CN101046461A - 一种电化学传感器及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电化学传感器及其制备方法和用途，将末端羧基化的开口多壁碳纳米管修饰在玻碳电极表面，通过共价修饰法将BCR/ABL的b3－a2型基因作为探针固定到碳纳米管的末端羧基上。通过探针DNA与靶DNA的杂交，选择姜黄素作为杂交指示剂，研究固定在修饰电极上的单链对其互补DNA的识别能力。由于碳纳米管的比表面积大，有利于DNA在电极表面的固定，另外碳纳米管良好的电子传递特性极大地增强了传感器的检测灵敏度。本发明实现了对慢粒融合基因在玻碳电极上的检测。该电化学传感器测定慢性粒细胞白血病基因不仅选择性和灵敏度高，而且实现了对慢性粒细胞白血病的早期诊断。

Description

一种电化学传感器及其制备方法和用途

所属技术领域：

本发明涉及生化工程、传感器和医学诊断技术，特别涉及一种用于慢性粒细胞白血病基因检测的DNA电化学传感器的制备方法和用途。

背景技术：

慢性粒细胞白血病，简称慢粒(chronic myelocytic leukemia，CML)，是伴有获得性染色体异常的多能干细胞水平的恶性病变而引起的一种细胞株病。其临床特征为显著的粒细胞过度生成。慢性粒细胞白血病是严重危害中青年健康的恶性血液病之一，为白血病中较常见的类型。慢性粒细胞白血病起病缓慢，早期常没有任何症状，给临床诊断造成困难。而早期诊断水平将直接影响白血病患者的治疗效果及生存质量，其重要意义不言而喻。

目前慢性粒细胞白血病的临床诊断方法主要包括染色体分析、Southern Blot、RT-PCR及FISH等技术，但这些方法均存在一定的局限性：染色体分析费时费力，且灵敏度低，灵敏度最高达到10^-8mol/L；传统的Southern Blot检测虽特异性强，但对低拷贝基因序列的检测极不灵敏，不仅方法复杂，检测周期长，且价格昂贵兼有放射性污染，限制了临床上的广泛应用；RT-PCR操作繁琐、价格昂贵；FISH技术需要使用复杂的荧光显色系统，且相对灵敏度不高，临床大规模应用亦难以开展。因此开发研究一种简便、快速、准确、灵敏、经济的慢性粒细胞白血病基因检测技术具有极其广阔的应用前景，将有效解决慢性粒细胞白血病早期诊断这一临床迫切的实际问题，无疑具有极其重要的意义。

DNA电化学生物传感器是新近国际热点研究的一类新型DNA生物传感器，它是将单链的DNA(ssDNA)修饰到电极表面，构成探针DNA修饰电极，由于电极上的探针DNA与溶液中的互补链杂交的高度序列选择性，使得该DNA电极具有极强的分子识别能力。DNA探针分子与靶序列杂交，在电极表面形成双链的DNA(dsDNA)，从而导致杂交前后的电极表面结构的改变，这种杂交前后的差异可以通过电活性分子即杂交指示剂来识别，从而达到检测的目的。这种新型DNA电化学生物传感器具有灵敏度高、特异性高、响应快、操作简便、微型化、价格低廉等显著优点，因而在临床基因诊断、新药筛选、环境监测等多个领域具有巨大的潜在应用价值。

现代分子生物学研究表明费城(Ph)染色体为t(9；22)相互易位所致，其易位产物BCR/ABL融合基因发生于95％以上的慢性粒细胞白血病中，是恶性克隆的标志基因。

下面所述的为本发明人率先将具有灵敏、简便、经济等优点的DNA电化学生物传感器用于快速检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因，并首次设计出一种测定慢性粒细胞白血病基因的DNA电化学传感器：将末端羧基化的开口多壁碳纳米管修饰在玻碳电极表面，通过共价修饰法将BCR/ABL的b3-a2型基因作为探针固定到碳纳米管的末端羧基上。通过探针DNA与靶DNA的杂交，选择姜黄素作为杂交指示剂，成功实现了固定在修饰电极上的单链对其互补DNA的识别。由于碳纳米管的比表面积大，有利于DNA在电极表面的固定，另外碳纳米管良好的电子传递特性极大地增强了传感器的检测灵敏度。从而建立了高灵敏度、高特异性的慢性粒细胞白血病基因检测方法。今后，我们将在此新技术成功应用于慢性粒细胞白血病早期诊断的基础上，推广应用于其他类型肿瘤的早期诊断及筛选抗肿瘤新药工作中，因而本发明具有巨大的潜在应用价值和深远的意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能用于慢性粒细胞白血病基因检测的DNA电化学传感器。本发明的另一目的是提供这种传感器的制法和用途。

本发明所述的电化学传感器，包括玻碳电极，其特殊之处在于玻碳电极的表面涂覆有敏感膜。所述的敏感膜由末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)和固定的探针基因组成，所述的探针基因通过其带有的氨基(-NH₂)固定到末端羧基化的开口多壁碳纳米管的末端羧基上。所述的探针基因可采用由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，结构为5′-AGA GTT CAA AAG CCC TTC-3′(BCR/ABL)，其中基因片段5′带有氨基-NH₂，5′-NH₂-AGA GTT CAA AAG CCC TTC-3′是BCR/ABL的b3-a2型基因。

本发明的电化学传感器制备方法，依序包括如下步骤：1)多壁碳纳米管制备末端羧基化的开口多壁碳纳米管：一般先将多壁碳纳米管经HF酸浸泡除去铁等金属催化剂及其他杂质后，在浓硫酸和浓硝酸的混酸体积比例为1∶3中温度为120℃～130℃下回流1～2h，放置过夜，弃上清液，水洗涤至中性，冷冻干燥，即得末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)。2)将末端羧基化的开口多壁碳纳米管修饰在玻碳电极表面：称取适量的末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)，加到适量的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶剂中，超声半小时使其分散均匀，得到0.1mg/ml～10mg/ml的黑色分散液，将此分散液适量滴加到处理好的玻碳电极表面，置于红外灯下，待溶剂挥发完全后即为末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)修饰玻碳电极。3)通过共价修饰法将BCR/ABL的b3-a2型基因作为探针固定到碳纳米管的末端羧基上。

上述的传感器制备方法，将末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)修饰玻碳电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的多壁碳纳米管，再将其浸泡在含有10mmol/L二环己基碳二亚胺量的30mmol/L的pH为4.8的醋酸缓冲溶液中搅拌反应，用醋酸缓冲溶液冲洗后置于含3.5μmol/L探针基因的醋酸缓冲溶液中，室温下搅拌反应，即将末端修饰氨基的b3-a2型基因寡聚核苷酸共价固定于末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)的羧基上。

上述涂覆在玻碳电极表面的末端羧基化的开口多壁碳纳米管溶解在N，N-二甲基甲酰胺溶剂形成的分散液的量为10～50μl。

上述的电化学传感器应用于慢性粒细胞白血病基因的检测。所述的的传感器检测方法，是通过探针DNA与靶DNA的杂交，选择姜黄素作为杂交指示剂，通过固定在修饰电极上的单链成功地对其互补DNA的识别。

本发明电化学传感器为全固态不含对人体有毒、污染环境的材料，稳定性好、灵敏度高、重现性好，抗环境中其它常见离子干扰的能力强，而且传感器便于携带。本发明通过对常规固体电极进行表面分子设计，将具有优良电化学性能的碳纳米管进行修饰使之结合上羧基，并将末端羧基化的开口多壁碳纳米管固定在玻碳电极表面，通过共价修饰法将BCR/ABL的b3-a2型基因作为探针固定到碳纳米管的末端羧基上。通过探针DNA与靶DNA的杂交，选择姜黄素为杂交指示剂，实现了对慢性粒细胞白血病的早期诊断。该方法对特定序列DNA(是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的慢性粒细胞白血病DNA)的最低检测下限为2.0×10^-10g/ml。纳米碳管显著提高了NH₂-DNA在玻碳电极上的共价固定量，并能加快嵌入剂与电极间的电子传递速率，从而提高其对互补序列识别的灵敏度。

本发明的优点：

95％以上的慢性粒细胞白血病中有费城(Ph)染色体，其易位产物BCR/ABL融合基因是恶性克隆的标志基因。选取BCR/ABL的b3-a2型基因作为探针，该型基因在慢性粒细胞白血病(CML)病人中突变率高，用作探针后特异性好。

在玻碳电极表面修饰碳纳米管的优点在于碳纳米管的比表面积大，有利于DNA在电极表面的固定，另外碳纳米管良好的电子传递特性极大地增强了传感器的检测灵敏度。

选择天然活性小分子姜黄素作为杂交指示剂，可以解决一些染料，金属离子配合物作为杂交指示剂时，与单链脱氧核糖核酸ssDNA和双链脱氧核糖核酸dsDNA相结合，只是结合力大小不同，而且容易脱落，不利于检测等缺点。

附图说明：

图1为本发明的电化学传感器的原理和结构示意图。

图2为本发明的多壁碳纳米管经纯化后于端口修饰上羧基的红外表征图。

图3为本发明的b3-a2型基因在修饰电极上的固定表征图。

图4为本发明的电化学信号检测图。

图1中：1为玻碳电极，2为羧基化的多壁碳纳米管，3为探针基因，4为DNA，5为姜黄素。

图3中：玻碳电极(GCE)未修饰和修饰后电化学信号比较：A为未修饰；B为修饰后。

图4中：玻碳电极(GCE)杂交链不同浓度电化学信号A、B、C、D比较。

具体实施方式：

下列结合附图和实施例对本发明进行详细描述：

参见图1，本发明的电化学传感器包括玻碳电极1，表面涂覆有敏感膜。敏感膜由羧基化的多壁碳纳米管2和固定的探针基因3(NH₂-AGA GTT CAA AAG CCC TTC-3′)组成，将固定了探针DNA的玻碳电极浸入含有一定浓度的互补或三碱基错配或不互补DNA4的PBS(磷酸磷酸盐)缓冲溶液中pH 7.0，进行杂交反应。取出电极后浸入含姜黄素5做为指示剂的0.3mol/L PBS(磷酸磷酸盐)缓冲溶液中，让其嵌入到DNA的双螺旋结构中。随后，将该电极用磷酸缓冲溶液清洗三次。再在磷酸缓冲溶液中对电极施加一定的电位，以除去非特异性吸附在电极表面的姜黄素，清洗后即可用于电化学检测。

上述传感器的制备方法

1)羧基化的多壁碳纳米管的制备：将碳纳米管经HF酸浸泡除去催化剂及其他杂质后，在混酸(浓硫酸：浓硝酸)中120℃～130℃下，回流1～2h，放置过夜，弃上清液，水洗涤至中性，冷冻干燥，备用。碳纳米管经HF酸浸泡除去催化剂及其他杂质后，用混酸煮沸处理一定时间，测定其红外光谱.结果如图2所示。随着混酸煮沸处理后.羧基峰(v_-cooH1720cm)逐渐增强，说明混酸的氧化作用确实能产生羧基。

2)多壁碳纳米管(MWNTS)修饰玻碳电极的制备：1～100mg的羧基化的多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)，加入到10～10mL的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中，超声半小时使其分散均匀。将得到的黑色分散液滴加到处理好的玻碳电极表面，置于红外灯下，待溶剂挥发完全后即可。

3)探针和目标DNA的设计探针：探针：NH₂-AGA GTT CAA AAG CCC TTC-3′(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，目标DNA：5′-GAA GGG CTT TTG AACTCT-3′为特定序列DNA(也由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的慢性粒细胞白血病DNA)，将探针溶于ph4.8醋酸缓冲液中制成100μg/ml的探针溶液，将目标DNA溶解于ph7.0Tris-HCL缓冲液中制成100μg/ml的目标DNA溶液。

4)b3-a2型基因在修饰电极上的固定：多壁碳纳米管修饰玻碳电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的碳纳米管。再将其浸泡在含有10mmol/L EDC的30mmol/L的醋酸缓冲溶液中搅拌反应，用醋酸缓冲溶液冲洗后置于含3.5μmol/L NH₂-DNA的醋酸缓冲溶液中，室温下搅拌反应，将末端修饰氨基的b3-a2型基因寡聚核苷酸共价固定于羧基化碳纳米管的羧基上。从实验结果可知(见图附图3)，若电极不经修饰，则单链脱氧核糖核酸/玻碳电极(ssDNA/GCE)电极与玻碳电极(GCE)之间的峰电流差(ΔIp)小；若电极经过修饰，则ΔIp大。这是由于未经修饰的电极表面则是由DNA链中嘌呤环的N原子与其结合，这种结合杂乱无章且固定量变化不定，不利于检测。而修饰上多壁碳纳米管后电极表面，产生-COOH基团，与带氨基的DNA结合更牢固，产生的指示剂还原峰电流增大。

通过以上方法即可得到所需的传感器。

上述电化学传感器用于检测慢性粒细胞白血病基因即慢粒融合基因，具体检测方法为：将固定了探针DNA的玻碳电极浸入含有一定浓度的互补或三碱基错配或不互补DNA4的PBS缓冲溶液中pH 7.0，进行杂交反应。取出电极后浸入含姜黄素5做为指示剂的0.3mol/L PBS缓冲溶液中，让其嵌入到DNA的双螺旋结构中。随后，将该电极用磷酸缓冲溶液清洗三次。再在磷酸缓冲溶液中对电极施加一定的电位，以除去非特异性吸附在电极表面的姜黄素，清洗后即可于磷酸盐缓冲溶液中用示差脉冲伏安法检测。

本发明运用现有技术的示差脉冲伏安法电化学检测技术观察指示剂的氧化还原信号变化。实验结果见附图4，由图可知，一定范围内，随着目的DNA浓度增加，杂交形成的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)量增加，指示剂嵌入增加，峰电流信号线性加大。指示剂姜黄素的峰电位别为-0.0950V。测定的条件：测定介质为PBS缓冲溶液，pH＝7.0；开路富集5分钟。示差脉冲伏安法测定参数：脉冲振幅0.1V；脉冲持续时间40ms。其线性范围为：8.0×10^-9～5.0×10^-6g/ml。回归方程为Y＝5.273X-0.0538(X为互补DNA的浓度，单位：g/ml；Y为姜黄素示差脉冲伏安法(DPV)氧化峰电流，单位：μA，线性相关系数为0.9956，该方法对特定序列DNA的最低检测下限为2.0×10^-10g/ml。纳米碳管能显著提高NH₂-DNA在玻碳电极上的共价固定量，并能加快嵌入剂与电极间的电子传递速率，从而提高其对互补序列识别的灵敏度。

实施例1：一种电化学传感器，包括玻碳电极，玻碳电极的表面涂覆有敏感膜。敏感膜由0.01mg羧基化的的多壁碳纳米管和末端修饰氨基的b3-a2型基因(NH₂-DNA)组成，下述的NH₂-DNA均为末端修饰氨基的b3-a2型基因。

上述电化学传感器的制备方法，将10mg碳纳米管加入10毫升DMF中，超声分散直至得到均一、浅黑色的碳纳米管分散液，将10微升碳纳米管分散液涂覆到玻碳电极表面，红外灯下照烤蒸发溶剂，MWNTS-COOH修饰电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的碳纳米管。再将其浸泡在含有10mmol/L EDC的30mmol/L的醋酸缓冲溶液中搅拌反应，用醋酸缓冲溶液冲洗后置于含3.5μmol/L NH₂-DNA的醋酸缓冲溶液中，室温下搅拌反应，即将末端修饰氨基的b3-a2型基因寡聚核苷酸共价固定于羧基化碳纳米管的羧基上。即得所需传感器。

实例2：一种电化学传感器，包括玻碳电极，玻碳电极的表面涂覆有敏感膜。敏感膜由0.1mg羧基化的的多壁碳纳米管和末端修饰氨基的b3-a2型基因组成。

上述电化学传感器的制备方法，将50mg碳纳米管加入10毫升DMF中，超声分散直至得到均一、浅黑色的碳纳米管分散液，将20微升碳纳米管分散液涂覆到玻碳电极表面，红外灯下照烤蒸发溶剂，MWNTS-COOH修饰电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的碳纳米管。再将其浸泡在含有10mmol/L EDC的30mmol/L的醋酸缓冲溶液中搅拌反应，用醋酸缓冲溶液冲洗后置于含3.5μmol/L NH₂-DNA的醋酸缓冲溶液中，室温下搅拌反应，即将末端修饰氨基的b3-a2型基因寡聚核苷酸共价固定于羧基化碳纳米管的羧基上。即得所需传感器。

实例3：一种电化学传感器，包括玻碳电极，玻碳电极的表面涂覆有敏感膜。敏感膜由0.5mg羧基化的的多壁碳纳米管和末端修饰氨基的b3-a2型基因组成。

上述电化学传感器的制备方法，将100mg碳纳米管加入10毫升DMF中，超声分散直至得到均一、浅黑色的碳纳米管分散液，将50微升碳纳米管分散液涂覆到玻碳电极表面，红外灯下照烤蒸发溶剂，MWNTS-COOH修饰电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的碳纳米管。再将其浸泡在含有10mmol/L EDC的30mmol/L的醋酸缓冲溶液中搅拌反应，用醋酸缓冲溶液冲洗后置于含3.5μmol/L NH₂-DNA的醋酸缓冲溶液中，室温下搅拌反应，即将末端修饰氨基的b3-a2型基因寡聚核苷酸共价固定于羧基化碳纳米管的羧基上。即得所需传感器。

Claims (7)

1.一种电化学传感器，包括玻碳电极，其特征在于：玻碳电极的表面涂覆有敏感膜，所述的敏感膜由末端羧基化的开口多壁碳纳米管和固定的探针基因组成，所述的探针基因通过其带有的氨基(-NH₂)固定到末端羧基化的开口多壁碳纳米管的末端羧基上。

2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于探针基因采用5′-AGA GTT CAAAAG CCC TTC-3′(BCR/ABL)，其中基因片段5′带有氨基(-NH₂)，5′-NH₂-AGA GTT CAAAAG CCC TTC-3′是BCR/ABL的b3-a2型基因。

3.权利要求1所述的电化学传感器制备方法，依序包括如下步骤：1)多壁碳纳米管制备末端羧基化的开口多壁碳纳米管：将多壁碳纳米管在体积比为1∶3浓硫酸和浓硝酸的混酸中，于温度为120℃～130℃下，回流1～2h，放置过夜，弃上清液，水洗涤至中性，冷冻干燥，即得末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)；2)将末端羧基化的开口多壁碳纳米管修饰在玻碳电极表面：称取适量的末端羧基化的开口多壁碳纳米管，加到适量的N，N-二甲基甲酰胺溶剂中，超声半小时使其分散均匀，得到0.1mg/ml～10mg/ml的黑色分散液，将此分散液适量滴加到处理好的玻碳电极表面，置于红外灯下，待溶剂挥发完全后即为末端羧基化的开口多壁碳纳米管修饰玻碳电极；3)通过共价修饰法将BCR/ABL的b3-a2型探针基因固定到碳纳米管的末端羧基上。

4.根据权利要求3所述的电化学传感器制备方法，其特征在于将末端羧基化的开口多壁碳纳米管修饰玻碳电极在乙醇、二次水中充分洗涤除去多余的多壁碳纳米管，再将其浸泡在含有10mmol/L二环己基碳二亚胺量的30mmol/L的PH为4.8的醋酸缓冲溶液中搅拌反应，用醋酸缓冲溶液冲洗后置于含3.5μmol/L探针基因的醋酸缓冲溶液中，室温下搅拌反应，即将末端修饰氨基的b3-a2型基因寡聚核苷酸共价固定于末端羧基化的开口多壁碳纳米管(MWNTS-COOH)的羧基上。

5.根据权利要求3或4所述的的电化学传感器制备方法，其特征在于涂覆在玻碳电极表面的末端羧基化的开口多壁碳纳米管溶解在N，N-二甲基甲酰胺溶剂形成的分散液的量为10～50μl。

6.权利要求1所述的电化学传感器应用于慢性粒细胞白血病基因的检测。

7.权利要求1所述的的电化学传感器检测方法，其特征在于通过探针DNA与靶DNA的杂交，选择姜黄素作为杂交指示剂，通过固定在修饰电极上的单链对其互补DNA的识别。

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