CN1548551A - 肽核酸分子信标探针的设计及其在基因诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

采用人工合成肽核酸(PNA)作为分子信标探针。探针总长度为20－25个碱基，其中与靶DNA特异性互补的碱基数为12－15个。在PNA探针的氨基(－NH₂)端标记FAM等荧光基团(R)，在羧基端标记淬灭基团(Q)DPI₃等。PNA分子信标探针主要用于基于实时定量聚合酶反应(PCR)法的基因分子诊断。PNA探针与核酸形成的杂交链稳定性好，Tm值高，与靶DNA特异性结合的碱基数缩短，显著增加单个碱基突变链与非突变链的Tm值差异。PNA分子信标探针尤其适用于单个碱基的基因突变和单核苷酸多态性(SNP)的检测。

Description

肽核酸分子信标探针的设计及其在基因诊断中的应用

一、技术领域：

生物医学、基因分子诊断技术

二、技术背景：

肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)是一种人工合成的，以多肽样结构作为骨架的核酸类似物。在PNA的分子结构中，其分子骨架由N-(2-氨基乙基)甘氨酸残基单位通过酰胺键连接而成，几种嘌呤和嘧啶碱基通过α-N-羧甲基与多肽样骨架相连。因此，PNA的碱基顺序可以与模板脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的碱基序列完全相同，也遵循碱基互补配对的原则与靶核酸的相应序列互补配对形成杂合链。此外，PNA还有以下几个独特的化学性质：(1)与靶DNA或RNA序列的亲和力强，并且更不容易受杂交液盐离子浓度影响。在同等条件下，PNA/DNA和PNA/RNA杂交链较天然的DNA/DNA和DNA/RNA杂交链更稳定。PNA与DNA和RNA组成的杂交链之间几乎没有静电排斥，链熔解温度(Tm值)增高。以15个碱基对(bp)为例，同等条件下PNA/DNA的Tm值为69℃，而DNA/DNA为54℃，PNA/RNA杂交链的Tm值为72℃，而DNA/RNA的Tm值为54℃。这样单个碱基改变后，杂交链Tm值的差异更显著，用于检测单个碱基突变的灵敏度更高。(2)不为核酸酶和蛋白酶降解。PNA既无磷酸二酯键，也不存在肽键，不能被环境中的核酸酶和蛋白酶降解，稳定性好，贮存期长。(3)能与DNA单链形成(PNA)₂/D三链结构。这样既增加了稳定性，又防止靶DNA的降解。

分子信标(molecular beacon)又称分子灯塔，是一种人工合成的荧光标记寡核苷酸探针，现已广泛用于实时检测聚合酶链反应(PCR)(荧光定量PCR)的产物数量和效率，具有灵敏度高、特异性好，能定性定量的优点。分子信标探针的原理是：探针的两端由5-7个与靶序列无关的互补碱基组成，一端标记报告荧光基团(reporter，R)，另一端标记淬灭基团(quencher，Q)。这样在游离状态下，荧光探针两端互补拆叠成茎环结构(stem-loop structure)。R基团与Q基团在空间上非常接近，此时R基团经激发后发射出的荧光能量被Q基团吸收，不产生荧光信号，表现为荧光淬灭。而当探针与靶DNA杂交后，探针的茎环结构破坏，Q基团离开R基团，经激发后可产生荧光信号。但寡核苷酸分子信标探针不大适合于单个碱基突变和单核苷酸多态性(SNP)的检测。因为为了保证探针在PCR扩增过程中能与靶DNA结合，探针与靶DNA杂交链的Tm值必须大于上下游引物的Tm值，这样，一、二个碱基的错配后，杂交链的Tm值变化较小，因此这种探针很难将突变序列与正常序列区分，

不适合于检测单个碱基突变的应用。而肽核酸探针小于15个bp的Tm值可达72℃，一个碱基的变化Tm值可达15℃。因此肽核酸探针能将单个碱基突变的核酸序列与正常序列相区分。

三、发明内容：

采用肽核酸(PNA)作为分子信标探针用于PCR定量实时检测、特别适合于单个碱基突变和SNP检测。PNA分子信标的制备方法是：在PNA的氨基(NH₂-)端标记荧光基团FAM、TET或TAMRA等不同的荧光素。羧基(-COOH)端标记淬灭基团DPI3。这样在维持PNA/DNA杂交链Tm值与DNA/DNA Tm值相当的前提下，可缩短PNA分子信标探针的长度。通常与靶DNA特异性互补的碱基可缩短至12-15个。这样，PNA探针中一、二个碱基的改变可引起Tm值的显著变化，提高检测单个碱基突变和SNP的灵敏度和稳定性。

Claims (3)

1、人工合成的肽核苷酸(PNA)分子信标探针，探针的长度一般为20-25个碱基，其中两端为4-5个互补碱基，中间隔12-15个与靶DNA序列互补的碱基。

2、PNA探针的氨基端(-NH₂)标记FAM、TET等各种荧光基团(R)，羧基端(-COOH)标记DPI3等淬灭基团。

3、PNA探针应用于基因点突变，单个核苷酸多态性(SNP)及基因的定性、定量检测。