JP2008154490A - 複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板と、該基板を用いた塩基配列の増幅方法 - Google Patents

Abstract

【課題】プレ増幅することなく、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅する方法、及び、該方法のための基板の提供。
【解決手段】複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、前記基板は、複数のチャンネルを備えており、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、各チャンネルにおいて行われるものであり、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、を特徴とする基板、及び、該基板を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、塩基配列の増幅方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板と、該基板を用いた塩基配列の増幅方法に関する。

ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果、遺伝子を解析して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の設定、治療後の管理、予後予想等が行われている。また別の分野では、遺伝子を解析することにより、食肉、穀物等の食品の流通管理も行われている。
これらの遺伝子解析では、解析対象となる標的塩基配列を増幅することにより解析が行われることが多く、該塩基配列の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。

一塩基多型（ＳＮＰ）検出、遺伝的変異の検出、及び感染したウィルスの特定等の遺伝子解析では、１つのＤＮＡサンプル中に、標的塩基配列が複数存在する場合が多く、また、非常に多くのＤＮＡサンプルを処理しなければならない場合も多い。このような解析を通常のＰＣＲ法で行う場合には、ＤＮＡサンプルを小分けし、それぞれの標的塩基配列に特異的なプライマーセットを用いて、別々にＰＣＲによる増幅を行うことになる。しかしながら、ＤＮＡサンプルが大量に必要とされるため、ＤＮＡサンプルが微量しか得られない場合には解析が困難である。また、標的塩基配列の数だけ反応容器が必要となり、同時に処理できるサンプル数が限られる、という問題もある。このため、微量のＤＮＡサンプルから、複数種類の標的塩基配列を増幅する方法の改良が望まれている。

微量のＤＮＡサンプルから、複数種類の標的塩基配列を増幅する方法の１つに、マルチプレックスＰＣＲ法がある。通常のＰＣＲ法では、１つの反応容器に、１種類のプライマーセットを用いて標的塩基配列の増幅を行うが、マルチプレックスＰＣＲ法では、１つの反応容器に、複数種類のプライマーセットを用いて、複数種類の標的塩基配列の増幅を行う。この手法により、鋳型とするＤＮＡサンプルが少量しか得られない場合であっても、多種類のＰＣＲを同時に行うことが可能であり、また、同一の反応容器で反応を行うことにより、検出の定量性の向上も期待できる。

その他にも、例えば、（１）担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し、第１のプライマー対を用いて第１の標的領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し、第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し、第２のプライマー対を用いて第２の標的領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し、第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し、そして、第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅することにより、１つのＤＮＡサンプルから２又はそれ以上の標的領域をＰＣＲにより増幅する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２００５−１９８５８１号公報

しかしながら、多くの種類のプライマーセットを同時に用いるマルチプレックスＰＣＲ法では、プライマーが標的塩基配列以外にアニールするミスアニーリングや、プライマー同士がアニールすることによるプライマー二量体の形成等を防止しつつ、複数種類の標的塩基配列を、それぞれ特異的に増幅するようにプライマーを設計しなくてはならないため、１種類のプライマーセットのみを用いる通常のＰＣＲ法に比べ、プライマー設計が非常に困難であるという問題がある。

一方、上記（１）の方法においては、複数種類の標的塩基配列を、それぞれ別の反応容器中で増幅させるため、マルチプレックスＰＣＲ法が有するようなプライマー設計上の困難性は解消できる。しかしながら、全ての標的塩基配列を、それぞれプレ増幅する必要があるため、操作が煩雑となり、コンタミネーションの危険性も高くなる。また、プレ増幅産物を移動させるために、大掛かりな装置が必要であり、同時に処理できるサンプル数が限られてしまうという問題もある。

本発明は、プレ増幅することなく、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅する方法、及び、該方法のための基板を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、反応容器として、キャピラリーのような非常に孔径の小さなチャンネルを用いることにより、ＤＮＡサンプルが微量であっても、プレ増幅することなく、多くの反応容器において、別個にＰＣＲによる増幅を行うことが可能であることを見出した。そして、さらに検討した結果、反応容器として用いるチャンネルを、複数まとめて備えている基板を用いることにより、非常に簡便に、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、前記基板は、複数のチャンネルを備えており、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、各チャンネルにおいて行われるものであり、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、を特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、複数の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、前記基板は、複数のチャンネルを備えており、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲに用いられる、１又は複数種類のプライマーセットが、１以上のチャンネル内に存在しており、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、存在するプライマーセットの種類が異なること、を特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、前記プライマーセットが、前記チャンネルに固定されていることを特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、１又は複数種類の前記プライマーセットが、前記基板が備える全ての前記チャンネルに存在していることを特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、１の前記チャンネルに１種類の前記プライマーセットが存在していることを特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、各チャンネルに存在している各プライマーセットの量が、全てのチャンネルにおいて等しいことを特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、前記プライマーセットが、標識されたプライマーを含有するセットであることを特徴とする基板を提供するものである。
また、本発明は、前記いずれか記載の基板を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、複数種類の標的塩基配列を増幅する方法であって、前記いずれか記載の基板に、ＤＮＡサンプルを供給する工程と、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するＰＣＲを、前記チャンネルにおいて行う工程と、を有することを特徴とする、塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡサンプルを、前記チャンネルに、毛細管現象を利用して供給することを特徴とする、塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、増幅された塩基配列を有するＰＣＲ産物を、前記チャンネルの一端から加圧することにより、前記基板から回収することを特徴とする、塩基配列の増幅方法を提供するものである。

本発明の基板を用いることにより、ＤＮＡサンプルが微量であっても、多くのチャンネルにおいて、別個にＰＣＲによる増幅を行うことが可能となる。したがって、１つの反応容器内で全ての標的塩基配列の増幅を行うよりも、プライマー設計が著しく容易になる。非特異的な塩基配列の増幅も顕著に抑制できることから、遺伝子解析の精度の向上も期待できる。また、プレ増幅等の煩雑な操作を必要とせず、操作が簡便となるため、多サンプルの解析も容易にする上に、コンタミネーションの危険性も低く抑えることができる。さらに、本発明の基板が備えるチャンネル毎に、複数種類の標的塩基配列を増幅するＰＣＲを行うことにより、従来のマルチプレックスＰＣＲ法よりも多くの標的塩基配列を、より高精度に増幅することが可能である。
また、本発明の、予めチャンネルにプライマーセットを固定した基板を用いることにより、さらに簡便に複数種類の標的塩基配列を同時に増幅することができる。
本発明の塩基配列の増幅方法、すなわち、本発明の基板を用いた塩基配列の増幅方法により、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅することが可能である。また、増幅した標的塩基配列を、容易に回収することも可能である。

本発明におけるチャンネルは、キャピラリーのような非常に孔径の小さな円筒状の構造である。孔径が数〜２００μｍで、かつ、厚さが０．４〜数十ｍｍのものが好ましい。ポリメラーゼ等が付着することを防止するため、チャンネルの内壁は、タンパク質吸着阻害作用を有する物質で覆われていることが好ましい。該タンパク質吸着阻害作用を有する物質として、例えば、ウシ血清アルブミン等がある。該タンパク質吸着阻害作用を有する物質の量は特に限定されないが、ポリメラーゼ濃度に対して過剰であることが好ましい。

本発明の基板の素材は、耐熱性の高い素材であることが好ましい。ＰＣＲの反応容器として用いるものであるためである。例えば、ガラス製やシリコン製の素材から構成される基板が好ましい。本発明の基板の形状は、複数の前記チャンネルを備えている限り、特に限定されるものではない。好ましくは、複数の前記チャンネルが規則正しく二次元的に配列された板状構造である。円形でも角形でもよいが、市販のサーマルサイクラーに設置可能な大きさ・形状であることが好ましい。

本発明における標的塩基配列とは、遺伝子上に存在する特定の領域の塩基配列であって、ＰＣＲが可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列等がある。

本発明において用いられるＤＮＡサンプルは、標的塩基配列の存在の検出や配列の同定等が望まれるものであり、ＰＣＲにおいて鋳型となるものであれば、特に限定されるものではない。天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよい。また、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。例えば、血液や体液等の生体試料や、培養細胞溶液等から、通常用いられる方法により抽出されたＤＮＡ等がある。このような抽出法として、例えば、チオシアン酸グアニジンを用いた方法や、酸性フェノール及びクロロホルムを用いた方法等がある。また、市販の核酸抽出試薬を、製造業者の指示に従って用いることによっても、核酸を抽出することができる。

本発明の基板は、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、前記基板は、複数のチャンネルを備えており、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲが、各チャンネルにおいて行われるものであり、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、を特徴とするものである。ＤＮＡサンプルを、複数の容量の小さいチャンネルに供給することにより、通常ＰＣＲの反応容器として用いられる１．５ｍＬチューブや０．６ｍＬチューブ等を使用する場合と異なり、ＤＮＡサンプルが微量の場合であっても、反応容器毎に別個にＰＣＲを行うことが可能となる。

各チャンネル内で行われるＰＣＲは、１種類の標的塩基配列を増幅するものであってもよく、複数種類の標的塩基配列を増幅するものであってもよい。非特異的な塩基配列の増幅も顕著に抑制できるため、１種類の標的塩基配列を増幅することが好ましい。一方、各チャンネルにおいて複数種類の標的塩基配列を増幅することにより、従来のマルチプレックスＰＣＲ法よりも、非常に多種類の標的塩基配列を同時に、かつ、高精度に増幅することが可能となる。１のチャンネル内で行われるＰＣＲは、２０種類以下の標的塩基配列を増幅するものであることが好ましく、１０種類以下であることがより好ましい。それ以上の種類の標的塩基配列を増幅すると、増幅の精度が落ちるおそれがあるためである。

但し、増幅する標的塩基配列の種類の異なるチャンネルが、基板全体として、少なくとも２以上有することが必要である。全てのチャンネルにおいて、同一種類の標的塩基配列を増幅するのであれば、わざわざチャンネル毎に別個にＰＣＲを行う必要は無いためである。

本発明の基板は、複数の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、前記基板は、複数のチャンネルを備えており、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲに用いられる、１又は複数種類のプライマーセットが、１以上のチャンネル内に存在しており、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、存在するプライマーセットの種類が異なること、を特徴とするものである。１のチャンネル内に存在するプライマーセットは、２０種類以下であることが好ましく、１０種類以下であることがより好ましい。

本発明におけるプライマーセットとは、標的塩基配列の一方の端と相補的なプライマーと、標的塩基配列の他方の端と相補的なプライマーのセットであって、標的塩基配列をＰＣＲ法により増幅できるものであれば、特に限定されるものではない。プライマーセットの各プライマーの設計や合成は、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても行うことができる。また、それぞれのプライマーは、標的塩基配列と相補的な配列以外にも、ＰＣＲによる増幅を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。

標的塩基配列を増幅するために用いられるプライマーセットを、チャンネルに固定しておいてもよい。予めプライマーセットが固定された基板を用いることにより、より簡便に、標的塩基配列を増幅することができるためである。

プライマーセットをチャンネルに固定する方法は、ＰＣＲを阻害するものでなければ、特に限定されるものではない。例えば、プライマー水溶液をチャンネル内に供給した後、水分を蒸発させ、プライマーのみをチャンネル内壁に固定する方法がある。該方法のように、ＰＣＲ開始前にはチャンネル内壁にプライマーが固定されているが、ＰＣＲ反応溶液の供給等により、ＰＣＲ開始時にはプライマーをチャンネル内壁から剥がすことのできる固定方法が好ましい。ＰＣＲ中にプライマーが内壁に固定されていると、ＰＣＲ効率が落ちるおそれがあるためである。

プライマーセットは、必ずしも基板が備える全てのチャンネルに存在している必要はないが、全てのチャンネルにおいて存在していることが、ＤＮＡサンプルやＰＣＲのための試薬溶液等が有効に利用できるため好ましい。

チャンネル毎に、異なる種類のプライマーセットが存在してもよく、複数のチャンネルにおいて同一種類のプライマーセットが存在してもよい。標的塩基配列が多種類である場合には、全てのチャンネルに異なる種類のプライマーセットを存在させ、チャンネル毎に異なる種類の標的塩基配列の増幅を行うことが好ましい。一方、標的塩基配列の種類があまり多くない場合には、複数のチャンネルに同一種類のプライマーセットを存在させ、複数のチャンネルにおいて同一種類の標的塩基配列を増幅することが、増幅された標的塩基配列をより多量に得られるため、好ましい。

プライマーセットの設計が容易であるため、１のチャンネルには、１種類のプライマーセットが存在していることが好ましい。１のチャンネルに１種類のプライマーセットが存在しており、かつ、基板が備える全てのチャンネルにおいて、同一量のプライマーセットが存在していることがより好ましい。チャンネル間のＰＣＲの条件を揃えることができるためである。

チャンネルに固定されるプライマーセットの量は、特に限定されるものではなく、また、チャンネル毎に同一の量でなくてもよいが、各チャンネルに存在している各プライマーセットの量が、全てのチャンネルにおいて等しいことが好ましい。ここで、各チャンネルに存在している各プライマーセットの量が全てのチャンネルにおいて等しいとは、例えば、或る１のチャンネルに３種類のプライマーセット（ア、イ、ウ）が、別の１のチャンネルに１種類のプライマーセット（エ）が、それぞれ存在している場合に、４種類のプライマーセット（ア、イ、ウ、エ）の量が等量であることを意味する。複数種類の標的塩基配列を増幅する場合に、それぞれのプライマーセットが等量である場合には、ＤＮＡサンプル中に存在していた標的塩基配列間の、簡単な量比をも求めることが可能であるためである。

増幅された標的塩基配列の検出や解析を容易にするために、プライマーセットが、標識されたプライマーを含有するセットであることが好ましい。該標識をするための物質には、例えば、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン等がある。

本発明の塩基配列の増幅方法は、本発明の基板を用いてＰＣＲを行うものであれば、特に限定されるものではない。本発明の塩基配列の増幅方法により、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅することが可能となる。
例えば、本発明の基板に、ＤＮＡサンプルを供給する工程と、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するＰＣＲを、本発明の基板が備えるチャンネルにおいて行う工程と、を有することを特徴とする、塩基配列の増幅方法がある。特に、予めプライマーセットを固定しておいた基板を用いることにより、より簡便に複数種類の標的塩基配列を同時に増幅することが可能となる。

具体的には、まず、本発明の基板に、ＤＮＡサンプルを供給する。該供給方法は、特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡサンプル溶液を、マイクロピペッター等を用いて各チャンネルに供給する方法や、毛細管現象を利用して供給する方法等がある。分注機等の大掛かりな装置や、煩雑な手動のピペット操作も必要とせず、容易にＤＮＡサンプルを供給することができるため、毛細管現象を利用して供給する方法が好ましい。

ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の試薬と、ＤＮＡサンプルを、同時に調製したＰＣＲ溶液を作製し、該ＰＣＲ溶液を本発明の基板に供給することが好ましい。プライマーセット以外にＰＣＲに必要な全ての試薬等を、同時に調製することにより、基板に供給する操作が一度ですみ、操作が簡便となるためである。

ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の、ＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。ＤＮＡサンプルとプライマーセットの量も、通常用いられる量であれば、特に限定されるものではない。

ＰＣＲに必要な全ての試薬をチャンネルに供給した後、チャンネルの両端を密封する。該密封方法は、チャンネルが独立したＰＣＲ反応容器として機能するように、チャンネルの開口部を密封できる方法であれば、特に限定されない。例えば、基板の両面を弾力のある板でチャンネルの両端を密封する方法がある。該弾力のある板は、透明なシリコンゴム板が好ましい。耐熱性に優れ、かつ、内部の確認が容易であるためである。

チャンネルの両端を密封した基板を、市販のサーマルサイクラー等に設置し、ＰＣＲを行う。ＰＣＲは、使用するポリメラーゼの種類、プライマーのＴｍ、標的塩基配列の長さ等に基づいて決定される反応条件で、通常行われる方法により行うことができる。該反応条件の決定方法は、当該技術分野においてよく知られている。

増幅された標的塩基配列を有するＰＣＲ産物を、本発明の基板から回収し、その後の遺伝子解析等に用いることができる。該回収方法は、特に限定されるものではないが、簡便であるため、チャンネルの一端から加圧することにより、回収する方法が好ましい。具体的には、チャンネルを密封していた弾力のある板をはずし、チャンネルの開口部の一端から空気を挿入することにより、ＰＣＲ産物をチャンネルから回収する。
なお、遺伝子解析の種類によっては、基板から回収しなくてもよい場合がある。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

複数のチャンネルを備えた基板として、浜松ホトニクス社製のキャピラリープレート（型名：J5022-09）を用いた。該キャピラリープレートを図１に示す。該キャピラリープレート１は、外縁部１ｂの内部に、孔径６μｍ、厚さ１ｍｍのチャンネル１ａが、開孔比５５％以上で規則正しく二次元的に配列されたガラス板である。

１００種類のプライマーセットをチャンネル１ａに固定するために、図２に示すようにキャピラリープレート１を１００等分し、各１領域につき１種類のプライマーセットを固定した。具体的には、１００μＭに調整したプライマーセット水溶液を、インクジェットプリンターを用いて、チャンネルに吐出させた。つまり、図２のように、例えば、領域Ｐ１にプライマーセット１の水溶液を吐出させた。吐出されたプライマーセット水溶液は、それぞれの領域Ｐに含まれるチャンネル１ａの開口部に付着後、毛細管現象によりチャンネル１ａ内に供給された。その後、室温で放置することにより、水が蒸発し、プライマーのみチャンネル１ａ内壁に固定された。

プライマーセットのうち、リバースプライマーは無標識のものを用いたが、増幅された標的塩基配列の検出を容易にするために、フォワードプライマーは蛍光物質Ｃｙ５で標識したものを用いた。

ＤＮＡサンプルとして、白血球から抽出したゲノムＤＮＡを用いた。該白血球は、採血した末梢血液から、遠心分離法により、単離した。該白血球からのゲノムＤＮＡの抽出は、ＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＺＧＥＮ社製 cat.#.5１１83）を用いて、該キットに添付の方法に従い、行った。

プライマーセット以外にＰＣＲに必要な全ての試薬を調製したＰＣＲサンプル２として、最終濃度５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを含むＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）の２倍希釈溶液を調製した。
２００μＬの該ＰＣＲサンプルを、図３に示すように、ＰＣＲサンプル容器３に分注し、その上部にキャピラリープレート１を設置した。これにより、ＰＣＲサンプル２は、毛細管現象によりチャンネル１ａに供給された。

ＰＣＲサンプル２が供給されたキャピラリープレート１を、図４に示すように、透明なシリコンゴム板４で挟みこみ、チャンネル１ａの両端を密封した。シリコンゴム板４で密封されたキャピラリープレート１を、図５に示すように、サーマルサイクラー５（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に設置し、ＰＣＲを行った。具体的には、９５℃で１０分間の変性、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル、最後に７２℃で１０分間の伸長、からなる反応条件により行った。

ＰＣＲ終了後、サーマルサイクラー５から取り出したキャピラリープレート１を、シリコンゴム板４を取り外した後に、図６に示すように、ＰＣＲ回収容器６ａに設置した。上部に開口部のある加圧用蓋６ｂを、図７に示すように、ＰＣＲ回収容器６ａの上部に設置した。加圧用蓋６ｂの開口部より空気を挿入してキャピラリープレート１を加圧し、ＰＣＲ産物溶液７をＰＣＲ回収容器６ａに回収した。

ＰＣＲ産物の検出のために、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。該ハイブリダイゼーション溶液は、最終濃度が、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）、０．５％（重量／体積）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）である、ＰＣＲ産物溶液７の２倍希釈溶液である。

１００種類のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物と特異的にハイブリダイズする１００種類のプローブを固相したＤＮＡチップを用意した。プローブは、アミノ修飾をした６０ｍｅｒのものを用いた。具体的には、１００μＭとしたプローブ水溶液を、パーキンエルマー社製のアレイヤーを用いて、ＴＡＫＡＲＡ社製のハッブルスライド表面の所定の位置に吐出して、ＤＮＡチップを作成した。

上記ＤＮＡチップに、固相した１００種類のプローブを覆うようにハイブリダイゼーション用のシートを貼り、２５μＬの上記ハイブリダイゼーション溶液を、該シートの内部に注入した。該シート上部を蒸発防止用のシートで密閉し、ＤＮＡチップを５０℃の恒温装置内で３０分間静置させ、ハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション終了後、ＤＮＡチップをウォッシング液（１ｘＳＳＣ、０．２％（重量／体積）ＳＤＳ）中で、室温下、５分間振とうし、続いて、０．１ｘＳＳＣ中で、室温下、１０分間振とうした。その後、エアスプレーでＤＮＡチップの表面にエアーをあて、表面を乾燥させた。

乾燥させたＤＮＡチップを、Ａｘｏｎ社製のＧｅｎｅＰｉｘ４０００を用いて、Ｃｙ５の蛍光を検出したところ、１００種類のプローブ全てにおいて、蛍光が観察された。すなわち、１００種類全てのプローブに特異的にハイブリダイズする標的塩基配列が、ＰＣＲにより増幅されたことが確認された。
実施例１の結果から、本発明の基板を用いることにより、１００種類の標的塩基配列を同時に増幅できることが明らかである。

（比較例１）
実施例１で用いたゲノムＤＮＡと１００種類のプライマーセットを用いて、比較例１を行った。１００種類全てのプライマーセットを、１本のＰＣＲチューブに添加し、ＰＣＲを行った。具体的には、最終濃度０．５μＭの各プライマーセットと、最終濃度５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを含む、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）の２倍希釈溶液を調製し、これをＰＣＲサンプルとした。２００μＬの該ＰＣＲサンプルを分注した０．５ｍＬのＰＣＲチューブを、実施例１と同様にサーマルサイクラーに設置し、ＰＣＲを行った。
得られたＰＣＲ産物を、全て、１の回収容器に回収した。回収されたＰＣＲ産物溶液を用いて、実施例１と同様にしてハイブリダイゼーションを行い、Ｃｙ５の蛍光を検出した。

比較例１では、実施例１と同じＤＮＡサンプルとプライマーセットを用いたにも関わらず、蛍光が観察されたのは、１００種類のプローブのうち、２３種類であった。すなわち、１００種類の標的塩基配列のうち、２３種類しか同時に増幅することができなかった。
実施例１と比較例１の結果から、本発明の基板を用いることにより、プライマー設計上の困難性が解消される上に、従来のマルチプレックスＰＣＲ法よりも、高精度に、複数種類の標的塩基配列を増幅できることが明らかである。

１０００種類のプライマーセットを用いて、１０００種類の標的塩基配列の増幅を行った。実施例１と同様に、プライマーセットのうち、リバースプライマーは無標識のものを用いたが、増幅された標的塩基配列の検出を容易にするために、フォワードプライマーは蛍光物質Ｃｙ５で標識したものを用いた。

まず、実施例１と同じキャピラリープレート１のチャンネル１ａに、１０００種類のプライマーセットを固定するために、図２に示すようにキャピラリープレート１を１００等分し、各１領域につき１０種類のプライマーセットを固定した。具体的には、１００μＭに調整した１種類のプライマーセット水溶液の代わりに、１０種類のプライマーセットをそれぞれ１００μＭずつ含有するように調整した混合水溶液を用いた以外は、全て実施例１と同様に行った。

次に、上記キャピラリープレート１を用いて、実施例１と同様にＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を回収した。得られたＰＣＲ産物溶液７を用いて、実施例１と同様に、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。さらに、１０００種類のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物と特異的にハイブリダイズする１０００種類のプローブを固相したＤＮＡチップを、実施例１と同様にして用意した。

２５μＬではなく、２５０μＬのハイブリダイゼーション溶液を、シートの内部に注入した以外は、全て実施例１と同様にして、ハイブリダイゼーションを行い、Ｃｙ５の蛍光を検出したところ、１０００種類のプローブ全てにおいて、蛍光が観察された。
実施例２の結果から、本発明の基板を用いることにより、１０００種類の標的塩基配列を同時に増幅できることがわかった。したがって、極微量のＤＮＡサンプルを鋳型にして、従来のマルチプレックスＰＣＲ法よりも、非常に多くの標的塩基配列を、より高精度に増幅できることがあきらかである。

本発明の基板を用いることにより、複雑なプライマー設計を行うことなく、また、大掛かりな装置や煩雑な操作を必要とせずに、極微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、複数種類の標的塩基配列を増幅することができるため、医療機関等における検体の遺伝子解析等の分野で利用が可能である。

実施例１において用いた複数のチャンネルを備えた基板（キャピラリープレート）を示した斜視図である。 実施例１において、プライマーセットを固定するために、キャピラリープレート１を１００等分した状態を、模式的に示す平面図である。 実施例１において、キャピラリープレート１に、ＰＣＲサンプル容器３に入ったＰＣＲサンプル２を供給する様子を、模式的に示す平面図である。 実施例１において、チャンネル１ａの両端を透明なシリコンゴム板４で挟みこんで密封したキャピラリープレート１を模式的に示す平面図である。 実施例１において、キャピラリープレート１をサーマルサイクラー５に設置した状態の概略構成図である。 実施例１において、シリコンゴム板４を取り外したキャピラリープレート１を、ＰＣＲ回収容器６ａに設置した状態を模式的に示す平面図である。 実施例１において、上部に開口部のある加圧用蓋６ｂを、ＰＣＲ回収容器６ａの上部に設置した状態を模式的に示す平面図である。

符号の説明

１…キャピラリープレート、１ａ…チャンネル、１ｂ…外縁部、Ｐｎ（ｎ＝１〜１００）…キャピラリープレートの１００等分された領域、２…ＰＣＲサンプル、３…ＰＣＲサンプル容器、４…シリコンゴム板、５…サーマルサイクラー、６ａ…ＰＣＲ回収容器、６ｂ…加圧用蓋、７…ＰＣＲ産物溶液

Claims (11)

1. 複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、
   前記基板は、複数のチャンネルを備えており、
   １又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、各チャンネルにおいて行われるものであり、
   少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、
   を特徴とする基板。
2. 複数の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、
   前記基板は、複数のチャンネルを備えており、
   １又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いられる、１又は複数種類のプライマーセットが、１以上のチャンネル内に存在しており、
   少なくとも２以上のチャンネルにおいて、存在するプライマーセットの種類が異なること、
   を特徴とする基板。
3. 前記プライマーセットが、前記チャンネルに固定されていることを特徴とする、請求項２記載の基板。
4. １又は複数種類の前記プライマーセットが、前記基板が備える全ての前記チャンネルに存在していることを特徴とする、請求項２又は３記載の基板。
5. １の前記チャンネルに１種類の前記プライマーセットが存在していることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか記載の基板。
6. 各チャンネルに存在している各プライマーセットの量が、全てのチャンネルにおいて等しいことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか記載の基板。
7. 前記プライマーセットが、標識されたプライマーを含有するセットであることを特徴とする、請求項２〜６のいずれか記載の基板。
8. 請求項１〜７のいずれか記載の基板を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、塩基配列の増幅方法。
9. 複数種類の標的塩基配列を増幅する方法であって、
   請求項１〜７のいずれか記載の基板に、ＤＮＡサンプルを供給する工程と、
   １又は複数種類の標的塩基配列を増幅するＰＣＲを、前記チャンネルにおいて行う工程と、
   を有することを特徴とする、塩基配列の増幅方法。
10. ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡサンプルを、前記チャンネルに、毛細管現象を利用して供給することを特徴とする、請求項８又は９記載の塩基配列の増幅方法。
11. 増幅された塩基配列を有するＰＣＲ産物を、前記チャンネルの一端から加圧することにより、前記基板から回収することを特徴とする、請求項８〜１０記載の塩基配列の増幅方法。

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