CN112973813B - 一种用于分离富集外泌体的微流控芯片及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于分离富集外泌体的微流控芯片及其制作方法，将可溶性材料研磨至微米级，以此作为制孔剂添加到可塑性材料中，然后涂抹于微通道上的宽通道处，再通过洗去制孔剂来获得三维多孔区。该三维多孔区具有独特的三维多孔结构，提高了分离富集外泌体的捕获效率，所需外泌体捕获时间短，样品试剂消耗量小，制作成本低。可以从血清、细胞上清液中快速分离出高质量的外泌体，并且极大减少了制作成本和制作时间并且可批量制备、更加小型化、适用于临床大规模分离富集外泌体。

Description

一种用于分离富集外泌体的微流控芯片及其制作方法
发明领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于分离富集外泌体的微流控芯片及其制作方法。
背景技术
外泌体(Exosomes)是一种脂质膜包裹的纳米颗粒(30-150nm)，来源于胞吞作用，是一类细胞在静息或应急状态下所主动分泌的纳米级囊泡，属于细胞外囊泡的一种。外泌体携带和传递着重要的生物信号，与细胞通讯、免疫反应调节、肿瘤发生与转移等生物过程息息相关，影响着机体的生理和病理状态。目前，外泌体在液体活检领域引起了广大科研人员的关注，它已经被认为是肿瘤早期诊断和预测肿瘤预后的理想生物标志物。
但是，由于外泌体尺寸较小(30-150nm)，通常与体液混合在一起，极大地增加了外泌体的分离难度。目前，最常用的、也是外泌体分离“金标准”的超速离心法，耗时长(＞10h)，分离效率低(＜15％)，需要专门的超速离心机，样品消耗量大，使其难以应用于临床。
市面上常见的外泌体试剂盒虽然操作简单且不需特殊设备，但试剂盒之间差异大，每种方法都不能有效分离到高纯度的外泌体，不同方法获得的外泌体中存在白蛋白、高密度脂蛋白和RNA结合蛋白聚合体等污染，限制了其在临床上的应用。基于分子尺寸的外泌体分离，比如超滤技术、尺寸排阻色谱、压滤技术，是基于外泌体与其他物体分子尺寸的差异，通过不同的过滤系统去除杂质保留外泌体以达到分离效果，但这一类技术均面临过滤堵塞这一弊端，造成外泌体损失，并且样品需要经过充分的预处理才能保证分离效果最大化。免疫亲和法特异性高、不影响外泌体形态的完整性，得到的外泌体可直接用于分析；但传统的免疫亲和法，例如磁珠法，效率低，样品、试剂消耗量大，提取过程中需要多次洗涤，易造成外泌体的流失，不适合从临床大量样品中分离外泌体。
虽然目前已有不少研究人员同样将微流控技术与免疫亲和法相结合，开发了多种类型的微流控芯片。但这些微流控芯片制作耗时长，制作一片芯片往往需要耗费数天的时间；并且需要多种化学物质进行材料的表面改性以固定抗体，这不但会增加芯片成本而且耗时耗力；有些芯片还需要纳米二氧化硅球或泡沫镍等物质来作为制孔剂或将其直接作为多孔结构，但这些材料自己制备较困难，购买价格又较为昂贵。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于分离富集外泌体的微流控芯片及其制作方法，克服了传统免疫亲和法效率低、样品试剂消耗量大、制作时间长、成本高等缺点。
本发明具体的技术方案是这样实现的：
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的基片，所述基片上设置有微通道，所述微通道上设置有三维多孔区。将三维多孔区的材料填充入微通道中，构建出新型三维多孔微流控芯片，可高效从细胞培养液、血清等样品中捕获外泌体。
所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有三维多孔区；所述三维多孔区是将制孔剂和可塑性材料先混合再固化，最后清洗掉制孔剂后得到的三维多孔结构。该三维多孔结构，有混流作用、较大比表面积、类排阻效应的特点，将其填充入微通道中，构建出新型三维多孔微流控芯片，可高效从细胞培养液、血清等样品中捕获外泌体。
所述制孔剂为可溶性材料；优选地，所述制孔剂为氯化钠、白砂糖、冰、氯化钾中的一种或几种；优选地，所述制孔剂为平均直径为2-6微米的氯化钠颗粒，最优选平均直径为4微米的氯化钠颗粒，氯化钠价格低廉，容易获取，制作简单，成本低。
所述基片与三维多孔区的材质均为可塑性材料，优选为高分子聚合物，其中基片的材质进一步优选为聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯或环烯烃类共聚物中的一种或几种，最优选为聚二甲基硅氧烷；三维多孔区的材质进一步优选为聚二甲基硅氧烷、丙烯酰胺、海藻酸钠中的一种或几种；这是因为上述材质具有混流作用、较大比表面积、类排阻效应的特点，将其填充入微通道中，构建出新型三维多孔结构的微流控芯片，可高效从细胞培养液、血清等样品中捕获外泌体，最优选为聚二甲基硅氧烷。
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的10％-50％，所述三维多孔区表面的孔径为1-16μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的20-50％，所述三维多孔区横截面的孔径为1-17μm；优选地，所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的21.6％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.94μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的31.9％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为2.86μm。之所以选择这样的三维多孔区，是因为具有独特的三维多孔结构，进一步说，具有特定的表面和横截面、较好的孔数量与孔面积，且各个孔洞之间具有极好的互联性，能够提高分离富集外泌体的捕获效率。
所述微通道长2-6cm，高40-50μm，其中窄通道一和窄通道二长3-8mm，宽0.2-0.6mm；宽通道长10-30mm，最宽处为2-6mm，最窄处为0.2-0.6mm；窄通道与宽通道的夹角为120-160°；优选地，所述微通道为对称型微通道，即所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。采用上述对称型微通道进行分离富集外泌体时，捕获效率最高。
所述宽通道内设置有至少两个三维多孔区，所述宽通道内设置有间隔相同或不同的至少两个三维多孔区，优选地，当所述宽通道内设置有间隔相同的四个三维多孔区时，分离富集外泌体的捕获效率最高。
所述微通道表面和三维多孔区覆盖有抗体，优选为CD9抗体、CD63抗体、CD81抗体或EpCAM抗体。由于三维多孔结构具有极好的蛋白吸附能力，不需要多种复杂的化学试剂来进行表面改性，只需要将抗体通入芯片后再放入37℃烘箱孵育2h，抗体就可以固定在微通道表面及三维多孔区，然后就可以进行外泌体捕获，进一步降低了制作成本、减少操作步骤、无需多种复杂的化学试剂、便于大规模制备，所述抗体优选为CD9抗体。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
(1)基片的制作；
(2)载玻片基板与基片的键合；
(3)抗体修饰；
还包括所述微通道上设置的三维多孔区的制作。
所述三维多孔区制作方法是将制孔剂和可塑性材料先混合再固化，最后清洗掉制孔剂后得到的三维多孔结构。
所述基片与三维多孔区的材质均为可塑性材料，优选为高分子聚合物，所述基片的材质进一步优选为聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯或环烯烃类共聚物中的一种或几种，最优选为聚二甲基硅氧烷；三维多孔区的材质进一步优选为聚二甲基硅氧烷、丙烯酰胺、海藻酸钠的一种或几种；最优选为聚二甲基硅氧烷。所述基片上设置的三维多孔区的制作中采用的制孔剂为可溶性材料；优选地，所述制孔剂为氯化钠、白砂糖、冰、氯化钾的一种或几种；优选地，所述制孔剂为平均直径为2-6微米的氯化钠颗粒，最优选平均直径为4微米的氯化钠颗粒。
所述微通道上设置的三维多孔区的制作的具体步骤如下：
(a)填充制孔剂：将制孔剂和可塑性材料按照比例配制，得到制孔剂-可塑性材料的混合物，将该混合物涂抹至所述基片上进行固化；
(b)清洗制孔剂：将步骤(a)固化完成后的基片放入酒精溶液中，置于磁力搅拌器上加热搅拌，除去制孔剂得到具有三维多孔结构的基片。
优选地，所述微通道上设置的三维多孔区的制作方法，具体步骤如下：
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入氯化钠颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到氯化钠-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片。
所述微通道上设置的三维多孔区的制作方法，将平均颗粒直径为2-6微米的可溶性微米级颗粒作为制孔剂，然后再快速洗去制孔剂的方法，可以短时间快速制备大量具备三维多孔结构的微流控芯片。与其他同样采用微流控技术、免疫亲和法相结合的方法相比，整个制作过程耗时短，只需16h，其中14h为无需人为操作的清洗和抗体孵育过程；成本低，芯片制作成本约为1.5元/片。
本发明所述制作的微流控芯片的微通道上具有三维多孔区，将可溶性材料研磨至微米级，以此作为制孔剂添加到可塑性材料中，然后涂抹于微通道上的宽通道处，再通过洗去制孔剂来获得三维多孔区。该三维多孔区具有独特的三维多孔结构，提高了分离富集外泌体的捕获效率，所需外泌体捕获时间短，样品试剂消耗量小，制作成本低。本发明所制作的微流控芯片可以从血清、细胞上清液中快速分离出高质量的外泌体，并且极大减少了制作成本和制作时间并且可批量制备、更加小型化、适用于临床大规模分离富集外泌体。
附图说明
图1是本发明所述微流控芯片的立体结构示意图；
图2是图1的主视图；
图3是图1的俯视图；
图4是图1的左视图；
图5是图1的仰视图；
图6是设置有三维多孔区的微通道的结构示意图；
图7是三维多孔区表面结构图；
图8是三维多孔区横切面结构图。
图中1是载玻片基板，2是基片，3是微通道，4是加样孔，5是窄通道一，6是宽通道，7是窄通道二，8是出样孔，9是三维多孔区。
具体实施方式
本发明所述材料和设备除特别说明外，均为市售产品。
实施例1
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的21.6％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.94μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的31.9％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为2.86μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
(1)基片的制作
用AutoCAD绘制微通道的图案，使用该CAD图绘制光刻掩膜；在洁净的硅片上旋涂SU-8光刻胶后，置于烘片机上95℃30min固化SU-8光刻胶；将掩膜覆盖于SU-8胶层上，使用光刻机进行曝光，最后进行显影，得到SU-8硅模板；将质量比10：1的PDMS预聚物和PDMS固化剂(型号：RTV615，来源：Momentive Performance Materials，Waterford，NY，US)倒入容器中，使用搅拌器搅拌5min后，倒入上述制备好的SU-8硅模板上，在真空釜中抽真空15分钟以去除气泡；将去除气泡后的培养皿放入80℃烘箱中烘烤30min；固化后将其从硅板上揭下，使用切割器按照设计切割，从而得到带有微通道的基片。
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入氯化钠颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到氯化钠-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片。
(3)载玻片基板与基片的键合
采用直径1.2mm打孔器在步骤(2)得到的基片的特定位置打孔，分别为加样孔和出样孔；将载玻片基板与基片使用无水乙醇和超纯水进行清洗干净后，将基片和载玻片基板都放入等离子机中进行等离子处理15秒，再快速将载玻片基板与基片对准紧密贴合，放入80℃的烘箱中，加压键合半小时，使得载玻片基板与基片成功键合。
(4)抗体修饰
从加样孔注入10μl，浓度为50μg/ml CD9抗体，在加样孔和出样孔插上外径1.6mm，内径1.2mm的PE管道，放入装有蒸馏水的烧杯中，烧杯中可放入物体垫高，使蒸馏水接触不到芯片。使用封口膜封闭烧杯口，放入37℃的烘箱中孵育2h，最终得到抗体固定好的微流控芯片。
所述PDMS预聚物与PDMS固化剂，型号：RTV615，来源：Momentive PerformanceMaterials，Waterford，NY，US。
实施例2
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的21.6％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.94μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的31.9％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为2.86μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
(1)基片的制作
用AutoCAD绘制微通道的图案，使用该CAD图再通过激光雕刻切割机来绘制流道图案；使用2mm厚的PMMA材料制备微流控芯片，使用CO2激光雕刻切割机(HTC-0906-W80 CO2激光雕刻机)在2mm PMMA聚合物上加工出CAD设计好的微通道来作为基片；激光雕刻机设置的参数为：激光器功率80W。
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入氯化钠颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到氯化钠-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片。
(3)载玻片基板与基片的键合
采用直径1.2mm打孔器在步骤(2)得到具有三维多孔结构的基片的特定位置打孔，分别为加样孔和出样孔；载玻片基板与步骤(2)得到具有三维多孔结构基片的键合方法采用热压键合技术，将热压键合机上下基板调至90℃，压力恒定在1.2-1.4MPa之间；将载玻片基板与基片对准放入热压键合机后，在机器中恒温恒压保持10min，再在保压的状态下将芯片冷却至50℃以下，使得载玻片基板与基片成功键合。
(4)抗体修饰
从加样孔注入10μl，浓度为50μg/ml CD9抗体，在加样孔和出样孔插上外径1.6mm，内径1.2mm的PE管道，放入装有蒸馏水的烧杯中，烧杯中可放入物体垫高，使蒸馏水接触不到芯片。使用封口膜封闭烧杯口，放入37℃的烘箱中孵育2h，最终得到抗体固定好的微流控芯片。
实施例3
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的21.6％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.94μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的31.9％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为2.86μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
(1)基片的制作
用AutoCAD绘制微通道的图案，使用该CAD图并采用阴性打印的方法打印胶片；将覆铜板裁成2.5×8.0cm的长方形，蒸馏水洗净后烘干，在暗室中用吹风机加热覆铜板，趁热将干膜贴于表面；以上述打印的胶片作为光掩膜，在紫外光下曝光3min；将覆铜板放入显影液中显影6min，蒸馏水冲洗并晾干；取一块2mm厚的干净环烯烃类共聚物COC片放在覆铜板上，放入烘箱140℃压制20min通道即可成型。
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入氯化钠颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到氯化钠-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片；
(3)载玻片基板与基片的键合
采用直径1.2mm打孔器在步骤(2)得到的基片的特定位置打孔，分别为加样孔和出样孔；载玻片基板与步骤(2)得到的具有三维多孔结构的基片的键合方法采用热压键合技术，将热压键合机上下基板调至121℃，将载玻片基板与具有三维多孔结构的基片对准放入热压键合机后，在机器中恒温恒压保持10min，再将芯片冷却至50℃以下，使得载玻片基板与基片成功键合。
(4)抗体修饰
从加样孔注入10μl，浓度为50μg/ml CD9抗体，在加样孔和出样孔插上外径1.6mm，内径1.2mm的PE管道，放入装有蒸馏水的烧杯中，烧杯中可放入物体垫高，使蒸馏水接触不到芯片。使用封口膜封闭烧杯口，放入37℃的烘箱中孵育2h，最终得到抗体固定好的微流控芯片。
实施例4
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的15％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.1μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的21％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为1.2μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
步骤(1)(3)(4)与最优选实验例1相同，但三维多孔区材质改为丙烯酰胺；
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；使用电子天平称取0.8g丙烯酰胺放入烧杯，加入5ml去离子水溶解；完全溶解后再加入6ml的2N-亚甲基双丙烯酰胺溶液、2ml的过硫酸铵溶液、4μl的四甲基乙二胺，搅拌混合均匀；按质量比3：1将上述研磨好的氯化钠颗粒及上述丙烯酰胺混合物充分混合后，将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状，再放在紫外灯下照射1h，之后将其置于室温下24h固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上室温搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片。
实施例5
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的40％，所述三维多孔区表面的平均孔径为15.7μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的43％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为15.5μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
步骤(1)(3)(4)与最优选实验例1相同，但三维多孔区材质改为丙烯酰胺；
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；使用电子天平称取0.2g海藻酸钠放入烧杯，加入11ml去离子水充分搅拌；完全溶解后放入真空泵真空脱气20min；再加入乙二胺四乙酸二钠钙0.059g、葡萄糖酸内酯0.0651g，继续搅拌3-5min；按质量比3：1将上述研磨好的氯化钠颗粒及上述海藻酸钠混合物充分混合后，将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状，将其置于室温下24h固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上室温搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片。
实施例6
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的20.7％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.83μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的30.1％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为2.74μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
步骤(1)(3)(4)与最优选实验例1相同，但制孔剂改为白砂糖、氯化钾；
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钾或白砂糖颗粒，使用球磨机对氯化钾或白砂糖颗粒进行研磨，得到氯化钾或白砂糖颗粒；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入研磨好的氯化钾颗粒或白砂糖颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到氯化钾或白砂糖-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钾或白砂糖粉末得到具有三维多孔结构的基片。
实施例7
一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的具有三维多孔结构的基片，所述具有三维多孔结构的基片包括基底上设置的微通道，所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有四个间隔相同的三维多孔区；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的20％，所述三维多孔区表面的平均孔径为3.45μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的28％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为4.2μm；
所述微通道长3.43cm，高45μm，其中窄通道一和窄通道二长6.0mm，宽0.4mm；宽通道长20.0mm，最宽处为4.4mm，最窄处为0.4mm；窄通道与宽通道的夹角为158°。
所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的制作方法，其步骤包括：
步骤(1)(3)(4)与最优选实验例1相同，但制孔剂改为冰；
(2)三维多孔区的制作
(a)填充制孔剂：取超纯水100ml，放入冰盒中，再将冰盒放入-20℃冰箱过夜；取少量冰块于石英研磨钵中，充分研磨5-10min；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入研磨好的冰颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到冰颗粒-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；以上步骤均需要在-4℃下进行；将该混合物使用涂抹板涂抹至步骤(1)得到的基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
(b)清洗制孔剂：步骤(a)固化完成后，将基片放入体积分数40％的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌1-2小时，完全除去混合物中的冰颗粒得到具有三维多孔结构的基片。
对照例
相比实施例1所制作的微流控芯片中未设置三维多孔结构。
(1)基片的制作
用AutoCAD绘制微通道的图案，使用该CAD图绘制光刻掩膜；在洁净的硅片上旋涂SU-8光刻胶后，置于烘片机上95℃30min固化SU-8光刻胶；将掩膜覆盖于SU-8胶层上，使用光刻机进行曝光，最后进行显影，得到SU-8硅模板；将质量比10：1的PDMS预聚物和PDMS固化剂(型号：RTV615，来源：Momentive Performance Materials，Waterford，NY，US)倒入容器中，使用搅拌器搅拌5min后，倒入上述制备好的SU-8硅模板上，在真空釜中抽真空15分钟以去除气泡；将去除气泡后的培养皿放入80℃烘箱中烘烤30min；固化后将其从硅板上揭下，使用切割器按照设计切割，从而得到带有微通道的基片。
(2)载玻片基板与基片的键合
采用直径1.2mm打孔器在步骤(2)得到的基片的特定位置打孔，分别为加样孔和出样孔；将载玻片基板与基片使用无水乙醇和超纯水进行清洗干净后，将基片和载玻片基板都放入等离子机中进行等离子处理15秒，再快速将载玻片基板与基片对准紧密贴合，放入80℃的烘箱中，加压键合半小时，使得载玻片基板与基片成功键合。
(3)抗体修饰
从加样孔注入10μl，浓度为50μg/ml CD9抗体，在加样孔和出样孔插上外径1.6mm，内径1.2mm的PE管道，放入装有蒸馏水的烧杯中，烧杯中可放入物体垫高，使蒸馏水接触不到芯片。使用封口膜封闭烧杯口，放入37℃的烘箱中孵育2h，最终得到抗体固定好的微流控芯片。
试验例
将实施例1-7步骤(2)制备的具有三维多孔结构的基片使用扫描电子显微镜(SEM，型号：FEI QUANTA)对三维多孔结构进行表征：将具有三维多孔结构的基片放入烘箱80℃干燥2小时后，使用切割刀将三维多孔区切割成2mm×2mm的小块，再放入喷金机中涂上金薄膜上机检测。
其中筛选出最优实施例1所制备的微流控芯片中三维多孔区表面结构图见图7；三维多孔区横切面结构图见图8。对图7和图8使用Imagepro Plus 6.0进行分析，结果如下：所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的21.6％，所述三维多孔区表面的平均孔径为2.94μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的31.9％，所述三维多孔区横截面的平均孔径为2.86μm。数据显示：所述三维多孔区的结构具有较好的孔数量与孔面积。
采用本发明实施例1-7所制作的微流控芯片，用来分离富集细胞上清液的外泌体，具体步骤如下：
(1)外泌体的分离及荧光染色：取30ml结肠癌细胞培养上清液，4℃、2000×g、30min离心；小心的将上清转移到干净的超速离心管中；再4℃、12000×g、45min离心后，取上清液用0.22μm滤膜过滤到一个干净的超速离心管中；再4℃、110000g、进行超速离心70min，倒掉上清液，用100ul 1×PBS重悬沉淀转移至1.5mlEP管中；得到100μl外泌体溶液，-80℃下可保存一年。使用PKH67染色试剂盒(Sigma-Aldrich)按照说明书进行染色，加入染料染色2min后，再加入同体积的1％BSA溶液终止染色并孵育1分钟以使多余的染料结合。再次用超速离心法收集染色后的外泌体，并用1×PBS缓冲液重悬至终体积为1ml；
(2)定量外泌体初始荧光强度及初始浓度：取上述染色后的外泌体溶液100μl，加入1×PBS缓冲液900μl至终体积为1ml，使用纳米颗粒跟踪分析仪(ZetaView ParticleMetri，德国PMX公司)测量外泌体浓度C初(初始外泌体浓度)，重复测试两次；另取10μl上述染色后的外泌体溶液加入至黑色96孔板酶标板中，再加入1×PBS缓冲液90μl补足至终体积为100μl，置于酶标仪中测量外泌体荧光强度F初(初始外泌体荧光强度)，捕获效率＝(初始外泌体荧光强度F初-流出液的荧光强度)÷初始外泌体荧光强度F初。
(3)外泌体捕获实验过程：取本发明所述微流控芯片，先以1μl/min的速度通入20μl 1×PBS缓冲液，冲洗掉未能成功结合的抗体。取步骤(1)中染色并测过初始荧光强度与初始浓度后的外泌体105μl以1μl/min的流速注入芯片，每隔15min在出口处收集10μl流出液，加入1×PBS稀释液90ul至终体积100μl后，放入黑色96孔酶标板中使用酶标仪测定各次荧光强度。收集酶标仪检测完的黑色96孔酶标板中第二次至第六次的流出液，共约500μl，加入1×PBS缓冲液500μl补足至终体积1ml，使用纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体浓度C，捕获效率＝(C初-C×2)÷C初。
实施例1-7和对照例(实施例1所述微流控芯片中未设置三维多孔结构)进行分离富集外泌体实验结果对比如下：
Figure BDA0002942782830000161
Figure BDA0002942782830000171

Claims (3)

1.一种用于分离富集外泌体的微流控芯片，包括载玻片基板上键合的基片，所述基片上设置有微通道，其特征在于：所述微通道上设置有三维多孔区；
所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有三维多孔区；
所述微通道长2-6cm，高40-50μm，其中窄通道一和窄通道二长3-8mm，宽0.2-0.6mm；宽通道长10-30mm，最宽处为2-6mm，最窄处为0.2-0.6mm；窄通道与宽通道的夹角为120-160°；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的10%-50%，所述三维多孔区表面的孔径为1-16μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的20-50%，所述三维多孔区横截面的孔径为1-17μm；
所述三维多孔区是将制孔剂和可塑性材料先混合再固化，最后清洗掉制孔剂后得到的三维多孔结构；
所述制孔剂为平均直径为2-6微米的氯化钠颗粒，所述基片与三维多孔区的材质均为聚二甲基硅氧烷；
所述微通道上设置的三维多孔区的制作方法，具体步骤如下：
（a）填充制孔剂：向球磨罐中按质量比5比1的比例加入直径3mm的氧化锆研磨珠与分析纯氯化钠颗粒，使用球磨机对氯化钠颗粒进行研磨，得到氯化钠颗粒；PDMS预聚物和PDMS固化剂事先按质量比10：1配制好，再按照质量比3：1加入氯化钠颗粒与配制好的PDMS预聚物、PDMS固化剂于培养皿中，充分搅拌，得到氯化钠-PDMS预聚物-PDMS固化剂的混合物；将该混合物使用涂抹板涂抹至上述基片上的宽通道处，分隔成不同的形状后，放入80℃烘箱30min固化；
（b）清洗制孔剂：步骤（a）固化完成后，将基片放入体积分数40%的酒精溶液中，置于磁力搅拌器上70℃加热搅拌12-14小时，完全除去混合物中的氯化钠粉末得到具有三维多孔结构的基片。
2.根据权利要求1所述微流控芯片，其特征在于：所述微通道表面及三维多孔区覆盖有抗体。
3.制作如权利要求1-2任一所述用于分离富集外泌体的微流控芯片的方法，其步骤包括：
基片的制作；
载玻片基板与基片的键合；
抗体修饰；
其特征在于：还包括所述微通道上设置的三维多孔区的制作；
所述微通道依次由加样孔、窄通道一、宽通道、窄通道二、出样孔组成，所述宽通道内设置有三维多孔区；
所述微通道长2-6cm，高40-50μm，其中窄通道一和窄通道二长3-8mm，宽0.2-0.6mm；宽通道长10-30mm，最宽处为2-6mm，最窄处为0.2-0.6mm；窄通道与宽通道的夹角为120-160°；
所述三维多孔区是将制孔剂和可塑性材料先混合再固化，最后清洗掉制孔剂后得到的三维多孔结构；
所述三维多孔区表面的孔面积占三维多孔区总面积的10%-50%，所述三维多孔区表面的孔径为1-16μm；所述三维多孔区横截面的孔面积占三维多孔区总面积的20-50%，所述三维多孔区横截面的孔径为1-17μm。
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