2@Gel微球的制备、修饰以及捕获、释放细胞的示意图。
[0035]图2是本发明对肿瘤细胞进行分选的芯片的原理图、结构图,①、②、③分别为讲榉 口、PBS注入口、下边出口。
[0036]图3是本发明微流控芯片的实物图。
[0037] 图4是Si〇2、Si〇2@Gel微球和明胶的傅里叶红外结果图。
[0038]图5是不同浓度训观以微球对靶细胞捕获率影响的结果图。
[0039]图6是Si〇2@Gel微球对肿瘤细胞系的捕获效率图。< 。
[0040] 图7是Si〇2@Gel微球捕获细胞的显微镜下的视野图,其中a)为经anti-EpCAM修饰 的Si〇2@Gel微球对结直肠癌细胞系HCTlie的捕获结果图,b)为未经anti-EpCAM修饰的Si02@ Gel微球对HCT116的捕获结果图,c)为经anti-EpCAM修饰的Si02@Gel微球对HCT116和白细 胞的捕获结果图,图中标尺为4〇Wn。
[0041] 图8是Si02@Gel微球对人造血样中的肿瘤细胞的捕获结果图。
[0042]图9是微流控芯片进样口①与PBS注入口②流速比值及PBS注入口②流速与肿瘤细 胞分选效率之间的关系图。
[0043]图10是Si〇2@Gel微球对人造血样中肿瘤细胞的释放效率图。
[0044]图11是基质金属蛋白酶MMP-9对SiOWGel微球上捕获的细胞进行释放后的活性测 试结果图;其中,对照组是刚传代的细胞活性,释放组是释放下来1小时内的细胞活性,1天、 3天、7天分别代表释放下来的细胞进行再培养1天、3天、7天后的细胞活性。
[0045]图12是释放下来的肿瘤细胞进行再培养的显微镜下的视野图,其中a)为释放下来 的细胞培养一个小时后FDA/PI荧光图,绿色荧光代表活细胞,b)为释放下来的细胞培养3天 后的荧光图,c)为释放下来的细胞培养7天后的荧光图。
[0046]图13是使用三色荧光对释放下来的肿瘤细胞以及白细胞进行鉴定的荧光显微图, 其中a)为白细胞荧光(绿光),b)为肿瘤细胞的荧光(红光),c)为细胞核的荧光(蓝光),d)为 a)、b)、c)三张焚光的融合图。
[0047]图14是本发明实验平台对肿瘤细胞进行分选前、分选后以及再培养1天、2天后肿 瘤细胞和白细胞所占比例图。
具体实施方式
[0048]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限 于此。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0049] 本发明在微流控芯片中基于细胞尺寸分选肿瘤细胞的方法的原理见图1、图2,其 中图1是在二氧化硅微球表面包裹明胶、明胶表面修饰抗体、细胞表面抗原与抗体特异性结 合、明胶被MMP-9降解后细胞被释放下的示意图。图2是肿瘤细胞在微流控芯片中的分选原 理图,具体过程为:将修饰上抗体的Si〇2@Gel与样品(血样)在细胞混匀仪上旋转半个小时 后使Si〇2@Gel捕获样品的靶细胞,通入微流控芯片的主通道中,同时将MS从宽的支路向下 注入主通道中,当其与血样接触时,挤压血样从下边窄的支路流出,形成动态稳定的类层流 界面。Si02@Gel形变可忽略,且尺寸大于窄的支路通道,会从血样中分离出来进入PBS相,在 右边出口处收集起来,同时未被微球捕获的血细胞由于尺寸小于窄的支路通道,会被挤 压到下边支路通道,在下边出口处收集起来,完成肿瘤细胞筛选纯化过程。
[0050] 实施例1
[0051] (1)微流控芯片的制备
[0052]微流控芯片制作最核心的工序是将预先设计好的微缩图形高精度地转移到芯片 的基底材料上,其高度为100M1,主要包含一个主通道(宽550wn),连接在主通道一侧的4条 宽的支路(宽400M1)以及另一侧16条窄的支路(宽30wn)。按照传统的光刻技术制备成如图3 所示的微流控芯片。
[0053]⑵ Si〇2@Gel的制备
[0054] 称取50um左右的二氧化硅微球0• lg倒入三口烧瓶中,加入5〇mL无水乙醇加热搅拌 均匀,待温度升高到6(TC后滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APS) 0.5mL磁力搅拌沾,离心收 集到的微球分别经过无水乙醇、去离子水离心洗涤3次后得到了氨基修饰的二氧化硅微球 (NH2-Si02)。接着,将NH2-Si02重新分散到40mL去离子水中,加入0 • 5mL浓度为50 %的戊二醛 溶液,室温搅拌l〇h,离心收集到的微球经过去离子水离心洗涤3次后得到了醛基修饰的二 氧化硅微球(CHO-Si02)。最后,将CH〇-Si〇2再次分散到40mL浓度为1 %的明胶溶液,室温搅拌 4h后用去离子水离心洗涤3次得到表面均匀包裹上一层l〇_50nm明胶的二氧化硅微球 (Si02@Gel)。整个实验离心的过程转速设定为1000转/分钟。
[0055] 图4是明胶(Gel)、包裹上明胶的二氧化硅微球Si02@Gel、二氧化硅微球(Si〇2)的傅 里叶红外结果图,从图4可以看出Si02@Gel在吸收峰1544CHT1处很明显有一个吸收光谱带, 是明胶的N-H伸缩振动峰,而单独的二氧化硅微球在这个波数位置并没有吸收峰,表明二氧 化硅微球表面包裹上了一层明胶 [0056] (3)Si〇2@Gel 的抗体修饰
[0057] 1)将⑵得到的Si〇2@Gel取80mg浸泡在无水乙醇中lOmin进行消毒灭菌,用无水乙 醇配制(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MTPMS)成体积比为4 %的溶液,并将Si02@Ge 1浸入5mL MTPMS溶液中室温下反应lh,然后用无水乙醇离心洗涤三次。
[0058] 2)将4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)溶于二甲亚砜(DMS0)中配制成 摩尔浓度为2.5UM的溶液,再将上一步处理过的微球浸入0.2mL GMBS溶液中室温下反应lh, 然后分别用无水乙醇、DMS0洗涤三次。
[0059] 3)将链霉亲和素(SA)溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中配制浓度为10ug/mL的溶液,再将 上一步处理过的微球浸入0. lmL SA溶液中,放入4°C冰箱过夜处理,然后用PBS洗涤三次,待 用。
[0060] 4)将上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpGAM)溶于PBS中配制浓度为50iig/mL的溶液 再将上一步处理过的微球浸入0• lmL anti-EpCAM溶液中,然后用roS洗涤三次,得到anti-EpCAM 修饰的 Si02@Gel。
[0061] 实施例2
[0062] 为了研宄lmL混匀液中Si02@Gel微球数量对靶细胞(祀细胞为EpCAM高表达的肿瘤 细胞HCT116)捕获率的影响,使用不同浓度的微球数(0、1.6X104、8X104、1.6X105、3.2X 105/mL,对应的微球质量分别为2、10、20、401^)来捕获两种浓度的靶细胞(105/11^和104/ mL)。样品放在细胞混句仪上室温下搅拌3〇min,转速设定为lOrpm。通过在Olympus IX 71显 微镜下计数微球对肿瘤细胞的捕获率,实验结果如图5所示,当微球浓度在1.6X105/mL时, 也即2〇mg,对不同浓度的靶细胞的捕获已经达到饱和。故下述实施例所使用的微球浓度在 1.6X105/mL 左右。
[0063] 实施例3
[00M]向细胞培养溶液中加入经FDA荧光染色的靶细胞(粑细胞为EpCAM高表达的肿瘤细 胞HCT116或MCF-7),配成的靶细胞密度分别为500个/mL、1000个/mL、5000个/mL、10000个/ mL,向lmL上述不同浓度的靶细胞溶液中分别加入实施例1制备的anti-EpCAM修饰的Si〇2@ Gel以及没有经过anti-EpCAM修饰的SiOWGel微球各20mg,通过细胞混匀仪室温下搅拌 30min,转速设定为l〇rpm。搅拌3〇min后,在〇iympus ix 71显微镜下观察计数,归一化计算 靶细胞的捕获率。捕获结果见图6,anti-EpCAM修饰的Si〇2@Gel对靶细胞的捕获效率在80% 左右,而未经修饰的Si02@Gel捕获效率在3%左右。图7a)、b)分别为是anti-EpCAM修饰的 SiOWGel和未经修饰的Si02@Gel捕获靶细胞(HCT116)的视野图(Olympus IX 71显微镜下 10X拍摄)。上述结果表明,经过anti-EpCAM修饰的Si02@Gel对靶细胞的捕获效率已经相当 高,并且微球的非特异性捕获可以忽略不计。
[0065] 实施例4
[0066] 向lmL健康人血样中加入不同数量的经过FDA染色的靶细胞(HCT116或MCF-7),分 别配制成密度为100个/mL、250个/mL、500个/mL、1000个/mL的人造血样,各加入20mg实施例 1制备的anti-EpCAM修饰的Si〇2@Gel,通过细胞混匀仪室温下搅拌30min,转速设定为 l〇rpm。搅拌30min后,通过荧光显微镜观察计数,捕获结果如图8所示,平均的捕获效率为 80%左右,且对白细胞非特异性吸附很低。图7c)为人造血的捕获显微镜观察视野图,微球 上尺寸大的细胞为靶细胞,小的未被吸附的细胞为血细胞。结果表明,an t i -EpCAM修饰的 Si02@Gel能特异性吸附靶细胞,而不吸附血细胞。
[0067] 实施例5
[0068] 探究流速对靶细胞分选效率的影响,具体操作为:修饰上抗体的Si02@Gel捕获住 人造血中的CTCs后用注射栗将混匀液通入进样口①(见图2中①、②、③)中,同时将PBS通入 入口②中,调节①和②两个入口注射泵的流速。例如,当将入口①处流速设定为7〇uL/小时, 调节入口②处的流速,当②处流速比较低时,样品跟PBS的分界面比较靠近主通道出口处, 导致含有白细胞的溶液不能完全从芯片窄支路(宽30wii)流出,分选纯度降低;随着②处流 速的增加,分界面慢慢向入口①处靠近,含有白细胞的溶液能够完全从芯片的窄支路(宽30 _)流出,提高靶细胞的分选纯度。当②处ros流速的增加到600此/小时以上,PBS往入口① 处涌出,样品很难往前推进,影响分选效果。PBS注入口②流速在300-600UL/小时时分选纯 度最高。进样口①与PBS注入口②流速比值及roS注入口②流速与靶细胞分选效率之间的关 系见图9,当进样口①与PBS注入口②流速比值在1:4-1:10之间时分选纯度最高,即③处白 细胞的过滤效果最好。
[0069] 实施例6
[0070] 在上述实施例4人造血CTCs捕获实验后(向lmL的健康人血样中加入经FDA染色的 HCT116细胞悬液,配制成HCT116密度为100个/mL、250个/mL、500个/mL、1000个/mL的人造血 样。加入20mg经anti-EpCAM修饰过的Si02@Gel微球中,通过细胞混匀仪室温下搅拌30min, 转速设定为lOrpm),通入分选芯片进行纯化后(如实施例5所述,将混合样品通过注射栗注 入进样口①处,流速为70uL/小时;同时将PBS注入入口②处,流速为500uL/小时),在主通道 出口处收集SiOWGel微球,放入0.5mL PBS配制的基质金属蛋白酶溶液(匪P-9,浓度为 100nM)中浸泡30min降解二氧化硅微球表面的明胶,经过PBS多次冲洗离心收集释放下来的 细胞。经统计靶细胞的释放效率为95%左右(图10)。
[0071] 实施例7
[0072]将上述实施例6释放下来的细胞进行传代培养。离心收集后加入lmL细胞培养液放 入24孔板中(孔槽中放置有玻璃基底)孵育111、1(1、2〇1、3(1、7£1观察释放后肿瘤细胞的生长状 〇
[0073]释放后肿瘤细胞活性的测定:将不同培养期的细胞取出利用二乙酸荧光素(FDA) 和碘化丙碇(PI)进行肿瘤细胞的双染色,观测细胞的活性。细胞浸泡在〇.5mL FDA/PI (各 5mg/mL溶解在MS中)的混合溶液中,10min后用pBS洗涤,放在荧光显微镜下观察。其中n)A 经蓝光激发呈绿色荧光,用于鉴定活细胞,绿光激发呈红色荧光,用于鉴定死细胞。细 胞的存活率的统计,是通过在Olympus IX 71显微镜下计数,归一化计算完成。实验数据表 明不同培养时间的细胞活性均在95 %左右(图11),表明细胞捕获释放过程并未对细胞造成 损伤,也未对细胞周期活动产出明显的影响(图12)。
[0074] 实施例8
[0075]将上述实施例6释放下来的细胞分别培养1天、2天后使用三色荧光识别肿瘤细胞 跟白细胞。
[0076]人造血中CTCs的检测:将上述不同孵育时间的肿瘤细胞利用一种三重免疫荧光识 别方法进行鉴别。首先用PBS将上层培养液洗掉;然后加入4 %多聚甲醛(PFA)溶液1 mL对培 养的细胞进行固定,静置10分钟,用f>BS冲洗;接着加入〇. 1 %Triton-X100溶液lmL对细胞进 行穿孔,静置10分钟,用PBS冲洗,再加入3%BSA溶液0.5mL对非特异性位点进行包被,静置 30分钟,用PBS冲洗;加入anti-CD45-FITC和anti-CK-PE荧光染料各0 • lmL对细胞进行免疫 荧光染色,并4°C下静置过夜;最后经DAPI染色后利用多通道荧光检测系统进行CTCs观测和 计数。anti-CD45-FITC在蓝光激发下发绿色荧光用于识别白细胞,anti-CK-PE在绿光激发 下发橙红色荧光用于识别肿瘤细胞,DAPI在紫外光激发下呈蓝色用于染细胞核(图13)。再 结合肿瘤细胞与正常血细胞在尺寸上的差异,因此利用以上四种参量来对CTCs进行鉴别, 原则如下:(l)CTCs(DAPI+/CK+/CD45-,10ym〈直径<30wm) ; (2)白细胞(DAPI+/CK-/CD45+,直 径<16wn) ; (3)红细胞(DAPI-/CK-/⑶45-,直径<7um)。实验结果整理如图14,细胞分选前,力口 入的肿瘤细胞(HCT116)浓度为500/毫升,其中白细胞数量大约为106/毫升;经过Si02@Gel微 球捕获、细胞分选芯片进行分选后,肿瘤细胞比值增长到80%左右;经过培养1天、2天后,白 细胞数量几乎降为零。

Claims (10)

1.一种非诊断和非治疗目的的在微流控芯片中同时利用抗原抗体特异性识别和细胞 尺寸差别分选肿瘤细胞的方法,其特征在于包括如下步骤: (1) 制备可进行尺寸分选的微流控芯片:该芯片主要包含一个宽度为300-SOOwii的主通 道,连接在主通道一侧的3_6条宽度为2〇〇-500ym的宽支路以及另一侧的10-25条宽度为20-30mi的窄支路; (2) 在35-100ym的二氧化桂微球表面包裹一层的明胶,得到具有明胶表面的二氧化桂 微球Si〇2@Gel; ⑶在Si〇2@Gel的明胶表面修饰上具有特异性免疫识别肿瘤细胞功能的抗体,得到抗体 修饰的Si02@Gel; ⑷将含有肿瘤细胞的样品与抗体修饰的Si〇2@Ger混匀孵育得混合样品,再通入微流控 芯片的主通道,同时从宽支路注入PBS,分别在主通道的另一侧及窄支路收集捕获住肿瘤细 胞的微球与未被微球捕获的细胞; 将收集的捕获住肿瘤细胞的微球用明胶酶进行降解释放肿瘤细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于: 步骤⑴中所述的微流控芯片为:高度100M1,主通道宽度550wn,4条宽度为400um的宽 支路,16条宽度为30um的窄支路; 步骤⑵中所述的二氧化硅微球的粒径为50m。
3. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤⑵包括如下步骤: 1) 将二氧化硅微球加入到无水乙醇中,加热升温至50-80°C后滴入3-氨基丙基三乙氧 基硅烷磁力搅拌2-4h,然后经过无水乙醇、去离子水离心洗涤后得到了氨基修饰的二氧化 硅微球NH2-Si〇2; 2) 将NH2-Si02重新分散到去离子水中,加入戊二醛,搅拌5-20h,然后经过去离子水离心 洗涤后得到了醛基修饰的二氧化硅微球CH0-Si02; 3) 将CH0-Si02再次分散到去离子水中,加入明胶,搅拌3-5h后用去离子水离心洗涤得到 表面均匀包裹上一层明胶的二氧化硅微球Si02@Gel。
4. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤⑶中所述的抗体为anti-EpCAM。
5. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤⑶包括如下步骤: 1) 将Si02@Gel浸泡在无水乙醇中进行消毒灭菌,再将Si02@Gel浸入C3-巯基丙基)三甲 氧基硅烷中反应45-120分钟,再用无水乙醇洗涤; 2) 将1)处理的微球浸入到GMBS溶液中反应45-60分钟,分别用无水乙醇、DMSO洗涤; 3) 将2)处理的微球浸入链霉亲和素溶液中,4°C过夜处理,用PBS洗涤; 4) 对3)处理的微球进行anti-EpCAM修饰l-3h,用PBS洗涤得到抗体修饰的SiO#Gel。
6. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)中所述的混匀孵育的条件为通过 细胞混匀仪室温下搅拌3〇min,转速设定为l〇rpm。
7. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)中主通道进样口混合样品的流速 为70uL/h,主通道进样口混合样品与宽支路注入口 PBS的流速比值为1:4-1:10。
8. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(5)中所述的明胶酶为基质金属蛋白 酶9〇
9. 根据权利要求1所述的方法,其特征在于:将所述的二氧化桂微球替换为其他羟基微 球。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法,其特征在于:还包括对收集的肿瘤细胞进行 鉴定的步骤。
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