CN113776919B - 一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离装置 - Google Patents

一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离装置 Download PDF

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Abstract

一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置，其构成如下：外部为带有通道的反应池，内部为用于吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料；具体设置有下述结构：反应池底部平板、反应池上层板样品分离通道、反应池上层板样品出入口以及内部的壳聚糖多孔吸附材料。所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法为：加工得到所需反应池；冻干法得到壳聚糖多孔吸附材料置入反应池通道中。本发明结构简单，制备操作方便，效率高，成本低，应用范围广泛。

Description

一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离装置
技术领域
本发明涉及高分子材料的设计、加工、制作和应用技术领域，特别提供了一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置及其制备方法。
背景技术
外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调整过程而形成的细胞外纳米级囊泡。其在人体内分布广泛，人体的尿液、汗液、血液、乳汁等均含有外泌体。近年来的研究表明，外泌体会作为细胞之间物质代谢和信号传递的途径，且既参与疾病的发生，又参与免疫调节。外泌体生成机制表明，通过分析外泌体的组分，可以帮助识别其来源的细胞类型。于是外泌体可作为液体活检的重要生物标志物，用于癌症早期临床诊断；也可作为一些疾病的预后标志物，用来评估药物疗效或监控病情进展。此外，一些研究表明，小鼠体内外泌体的免疫原性比脂质体低，稳定性高，因此可通过修饰处理作为潜在的药物载体；也有研究表明，干细胞外泌体本身就具有促进再生、抑制凋亡、调节免疫等疗效，因此外泌体在一些神经退行性疾病中也有着广泛的应用前景。
然而，由于外泌体的尺寸小且与血液中的其他复杂物质特征相近，高效分离外泌体极具挑战性。目前，基于密度分离的超速离心法是最常用的外泌体分离方法，被誉为分离外泌体的“金标准”。但超速离心法分离外泌体耗时长，需要大型仪器成本高，回收率与分离纯度也比较低。现已有许多基于不同原理的其它被报道过的外泌体分离方法，如基于抗原抗体反应的免疫分离、基于尺寸的超滤分离与尺寸排阻层析、基于亲疏水性质的聚合物沉淀分离以及各种新型的依靠流体力学的微流控方法等，各有各的优势与不足。
由于外泌体膜带有负电荷，基于电荷的方法近年来逐渐被重视。已有使用电泳等方法使外泌体在电场中分离的报道，也有修饰聚赖氨酸到磁珠上同样利用正负电荷相互作用分离外泌体的研究。然而，加电场的方法操作繁琐，使用聚赖氨酸吸附的方法价格较为昂贵且不适合处理部分生物样本，因此研究基于电荷的外泌体分离方法依然很有前景。壳聚糖是一种带有氨基的天然生物活性化合物，在酸性条件下氨基与氢离子结合使壳聚糖带正电。由于壳聚糖具有免疫增强、抗菌、抗氧化和伤口愈合等多种生物活性，且它无毒、可生物降解、生物相容性高、成本低廉，导致了其广泛的生物医学应用。利用壳聚糖与外泌体的正负电荷相互作用达到外泌体的分离与富集，有望为我们在外泌体研究发展及疾病检测等方面提供一个新思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置，以解决以往外泌体分离与检测过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂、成本高昂等局限。
本发明提供了一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置，该装置由内外两部分组成，其中：外部为带有通道的反应池，内部为吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料；
所述带有通道的反应池设置有下述结构：
——反应池底部平板：位于整个反应池的底部；
——反应池上层板：位于反应池底部平板之上；
所述反应池上层板设置有下述结构：
——反应池上层板样品分离通道：位于反应池上层板上；
——反应池上层板样品出入口：位于反应池上层板样品分离通道两端；
所述吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料位于反应池上层板样品分离通道内部，由反应池上层板样品出入口置入，位于反应池底部平板上方。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置还满足下述要求之一或其组合：
其一，所述带有通道的反应池的材料为聚甲基丙烯酸甲酯，反应池底部平板高度为0.1-5cm，反应池上层板高度为0.1-5cm；反应池底部平板和反应池上层板长度相同，均为5-20cm，宽度相同，均为2-15cm；
其二，所述反应池上层板样品分离通道高度为0.1-3cm，长度为2-10cm，宽度为0.5-2cm；通道个数为1-20个；
其三，所述吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料是长方体结构，材料边长为0.1-1cm。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备还满足下述步骤：
(1)所述反应池底部平板与反应池上层板是采用聚甲基丙烯酸甲酯加工得到的；
(2)所述反应池底部平板与反应池上层板通过粘接剂粘连到一起，或打孔后用螺丝固定得到带有通道的反应池。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法还满足下述步骤：
(1)在壳聚糖溶液中加入致孔剂与交联剂得到壳聚糖凝胶，冻干壳聚糖凝胶得到壳聚糖多孔吸附材料；
(2)将壳聚糖多孔吸附材料切割后放入带有通道的反应池中得到基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置；
所述的致孔剂为二甲基亚砜，所述的交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平中的一种。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的壳聚糖多孔吸附材料制备方法还满足下述步骤：
(1)配置质量分数为1％-10％的壳聚糖水溶液，在壳聚糖水溶液中加入1％的冰乙酸和1％-10％的二甲基亚砜，制备得到壳聚糖溶液；
(2)将得到的壳聚糖溶液置于4℃环境下3-12h；
(3)配置等体积的0.1％-0.5％的戊二醛溶液，与壳聚糖溶液搅拌混合，抽真空10-60min至无气泡，置于-30℃冰冻3-12h；
(4)将冰冻后的材料用0.5％-2％的硼氢化钠溶液清洗至变白色，再用水清洗至无气泡产生；
(5)将得到的壳聚糖材料置于-30℃环境下2-12h，再转移到-80℃环境下2-12h使其彻底冰冻，然后用冷冻干燥机冻干1-3天。取出后切割成所需尺寸，得到基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的壳聚糖多孔吸附材料。
本发明所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的用途说明：该装置可应用于不同样本(培养基、血液、尿液、唾液等)中外泌体的分离与富集。
本发明的优点：
1、本发明选用壳聚糖对外泌体进行捕获富集，是一种无标记的外泌体富集方式，可以实现对样本中所有外泌体的富集，分离效率高。
2、本发明使用价格低廉的生物材料壳聚糖作为吸附材料，大大降低了外泌体的分离成本。
3、本发明通过向通道中直接加样，将装置放置在摇床上摇摆一定时间即可分离外泌体，操作简单，耗时短。
4、本发明在装置的通道中实现外泌体的分离，通过减小通道尺寸减小反应体积，可以实现珍稀样本中外泌体的富集。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的俯视图简图；
图2为基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的侧视图简图；
图3为壳聚糖多孔吸附材料的实物图；
图4为壳聚糖多孔吸附材料的电镜表征图；
其中：1为反应池上层板样品出入口；2为壳聚糖多孔吸附材料；3为反应池上层板样品分离通道；4为反应池上层板；5为反应池底部平板。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置进行具体的说明。
如未特殊说明，本发明中所述的百分数均指质量百分数。
实施例1
一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置，如图1、图2所示，该基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置由内外两部分组成，其中：外部为带有通道的反应池，内部为吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料2；
所述带有通道的反应池设置有下述结构：
——反应池底部平板5：位于整个反应池的底部；
——反应池上层板4：位于整个反应池的上层；
所述反应池上层板设置有下述结构：
——反应池上层板样品分离通道3：位于反应池上层板；
——反应池上层板样品出入口1：位于整个通道两端；
所述吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料2位于反应池上层板样品分离通道内部，由反应池上层板样品出入口1置入，位于反应池底部平板5上方。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置还满足下述要求：
其一，所述带有通道的反应池的材料为聚甲基丙烯酸甲酯，反应池底部平板高度为0.5cm，反应池上层板高度为3cm；长度相同，均为15cm；宽度相同，均为10cm；
其二，所述反应池上层板样品分离通道高度为2cm；长度为7cm；宽度为1cm；通道个数为10；
其三，所述吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料，材料尺寸边长为0.5cm。
所述壳聚糖多孔吸附材料制备方法还满足下述步骤：
(1)配置50ml的4％的壳聚糖水溶液，加入1ml冰乙酸，加入5ml二甲基亚砜作为致孔剂，加水定容至100ml，搅拌均匀至无结块；
(2)将得到的壳聚糖溶液置于4℃静置8h，使溶液大体无气泡；
(3)配置100ml的0.1％的戊二醛溶液，加入到壳聚糖溶液中，低温搅拌混合，抽真空30min除气泡，置于-30℃冰冻12h；
(4)将冰冻后的材料取出切成小块，用1％的硼氢化钠溶液清洗至变白色，再用水清洗至无气泡产生；
(5)将得到的壳聚糖材料预冷：放于-30℃两小时；转移至-80℃再放置两小时。使用冻干机冻干24小时。冻干结束后取出切割成0.5cm*0.5cm*0.5cm的小立方体，得到基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的壳聚糖吸附材料，外观照片如图3所示，电镜观察如图4所示。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备还满足下述步骤：
(1)所述反应池底部平板与反应池上层板是对聚甲基丙烯酸甲酯进行加工得到；
(2)所述反应池底部平板与反应池上层板是通过粘接剂粘连到一起或打孔后用螺丝固定得到带有通道的反应池。
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法还满足下述步骤：
(1)在壳聚糖溶液中加入致孔剂与交联剂得到壳聚糖凝胶，冻干壳聚糖凝胶得到壳聚糖多孔吸附材料；
(2)将壳聚糖多孔吸附材料切割后放入带有通道的反应池中得到基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置；
本实施例所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的用途说明：该装置可应用于不同样本(培养基、血液、尿液、唾液等)中外泌体的分离和富集。

Claims (5)

1.一种基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置，其特征在于：
该基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置由内外两部分组成，其中：外部为带有通道的反应池，内部为吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料；
所述带有通道的反应池设置有下述结构：
——反应池底部平板：位于整个反应池的底部；
——反应池上层板：位于反应池底部平板之上；
所述反应池上层板设置有下述结构：
——反应池上层板样品分离通道：位于反应池上层板上；
——反应池上层板样品出入口：位于反应池上层板样品分离通道两端；
所述吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料位于反应池上层板样品分离通道内部，由反应池上层板样品出入口置入，位于反应池底部平板上方；
所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置满足下述要求之一或其组合：
其一，所述带有通道的反应池的材料为聚甲基丙烯酸甲酯，反应池底部平板高度为0.1-5cm，反应池上层板高度为0.1-5cm；反应池底部平板和反应池上层板长度相同，均为5-20cm，宽度相同，均为2-15cm；
其二，所述反应池上层板样品分离通道高度为0.1-3cm，长度为2-10cm，宽度为0.5-2cm；通道个数为1-20个；
其三，所述吸附外泌体的壳聚糖多孔吸附材料是长方体结构，材料边长为0.1-1cm。
2.一种如权利要求1所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法，其特征在于：
(1)所述反应池底部平板与反应池上层板是采用聚甲基丙烯酸甲酯加工得到的；
(2)所述反应池底部平板与反应池上层板通过粘接剂粘连到一起，或打孔后用螺丝固定得到带有通道的反应池。
3.按照权利要求2所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法，其特征在于：
(1)在壳聚糖溶液中加入致孔剂与交联剂得到壳聚糖凝胶，冻干壳聚糖凝胶得到壳聚糖多孔吸附材料；
(2)将壳聚糖多孔吸附材料切割后放入带有通道的反应池中得到基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置；
4.按照权利要求3所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法，所述的致孔剂为二甲基亚砜，所述的交联剂为甲醛、戊二醛、京尼平中的一种。
5.按照权利要求3或4所述基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖多孔吸附材料的制备方法为：
(1)配制质量分数为1％-10％的壳聚糖水溶液，在壳聚糖水溶液中加入1％的冰乙酸和1％-10％的二甲基亚砜，制备得到壳聚糖溶液；
(2)将得到的壳聚糖溶液置于4℃环境下3-12h；
(3)配制等体积的0.1％-0.5％的戊二醛溶液，与壳聚糖溶液搅拌混合，抽真空10-60min至无气泡，置于-30℃冰冻3-12h；
(4)将冰冻后的材料用0.5％-2％的硼氢化钠溶液清洗至变白色，再用水清洗至无气泡产生；
(5)将得到的壳聚糖材料置于-30℃环境下2-12h，再转移到-80℃环境下2-12h使其彻底冰冻，然后用冷冻干燥机冻干1-3天；取出后切割成所需尺寸，得到基于正负电荷吸附原理的外泌体分离富集装置的壳聚糖多孔吸附材料。
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