CN102827764A - 核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因芯片技术领域，主要涉及一种核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法，具体地讲是一种可以将溶液中PCR扩增、核酸探针延伸、杂交、清洗和荧光图像扫描功能集成在同一装置上的基因芯片，在该芯片上能够实现核酸探针在片延伸，有利于基因芯片检测过程的自动化，避免基因芯片操作流程中人为因素干扰，减少检测结果的偶然误差，适于推广应用。

Description

核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法

技术领域

本发明主要涉及一种核酸探针在片延伸基因芯片及其制备工艺和使用方法，属于生物技术领域，特别是基因芯片领域。 

背景技术

基因芯片技术在医学、生命科学、药业、农业、环境科学等凡与生命活动有关的领域中均具有重大的应用前景。阵列型基因芯片技术可广泛应用于疾病诊断、药物基因组图谱、筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。国内外研究结果表明：传统基因芯片将寡核酸探针固定在芯片载体表面的杂交动力学表现与核酸在溶液中的表现明显不同，实验结果很难解释，甚至互相矛盾。主要原因是表观反应速率不仅与探针的密度、探针的长度、探针在互补序列上的位置、溶液扩散速度、载体表面物理性状、环境温度、离子强度及种类有关，还受其他重要因素的影响。 

科学家们发现，基因芯片杂交结果的重现性仍然不是十分理想，一般情况下，中高密度基因芯片杂交结果的重现性在85%左右。Zhang L等使用从同一标本中提取mRNA用Affymetrix公司生产的U133A Gene和U133 Plus2.0芯片进行参照杂交，杂交实验获得的结果相当不一致，两个芯片杂交结果比较，将近70%检测相同基因的探针阵列点杂交信号数值出现明显偏差，他们认为通过比 较两种芯片杂交结果，无法确定哪个结果能够准确反映生物样本中基因表达水平。利用OWLS(optical waveguide lightmode spectroscopy,OWLS)非标记检测技术，在实验过程中观测到当靶核酸序列长于探针序列时，靶序列及其与探针杂交后的游离端在溶液中会形成立体结构，而具有立体结构的靶序列分子的热力学扩散运动，不仅影响杂交体的形成，还会使杂交体的解离常数增加，甚至使杂交体不能稳定存在。靶序列分子游离端热力学运动是影响杂交动力学的重要因素。杂交结果重复性较差这一瓶颈问题限制了基因芯片技术的发展。 

前期研究发现，核酸在固液界面，尤其是当固定在芯片表面的核酸探针长度短于核酸靶序列长度情况下，杂交动力学行为有悖于Southern理论。 

为了实现核酸探针在片延伸，提高基因芯片检测的重复性和单碱基变异检测的特异性，应该构建具有PCR扩增、探针延伸、荧光标记、杂交、清洗和检测功能的核酸探针在片延伸基因芯片。采用核酸探针在片延伸技术在延伸核酸序列时，可以实现等位基因特异性PCR（allele specific PCR），针对单碱基变异（包括SNPs）进行分析。传统的基因芯片通过互补序列杂交的方式检测待检样品的核酸序列，对单碱基变异识别能力较差。如果通过改变现有基因芯片工作原理，研制核酸探针在片延伸基因芯片，可以利用等位基因特异性PCR技术原理提高基因芯片识别单碱基变异的能力。 

发明内容

发明目的 

本发明设计了一种核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法，在该芯片上能够实现核酸探针在片延伸，其目地在于提供一种高通量、高重复性、高准确性的基因序列检测技术及装置。 

技术方案 

一种核酸探针在片延伸基因芯片，包括芯片本体，其特征在于：芯片本体上具有微池，芯片本体一侧为盖玻片，芯片本体与盖玻片之间设有密封圈，芯片本体上方设有压盖，芯片本体另一侧设有两个阀门，在微池的两端分别设有阀门的流入道和流出道；核酸探针微阵列固定于盖玻片内表面的微池覆盖范围内，盖玻片、密封圈与芯片本体的微池形成密闭的PCR反应室，盖玻片构成透明的一侧薄室壁。 

微池的容积为20-50μl，微池具有快速变温的薄壁结构。 

该芯片在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定识别不同基因序列的特异性探针和等位基因鉴别探针，同时另设有质控探针和阵列位置指示探针；利用DNA聚合酶特异性延伸的特性，在基因芯片表面进行核酸探针特异性延伸，实现完全互补核酸探针在片延伸。 

一种如上所述核酸探针在片延伸基因芯片的制备工艺，其特征在于：步骤如下： 

（1）芯片本体制备：选用热变形温度≥140℃注塑材料，制做基因芯片本体； 

（2）密封圈制备：制做环形密封圈； 

（3）设计探针和引物：从NCBI等数据库获得基因芯片设计需要的基因序列，利用生物信息学生物软件设计引物和特异性的探针； 

（4）合成探针和引物：用核酸合成仪合成基因芯片所需的与靶序列反义链互补的核酸探针序列，5’端加氨基修饰；合成正义链引物和5’端荧光素标记的反义链引物； 

（5）制备核酸探针微阵列芯片：用氨基硅烷和戊二醛将0.2mm厚的盖玻片处理成表面具有活性氨基的片基；用去离子水将合成的探针溶解，配制浓度为200mmol/l探针溶液；然后进行点样；点样后的芯片于37℃下水化12小时，然 后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；用封闭液封闭玻片，之后洗涤3次；吹干备用。 

一种如上所述核酸探针在片延伸基因芯片的使用方法，其特征在于：步骤如下： 

（1）获取待测样品DNA模板； 

（2）开启流入道、流出道阀门，将待测样品DNA模板与PCR缓冲液混合后，加入基因芯片微池中； 

（3）将基因芯片放入温度循环风场中，进行95℃变性；94℃→54℃→72℃循环变温，50℃杂交； 

（4）开启流出道、流入道阀门，通过流入道注入清洗缓冲液，流出道排放液体的方式洗去游离的PCR产物和未反应的引物、核酸单体以及PCR缓冲液； 

（5）用荧光图像扫描仪扫描芯片获取芯片上不同位点荧光信号强度，分析被检靶序列核酸序列信息。 

优点及效果 

本发明是一种核酸探针在片延伸基因芯片及制备工艺和使用方法，具有如下优点及有益效果： 

本发明设计了一种新型工作原理的基因芯片，其原理是应用DNA聚合酶特异性延伸的特性，在基因芯片表面进行核酸探针特异性延伸，实现等位基因特异性延伸功能，可以有效地鉴别单碱基变异，为SNPs检测提供了新的技术方法；构建具有微池的基因芯片，可以将溶液中PCR扩增、核酸探针延伸、杂交、清洗和荧光图像扫描功能集成在同一装置上，有利于基因芯片检测过程的自动化，避免基因芯片操作流程中人为因素干扰，减少检测结果的偶然误差；基因芯片采用薄壁设计，有利于快速温度循环变化，不仅可以提高核酸扩增的质量，还 可以缩短PCR所需的时间，减少基因芯片检测流程总时间，提高工作效率，有利于实际应用时快速检测的需要。由于基因芯片的微池采用了一侧透明室壁设计，为实时定量PCR检测和可视化基因芯片研制提供了技术实施的可能性。 

附图说明

图1为本发明核酸探针在片延伸基因芯片结构示意图。 

图2为本发明芯片PCR扩增时的扩增条件。 

附图标记说明： 

1、芯片本体，2、微池，3、盖玻片，4、密封圈，5、压盖，6、阀门，7、流入道，8、流出道。 

具体实施方式：

下面结合附图和具体的实施方式对本发明做进一步的说明： 

本发明这种核酸探针在片延伸基因芯片构建了一种新型工作原理的基因芯片，达到核酸探针在片延伸，提高基因芯片检测结果的重复性的目地。 

本发明研制的核酸探针在片延伸基因芯片，利用DNA扩增酶在引物与模板杂交形成的局部双链3’末端特异性延伸技术原理，在玻片固定基因探针的表面构建能够容纳PCR缓冲液的微池，在微池中进行PCR反应，当溶液中靶序列数量扩增到一定数量时，固/液界面的核酸探针可以与溶液中的互补靶序列杂交，在DNA聚合酶的作用下，使核酸探针延伸，实现单碱基变异检测的功能。为了实现上述过程，本发明构建了新型工作原理的基因芯片，芯片结构如图1中所示。 

一种核酸探针在片延伸基因芯片，包括芯片本体1，其特征在于：芯片本体1上具有微池2，芯片本体1一侧为盖玻片3，芯片本体1与盖玻片3之间设有密封圈4，芯片本体1上方设有压盖5，芯片本体1另一侧设有两个阀门6，在微池2的两端分别设有阀门6的流入道7和流出道8；如图1所示，将核酸探针 微阵列固定于盖玻片3内表面的微池2覆盖范围内，盖玻片3、密封圈4与芯片本体的微池2形成密闭的PCR反应室，盖玻片3构成透明的一侧薄室壁，高速流动的变温空气吹到盖玻片3表面，可以通过盖玻片3进行热传导，控制微池2内液体的温度变化，实现PCR所需的温度循环控制，完成溶液中靶核酸序列扩增、核酸探针延伸和杂交过程；开启流入道、流出道阀门进行清洗；清洗后，通过盖玻片进行荧光图像扫描。可以将溶液中PCR扩增、芯片固/液界面核酸探针延伸、杂交、清洗和荧光图像扫描功能集成在同一装置上，有利于基因芯片检测过程的自动化，避免基因芯片操作流程中人为因素干扰，减少检测结果的偶然误差。 

微池2的容积为20-50μl，微池2具有快速变温的薄壁结构。 

本发明设计的基因芯片采用薄壁设计，有利于快速温度循环变化，不仅可以提高核酸扩增的质量，还可以缩短PCR所需的时间，减少基因芯片检测流程总时间，提高工作效率，有利于实际应用时快速检测的需要。 

由于基因芯片的微池采用了一侧透明室壁设计，为实时定量PCR检测和可视化基因芯片研制提供了技术实施的可能性。 

该芯片在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定识别不同基因序列的特异性探针和等位基因鉴别探针，同时另设有质控探针和阵列位置指示探针；利用DNA聚合酶特异性延伸的特性，在基因芯片表面进行核酸探针特异性延伸，实现完全互补核酸探针在片延伸，可以有效地鉴别单碱基变异，为SNPs检测提供了新的技术方法；等位基因鉴别阵列点探针能够有效地区分单碱基变异基因型，达到提高基因芯片检测单碱基变异特异性的目地。 

具体来说是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区 域中，分别固定识别不同核酸序列的特异性核酸探针，针对需要鉴别的等位基因位点分别设计四个等位基因鉴别探针，等位基因鉴别探针除了3’末端分别为A、T、C、G外，其余序列完全相同，其中与模板完全互补的探针序列可以与溶液中靶核酸序列杂交，在核酸聚合酶的作用下，完全互补的探针将会延伸，不完全互补的探针将不会延伸。延伸的核酸探针与靶序列杂交后形成的杂交体结合能增加，在清洗时不易被洗脱；而没有被延伸的核酸探针与靶序列杂交后的杂交体结合能较小，在清洗时容易洗脱。由于靶序列在扩增时被标记荧光，杂交后延伸的核酸探针位点经荧光图像扫描仪扫描后就会有荧光信号，通过分析不同位点荧光信号就可以实现单碱基变异识别功能。同时，在芯片上另设有质控探针和阵列位置指示探针，可以反应芯片制备的质量及在扫描图像上提供位点定位信息。 

该基因芯片是在固定有核酸探针阵列的玻片表面构建具有容积为20-50μl的微池，在微池两端分别设有常闭逆止阀门的流入通道和流出通道，常闭逆止阀门可以通过外力实现开关功能；微池具有快速变温的薄壁结构，足够的换热面积，能够达到升、降温速度：>10℃/s的要求；芯片一侧室壁透明，可以满足核酸探针微阵列荧光图形扫描的需要。 

一种如上所述核酸探针在片延伸基因芯片的制备工艺，其特征在于：步骤如下： 

（1）芯片本体制备：选用热变形温度≥140℃（注塑）材料，根据图1所示制做基因芯片本体； 

（2）密封圈制备：根据图1所示制做环形密封圈； 

（3）设计探针和引物：从NCBI等数据库获得基因芯片设计需要的基因序列，利用生物信息学生物软件设计引物和特异性的探针； 

（4）合成探针和引物：用核酸合成仪合成基因芯片所需的与靶序列反义链互补的核酸探针序列，5’端加氨基修饰；合成正义链引物和5’端荧光素标记的反义链引物； 

（5）制备核酸探针微阵列芯片：用氨基硅烷和戊二醛将0.2mm厚的盖玻片处理成表面具有活性氨基的片基；用去离子水将合成的探针溶解，配制浓度为200mmol/l探针溶液；用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样；按照不同要求从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右，点间距依点的数量而定；点好的芯片于37℃下水化12小时，然后在80℃下烘干2小时；用探针缓冲液（1xSSC，0.1%SDS）及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以封闭液（1%BSA，PH=7.0，0.01mol/l PB）封闭玻片，之后洗涤3次；吹干备用。 

一种如上所述核酸探针在片延伸基因芯片的使用技术原理步骤如下： 

（1）获取待测样品DNA模板； 

（2）开启流入道、流出道阀门，将待测样品DNA模板与PCR缓冲液（含有DNA聚合酶）混合后，加入基因芯片微池中； 

（3）将基因芯片放入温度循环风场中，进行95℃变性；94℃→54℃→72℃循环变温，50℃杂交； 

（4）开启流出道、流入道阀门，通过流入道注入清洗缓冲液，流出道排放液体的方式洗去游离的PCR产物和未反应的引物、核酸单体以及PCR缓冲液； 

（5）用荧光图像扫描仪扫描芯片获取芯片上不同位点荧光信号强度，分析被检靶序列核酸序列信息。 

上述芯片的具体使用方法按以下步骤进行： 

（1）处理样品 

取待检样品1毫升，用溶菌酶溶解，氯仿抽提，乙醇沉淀法提取模板DNA， 备用。如需长时间放置，在-20℃下冻存。 

（2）上样 

开启流入道、流出道阀门，将待测样品DNA模板与PCR缓冲液（含有DNA聚合酶）混合后，加入基因芯片微池中。 

（3）PCR扩增 

扩增条件如下：如图2中所示。 

（4）杂交 

PCR产物与芯片上的探针在50℃下杂交10分钟。 

（5）清洗 

经流入道在3分钟内连续注入1ml清洗缓冲液清洗芯片。 

（6）检测 

用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。 

（7）数据分析 

Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件将芯片分析结果输出。 

Claims (5)

1.一种核酸探针在片延伸基因芯片，包括芯片本体（1），其特征在于：芯片本体（1）上具有微池（2），芯片本体（1）一侧为盖玻片（3），芯片本体（1）与盖玻片（3）之间设有密封圈（4），芯片本体（1）上方设有压盖（5），芯片本体（1）另一侧设有两个阀门（6），在微池（2）的两端分别设有阀门（6）的流入道（7）和流出道（8）；核酸探针微阵列固定于盖玻片（3）内表面的微池（2）覆盖范围内，盖玻片（3）、密封圈（4）与芯片本体的微池（2）形成密闭的PCR反应室，盖玻片（3）构成透明的一侧薄室壁。

2.根据权利要求1所述的核酸探针在片延伸基因芯片，其特征在于：微池（2）的容积为20-50μl，微池（2）具有快速变温的薄壁结构。

3.根据权利要求1所述的核酸探针在片延伸基因芯片，其特征在于：该芯片在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定识别不同基因序列的特异性探针和等位基因鉴别探针，同时另设有质控探针和阵列位置指示探针；利用DNA聚合酶特异性延伸的特性，在基因芯片表面进行核酸探针特异性延伸，实现完全互补核酸探针在片延伸。

4.一种如权利要求1所述核酸探针在片延伸基因芯片的制备工艺，其特征在于：步骤如下：

（1）芯片本体制备：选用热变形温度≥140℃注塑材料，制做基因芯片本体；

（2）密封圈制备：制做环形密封圈；

（3）设计探针和引物：从NCBI等数据库获得基因芯片设计需要的基因序列，利用生物信息学生物软件设计引物和特异性的探针；

（4）合成探针和引物：用核酸合成仪合成基因芯片所需的与靶序列反义链互补的核酸探针序列，5’端加氨基修饰；合成正义链引物和5’端荧光素标记的反义链引物；

（5）制备核酸探针微阵列芯片：用氨基硅烷和戊二醛将0.2mm厚的盖玻片处理成表面具有活性氨基的片基；用去离子水将合成的探针溶解，配制浓度为200mmol/l探针溶液；然后进行点样；点样后的芯片于37℃下水化12小时，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；用封闭液封闭玻片，之后洗涤3次；吹干备用。

5.一种如权利要求1所述核酸探针在片延伸基因芯片的使用方法，其特征在于：步骤如下：

（1）获取待测样品DNA模板；

（2）开启流入道、流出道阀门，将待测样品DNA模板与PCR缓冲液混合后，加入基因芯片微池中；

（3）将基因芯片放入温度循环风场中，进行95℃变性；94℃→54℃→72℃循环变温，50℃杂交；

（4）开启流出道、流入道阀门，通过流入道注入清洗缓冲液，流出道排放液体的方式洗去游离的PCR产物和未反应的引物、核酸单体以及PCR缓冲液；

（5）用荧光图像扫描仪扫描芯片获取芯片上不同位点荧光信号强度，分析被检靶序列核酸序列信息。

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