CN117844630A - 一种快速pcr热循环系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了快速PCR热循环系统，包括加热器，反应芯片和散热器；具体地，所述加热器位于所述反应芯片的上方，所述散热器位于所述反应芯片的下方；其中，所述加热器由控制器和LED阵列构成，控制器控制LED阵列中每个LED单元的开关，实现反应微滴的光学加热；所述反应芯片由为PMMA‑PDMS‑PMMA结构，反应芯片具有反应腔，腔内可以形成单层平面微滴阵列；并对对反应芯片进行修饰，提高热转换效率和核酸扩增反应效果。
Description
技术领域
本发明属于数字PCR领域，具体涉及一种快速PCR热循环系统和反应芯片。
背景技术
核酸扩增检测是通过酶的作用将待检核酸序列进行多次半保留复制，随后检测的方法。根据核酸扩增是否需要变温循环的过程，又可以分为聚合酶链式反应(PCR)方法和恒温扩增方法。经过发展，PCR技术又细分为荧光定量PCR，多重PCR，可变串联重复PCR，不对称PCR，巢式PCR以及数字PCR等。数字PCR中，包括基于微流控芯片的技术，微流控芯片通常是以微通道为结构特征，是一种集样品处理、生化反应和结果检测等几个典型步骤为一体的微型生化分析仪器。然而，利用在微流控芯片上的刻蚀技术或者采用的材料等介质会对核酸提取效率造成影响，而且核酸提取步骤繁琐，微流控芯片的制备成本也随之升高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于简易的LED加热方法的，具有低比表面积的、基于电荷转化材料修饰的微流控芯片，并在微流控芯片上实现效果核酸高效提取和原位扩增检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种快速PCR热循环系统，包括加热器，反应芯片和散热器；具体地，所述加热器位于所述反应芯片的上方，所述散热器位于所述反应芯片的下方；
其中，所述加热器由控制器和LED阵列构成，控制器控制LED阵列中每个LED单元的开关，实现反应微滴的光学加热；
所述反应芯片为PMMA-PDMS-PMMA结构，反应芯片具有反应腔，腔内可以形成单层平面的反应微滴阵列；
具体地，所述反应芯片制作方法包括：
步骤1：将4mm的上层PMMA板材进行激光切割，形成进液口，并且在2×10-7托的基压下通过电子束蒸发在反应腔区域沉积形成金薄膜。
步骤2：采用模塑法对PDMS(聚二甲基硅氧烷)薄膜进行刻蚀，形成反应腔。
步骤3：将5mm厚的底部PMMA板材和PDMS薄膜进行等离子清洗，清洗完成后，将底部PMMA板材在5％APTES的偶联剂中浸泡10分钟，再放入干燥箱进行硅烷化反应，将硅烷化反应后的底部PMMA板材进行二次等离子清洗，将二次等离子清洗后的底部PMMA板材和PDMS薄膜放入热压机中进行热键合。
步骤4：将热键合后的底部PMMA板材和PDMS再次进行等离子清洗，贴合到步骤1得到的金薄膜修饰的上层PMMA板材上，放入热压机中进行热键合，形成反应芯片。
步骤5：将反应芯片进行真空等离子处理1分钟；将壳聚糖溶液注入芯片腔体中，静置24h；
步骤6：将反应芯片中的壳聚糖溶液吸出，采用去离子水清洗，再将芯片烘干，得到最终使用的反应芯片。
进一步的，所述LED单元为波长为450-480nm的LED灯。
进一步的，所述壳聚糖溶液为0.85％(w/v)的壳聚糖的乙酸浓度为1％(w/v)的溶液。
进一步的，所述散热器为风扇。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.采用LED加热方法直接对反应微滴进行加热，提高加热的均匀性，同时能够降低系统升温和降温所需要的时间，提高热循环速度。
2.采用LED加热方法来直接对微滴进行加热，由于为了帮助微滴吸收热量，对反应芯片进行金薄膜修饰，为了防止其对PCR反应的抑制，进一步对反应芯片修饰了壳聚糖，消除了该抑制反应。
附图说明
图1：热循环控制系统加热示意图。
图2：PCR扩增抑制测试图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是利用一段DNA为模板，在DNA聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段DNA扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析。PCR检测方法在临床上快速诊断细菌性传染病等方面具有极为重要的意义。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性主要依赖于和靶序列两端互补的寡核苷酸引物，它由变性——复性——延伸三个基本反应步骤构成。首先，根据靶序列DNA片段两端的核苷酸序列，合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的两条链互补配对。将适量的寡聚核苷酸引物与四种脱氧核糖核苷三磷酸(dDNA)、DNA聚合酶以及含有靶序列片段的DNA分子混合，经过高温变性使DNA双链解开、低温复性使底物与模板附着和中温延伸合成新的DNA片段这三个阶段的一次循环，DNA的量即可增加一倍，而循环n次，则DNA的量增加2n倍，扩增反应迅速地循环，产生了大量相同的片段，每一片段中均包含目的DNA片段。
数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。除了基因表达和拷贝数检测，数字PCR也适用于诸如低频等位基因的辨别、病毒滴定和二代测序文库的绝对定量。
因此，PCR技术中如何快速地进行热循环，保证热循环过程中温度的精确控制是技术人员需要解决的问题之一。
如图1所示，本发明的快速PCR热循环系统中，包括LED阵列加热器，反应芯片和散热器；具体地，加热器位于反应芯片的上方，散热器位于反应芯片的下方(图中未示出)。具体的，散热器可以为风扇。
LED阵列由控制器控制，控制器通过控制LED阵列中每个LED单元的开关，调节反应微滴的加热功率，实现反应微滴的光学加热。具体的，采用波长为450-480nm的LED灯作为LED单元。
为了促进反应微滴吸收LED阵列的光热量，需要对反应芯片进行金薄膜修饰，然而这会抑制核酸反应，因此，需要对反应芯片进行特殊处理，来减少核酸反应的抑制。
具体的，反应芯片为PMMA-PDMS-PMMA结构，反应芯片具有反应腔和进液口，腔内可以形成单层平面微滴阵列。
具体地，反应芯片制作方法包括：
步骤1：将4mm的上层PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)板材进行激光切割，形成进液口，并且在2×10-7托的基压下通过电子束蒸发在反应腔区域沉积形成金薄膜。
步骤2：采用模塑法对PDMS(聚二甲基硅氧烷)薄膜进行刻蚀，形成反应腔。
步骤3：将5mm厚的底部PMMA板材和PDMS薄膜进行等离子清洗，清洗完成后，将底部PMMA板材在5％APTES(氨丙基三乙氧基硅烷)的偶联剂中浸泡10分钟，再放入干燥箱进行硅烷化反应，将硅烷化反应后的底部PMMA板材进行二次等离子清洗，将二次等离子清洗后的底部PMMA板材和PDMS薄膜放入热压机中进行热键合。
步骤4：将热键合后的底层PMMA板材和PDMS再次进行等离子清洗，贴合到步骤1得到的金薄膜修饰的上层PMMA板材上，放入热压机中进行热键合，形成反应芯片。
而由于表面带有电荷的材料可以通过吸附扩增试剂中的关键组分，从而导致PCR扩增效率降低，因此，需要进一步对反应芯片进行修饰，以消除带电荷的材料的影响，因此，进一步进行如下操作：
步骤5：将反应芯片进行等离子清洗1分钟；将壳聚糖溶液注入芯片腔体中，静置24h；
步骤6：将反应芯片中的壳聚糖溶液吸出，采用去离子水清洗，再将芯片烘干，得到最终使用的反应芯片。
其中，壳聚糖溶液为0.85％(w/v)的壳聚糖的乙酸浓度为1％(w/v)的溶液。
附图2为以pUC18质粒样本作为模板，进行的PCR扩增抑制测试。图中曲线1为扣除荧光基线后，未采用壳聚糖修饰的反应芯片的荧光曲线，曲线2为扣除荧光基线后，进一步采用壳聚糖修饰的反应芯片中，从图中可以看出，曲线2比曲线1的峰值提前，并且荧光强度较曲线1高，侧面说明了壳聚糖修饰可以消除PCR反应抑制现象。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，除非另有说明，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
最后应说明的是，上述技术方案只是本发明的一种实施方式，对于本领域内的技术人员而言，在本发明公开了应用方法和原理的基础上，很容易做出各种类型的改进或变形，而不仅限于本发明上述具体实施方式所描述的方法，因此前面描述的方式只是优选的，而并不具有限制性的意义。
Claims (4)
1.一种快速PCR热循环系统，其特征在于：包括加热器、反应芯片和散热器；具体地，所述加热器位于所述反应芯片的上方，所述散热器位于所述反应芯片的下方；
其中，所述加热器由控制器和LED阵列构成，所述控制器控制所述LED阵列中每个LED单元的开关，实现反应微滴的光学加热；
所述反应芯片为PMMA-PDMS-PMMA结构，所述反应芯片具有反应腔和进液口，所述反应腔内可以形成单层平面的反应微滴阵列；
具体地，所述反应芯片制作方法包括：
步骤1：将4mm的上层PMMA板材进行激光切割，形成进液口，并且在2×10-7托的基压下通过电子束蒸发在所述反应腔区域沉积形成金薄膜；
步骤2：采用模塑法对PDMS薄膜进行刻蚀，形成所述反应腔；
步骤3：将5mm厚的底部PMMA板材和所述PDMS薄膜进行等离子清洗，清洗完成后，将所述底部PMMA板材在5％APTES的偶联剂中浸泡10分钟，再放入干燥箱进行硅烷化反应，将硅烷化反应后的所述底部PMMA板材进行二次等离子清洗，将所述二次等离子清洗后的所述底部PMMA板材和所述PDMS薄膜放入热压机中进行热键合；
步骤4：将热键合后的所述底部PMMA板材和所述PDMS薄膜再次进行等离子清洗，贴合到步骤1得到的金薄膜修饰的上层PMMA上，放入热压机中进行热键合，形成反应芯片；
步骤5：将所述反应芯片进行真空等离子处理1分钟，将壳聚糖溶液注入芯片腔体中，静置24h；
步骤6：将所述反应芯片中的壳聚糖溶液吸出，采用去离子水清洗，再将芯片烘干，得到最终使用的反应芯片。
2.根据如权利要求1所述的快速PCR热循环系统，其特征在于：所述LED单元为波长为450-480nm的LED灯。
3.根据如权利要求1所述的快速PCR热循环系统，其特征在于：所述壳聚糖溶液为0.85％(w/v)的壳聚糖的乙酸浓度为1％(w/v)的溶液。
4.根据如权利要求1所述的快速PCR热循环系统，其特征在于：所述散热器为风扇。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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