CN113649096A - 一种外泌体分离微流控芯片及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种外泌体分离微流控芯片及制备方法，包括外泌体微流控芯片，外泌体微流控芯片由盖玻片基地和PDMS芯片键合而成，外泌体微流控芯片内部设有多组分离捕获单元，分离捕获单元由两个左右对称的四分之一圆弧结构组成，分离捕获单元的两个圆弧结构之间的间距小于载有外泌体的微球直径，外泌体微流控芯片高度为30‑50μm；本发明通过分离捕获单元两组四分之一圆环的设置大大缩小了捕获单元的尺寸，同样面积的芯片内部捕获单元增加，提高了通量，增加了捕获率，使用本发明结构简单且分离捕获无需借助外力，仅需通样即可实现分离，操作简单快速且方便，同时本发明芯片正向通液可实现捕获，反向通液可实现释放，双向均可操作。
Description
技术领域
本发明涉及外泌体分离技术领域，尤其涉及一种外泌体分离微流控芯片及制备方法。
背景技术
外泌体是一种尺寸在30-150nm的磷脂双分子层包被的微小囊泡，属于细胞外囊泡的一种，可由各种类型的细胞分泌，外泌体内携带大量来自亲代细胞的生物信息，包括DNA、RNA、蛋白质等，能反应亲代细胞的众多信息，同时，外泌体被分泌后，在循环体液中含量丰富，其在血液中的浓度明显高于循环肿瘤细胞，因此，肿瘤细胞来源的外泌体能反应肿瘤状态，是理想的肿瘤生物标志物；
由于外泌体的尺寸在纳米量级，现有的技术难以将其从复杂的体液环境中高纯度分离出来，目前外泌体的主要分离方法为超速离心法，但其耗时长，仪器价格昂贵，且分离的外泌体容易被其他囊泡和大分子蛋白污染，商用外泌体分离试剂盒主要利用聚合物或者磁珠分离外泌体，但沉淀外泌体的同时也会沉淀杂蛋白，造成结果误导，而传统的微流控芯片多以来芯片内部尺寸形成的侧向流作用力或者蛋白亲和力捕获，侧向流原理分离的容易造成芯片堵塞，蛋白亲和力捕获容易受特异性抗体固定效率影响，且芯片中分离后的外泌体不易观察，因此，本发明提出一种外泌体分离微流控芯片及制备方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提出一种外泌体分离微流控芯片及制备方法，该外泌体分离微流控芯片及制备方法通过分离捕获单元两组四分之一圆环的设置大大缩小了捕获单元的尺寸，同样面积的芯片内部捕获单元增加，提高了通量，增加了捕获率，使用本发明结构简单且分离捕获无需借助外力，仅需通样即可实现分离，操作简单快速且方便。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种外泌体分离微流控芯片及制备方法，包括外泌体微流控芯片，所述外泌体微流控芯片由盖玻片基地和PDMS芯片键合而成，所述外泌体微流控芯片内部设有多组分离捕获单元，所述分离捕获单元由两个左右对称的四分之一圆弧结构组成，所述分离捕获单元的两个圆弧结构之间的间距小于载有外泌体的微球直径，所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm。
进一步改进在于：所述外泌体微流控芯片入口端通过进样管与微量注射器连通，所述微量注射器下方设有进样泵，所述进样泵根据提前设置的参数控制进样，所述外泌体微流控芯片出口端通过出样管连通废液收集器。
进一步改进在于：所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm，所述外泌体微流控芯片入口端设有第一微柱阵列和第二微柱阵列，所述第一微柱阵列和第二微柱阵列为圆柱形微柱。
进一步改进在于：所述第一微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为200μm。
进一步改进在于：所述第二微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为100μm。
一种外泌体分离微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、利用L-edit软件绘制负向版图，制作镉掩膜版，在4寸单抛硅片上通过光刻-刻蚀工艺制备图形，得到负向结构硅模具；
步骤二、将硅模具在通风橱中用氟硅烷原液过夜处理12小时，使硅模具表面钝化便于脱模；
步骤三、用锡箔纸包住模具形成圆柱状，然后将PDMS预聚物和固化剂按10:1称量后充分混合均匀搅拌，并置于真空箱中抽空气泡，将其倒入用锡箔纸包住的模具中再次置于真空箱中抽空气泡，再将其进行固化处理，待PDMS预聚物固化后将PDMS进行脱模得到PDMS芯片板；
步骤四、然后对PDMS芯片板通道进行切割打孔，打孔后将PDMS芯片板和载玻片一起置于氧等离子体机中处理25秒，PDMS图形面朝上，两个处理过的面相对实现键合，组成外泌体微流控芯片；
步骤五、将样本和抗体功能化的微球孵育，形成载有外泌体的微球复合体，并将其通入外泌体微流控芯片，流速根据实验具体情况调整为1μl/min，观察载有外泌体的微球复合体捕获情况。
进一步改进在于：所述步骤三中固化处理时将抽空起泡后的PDMS预聚物和固化剂混合物置于80℃热板上固化处理40分钟。
进一步改进在于：所述步骤五中微球的材料为聚丙乙烯，所述微球表面修饰有CD9、CD81和CD63中的一种或三种抗体蛋白。
本发明的有益效果为：本发明通过分离捕获单元两组四分之一圆环的设置大大缩小了捕获单元的尺寸，同样面积的芯片内部捕获单元增加，提高了通量，增加了捕获率，使用本发明结构简单且分离捕获无需借助外力，仅需通样即可实现分离，操作简单快速且方便，同时本发明芯片正向通液可实现捕获，反向通液可实现释放，双向均可操作。
附图说明
图1为本发明外泌体微流控芯片内部结构图。
图2为本发明外泌体微流控芯片分离捕获单元结构图。
图3为本发明制备流程图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据图1、2、3所示，本实施例提供了一种外泌体分离微流控芯片，包括外泌体微流控芯片，所述外泌体微流控芯片由盖玻片基地和PDMS芯片键合而成，所述外泌体微流控芯片内部设有多组分离捕获单元，所述分离捕获单元由两个左右对称的四分之一圆弧结构组成，所述分离捕获单元的两个圆弧结构之间的间距小于载有外泌体的微球直径，所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm。
所述外泌体微流控芯片入口端通过进样管与微量注射器连通，所述微量注射器下方设有进样泵，所述进样泵根据提前设置的参数控制进样，所述外泌体微流控芯片出口端通过出样管连通废液收集器。
所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm，所述外泌体微流控芯片入口端设有第一微柱阵列和第二微柱阵列，所述第一微柱阵列和第二微柱阵列为圆柱形微柱。
所述第一微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为200μm，可初步过滤样品中的杂质。
所述第二微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为100μm，可使液体分散输入芯片内。
所述第一微柱阵列和第二微柱阵列的微柱横截面尺寸、宽度、高度等，可以根据实际需求改变，从第三排开始的微柱阵列用于捕获载有外泌体的微球复合体，微柱之间的间隙为数微米，大小根据所用微球的大小决定，微柱的间距比所选微球间距小2微米。
一种外泌体分离微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、利用L-edit软件绘制负向版图，制作镉掩膜版，在4寸单抛硅片上通过光刻-刻蚀工艺制备图形，得到负向结构硅模具；
步骤二、将硅模具在通风橱中用氟硅烷原液过夜处理12小时，使硅模具表面钝化便于脱模；
步骤三、用锡箔纸包住模具形成圆柱状，然后将PDMS预聚物和固化剂按10:1称量后充分混合均匀搅拌，并置于真空箱中抽空气泡，将其倒入用锡箔纸包住的模具中再次置于真空箱中抽空气泡，再将其置于80℃热板上固化处理40分钟，待PDMS预聚物固化后将PDMS进行脱模得到PDMS芯片板；
步骤四、然后对PDMS芯片板通道进行切割打孔，打孔后将PDMS芯片板和载玻片一起置于氧等离子体机中处理25秒，PDMS图形面朝上，两个处理过的面相对实现键合，组成外泌体微流控芯片；
步骤五、将样本和抗体功能化的微球孵育，形成载有外泌体的微球复合体，并将其通入外泌体微流控芯片，流速根据实验具体情况调整为1μl/min，观察载有外泌体的微球复合体捕获情况，其中微球的材料为聚丙乙烯，所述微球表面修饰有CD9、CD81和CD63中的一种或三种抗体蛋白。
如果观察外泌体表面蛋白表达，可直接将荧光抗体通入外泌体微流控芯片，对外泌体进行染色，荧光显微镜下成像、观察。
实施例2
根据图1、2、3所示，本实施例提供了一种外泌体分离微流控芯片，包括外泌体微流控芯片，所述外泌体微流控芯片由盖玻片基地和PDMS芯片键合而成，所述外泌体微流控芯片内部设有多组分离捕获单元，所述分离捕获单元由两个左右对称的四分之一圆弧结构组成，所述分离捕获单元的两个圆弧结构之间的间距小于载有外泌体的微球直径，所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm。
所述外泌体微流控芯片入口端通过进样管与微量注射器连通，所述微量注射器下方设有进样泵，所述进样泵根据提前设置的参数控制进样，所述外泌体微流控芯片出口端通过出样管连通废液收集器。
所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm，所述外泌体微流控芯片入口端设有第一微柱阵列和第二微柱阵列，所述第一微柱阵列和第二微柱阵列为圆柱形微柱。
所述第一微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为200μm。
所述第二微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为100μm。
所述第一微柱阵列和第二微柱阵列的微柱横截面尺寸、宽度、高度等，可以根据实际需求改变，从第三排开始的微柱阵列用于捕获载有外泌体的微球复合体，微柱之间的间隙为数微米，大小根据所用微球的大小决定，微柱的间距比所选微球间距小2微米。
一种外泌体分离微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、利用L-edit软件绘制负向版图，制作镉掩膜版，在4寸单抛硅片上通过光刻-刻蚀工艺制备图形，得到负向结构硅模具；
步骤二、将硅模具在通风橱中用氟硅烷原液过夜处理12小时，使硅模具表面钝化便于脱模；
步骤三、用锡箔纸包住模具形成圆柱状，然后将PDMS预聚物和固化剂按10:1称量后充分混合均匀搅拌，并置于真空箱中抽空气泡，将其倒入用锡箔纸包住的模具中再次置于真空箱中抽空气泡，再将其置于80℃热板上固化处理40分钟，待PDMS预聚物固化后将PDMS进行脱模得到PDMS芯片板；
步骤四、然后对PDMS芯片板通道进行切割打孔，打孔后将PDMS芯片板和载玻片一起置于氧等离子体机中处理25秒，PDMS图形面朝上，两个处理过的面相对实现键合，组成外泌体微流控芯片；
步骤五、将样本和抗体功能化的微球孵育，形成载有外泌体的微球复合体，并将其通入外泌体微流控芯片，流速根据实验具体情况调整为1μl/min，观察载有外泌体的微球复合体捕获情况，其中微球的材料为聚丙乙烯，所述微球表面修饰有CD9、CD81和CD63中的一种或三种抗体蛋白。
如果检测外泌体内蛋白及核酸分析，可从外泌体微流控芯片出口向入口方向通液，释放载有外泌体的微球复合体，进行后续实验分析。
该外泌体分离微流控芯片及制备方法原理是外泌体被微球表面特异性抗体识别后，富集在微球表面，通过间隙比微球小的两个微柱来捕获微球，从而捕获外泌体，其好处有：1、外泌体在微球表面富集，免疫荧光染色荧光强度增大，信号放大，显微镜可观察；2、将原本纳米尺度的外泌体间接放大到微米尺度，在微流控芯片实现捕获。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种外泌体分离微流控芯片，其特征在于：包括外泌体微流控芯片，所述外泌体微流控芯片由盖玻片基地和PDMS芯片键合而成，所述外泌体微流控芯片内部设有多组分离捕获单元，所述分离捕获单元由两个左右对称的四分之一圆弧结构组成，所述分离捕获单元的两个圆弧结构之间的间距小于载有外泌体的微球直径，所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体分离微流控芯片，其特征在于：所述外泌体微流控芯片入口端通过进样管与微量注射器连通，所述微量注射器下方设有进样泵，所述进样泵根据提前设置的参数控制进样，所述外泌体微流控芯片出口端通过出样管连通废液收集器。
3.根据权利要求1所述的一种外泌体分离微流控芯片，其特征在于：所述外泌体微流控芯片高度为30-50μm，所述外泌体微流控芯片入口端设有第一微柱阵列和第二微柱阵列，所述第一微柱阵列和第二微柱阵列为圆柱形微柱。
4.根据权利要求3所述的一种外泌体分离微流控芯片，其特征在于：所述第一微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为200μm。
5.根据权利要求3所述的一种外泌体分离微流控芯片，其特征在于：所述第二微柱阵列横截面长度为100μm，宽度为40μm，半径为20μm，每两个圆柱形微柱之间间距为100μm。
6.一种外泌体分离微流控芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、利用L-edit软件绘制负向版图，制作镉掩膜版，在4寸单抛硅片上通过光刻-刻蚀工艺制备图形，得到负向结构硅模具；
步骤二、将硅模具在通风橱中用氟硅烷原液过夜处理12小时，使硅模具表面钝化便于脱模；
步骤三、用锡箔纸包住模具形成圆柱状，然后将PDMS预聚物和固化剂按10:1称量后充分混合均匀搅拌，并置于真空箱中抽空气泡，将其倒入用锡箔纸包住的模具中再次置于真空箱中抽空气泡，再将其进行固化处理，待PDMS预聚物固化后将PDMS进行脱模得到PDMS芯片板；
步骤四、然后对PDMS芯片板通道进行切割打孔，打孔后将PDMS芯片板和载玻片一起置于氧等离子体机中处理25秒，PDMS图形面朝上，两个处理过的面相对实现键合，组成外泌体微流控芯片；
步骤五、将样本和抗体功能化的微球孵育，形成载有外泌体的微球复合体，并将其通入外泌体微流控芯片，流速根据实验具体情况调整为1μl/min，观察载有外泌体的微球复合体捕获情况。
7.根据权利要求6所述的一种外泌体分离微流控芯片及制备方法，其特征在于：所述步骤三中固化处理时将抽空起泡后的PDMS预聚物和固化剂混合物置于80℃热板上固化处理40分钟。
8.根据权利要求6所述的一种外泌体分离微流控芯片及制备方法，其特征在于：所述步骤五中微球的材料为聚丙乙烯，所述微球表面修饰有CD9、CD81和CD63中的一种或三种抗体蛋白。
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2021
- 2021-09-16 CN CN202111084536.2A patent/CN113649096A/zh active Pending
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