CN116908265B - 检测核酸lamp扩增产物电化学生物传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于电化学检测技术领域，具体涉及一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，选取带有‑COOH修饰的多壁碳纳米管MWCNTs‑COOH；步骤S2，对金电极表面进行清洗和退火；步骤S3，将退火后的金电极与多壁碳纳米管通过吸附作用结合，进行金电极表面功能化，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器；其中所述步骤S3包括在金电极表面功能化后进行羧基的封闭处理；本发明基于多壁碳纳米管具有突出的导电能力可提高DNA生物传感器的灵敏度，并配合封闭处理有效封闭未与DNA探针结合的化学基团，极大的提升了DNA生物传感器的特异性，解决了DNA上双链结构与电极修饰中使用到的化学基团可能形成非特异性结合的问题。
Description
技术领域
本发明属于电化学生物传感器技术领域，具体涉及一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
核酸检测目前主要依靠实验室内的荧光PCR（聚合酶链反应）来实现，其具有准确度高的优点。近年来，快速PCR技术发展迅速，人们正在探索通过简化PCR技术实现POCT(point-of-care test) 即时检测，但由于PCR技术过程较复杂，且需要荧光设备较大的原因，距离真正实现以PCR为基础的POCT仍需要较长时间，特别是在研发小型化便携式检测设备方面。近二十年来，等温核酸扩增技术发展迅速，其中LAMP（环介导等温扩增）技术是各种等温扩增技术中发展较早也较成熟的一种技术，LAMP技术具有扩增速度快，灵敏度高，对样本纯度要求较低等特点，相较传统的PCR技术更适合核酸检测POCT化的研发。
电化学技术是通过对不同电极进行表面功能化修饰制备成不同的传感器，用以检测目标物化学反应中产生的电学信号，如电流、阻抗等，从而对目标物进行检测的一种方法。电化学技术检测核酸是基于将与目标核酸片段互补配对的DNA探针固定在不同电极上制备成电化学生物传器，通过目标核酸与DNA探针杂交结合，生物传感器可将杂交的化学信号转化为电信号，从而实现对目标核酸的特异性识别。电化学传感器具有高灵敏度、小尺寸、低成本的优点，不仅适合于研发核酸检测POCT产品中对小型化，集成化的要求，还具备拓展为多基因位点同时检测的微阵列传感器潜力。且电化学传感器相较于荧光检测法，对杂质耐受性更强，可对如血液、唾液、汗液等生物粗样本进行直接检测，更加适用于POCT产品研发的需求。
DNA生物传感器功能主要取决于如何将特异性DNA探针固定在电极上，及选用何种材料和方法对电极进行表面功能化。常用的几种将DNA探针固定在电极表面的方法包括如化学吸附法、共价结合法、静电吸附法、共聚合法，及通过抗生物素-生物素亲和系统的方法。
比如常见的，通过对DNA尾端修饰有-SH（巯基），通过在金电极表面形成S-Au键实现自组装单分子层，但该方法由于-SH本身化学活性强，不易保存，且易导致修饰在DNA探针尾端的-SH发生氧化反应等失去活性，影响DNA探针结合在金电极表面的效率，导致制备出的DNA生物传感器灵敏度较低。还有较常见的方法为通过化学键结合将DNA探针固定在电极表面，如通过一端具有-SH一端具有-NH2（氨基）的化合物例如半胱胺作为化合物linker将带有可与氨基结合的化学基团尾端修饰的DNA探针固定在金电极表面，但这种方法中使用的化合物通常导电性中等或较弱，会使电子转移产生的信号也相对较弱，同样影响DNA生物传感器的灵敏度。
碳纳米管具有表面积大和突出的电荷传输特性，可以极大地促进电化学反应中电子在电极表面的转移，从而显著增加DNA杂交后产生电信号的灵敏度，从而提高生物传感器的灵敏度。目前以碳纳米管制备的DNA电化学传感器多用于检测单链DNA，这是利用DNA双链中两条碱基互补配对的原理来设计与待检测目标互补配对的 DNA探针，从而达到特异性杂交，将待检测物绑定在电极上，进行特异性待测DNA检测的目的。而自然界的DNA或通过常规PCR方法扩增出的DNA一般为双链，为了与碳纳米管DNA电化学传感器上的DNA探针结合，需要先将双链DNA转化为单链DNA才可通过DNA电化学传感器结合识别。LAMP（Loop-mediatedIsothermal Amplification，环介导等温扩增）是一种等温扩增技术，同时，由于在其扩增反应过程中在产物两端会形成环状结构，且环状结构部分可形成部分单链DNA结构，所以在一些检测中可利用环状结构与电化学传感器上的DNA探针结合，无需将双链DNA转化为单链DNA的过程。但是由于LAMP整体结构中，既有双链的部分，又有单链的部分，其中的双链结构易和许多化学基团发生非特异性绑定，如氨基，羧基，醛基等，所以当制备电化学传感器使用到这些基团时需要选择恰当的封闭液，将可能与DNA双链结构非特异性结合的化学基团进行封闭，从而提高DNA电化学传感器的特异性。
因此，亟需一种在核酸LAMP扩增产物检测中可检测双链DNA的电化学生物传感器。
发明内容
本发明提供了一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法，以解决当前DNA生物传感器无法在LAMP扩增检测中应用于双链DNA的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，选取带有-COOH修饰的多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；步骤S2，对金电极表面进行清洗和退火；步骤S3，将退火后的金电极与多壁碳纳米管通过吸附作用结合，进行金电极表面功能化，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器；其中所述步骤S3包括在金电极表面功能化后进行羧基的封闭处理。
又一方面，本发明还提供了一种核酸LAMP扩增产物的检测方法，包括如下步骤：选取基因组DNA作为模板，在65～70℃下LAMP等温扩增25～35min，得到LAMP扩增产物；将LAMP扩增产物 12.5 µL滴加到如前所述方法制备得到的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器上，在室温条件下孵育30min使LAMP扩增产物与DNA探针杂交；将杂交完毕的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器与Autolab电化学工作站的连接线连接，检测电流信号，判断目标核酸产物，得到检测结果。
第三方面，本发明还提供了一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器，由如前所述的制备方法得到。
本发明的有益效果是，本发明的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法基于多壁碳纳米管具有突出的导电能力可以极大的促进电子的转移从而增加电信号强度的特点，可提高DNA生物传感器的灵敏度，并配合封闭处理有效封闭未与DNA探针结合的化学基团，极大的提升了DNA生物传感器的特异性，解决了DNA上双链结构与电极修饰中使用到的化学基团可能形成非特异性结合的问题。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的表面功能化完成后的DNA生物传感器的结构示意图；
图2是本发明的通过方波伏安法检测Actin的LAMP产物在MWCNTs DNA生物传感器上产生的信号图；
图3是本发明的通过差分脉冲伏安法检测Actin的LAMP产物在MWCNTs DNA生物传感器上产生的信号图。
图中：
1目标核酸、2 DNA探针、3 封闭液、4 羧基、5 多壁碳纳米管、6 金表面。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法，包括如下步骤：步骤S1，选取带有-COOH修饰的多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；步骤S2，对金电极表面进行清洗和退火；步骤S3，将退火后的金电极与多壁碳纳米管通过吸附作用结合，进行金电极表面功能化，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器；其中所述步骤S3包括在金电极表面功能化后进行羧基的封闭处理。
在本实施例中，具体的，所述多壁碳纳米管与金电极间依靠吸附力结合，所述多壁碳纳米管与DNA探针进行功能化依靠化学键结合，由于氨基尾端修饰的DNA探针易合成且价格较低，选择氨基修饰的特异性DNA探针与带有-COOH修饰的MWCNTs-COOH进行有效结合，优选Sigma的MWCNTs-COOH。
在本实施例中，具体的，所述步骤S2中对金电极表面进行清洗和退火包括：将金电极分别浸泡于乙醇和Milli-Q水中超声波清洗5～10分钟后，用氮气将金电极表面吹干，并将吹干后的金电极在180～190℃炉中退火1～1.5h；通过清洗和退火处理以去除表面的有机化合物，进一步提高传感器的导电性。
在本实施例中，具体的，所述退火的炉火设置条件为流动200/10S CCM的Ag/H2气体。
在本实施例中，具体的，所述步骤S3中将退火后的金电极与多壁碳纳米管通过吸附作用结合，并进行金电极表面功能化包括：将多壁碳纳米管溶解并滴加至金电极上进行结合，得到MWCNTs-COOH功能化的电极；将氨基尾端修饰的DNA探针连接到MWCNTs-COOH的羧基上，得到DNA探针孵育后的金电极；将MWCNTs-COOH上剩余的羟基进行封闭处理，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器。
如图1所示，蓝色的DNA探针通过金电极表面的羧基结合，并与红色的目标核酸一一匹配。
在本实施例中，具体的，所述将多壁碳纳米管溶解并滴加至金电极上进行结合，得到MWCNTs-COOH功能化的电极包括：将1mg MWCNTs-COOH 粉末分别溶于1ml 的N，N-二甲基甲酰胺、Milli-Q水和无水乙醇中制得1mg/ml的MWCNTs-COOH溶液，并分别将15µL的三种溶液滴加至金电极表面，在50℃环境下加热10～15min，用Milli-Q水洗涤5min后用氮气将电极表面吹干，得到MWCNTs-COOH功能化的电极；不同的溶剂会对MWCNTs-COOH与金电极的结合效率产生不同的影响，因此选择3种不同的溶剂分别进行结合。
在本实施例中，具体的，所述将氨基尾端修饰的DNA探针连接到MWCNTs-COOH的羧基上，得到DNA探针孵育后的金电极包括：将10µL浓度为100µM的氨基DNA探针滴在MWCNTs-COOH功能化的电极上，在密封容器内于4℃环境下孵育18～20h，用Milli-Q水洗涤DNA探针孵育后的金电极，并用氮气将电极表面吹干，得到DNA探针孵育后的金电极；利用Milli-Q水洗涤DNA探针孵育后的金电极可去除金电极表面额外的DNA探针。
在本实施例中，具体的，所述将MWCNTs-COOH上剩余的羟基进行封闭处理，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器包括：选取封闭液，其中所述封闭液包括乙醇胺溶液、鲑鱼精子DNA溶液、小牛胸腺DNA溶液、BSA溶液中的任意一种或多种的组合；以及制备浓度为1%的封闭液水溶液并滴加到DNA探针孵育后的金电极上，在室温环境下孵育30min，后在Milli-Q水中洗涤5min，用氮气将电极表面吹干，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器。
在本实施例中，优选的，对多种封闭液进行筛选，经过不同浓度和不同孵育时间的测试后，确定BSA溶液封闭效果最佳，对目标核酸LAMP扩增产物的识别特异性最佳，故实施例中优选BSA溶液作为封闭液。
在本实施例中，具体的，现有的DNA电化学生物传感器往往会采用碳量子点等手段提升传感器的灵敏度，但这些手段并不能从根本问题上解决金电极上存在部分未完全反应的羧基对灵敏度的影响问题，而同时双链结构也可能会与电极修饰中使用到的化学基团如羧基等形成非特异性结合，影响检测准确度；因此本发明中通过选取封闭液设置封闭处理，将这部分羧基进行封闭处理，也避免双链结构与羧基形成非特异性结合，有效提升了传感器的灵敏度，扩大了DNA电化学生物传感器在含双链结构的DNA的LAMP扩增检测中的应用。
又一方面，本发明还提供了一种核酸LAMP扩增产物的检测方法，包括如下步骤：选取基因组DNA作为模板，在65～70℃下LAMP等温扩增25～35min，得到LAMP扩增产物；将LAMP扩增产物 12.5 µL滴加到如前所述方法制备得到的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器上，在室温条件下孵育30min使LAMP扩增产物与DNA探针杂交；将杂交完毕的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器与Autolab电化学工作站的连接线连接，检测电流信号，判断目标核酸产物，得到检测结果。
在本实施例中，具体的，所述电流信号的检测方法包括SWV方波伏安法和差分脉冲伏安法中的任意一种。
实施例
以内参基因Actin，使用人类基因组DNA作为模板。
LAMP等温扩增在65℃条件下反应25分钟。将制备好的LAMP产物12.5uL滴到DNA生物传感器上，并在室温条件下孵育30分钟使LAMP产物与DNA生物传感器上的DNA探针杂交。然后将DNA生物传感器的与Autolab电化学工作站的连接线连接，通过检测电流信号，判断有无目标核酸产物。
如图2所示，测量SWV（方波伏安法）特性，其中1号线和2号线代表Actin的阳性LAMP产物，3号线为未放入人类基因组DNA的LAMP反应产物，即Actin的阴性LAMP产物，由图2可见，阳性LAMP产物产生的电流信号远远大于阴性LAMP产物的电流信号；其中1号样本和2号样本为同一样本在不同试管内进行反应后检测的结果，与阴性样本曲线有明显区别即可。
为进一步验证DNA 传感器的功能，又通过差分脉冲伏安法对Actin的LAMP产物在DNA 生物传感器上的反应进行验证。
如图3所示，在检测差分脉冲伏安法（DPV）特性时，可以看到阳性Actin LAMP产物产生的信号1号线和2号线，明显高于阴性Actin LAMP产物产生的电信号3号线，佐证方波伏安法检测的准确性；其中1号样本和2号样本为同一样本在不同试管内进行反应后检测的结果，与阴性样本曲线有明显区别即可。
第三方面，本发明还提供了一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器，由如前所述的制备方法得到。
综上所述，本发明的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法基于多壁碳纳米管具有突出的导电能力可以极大的促进电子的转移从而增加电信号强度的特点，可提高DNA生物传感器的灵敏度，并配合封闭处理有效封闭未与DNA探针结合的化学基团，极大的提升了DNA生物传感器的特异性，解决了DNA上双链结构与电极修饰中使用到的化学基团可能形成非特异性结合的问题。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (9)
1.一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，选取带有-COOH修饰的多壁碳纳米管MWCNTs-COOH；
步骤S2，对金电极表面进行清洗和退火；
步骤S3，将退火后的金电极与多壁碳纳米管通过吸附作用结合，进行金电极表面功能化，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器；其中
所述步骤S3包括在金电极表面功能化后进行羧基的封闭处理；
所述步骤S3中将退火后的金电极与多壁碳纳米管通过吸附作用结合，进行金电极表面功能化包括：
将多壁碳纳米管溶解并滴加至金电极上进行结合，得到MWCNTs-COOH功能化的电极；
将氨基尾端修饰的DNA探针连接到MWCNTs-COOH的羧基上，得到DNA探针孵育后的金电极；
将MWCNTs-COOH上剩余的羟基进行封闭处理，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤S2中对金电极表面进行清洗和退火包括：
将金电极分别浸泡于乙醇和Milli-Q水中超声波清洗5～10分钟后，用氮气将金电极表面吹干，并将吹干后的金电极在180～190℃炉中退火1～1.5h。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述退火的炉火设置条件为流动200/10S CCM的Ag/H2气体。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述将多壁碳纳米管溶解并滴加至金电极上进行结合，得到MWCNTs-COOH功能化的电极包括：
将1mg MWCNTs-COOH 粉末分别溶于1ml 的N，N-二甲基甲酰胺、Milli-Q水和无水乙醇中制得1mg/ml的MWCNTs-COOH溶液，并分别将15µL的三种溶液滴加至金电极表面，在50℃环境下加热10～15min，用Milli-Q水洗涤5min后用氮气将电极表面吹干，得到MWCNTs-COOH功能化的电极。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述将氨基尾端修饰的DNA探针连接到MWCNTs-COOH的羧基上，得到DNA探针孵育后的金电极包括：
将10µL浓度为100µM的氨基DNA探针滴在MWCNTs-COOH功能化的电极上，在密封容器内于4℃环境下孵育18～20h，用Milli-Q水洗涤DNA探针孵育后的金电极，并用氮气将电极表面吹干，得到DNA探针孵育后的金电极。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述将MWCNTs-COOH上剩余的羟基进行封闭处理，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器包括：
选取封闭液，其中
所述封闭液包括乙醇胺溶液、鲑鱼精子DNA溶液、小牛胸腺DNA溶液、BSA溶液中的任意一种或多种的组合；以及
制备浓度为1%的封闭液水溶液并滴加到DNA探针孵育后的金电极上，在室温环境下孵育30min，后在Milli-Q水中洗涤5min，用氮气将电极表面吹干，得到检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器。
7.一种核酸LAMP扩增产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
选取基因组DNA作为模板，在65～70℃下LAMP等温扩增25～35min，得到LAMP扩增产物；
将LAMP扩增产物 12.5 µL滴加到如权利要求1-6任一项所述方法制备得到的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器上，在室温条件下孵育30min使LAMP扩增产物与DNA探针杂交；
将杂交完毕的检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器与Autolab电化学工作站的连接线连接，检测电流信号，判断目标核酸产物，得到检测结果。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，
所述电流信号的检测方法包括方波伏安法和差分脉冲伏安法中的任意一种。
9.一种检测核酸LAMP扩增产物电化学生物传感器，其特征在于，
由如权利要求1所述的制备方法得到。
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