CN105505766A - 一种进行固相pcr反应的自动化微流工作站及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种进行固相PCR反应的自动化微流工作站及方法，该方法为基于微流控芯片实现固相PCR反应的方法。该工作站包括：至少一个微流控芯片，芯片含有一个或多个独立的反应通道，每一反应通道包括进出口、一个或多个串联或并联的反应腔室和/或流道，反应腔室底面锚定有寡核苷酸序列，以进行固相PCR扩增和/或固相单碱基延伸反应；液路系统，以控制引入不同反应试剂溶液流至对应的反应腔室；温控装置，以控制调节所述反应腔室内的温度；控制系统，其连接上述液路系统和温控装置，用于控制液路系统和温控装置，在微流控芯片的反应腔室内进行的固相PCR扩增和/或固相单碱基延伸反应，并包括变性-洗脱反应和洗脱-变性反应。该工作站具有一站式自动化、较高通量、低成本、操作方便、快速高效、准确性高的优点。

Description

一种进行固相PCR反应的自动化微流工作站及方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种基于微流控芯片的固相PCR&单碱基延伸反应，对接核酸质谱检测，主要应用于单核苷酸多态性检测，尤其是一种适用于一站式自动化、多样本、高通量、快反应、低成本的SNP检测样本前处理，可与核酸质谱检测仪如MALDI-TOF-MS直接对接，进行SNP位点检测。

背景技术

单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)是指个体基因组内特定核苷酸位置上的单个碱基A，T，C，G的改变而引起的DNA序列的改变或突变，这种突变包括单碱基的转换、颠换、插入或缺失等。严格来说，只有当等位基因的频率大于或等于1％时才能称得上是SNPs，然而部分SNPs数据库如HGVBase把等位基因的频率小于1％的变异也包括在SNPs内。研究表明，人类每对等位染色体上每1000bp就会出现1个SNP，而整个人类基因组每300bp就会出现1个SNP，在任意两个个体之间，就有好几百万的单碱基差异和十万个氨基酸的不同，在一定程度上反映了人类个体或群体的特异性，也造成人类在内的物种之间染色体基因组的多样性。

对人类基因组的SNP进行大规模的研究具有重要的意义，它不仅可以研究人类的起源、进化和群体遗传学特征，而且为多基因病和复杂性疾病如人类肿瘤、糖尿病、心血管疾病、自身免疫性疾病、精神病、老年性痴呆等相关基因的研究和药物遗传学的研究提供了科学基础和先进手段。SNP检测是目前基因诊断的主要研究内容。同时，SNP检测所代表的基因诊断也逐渐成为新生儿或特定人群遗传病筛查的重要手段之一。

由于SNP其重要性，并且随着SNP研究的普及和深入，SNP的检测方法目前已有了长远的发展，如全基因组测序，外显子组测序，全基因组SNP芯片，质谱法，SNPseq法，SNPlex，SNaPshot等，都可以快速、高效、较大通量检测基因组中的SNP，但这些设备价格昂贵，仅适用于大型实验室的研究，难以在普通实验室进行普及。

质谱法是SNP位点检测的常用方法和最具前景的技术。质谱法是通过对物质的分子量(质荷比)进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，通过分型实验将差异放大，然后以质谱仪进行检测即可达到SNP分型的目的。其主要是在紧挨SNP位点设计一段探针，在反应体系中以双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP，dideoxy-nucleosidetriphosphate)替代dNTP脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP，deoxy-nucleotidethiophosphate))，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP，从而具有不同的分子量，质谱仪可以检测出这种微小的分子量差异，从而实现SNP分型的目的。

其中，MassARRAY时间飞行质谱生物芯片系统由专业生产生物芯片系统用于遗传突变及SNP领域研究的美国Sequenom公司开发，是目前采用质谱法直接检测SNP的成熟设备。该系统的突出特点是能以极高的精确度进行基因型识别，直接测出带有SNP或其他突变的目标DNA。由于质谱法直接检测分子的本质特征-分子量，不需要通过荧光标记来进行间接检测，准确可靠；灵敏度高，可检测低至10ng的核酸片段。然而，国外公司利用质谱仪对SNPs位点进行检测的方法，在样本前处理过程中存在不少缺陷。如Sequenom的标准流程采用的是两步PCR：普通PCR预扩增和单碱基延伸PCR扩增，即放大含待检测SNP位点的ssDNA模板和放大含SNP位点的延伸产物；PCR预扩增需要45个循环，单碱基延伸循环需要40个外循环且每个外循环又内嵌5个内循环反应；且在两次PCR扩增之间，还需要使用虾碱性磷酸酶(ShrimpAlkalinePhosphatase，SAP)消化除去第一次PCR反应体系中剩余的dNTP和引物；这样就造成样本处理时间的延长、试剂消耗及检测成本的增加，尤其整个流程操作需要长达10个小时左右，不利于样本的即时检测。

微流控芯片技术是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程；其是生命科学、化学科学与信息科学信号检测和处理方法研究的重要技术平台。近十年来，微流控芯片技术在生物、医学、临床等领域得到了快速发展，尤其是核酸的扩增及分析等(ZhangY,OzdemirP.Analyticachimicaacta,2009,638(2):115-125；HorsmanKM,BienvenueJM,BlasierKR.Journalofforensicsciences,2007,52(4):784-799.)。

在PCT号为PCT/US2012/056888中林巧、朱静等人公开了一种核酸在微芯片上的分离和富集的方法：基于微流控芯片，以反应微室中的磁珠为载体实现固相PCR扩增及单碱基延伸反应，以检测SNPs及分离和富集所需DNA分子。但其微芯片集成微加热器和温度传感器，以磁珠为反应载体，若涉及不同样本和不同SNP位点检测，则需更换磁珠或其表面锚定的引物，这样就造成反应过程中的操作繁琐，且难以实现反应的自动化处理。

综上所述，现有的实现SNP位点检测方法，存在以下问题：样本处理操作步骤繁琐，所需配备仪器设备较多且昂贵，人工操作带来的干扰性大，且整个实验耗时较长，难于实现临床中的即时检测。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种基于微流控芯片作为反应通道和固相载体，并利用固相PCR扩增方法和固相单碱基延伸方法，在功能集成的微流工作站中，进行SNP检测样本前处理，能够和核酸质谱检测分析仪直接对接，检测出SNP位点。该工作站基于微流控芯片通道底面作为固相衬底锚定连接反向引物，并进行固相PCR扩增反应、变性-洗脱反应、一步单碱基延伸反应和洗脱-变性反应：克服现有质谱法检测SNP样本处理过程中需对样本进行两次多循环PCR扩增反应、SAP消化处理而导致的成本高、耗时、费力等缺陷；借助集液路系统、温控装置和控制系统等于一体的微流工作站实现反应的一站式自动化操作；同时一次性用的芯片避免样本间的交叉污染，并可根据不同SNP位点和检测需求量，使用不同类型芯片和不同寡核苷酸序列；在工作站对样本进行处理后，可直接对接核酸质谱分析仪；该工作站具有一站式自动化、较高通量、低成本、操作方便、快速高效、准确性高等优点。

在本文的各个方面，本发明包括可用于对一个或多个样本，包括全血或DNA样本，进行固相PCR扩增&单碱基延伸反应的微流工作站，其包括微流控芯片、液路系统、温控装置和控制系统等。其中，微流控芯片，提供反应通道和固相衬底：所有反应在一个或多个串联的反应腔室或流道完成，通道底面的固相衬底平铺锚定有反向引物，在固相衬底上可进行固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应；液路系统，连接微流控芯片，在反应过程中，则用于在特定时间和环境下控制引入特定的反应试剂溶液至反应腔室，与反向引物或目标DNA片段接触反应；温控装置，紧贴芯片通道底面，主要为帕尔贴加热片或其他加热/冷却装置，在反应过程中为通道底面和反应溶液试剂提供特定的温度环境；控制系统，耦连液路系统和温控装置，为用户可操作系统：可设置输入相关信息参数，包括反应温度、反应时间、试剂流速等，并以此对控制系统和温控装置进行监测并反馈输出指令集，使系统反应能按照设定参数自动完成。

在实施例中，微流控芯片材质为金属、玻璃、硅片和聚合物的一种或组合；微流控芯片包括进出口和通道，其中芯片可为一个或多个并行的通道，每个通道可为一个或多个串行的反应腔室或流道，通道底面为平面状或有阵列凹池，锚定连接一种或多种反向引物；通道底面-反向引物的连接方式为羧基/醛基/环氧基-氨基、链霉亲和素-生物素中的至少一种。

在实施例中，液路系统包括，蠕动泵、毛细微管、试剂仓和多通道阀门等。蠕动泵为试剂溶液提供动力；毛细微管为试剂溶液提供流道，连接试剂仓和微流控芯片；多通道阀门为多种试剂提供选择性开关。

在实施例中，温控系统包括，帕尔贴加热片或其他加热/冷却器件、金属导热片、散热装置、温度传感器和比例-积分-微分(PID，Proportional-Integral-Derivative)控制器等；为固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应提供合适的温度环境，优选的温控系统具有温度精确性高、均一性好、升降温速度快等特性。

在实施例中，控制系统包括，可视化操作界面、单片机、控制面板等，可根据用户需求进行参数信息输入，通过单片机对温控系统及液路系统进行指令输出，并在操作过程中对各参数信息进行实施监测并作出反馈。

在实施例中，整个反应包括，固相PCR预扩增，变性-洗脱反应，固相单碱基延伸反应，洗脱-变性反应：在液路系统控制下，引入正向引物、Taq酶/全血直扩酶、DNA/血液、dNTP和PCR扩增体系在内混合液到反应腔室，温控装置按照设定参数进行升降温，则在芯片通道底面，即固相衬底发生固相PCR扩增反应，包括多次的变性-退火-延伸反应，通道底面长满含有SNP位点的双链DNA(dsDNA)；温控装置升温或通入碱性溶液，固相衬底锚定的dsDNA发生变性解链，互补单链DNA(ssDNA)发生游离至溶液中，目标ssDNA连接锚定在芯片通道底面，后再通入清洗缓冲液对反应腔室进行反复的洗脱，即洗去未反应的引物、dNTP、游离的互补ssDNA等，以达到对锚定在固相衬底的目标ssDNA提纯目的；其次液路系统控制引入单碱基延伸引物、Taq酶、ddNTP和反应体系等混合液到反应腔室，温控装置按照设定参数进行升降温，进行单碱基延伸反应，包括多次的退火-延伸反应，即单碱基延伸引物和锚定在固相衬底的ssDNA发生退火互补，在引物下游延伸一个碱基即终止，产出且锚定在固相衬底、可与目标ssDNA互补的延伸产物；液路系统引入清洗缓冲液，对反应腔室进行反复的清洗，即洗去未反应的延伸引物、ddNTP等，以达到对锚定在固相衬底的目标ssDNA和延伸产物提纯目的，其中清洗缓冲液继续被引入流向废液仓，待清洗完毕后，通入去离子水再次进行清洗，后续启动温控装置进行加热处理，目标ssDNA和延伸产物发生变性，延伸产物解链游离至去离子水中，回收去离子水，直接可进行后续的质谱上机检测。

该工作站主要适用于，SNP质谱检测的样本前处理。该微流工作站对接核酸质谱分析仪进行SNP位点检测，能够大大降低了样本分析处理时间、检测成本，具有较高通量、低成本、操作方便、快速高效、准确性高等优点。

综上所述，本发明具有以下优点：

首先，该工作站利用微流控芯片通道底面作为固相衬底锚定连接反向引物，并进行固相PCR扩增反应、变性-洗脱反应、一步单碱基延伸反应和洗脱-变性反应：克服现有质谱法检测SNP样本处理过程中需对样本进行两次多循环PCR扩增反应、SAP消化处理而导致的成本高、耗时、费力等缺陷；尤其是SNP检测样本前处理时间大大降低，在1-2个小时内即可完成处理，甚至更短，再进行质谱上机获取SNP检测结果。

接着，在微流控芯片中同一个反应通道内实现固相PCR扩增和固相单碱基延伸，并对延伸产物/含有SNP位点的核苷酸进行富集、分离、提纯，以进行基因检测和其他用途，并且可以直接和SNP检测相对接，可以实现检测的自动化。

最后，借助集液路系统、温控装置和控制系统等于一体的微流工作站实现反应的一站式、自动化操作；同时一次性用的芯片减少样本间的交叉污染，并可根据不同SNP位点和检测需求量，使用不同类型芯片；在工作站对样本进行处理后，可直接对接核酸质谱分析仪；该工作站具有一站式自动化、较高通量、低成本、操作方便、快速高效、准确性高等优点。

结合说明书附图和权利要求书阅读以下详细描述，本发明的这些及其它特征将变得更为清楚。

附图说明

图1是本发明的实验原理示意图；

图2是本发明的微流控芯片示意图；

图3A是本发明的两层结构的微流控芯片示意图；

图3B是本发明的三层结构的微流控芯片示意图；

图3C是本发明的组装后微流控芯片模型图；

图4是本发明的微流工作站示意图；

图5A是本发明的固相衬底(芯片通道底面)平铺锚定反向引物的结构示意图；

图5B是本发明的固相PCR扩增后，固相衬底锚定目标dsDNA的结构示意图；

图5C是本发明的经过变性&清洗后，固相衬底锚定目标ssDNA的结构示意图；

图5D是本发明的固相单碱基延伸反应后，单碱基延伸产物与目标ssDNA互补结合，并锚定在固相衬底的结构示意图；

图5E是本发明的经过清洗&变性后，单碱基延伸产物脱离固相衬底，在芯片通道溶液中游离的结构示意图；

图6是本发明的生成产物进行的MALDI-TOF-MS质谱检测图。

具体实施方式

名词释义

在详细阐述本发明微流工作站前，为大家能够更好理解本发明的机理和要点，特对本文中采用的术语进行阐述，其释义仅限于实施例中。

反向引物/正向引物/单碱基延伸引物

在各个实施例中，反向引物、正向引物和单碱基延伸引物都是根据所需检测的SNP位点设计寡核苷酸序列，并交由相关引物公司进行合成(比如，生工生物工程股份有限公司，上海)。其中，反向引物的5’端是经过化学修饰的，如氨基、生物素等化学反应基团，便于反向引物锚定在固相衬底。在PCR反应过程中，反向引物扩增延伸的ssDNA为目标ssDNA，正向引物连接的ssDNA则为互补ssDNA，正向引物与目标ssDNA的游离端能够发生杂交结合；单碱基延伸引物则适用于单碱基延伸反应，能够与目标ssDNA发生互补杂交，延伸引物的下游紧靠着SNP位点，在反应过程中，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，延伸引物仅能在SNP位点处发生一个碱基延伸即终止。

锚定/连接/固定

在各个实施例中，在微流控芯片反应腔室内发生的固相PCR扩增和固相单碱基延伸，所谓“固相”都是通过反向引物在芯片通道底面进行固定实现。在实施案例中，提及的“锚定”、“连接”、“固定”，即通过共价键结合法，将反向引物通过生物素-链霉亲和素或者氨基-羧基/醛基/环氧基等之间的共价键结合，固定连接到通道底面。在反应前，反向引物通过孵育修饰，被锚定在固相衬底；反应开始，在固相衬底上发生固相PCR扩增反应；在经过变性处理及洗脱后，目标ssDNA固定在固相衬底，后续进行固相单碱基延伸反应。

微流控芯片/反应腔室/固相衬底

在各个实施例中，固相PCR扩增反应和固相单碱基延伸反应，都在微流控芯片内完成，具体来讲是在芯片流道的反应腔室内完成，再进一步讲是芯片通道的底面，即固相衬底表面进行的反应；微流控芯片是整个反应的载体，反应通道则提供封闭的空间，固相衬底则是真正反应发生地：反向引物固定在固相衬底，PCR扩增生成的目标ssDNA固定在固相衬底，单碱基延伸反应亦是在固相衬底的表面发生。

微流控芯片包括芯片通道，芯片通道是由一个或多个并行的反应通道组成，一个反应通道可以包含一个或多个串行的反应腔室或流道。

微流控芯片，通常来讲，指的是至少在一个维度上通道尺寸在毫米、微米级别，甚至于更小；芯片通道的体积在微升、纳升级别，甚至于更小。因其“微”特征，微流控芯片具有样品消耗少，易于控制特性；另其比表面积较大，分子扩散距离短，流体热容小，具有分析检测速度快、反应均一性好等特性。在本实施案例中，芯片通道宽为50um～4mm，通道高为50um～500um。芯片通道底面预先经过羧基/醛基/环氧基/链霉亲合素化学基团表面修饰。

液路系统

在各个实施例中，液路系统包括试剂仓(包括产物仓、废液仓)、注射器、多通道阀门、微泵和微管、压力/流量传感器等。其中试剂仓为反应试剂的存储设备，并可根据不同试剂设定不同的存储环境温度；微泵则是试剂溶液在芯片通道中流动的动力引擎，其可通过注射器进行正压推动或负压抽取的方法，来控制流体的流动或静止；微管则是试剂仓、废液仓连接微流控芯片通道的流路通道，可称为系统的血管系统；多通道阀门则是控制不同试剂流入芯片通道，废液、产物在不同仓室的收集，通过预设的参数和系统的控制，多通道阀门进行自动的切换实现不同试剂在特定时间的引入或流出。另外，工作站也可装配压力传感器，能够实时监测通道内试剂溶液的性质，包括试剂泄漏、溶液流量及体积等，在反应过程中用户可根据监测数据对系统进行维护，包括原件的更换；尤其在出现报错故障时，基于监测数据可对系统进行故障排除和调试。

温控装置

在各个实施例中，PCR扩增反应及单碱基延伸反应，包括dsDNA变性解链为ssDNA和延伸产物的变性游离，需集成在微流控芯片中完成；反应过程涉及：PCR温度循环如95℃(变性)-55℃(退火)-72℃(延伸)，且变性反应在采用热变性处理过程中，温度亦需在95℃左右；这就需要微流工作站设有温控装置，且紧贴芯片底面。温控装置要具有实现温度的精确控制、良好的温度均一性及较快的升降温速度的特性。在实施例中，温控装置可采用帕尔贴加热片(Peltierheatingplates)或其他加热/冷却装置，设有：高导热的金属/陶瓷平板和芯片能够紧密贴合，风扇或冷却装置能够实现迅速的降温且防止过热现象，温度传感器实时监测芯片的温度，PID控制器实时控制温度按照用户预设温度曲线进行加热/降温等。

控制系统

在各个实施例中，控制系统为微流工作站的大脑，其耦连液路系统和温控装置，在整个反应过程中，能够控制系统各器件按照用户预设参数自动运行。其包括电源控制模块、信息采集处理模块、单片机、输入/输入信号模块、可视化操作界面等；其中电源控制模块，为各部件供电；信息采集处理模块连接压力、温度、流量传感器，并传输至单片机；单片机为微型处理器；输入/输出信号模块可向单片机输入信号或接受单片机输出信号，并输出至各部件；可视化操作界面则可显示实时系统参数，并用户可通过其预设参数，包括PCR反应温度，反应时间，试剂流速等。

本发明公开了一种基于微流控芯片作为反应腔室和固相载体，通过功能集成的微流工作站，在微流控芯片中同一个反应通道内实现固相PCR扩增和固相单碱基延伸，并对延伸产物/含有SNP位点的核酸序列进行富集、分离、提纯，以进行基因检测和其他用途。

本发明公开了一种基于微流控芯片，在一个反应腔室内实现固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应，包括在微流控芯片通道底面提供的固相衬底锚定连接的反向引物。参考图1，原理方法包括以下步骤：将含有PCR反应液、dNTP、DNA模板/全血、正向引物的混合液引入固相衬底锚定连接有反向引物的芯片通道，在经过反复的变性、退火、延伸后生成含有反向引物的目标ssDNA和含有正向引物的互补ssDNA，两条ssDNA互补生成dsDNA，并通过反向引物固定在通道底面(见110)；通过变性处理，包括化学方式(如通入碱溶液)或热处理，dsDNA发生变性解链，互补ssDNA发生游离，引入清洗缓冲液对反应通道进行反复的清洗，洗脱掉游离的互补ssDNA、未反应引物和dNTP等，即对锚定在固相衬底的目标ssDNA进行提纯，其中清洗缓冲液经连接芯片出口的毛细微管和多通道阀门的选择性开启，被引入至废液仓(见120)；接着，将含有PCR反应液、ddNTP、单碱基延伸引物的混合液引入到芯片通道，在经过反复的退火-延伸后，单碱基延伸引物杂交到目标ssDNA，延伸一个碱基即终止，且锚定在固相衬底(见130)；再次引入清洗缓冲液对通道进行反复清洗，洗脱掉未反应延伸引物、ddNTP等，即对锚定在固相衬底的ssDNA和延伸产物进行提纯，再经过去离子水的洗脱去盐，最后进行加热变性处理，延伸产物发生解链游离，回收含有游离延伸产物的去离子水，此时切换多通道阀门，开启产物仓阀门，含有游离延伸产物的去离子水引入至产物仓(见140)。反应的终溶液即可直接MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪)上机，进行质谱检测，生成SNP位点报告。

上述的实验步骤都在微流控芯片中进行，又称为微流控芯片实验室或芯片实验室，其特征主要是其容纳流体的有效结构至少在一个维度上为微米级尺度。微流控芯片可由金属、硅片、玻璃和聚合物中的至少一个或组合组成。微流控芯片可采用微细加工技术进行制造，如模塑法、光刻化学腐烛方法等，其包括进出口、流道和反应腔室。根据不同需求和实现功能，可加工成不同形状和尺寸的芯片：芯片流道可为圆形通过或方形通道，反应腔室可为单个腔室或多个腔室串联/并联，通道尺寸可为10um～2mm，甚至更小。

在本发明的实施案例中，采用固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应原理，所有反应都集成在同一个反应腔室中实现，在实施过程中能够对反应试剂实现精确控制和集成操作，但并不局限，亦可在两个或多个反应腔室。图2适宜性地描述了本发明采用的微流控芯片，包括芯片的进口210、出口220、上盖230、反应通道240和基底250。在芯片的加工实施案例中，芯片加工方案可由两种实现方案，但并不局限，两层结构和三层结构。如图3A示意的两层结构：上盖310和基底320，上盖打孔作为通道的进出口，基底进行刻蚀挖槽作为反应流道；如图3B示意的三层结构：上盖330、通道栅栏340和基底350，上盖打孔作为通道的进出口，栅栏则为反应流道间隔；如图3C示意，通过对分层结构进行键合封装，形成可进出流通的封闭反应腔室，包括进出口360、370和通道380。在实施例中，微流控芯片具有8个并行的反应通道，每个通道仅含有单一的反应腔室；但并不局限，亦可为1，2，4，10，16个并行的通道，每个通道又可含有两个或两个以上的反应腔室，如两个串行的反应腔室，分别进行样本的PCR预扩增和单碱基延伸反应。但单个通道有严格的封闭性，不会与其他并行通道有溶液试剂的流通，避免不同样本的交叉污染。

在本发明的实施案例中，微流控芯片采用两层结构加工方案如图3A所示：上盖为无碱玻璃材质，基底为硅晶圆材质，尺寸为L*W*H＝7.5cm*2.5cm*0.1mm，与普通玻片大小相近。首先，对无碱玻璃、硅晶圆切割成上述尺寸；然后按照芯片设计图形上分别对玻璃、硅片进行打孔、刻蚀挖槽，即玻璃上盖设置有进出口，硅片基底设有微流通道，通道长度为6cm，深度为50um-200um，宽度为0.5mm～3mm，单个反应通道的反应体系总体积为5ul～20ul；其次，对芯片上盖、基底进行超声清洗，除去残留杂质并烘干处理；接着对固相衬底进行羧基/醛基/环氧基/链霉亲合素表面修饰处理；最后利用光刻胶粘合键合技术，在硅片非通道区域均匀涂胶，对准硅片和玻璃上盖轻压后，进行紫外光照键合，完成微流控芯片的制作后对其进行真空密封4℃留存。

在本发明的实施案例中，上述固相衬底表面修饰处理的方法流程，给出硅片醛基化修饰的具体步骤，包括：

A、采用过氧化氢和浓硫酸按照v/v＝1:3的比例进行处理，使硅片表面高度羟基化；

B、采用无水乙醇对硅片进行反复清洗后，利用硅烷化试剂APTMS，使硅片表面的羟基氨基化；

C、采用无水乙醇、去离子水对硅片反复清洗后，利用戊二醛试剂，使硅片表面的氨基醛基化。

在本发明的实施案例中，如示意图4，微流工作站包括微流控芯片、液路系统、温控装置和控制系统。

在本发明的实施案例中，微流控芯片410，提供反应腔室和固相衬底：所有反应在一个或多个串联的反应池或流道完成，通道底面的固相衬底平铺锚定反向引物，在固相衬底上可进行固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应。

在本发明的实施案例中，液路系统，在反应过程中，则用于在特定时间和环境下控制引入特定的反应试剂溶液至芯片通道，与PCR扩增引物或引物延伸的核苷酸接触反应，其包括试剂仓421、注射器422、多通道阀门423和微管424等。其中，通过多通道阀门连接芯片进口的试剂仓用于存储反应试剂包括血液/DNA模板、PCR扩增试剂、单碱基延伸试剂、缓冲清洗缓冲液和去离子水，连接出口的试剂仓用于收集废液和生成产物；多通道阀门则通过切换阀门引入不同试剂通入芯片通道，引出不同溶液流出产物仓/废液仓；注射器和微泵，微泵不在图中显示，其在反应过程中为试剂溶液的流动提供动力；微管，连通芯片进出口和试剂仓，提供流通管路。微泵和多通道阀门均耦合连接控制系统。

在本发明的实施案例中，温控装置，紧贴芯片通道底面，主要为帕尔贴加热片或其他加热/冷却装置，在反应过程中为通道底面和反应溶液试剂提供特定的温度环境，其包括帕尔贴加热片431(Peltierheatingplates)、散热片432和风扇433等。温控装置，能够实现温度的精确控制和较快的升降温速度，保证PCR反应和单碱基延伸反应高效准确完成。加热片、风扇和温度传感器等都耦连控制系统，温度传感器在图中未显示；另为保证温控装置按照预设参数精确运行，采用PID控制器对温控装置进行控制实现。

在本发明的实施案例中，控制系统，耦连液路系统和温控装置，为用户可操作系统：可预设参数，包括反应温度、反应时间、试剂流速等，反应开始自动控制各元件按照设定参数运行，且在反应过程中，耦连的温度传感器、流量传感器等实时监测系统运行状态，并自行作出反馈调整各元件参数，以保证系统反应的准确完成。控制系统包括电源控制模块、信息采集处理模块、单片机、输入/输入信号模块、可视化操作界面等，在图中并无显示。

在本发明的实施案例中，微流工作站的目标功能是对样本，包括全血或DNA模板，进行SNP位点检测的样本前处理，即处理原始样本，生成可直接用于质谱检测的单碱基延伸产物。在实施例中，给出DNA样本实现固相PCR扩增及单碱基延伸反应的具体操作流程，包括试剂选取和反应条件。

在本发明的实施案例中，将微流控芯片加载至微流控工作站适配固定位置，并进行预处理操作，包括微管和芯片的连接，试剂准备，反应程序参数预设等。至此，可启动控制系统开始按钮，开始反应。整个反应包括，引物固相锚定修饰，固相PCR预扩增，变性-洗脱操作，固相单碱基延伸反应，洗脱-变性操作；反应过程中，根据用户设置参数，系统自动控制完成。

在本发明的实施案例中，反应前首先需根据SNP检测位点，设计反向、正向引物和单碱基延伸引物，其中反向、正向引物为PCR扩增引物，单碱基延伸引物能与含有反向引物的目标ssDNA杂交结合，如DNA模板选用含有一个单碱基延伸突变的序列：rs111033318，突变位点为T>A，序列为(GCAATACTGGACAACCCACATCATTTTACTATTGCCAAAGCTCCAAATGTATAATTCAGAAAACCAGAACCTTACCACCCGC[A/T]GTGATCTCACTCCAACAACGTCCAGGAA)；则设计的反向引物为：(ACGTTGGATGTTTCCTGGACGTTGTTGGAG)，设计的正向引物为：(ACGTTGGATGTG CAATACTGGACAACCCAC)，ACGTTGGATGT为设计时加上的接头，单碱基延伸引物为：(AGAACCTTACCACCCGC，M.W＝5084.29Da)，且反向引物合成时对其5’端进行C6氨基修饰；引物的合成及修饰均由上海生工生物工程股份有限公司合成。其中，ddNTP采购为美国Sequenom公司，其分子量分别是：ddATP＝271.2Da，ddTTP＝327.1Da，ddCTP＝247.2Da，ddGTP＝287.2Da；若发生突变，延伸产物为(AGAACCTTACCACCCGCA，M.W＝5356.5Da)；不发生突变，则为(AGAACCTTACCACCCGCT，M.W＝5412.3Da)。

首先，通入清洗缓冲液1X(5mMTris-HCl，0.5mMEDTA，1MNaCl，and0.01％v/vTween-20，PH＝7.5)对芯片通道进行润洗，后引入含有5’端氨基修饰的反向引物，氨基与醛基发生缩合反应，即反向引物修饰锚定在芯片通道的固相衬底，再次通入清洗缓冲液，洗脱掉游离的反向引物，如图5A所示固相衬底501锚定连接有反向引物502；后续控制系统按照预输指令，液路系统响应启动，将正向引物503、DNA模板504在内的混合试剂引入至反应腔室中，混合液包括Taq酶0.1ul(5U/ul)、10×Taq缓冲液(Mg²⁺)2ul、dNTP混合液(各2.5mM)0.8ul、DNA模板1ul、正向引物0.6ul和去离子水5.5ul；PCR扩增循环温度见下表：

表1.固相PCR循环扩增参数

其次，启动温控装置，按照设定参数进行升温至95℃，DNA模板发生变性解链；温控装置进行降温至55℃，则含有正向引物的互补ssDNA与锚定在固相衬底的反向引物发生退火杂交，同时来自于样本的目标ssDNA与游离的正向引物发生退火杂交；温控装置升温至72℃，引物在聚合酶作用下发生延伸反应生成dsDNA505，并锚定在固相衬底；温控装置再次升温至95℃，dsDNA发生变性解链成游离的互补ssDNA和固定的目标ssDNA；降温至55℃，则互补ssDNA又与固定的反向引物发生退火杂交。重复30个循环(变性、退火和延伸)可实现目标dsDNA的扩增，并锚定连接在芯片通道底面，如图5B所示dsDNA通过反向引物锚定在芯片通道底面。

然后，在PCR扩增反应完成后，通入碱性溶液处理(碱性溶液用清洗缓冲液配制，0.1mMNaOH)或通入清洗缓冲液后加热至95℃、1min，固相衬底锚定的dsDNA发生变性解链，含有正向引物的互补ssDNA发生游离，含有反向引物的目标ssDNA506连接锚定在芯片通道底面，如图5C所示；接着，通入清洗缓冲液对反应腔室进行冲洗，即可冲去未反应的引物、dNTP和游离的互补ssDNA等，以达到对锚定在固相衬底的目标ssDNA提纯目的，其中连接芯片出口的毛细微管在多通道阀门的废液阀门开启下，清洗缓冲液被引入至废液仓。

接着，液路系统控制引入单碱基延伸引物507和ddNTP508等混合试剂到芯片通道，混合液包括Taq酶0.1ul(5U/ul)、10×Taq缓冲液(Mg²⁺)2ul、ddNTP混合液0.4ul、单碱基延伸引物工作液1ul和去离子水6.5ul；温控装置按照设定参数进行升降温，进行单碱基延伸反应，包括多次的退火-延伸反应，即单碱基延伸引物和锚定在固相衬底的目标ssDNA发生退火互补，并延伸一个碱基，得到和锚定在固相衬底目标ssDNA互补的延伸产物，如图5D所示；单碱基延伸反应循环温度见下表：

表2.单碱基延伸反应循环扩增参数

最后，液路系统引入清洗缓冲液，对反应通道进行反复的清洗，即洗去未反应的延伸引物、ddNTP等，以达到对锚定在固相衬底的目标ssDNA和延伸产物提纯目的，其中废液依然流向废液仓；通入去离子水进行二次清洗；启动温控装置升温至95℃、1min，对ssDNA和延伸产物进行变性操作处理，如图5E所示，延伸产物509发生解链游离，切换多通道阀门的产物仓，将含有游离延伸产物的溶液流至产物仓，即可转移产物至MALDI-TOF-MS进行上机质谱，获取SNP位点检测图。如图6所示，对突变纯合子的样本，进行上述反应后并质朴检测，根据分子量定量分析，图中的三个虚线分别标记为原始延伸引物(M.W＝5084Da)、突变延伸产物(M.W＝5356Da)、野生延伸产物的分子量(M.W＝5412Da)，而在图中在延伸引物、突变延伸产物处存在有质谱峰，即可判定延伸的碱基为ddATP，检测出SNP位点发生突变，由碱基T突变为A。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等同替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明的保护范围。

Claims (20)

1.一种自动进行固相PCR反应的微流工作站，所述工作站包括：

至少一个微流控芯片，芯片含有一个或多个独立的反应通道，每一反应通道包括进出口、一个或多个串联或并联的反应腔室和/或流道，反应腔室底面锚定有寡核苷酸序列，以进行固相PCR扩增和/或固相单碱基延伸反应；

液路系统，以控制引入不同反应试剂溶液流至对应的反应腔室；

温控装置，以控制调节所述反应腔室内的温度；

控制系统，其连接上述液路系统和温控装置，用于控制液路系统和温控装置，在微流控芯片的反应腔室内进行的固相PCR扩增和固相单碱基延伸反应，并包括变性-洗脱反应和洗脱-变性反应。

2.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上盖、反应通道和基底，上盖设有反应通道的进出口，基底进行刻蚀挖槽成反应通道，通道长度为2-8cm，深度为50um-200um，宽度为0.5mm～3mm，单个反应通道的反应体系总体积为5ul～20ul。

3.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片包括上盖、通道栅栏和基底，上盖设有反应通道的进出口，上盖-通道栅栏-基底的“三明治结构”形成多个独立的反应通道。

4.根据权利要求2和3所述的微流控芯片，其特征在于，通过对分层结构的键合封装，形成可进出流通的封闭反应腔室。

5.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片材质为包括金属、玻璃、硅片和聚合物的至少一种或组合组成，其容纳流体的有效结构至少在一个维度上为微米级尺度，微流控芯片处于多个的状态下，各个微流控芯片分别独立与控制系统连接。

6.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述微流控芯片的固相衬底为平面结构，可锚定高密度的一种或多种寡核苷酸序列，所述固相衬底平铺锚定寡核苷酸序列是通过羧基/醛基/环氧基-氨基、链霉亲和素-生物素在内的多种化学修饰中的至少一种完成。

7.根据权利要求6所述的微流工作站，其特征在于，所述锚定在芯片通道底面的寡核苷酸序列是PCR扩增所需的反向引物。

8.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述的固相单碱基延伸反应包括发生一个或多个退火-延伸反应。

9.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述温控装置设置在芯片反应腔室的底面。

10.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述液路系统包括设置各种所述试剂的容器、与反应通道相连的通路及控制阀，所述试剂包括用于PCR扩增的正向引物/单碱基延伸引物、脱氧核糖核苷三磷酸/双脱氧核糖核苷三磷酸、反应酶、反应缓冲液和清洗缓冲液在内，控制系统与此控制阀相连接，以控制阀门的开关或通路流量的大小。

11.根据权利要求1所述的微流工作站，其特征在于，所述控制系统包括电力提供装置、控制器、采集器、显示装置和/或输出装置，电力提供装置给微流工作站提供电力，控制器连接采集器，显示装置和/或输出装置，并连接液路系统和温控装置。

12.一种基于权利要求1所述的基于微流控芯片实现固相PCR反应的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A:在微流控芯片的每一反应通道的固相衬底上发生固相PCR扩增反应；

B:在经过变性处理及洗脱后，目标单链DNA片段固定在固相衬底；

C:进行固相单碱基延伸反应，并对延伸产物进行提纯分离。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤A进一步包括：

控制系统将含有PCR反应液、dNTP、DNA模板/全血、正向引物在内的混合液由液路系统引入固相衬底锚定连接有反向引物的反应腔室，

控制系统控制温控系统在经过若干次的变性、退火、延伸后生成含有反向引物的目标单链DNA和含有正向引物的互补单链DNA，两条单链DNA可互补生成双链DNA，并通过反向引物固定在通道底面。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤B进一步包括：

变性处理，控制系统控制液路系统引入碱性溶液到反应腔室内进行化学变性，或控制温控系统加热进行热变性包括控制系统控制反应通道内的化学方式或热处理，双链DNA发生变性解链，互补单链DNA发生游离；

控制系统引入清洗缓冲液对反应通道进行反复的清洗，洗脱掉游离物至废液仓，对锚定在固相衬底的目标单链DNA进行提纯。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤C进一步包括：

控制系统将含有PCR反应液、ddNTP、单碱基延伸引物在内的混合液引入到反应腔室，

通过温控系统进行一次或多次退火-延伸后，单碱基延伸引物杂交到目标单链DNA，延伸一个碱基即终止，且锚定在固相衬底；

再次引入清洗缓冲液对通道进行反复清洗，洗脱掉未反应延伸引物、ddNTP在内的物质，实现对锚定在固相衬底的目标单链DNA和延伸产物进行提纯，

最后引入去离子水对反应通道进行反复清洗去盐处理，并通过温控系统进行加热变性处理，延伸产物发生解链游离，回收含有游离延伸产物的去离子水，并含有游离延伸产物的去离子水引入至产物仓。

16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，PCR扩增的正向引物和锚定在芯片通道底面的反向引物在固相PCR扩增过程中，反复进行变性-退火-延伸反应，生成双链DNA且锚定在芯片通道底面。

17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，单碱基延伸引物可与锚定在芯片通道底面的反向引物延伸的目标单链DNA发生退火互补杂合。

18.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，ddNTP仅用于固相单碱基延伸反应，在延伸引物下游仅发生一个碱基的延伸。

19.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述变性-洗脱反应，变性反应使锚定在芯片通道底面的双链DNA发生变性，解链为目标单链DNA和互补单链DNA，互补单链DNA发生游离；洗脱将游离的互补单链DNA、未反应的正向引物、dNTP在内的物质清洗掉，对锚定在芯片通道底面的目标单链DNA进行提纯。

20.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述洗脱-变性反应，洗脱将未反应的单碱基延伸引物及ddNTP在内的物质清洗掉，对锚定在芯片通道底面的目标单链DNA和延伸产物进行提纯；变性反应使延伸产物与目标单链DNA解链，延伸产物发生游离。