CN103571962A - 一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法 - Google Patents
一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103571962A CN103571962A CN201310573895.3A CN201310573895A CN103571962A CN 103571962 A CN103571962 A CN 103571962A CN 201310573895 A CN201310573895 A CN 201310573895A CN 103571962 A CN103571962 A CN 103571962A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nicking
- template
- polysaccharase
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 100
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title abstract 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title abstract 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 title abstract 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 47
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 47
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 16
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 16
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 claims description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 claims description 9
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 3
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 2
- HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N fenoxycarb Chemical compound C1=CC(OCCNC(=O)OCC)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 HJUFTIJOISQSKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 claims description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 108091091807 let-7a stem-loop Proteins 0.000 description 12
- 108091057746 let-7a-4 stem-loop Proteins 0.000 description 12
- 108091028376 let-7a-5 stem-loop Proteins 0.000 description 12
- 108091024393 let-7a-6 stem-loop Proteins 0.000 description 12
- 108091091174 let-7a-7 stem-loop Proteins 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 6
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- 108091053410 let-7 family Proteins 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 3
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 108091007772 MIRLET7C Proteins 0.000 description 3
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 3
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 3
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 3
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 108091007423 let-7b Proteins 0.000 description 3
- 108091024449 let-7e stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091044227 let-7e-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091071181 let-7e-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091042844 let-7i stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150104425 T4 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000019587 texture Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学核酸检测技术领域，涉及一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，先对目标核酸通过碱基互补配对作用与模板核酸分子进行特异性杂交；再将聚合酶与切刻酶协同循环扩增，不断产生产物一与产物二；然后产物一与模板核酸结合进行循环扩增不断产生产物二；最后将产生的产物二与模板核酸进行杂交，产生信号，在恒温条件下对产生的信号进行检测，实现核酸恒温扩增检测；其检测工艺简单，反应快速，检测时间短，灵敏度高，应用范围广泛。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学核酸检测技术领域，涉及一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法。
背景技术：
核酸检测已经广泛应用于临床诊断，环境监测以及传染疾病的预防与控制等许多方面，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）的高灵敏度使其成为目前使用最广泛的DNA扩增方法，然而现有的常规PCR技术存在如下缺陷：一是需要反复的热变性以解开DNA双链,在应用上依赖于高质量的热循环仪；二是多因素影响扩增效果；三是常引起非特异性扩增；四是扩增反应时间长，需要几个小时，难以在基层推广应用等诸多的缺陷。自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术，链置换扩增反应技术（Stand Displacement Amplification,SDA）由美国BectonDickinson研究中心的Walker等于1992年首次报道，其原理是基于在靶DNA两端带有被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶延伸缺口3’端并替换下一条DNA链，被置换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链；但是链置换扩增技术对于引物和靶序列结合形成5’端有特殊要求；SDA在等温扩增之前需要一个加热变性打开双链的步骤，由于Klenow Fragment exo-无热稳定性，必须在靶DNA变性后才能加入到体系中，容易引起污染；依赖解旋酶恒温基因扩增技术（Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification,HAD）是由美国New England Biolabs的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制发明的一种新的体外恒温基因扩增技术，HDA法的原理是先用解旋酶解开双链DNA，再依靠单链DNA结合蛋白（SSB）与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性；引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶催化下扩增，新生成的dsDNA产物作为底物进人下一轮扩增，虽然HDA克服了PCR反应的反复变温过程，但是HDA反应系统反应成分复杂，HDA的反应体系由A和B两个部分组成，A部分含模板、引物、ddH20、缓冲液；B部分由大肠杆菌UurD解旋酶、SSB（T4基因32蛋白或RB49基因32蛋白）、dNTP、MutL、DNA聚合酶和缓冲液组成，造成反应成本高；环介导的恒温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP）是2000年由Notomi等建立了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，该技术是用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现DNA的快速等温扩增，该方法虽说扩增效率高，特异性强，但是该方法对引物设计的要求特别高，扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断；滚环扩增（Rolling CircleAmplification,RCA）是于恒定温度下以单链环状DNA为模板，在有强链置换活性的Phi29DNA聚合酶作用下，通过引物与模板环退火而进行的滚环式DNA合成，RCA极高的扩增效率使其可成为信号放大的手段，但是在RCA反应过程中未成环的锁式探针和未结合探针的模板DNA或者RNA可能产生一些背景信号。1996年Tyagi和Kramer首次建立了分子信标探针，分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定、甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。2009年，Kemin Wang利用分子信标进行核酸检测，其利用目标核酸打开分子信标，引发引物在打开的分子信标进行延伸扩增，该方法是线性扩增，扩增效率不高，灵敏度不高；2009年，Ashley R Connolly也利用分子信标进行核酸检测，其在分子信标上加入了一个切刻酶位点，引发指数反应，但是其反应体系中需要加入引物，引物的存在容易导致不可避免的非特异性扩增，背景较高，灵敏度也不高。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，利用切刻酶聚合酶协同进行链置换反应，建立一种新的快速高灵敏的核酸信号扩增检测方法。
为了实现上述目的，本发明的具体检测过程包括以下步骤：
（1）、目标核酸与模板核酸的杂交互补：先对目标核酸通过碱基互补配对作用与模板核酸分子进行特异性杂交；
（2）、聚合酶与切刻酶协同循环扩增：聚合酶结合到目标核酸的3’端，以模板核酸为模板延伸目标核酸形成双链，切刻酶作用于该双链的切刻位点处，进行切刻，形成切口，聚合酶结合到该切口处，进行延伸链置换，聚合酶与切刻酶协同循环扩增，不断产生产物一与产物二；
（3）、产物一与模板核酸结合进行循环扩增：将形成的产物一与模板核酸进行杂交，聚合酶以产物一3’端为起点，以模板核酸为模板进行聚合延伸，切刻酶作用于延伸形成的切刻位点处，进行切刻，形成切口，聚合酶再结合到切刻酶切刻形成的切口处，进行延伸链置换，聚合酶与切刻酶协同循环扩增，不断产生产物二；
（4）、信号检测：将步骤（2）和步骤（3）分别产生的产物二与模板核酸进行杂交，产生信号，在35-40℃恒温条件下通过荧光检测装置对产生的信号进行检测，实现核酸恒温扩增检测；所述荧光检测装置为荧光分光光度计或实时荧光热循环仪。
本发明所述的扩增为非线性级联扩增，结果表现为类指数形式；所述的核酸为DNA或者RNA。
本发明所述的目标核酸与模板核酸互补是指目标核酸的3’端与模板完全互补，5’端完全或者不完全与模板核酸互补；或者目标核酸带有切刻酶位点，与模板核酸中的下游切刻位点互补，目标核酸的3’端与模板完全互补，或者目标核酸的3’端与模板不完全互补，切刻酶切刻后形成的3’端与模板完全互补，目标核酸5’端完全或者不完全与模板核酸互补；目标核酸的3’端与模板核酸结合后不翘起，使聚合酶能够结合上。
本发明所述的模板核酸结构为线性结构核酸，或为茎环结构的核酸或者修饰荧光基团与猝灭基团的分子信标，分子信标的一端标记荧光基团，荧光基团为FAM，HEX，TET，JOE，TAMRA，Cy5或者Cy3以及其它类似的荧光基团中的一种；分子信标的另一端标记猝灭基团，猝灭基团选自DABCYL，ECLIPSE，TAMRA或BHQ以及其它类似的荧光猝灭基团中的一种；分子信标有两个或者两个以上切刻酶位点。
本发明形成的产物一能够与分子信标结合，聚合酶能够在产物一的3’端延伸；产物二能够与模板核酸稳定结合。
本发明所述的切刻酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII或者其他类似的切刻内切酶中的一种；聚合酶具有链置换活性，选自9°NmTmDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，大片段、Bsu DNA聚合酶，大片段、Deep VentRTm DNA聚合酶、Deep VentRTm（exo-）DNA聚合酶、Klenow片段3’-5’exo-、DNA聚合酶I，(Klenow)大片段、M-MuLV反转录酶、phi29DNA聚合酶、
DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶或其他类似的聚合酶中的一种；步骤（4）产生的信号为分子信标发出的荧光信号、核酸嵌插染料的信号或者类似的核酸信号。
本发明与现有技术相比，只需一个分子信标就可以进行检测，避免多引物存在下的相互干扰或者由此引起的不可避免的背景问题；分子信标结构简单，切刻酶位点位于分子信标上，避免待检的目标核酸也需要切刻酶位点；其检测工艺简单，反应快速，检测时间短，灵敏度高，应用范围广泛。
附图说明：
图1为本发明涉及的双切刻酶位点介导的核酸扩增基本原理图。
图2为本发明涉及的目标核酸与模板核酸结合示意图。
图3为本发明涉及的模板核酸结构示意图。
图4为本发明涉及的实施例1检测结果荧光信号图。
图5为本发明涉及的实施例1检测结果电泳图。
图6为本发明涉及的实施例2检测结果图。
图7为本发明涉及的实施例3检测结果图。
图8为本发明涉及的实施例4检测结果图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图作进一步说明。
实施例1：验证方法的可行性及其原理的正确性。
本实施例利用人工合成的microRNA Let-7a作为靶标核酸，利用分子信标作为模板核酸，通过荧光信号和电泳结果验证方法的可行性和原理的正确性，反应条为双切刻酶位点介导的分子信标恒温扩增系统组成为200nM的分子信标（序列为：5’-FAM-AGGTAGTAGCCATCCTCAGCACTCCGAATCCTCAGCAAACTATACAACCTA
CTACCT-DABCYL-3’即SEQ ID NO.1），1×NEB CutSmartTMBuffer（50mM Potassium Acetate20mM Tris-acetate10mM MagnesiumAcetate100μg/ml BSA pH7.925℃），0.1U/μL聚合酶Klenow片段(3′→5′exo-)，0.2U/μL切刻酶Nb.BbvCI，dNTPs100μM，向该体系分别加入1×10-7M、1×10-9M靶目标let-7a（序列为5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’即SEQ ID NO.2），利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，反应30分钟，非变性聚丙烯酰胺电泳胶浓度17.5%，电压135V，电泳75分钟，EB染色；检测结果如图4和图5所示，图4中A、B、C反应体系都含有200nM分子信标，1nM的Let-7a，图中A曲线体系加入了聚合酶和切刻酶，图中B曲线只加入了聚合酶，图中C曲线只加入了切刻酶。图5中泳道M代表20bp DNA Marker；泳道1只有200nM的分子信标；泳道2含有200nM的分子信标，100nM的Let-7a还加入了切刻酶；泳道3含有200nM的分子信标，100nM的Let-7a还有聚合酶；泳道4含有200nM的分子信标，1nM的Let-7a，还有切刻酶和聚合酶，反应20min；泳道5含有200nM的分子信标，1nM的Let-7a，还有切刻酶和聚合酶，反应30min，图4中的荧光信号结果表明，只有聚合酶切刻酶共同作用时信号才会迅速增长，图5中的电泳结果表明，聚合酶切刻酶共同作用，产生了目标产物；电泳图和荧光信号图表明了方法原理的正确性和可行性。
实施例2：利用双切刻酶位点介导的分子信标恒温扩增检测方法检测人工合成的寡聚核苷酸片段。
本实例检测不同浓度的人工合成的microRNA Let-7a，验证核酸检测方法的灵敏度，双切刻酶位点介导的分子信标恒温扩增系统组成为200nM的分子信标（SEQ ID NO.1），1×NEB CutSmartTMBuffer，0.1U/μL聚合酶Klenow片段(3′→5′exo-)，0.2U/μL切刻酶Nb.BbvCI，dNTPs100μM，向该体系分别加入5×10-9M、1×10-9M、5×10-10M、1×10-10M、5×10-11M、1×10-11M、1×10-13M、1×10-15M、1×10-17M及0M的靶目标（SEQ ID NO.2），利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，反应85分钟；结果如图6所示，浓度梯度从左到右依次递减，图6的结果表明，本方法能够检测到1×10-17M的Let-7a。
实施例3：利用双切刻酶位点介导的分子信标恒温扩增检测方法实现靶标的特异性检测。
本实施例检测与靶核酸序列存在不同位置有一个或多个碱基差异的四条人工合成的let-7家族序列（let-7b：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-3’，即SEQ ID NO.3;let-7c：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’，即SEQ ID NO.4;let-7e：5’-UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU-3’，即SEQ ID NO.5;let-7i：5’-UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU-3’即SEQ ID NO.6;）,各let-7家族序列与实施例1中的靶核酸序列在不同的位置有一个或多个碱基差异,用来考察本发明的方法检测核酸时区分碱基差异的能力。
本实施例的双切刻酶位点介导的分子信标恒温扩增系统组成为200nM的分子信标（SEQ ID NO.1），1×NEB CutSmartTMuffer，0.1U/μL聚合酶Klenow片段(3′→5′exo-)，0.2U/μL切刻酶Nb.BbvCI，dNTPs100μM，向该体系分别加入1×10-9M的靶目标（SEQ ID NO.2）及碱基差异的其他let-7家族序列，利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，反应60分钟。
本实施例的检测结果如图7所示，图7中A、B、C、D、E曲线结果分别对应着let-7a、let-7e、let-7c、let-7b、let-7i体系，结果表明，本专利提供的核酸检测方法能够实现对不同碱基差异的let-7家族进行区分检测，碱基差异越靠近3’端，碱基差异个数越多，检测结果差异越大，说明本专利具有极高的检测特异性。
实施例4：检测在复杂RNA体系环境下，本方法的抗背景干扰检测靶核酸的能力。
本实例检测在含有人肺癌细胞H1299总RNA复杂体系下，本方案的抗背景干扰能力，双切刻酶位点介导的分子信标恒温扩增系统组成为200nM的分子信标（SEQ ID NO.1），1×NEB CutSmartTMBuffer，0.1U/μL聚合酶Klenow片段(3′→5′exo-)，0.2U/μL切刻酶Nb.BbvCI，dNTPs100μM，6ng/μL的人肺癌细胞H1299的总RNA，向该体系分别加入1×10-9M、5×10-10M、1×10-10M、0M的靶目标（SEQID NO.2），利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，反应60分钟。
本实施例的检测结果如图8所示，图8中A、B、C、D曲线结果分别对应着浓度含有let-7a浓度分别为1×10-9M、5×10-10M、1×10-10M、0M的反应体系，检测结果表明，在6ng/μL的人肺癌细胞H1299的总RNA的复杂体系下，不同浓度的靶目标浓度也能很好地区分出来，抗复杂体系下的干扰能力较强。
本实施例涉及的200nM的分子信标即SEQ ID NO.1(5’-3’)的序列为：
AGGTAGTAGCCATCCTCAGCACTCCGAATCCTCAGCAAACTATACAACCTACTACCT，其中下划线为切刻酶位点，斜体为互补配对碱基；SEQ ID NO.2(5’-3’)即let-7a的序列为：
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU；
SEQ ID NO.3(5’-3’)即let-7b的序列为：
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU；
SEQ ID NO.4(5’-3’)即let-7c的序列为：
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU；
SEQ ID NO.5(5’-3’)即let-7e的序列为：
UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU；
SEQ ID NO.6(5’-3’)即let-7i的序列为：
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU；其中粗斜体为差异性碱基。
Claims (7)
1.一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于具体检测过程包括以下步骤：
（1）、目标核酸与模板核酸的杂交互补：先对目标核酸通过碱基互补配对作用与模板核酸分子进行特异性杂交；
（2）、聚合酶与切刻酶协同循环扩增：聚合酶结合到目标核酸的3’端，以模板核酸为模板延伸目标核酸形成双链，切刻酶作用于该双链的切刻位点处，进行切刻，形成切口，聚合酶结合到该切口处，进行延伸链置换，聚合酶与切刻酶协同循环扩增，不断产生产物一与产物二；
（3）、产物一与模板核酸结合进行循环扩增：将形成的产物一与模板核酸进行杂交，聚合酶以产物一3’端为起点，以模板核酸为模板进行聚合延伸，切刻酶作用于延伸形成的切刻位点处，进行切刻，形成切口，聚合酶再结合到切刻酶切刻形成的切口处，进行延伸链置换，聚合酶与切刻酶协同循环扩增，不断产生产物二；
（4）、信号检测：将步骤（2）和步骤（3）分别产生的产物二与模板核酸进行杂交，产生信号，在35-40℃恒温条件下通过荧光检测装置对产生的信号进行检测，实现核酸恒温扩增检测。
2.根据权利要求1所述的多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于所述的扩增为非线性级联扩增，结果表现为类指数形式；所述的核酸为DNA或者RNA。
3.根据权利要求1所述的多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于所述的目标核酸与模板核酸互补是指目标核酸的3’端与模板完全互补，5’端完全或者不完全与模板核酸互补；或者目标核酸带有切刻酶位点，与模板核酸中的下游切刻位点互补，目标核酸的3’端与模板完全互补，或者目标核酸的3’端与模板不完全互补，切刻酶切刻后形成的3’端与模板完全互补，目标核酸5’端完全或者不完全与模板核酸互补；目标核酸的3’端与模板核酸结合后不翘起，使聚合酶能够结合上。
4.根据权利要求1所述的多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于所述的模板核酸结构为线性结构核酸，或为茎环结构的核酸或者修饰荧光基团与猝灭基团的分子信标，分子信标的一端标记荧光基团，荧光基团为FAM，HEX，TET，JOE，TAMRA，Cy5或者Cy3以及其它类似的荧光基团中的一种；分子信标的另一端标记猝灭基团，猝灭基团选自DABCYL，ECLIPSE，TAMRA或BHQ以及其它类似的荧光猝灭基团中的一种；分子信标有两个或者两个以上切刻酶位点。
5.根据权利要求1所述的多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于形成的产物一能够与分子信标结合，聚合酶能够在产物一的3’端延伸；产物二能够与模板核酸稳定结合。
6.根据权利要求1所述的多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于所述的切刻酶选自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII或者其他类似的切刻内切酶中的一种；聚合酶具有链置换活性，选自9°NmTmDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，大片段、Bsu DNA聚合酶，大片段、Deep VentRTm DNA聚合酶、Deep VentRTm（exo-）DNA聚合酶、Klenow片段3’-5’exo-、DNA聚合酶I，(Klenow)大片段、M-MuLV反转录酶、phi29DNA聚合酶、
DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶或其他类似的聚合酶中的一种；步骤（4）产生的信号为分子信标发出的荧光信号、核酸嵌插染料的信号或者类似的核酸信号。
7.根据权利要求1所述的多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法，其特征在于所述荧光检测装置为荧光分光光度计或实时荧光热循环仪。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310573895.3A CN103571962B (zh) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | 一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310573895.3A CN103571962B (zh) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | 一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103571962A true CN103571962A (zh) | 2014-02-12 |
| CN103571962B CN103571962B (zh) | 2015-06-10 |
Family
ID=50044670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310573895.3A Active CN103571962B (zh) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | 一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103571962B (zh) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105176971A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-12-23 | 青岛科技大学 | Bst DNA聚合酶在RNA扩增中的应用 |
| CN108064312A (zh) * | 2014-12-24 | 2018-05-22 | 雅培实验室 | 基于具有靶扩增的信号放大dna级联反应的检测方法 |
| CN108913736A (zh) * | 2018-07-10 | 2018-11-30 | 中国海洋大学 | 单链寡核苷酸的制备方法 |
| CN110157777A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-23 | 福州大学 | 一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法 |
| CN110408678A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-11-05 | 宁儿医院股份有限公司 | 单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法 |
| WO2020168710A1 (zh) * | 2019-02-18 | 2020-08-27 | 华东理工大学 | 一种基于Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法及试剂盒 |
| CN112695076A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-04-23 | 青岛农业大学 | 一种核酸恒温扩增定量检测方法 |
| CN112941154A (zh) * | 2021-02-21 | 2021-06-11 | 中南大学 | 一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应用和试剂盒 |
| CN113624980A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-09 | 四川大学华西医院 | 基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法及试剂盒 |
| CN113736858A (zh) * | 2020-05-28 | 2021-12-03 | 香港科技大学 | 一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101368209A (zh) * | 2008-09-12 | 2009-02-18 | 青岛科技大学 | 一种基于核酸适体和pcr扩增来检测目标分子的方法 |
| US8017328B2 (en) * | 2008-11-21 | 2011-09-13 | Agilent Technologies, Inc. | Genome partitioning using a nicking endonuclease |
| CN103088128A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-08 | 华中科技大学 | 一种microRNA的二次循环扩增检测方法及试剂盒 |
| CN103215366A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-07-24 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 基于核酸酶和发夹dna探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法 |
-
2013
- 2013-11-18 CN CN201310573895.3A patent/CN103571962B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101368209A (zh) * | 2008-09-12 | 2009-02-18 | 青岛科技大学 | 一种基于核酸适体和pcr扩增来检测目标分子的方法 |
| US8017328B2 (en) * | 2008-11-21 | 2011-09-13 | Agilent Technologies, Inc. | Genome partitioning using a nicking endonuclease |
| CN103088128A (zh) * | 2013-01-09 | 2013-05-08 | 华中科技大学 | 一种microRNA的二次循环扩增检测方法及试剂盒 |
| CN103215366A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-07-24 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 基于核酸酶和发夹dna探针的等温信号扩增的多重基因分型的检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CUIPING MA,ET AL: "A new isothermal nucleic acid detection strategy mediated by a double-nicked beacon", 《CHEM. COMMUN》, vol. 50, 17 February 2014 (2014-02-17), pages 3799 - 3801 * |
| CUIPING MA,ET AL: "Cocaine detection via rolling circle amplification of short DNA strand separated by magnetic beads", 《BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS》, vol. 26, 6 January 2011 (2011-01-06), pages 3309 - 3312, XP028148416, DOI: doi:10.1016/j.bios.2011.01.003 * |
| YOSSI WEIZMANN,ET AL: "A virus spotlighted by an autonomous DNA machine", 《ANGEW. CHEM. INT. ED》, vol. 45, 11 October 2006 (2006-10-11), pages 7384 - 7388 * |
| 郭秋平: "荧光信号放大检测技术在生物大分子检测中的研究和应用", 《中国博士论文全文数据库工程科技I辑》, 15 May 2013 (2013-05-15), pages 014 - 82 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108064312A (zh) * | 2014-12-24 | 2018-05-22 | 雅培实验室 | 基于具有靶扩增的信号放大dna级联反应的检测方法 |
| CN105176971A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-12-23 | 青岛科技大学 | Bst DNA聚合酶在RNA扩增中的应用 |
| CN108913736A (zh) * | 2018-07-10 | 2018-11-30 | 中国海洋大学 | 单链寡核苷酸的制备方法 |
| CN108913736B (zh) * | 2018-07-10 | 2021-08-24 | 中国海洋大学 | 单链寡核苷酸的制备方法 |
| WO2020168710A1 (zh) * | 2019-02-18 | 2020-08-27 | 华东理工大学 | 一种基于Cas9切口酶偶联DNA聚合酶的恒温核酸检测分析方法及试剂盒 |
| CN110157777A (zh) * | 2019-05-27 | 2019-08-23 | 福州大学 | 一种基于发卡结构变换的放大型荧光生物传感器及制备方法 |
| CN110408678A (zh) * | 2019-07-26 | 2019-11-05 | 宁儿医院股份有限公司 | 单管型多重微生物检测体系及其即时检测方法 |
| CN113736858A (zh) * | 2020-05-28 | 2021-12-03 | 香港科技大学 | 一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法 |
| CN113736858B (zh) * | 2020-05-28 | 2024-05-10 | 香港科技大学 | 一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法 |
| CN112695076A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-04-23 | 青岛农业大学 | 一种核酸恒温扩增定量检测方法 |
| CN112941154A (zh) * | 2021-02-21 | 2021-06-11 | 中南大学 | 一种分子信标探针及其在制备检测circBART2.2制剂中的应用和试剂盒 |
| CN113624980A (zh) * | 2021-08-09 | 2021-11-09 | 四川大学华西医院 | 基于识别诱导的恒温扩增技术对蛋白质进行检测的方法及试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103571962B (zh) | 2015-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103571962B (zh) | 一种多切刻酶位点介导的核酸恒温扩增检测方法 | |
| CN104164488B (zh) | 一种单引物引发的核酸恒温扩增方法 | |
| CN100489112C (zh) | 切口酶扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用 | |
| JP5068175B2 (ja) | プライマー生成ローリングサークル型増幅 | |
| CN103789435B (zh) | 一种基于级联恒温扩增的miRNA荧光检测试剂盒及方法 | |
| EP2789689B1 (en) | Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same | |
| Chang et al. | Novel biosensing methodologies for improving the detection of single nucleotide polymorphism | |
| KR102592367B1 (ko) | 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 | |
| CA2800637C (en) | Method of dna sequencing by polymerisation | |
| CN107446919B (zh) | 一种恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒 | |
| CN102827922B (zh) | 级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法 | |
| CN103108961A (zh) | 使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增 | |
| JP2016537990A (ja) | 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法 | |
| CN105821138A (zh) | 一种基于连接反应构建双茎环结构dna模板检测核酸的方法 | |
| KR20050050390A (ko) | 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법 | |
| CN105803074A (zh) | 一种被双向链置换的引物型核酸荧光探针 | |
| CN110536968A (zh) | 两部分式中介探针 | |
| CN102719550A (zh) | 一种基于分裂锁式探针的多重rca方法 | |
| CN101974638B (zh) | 连接反应偶联核酸侵入反应与切刻内切酶反应的核酸信号扩增检测方法 | |
| KR102098710B1 (ko) | 헤어핀 프로브 기반 등온 핵산 증폭을 이용한 표적핵산 검출 방법 | |
| CA2810856C (en) | Compositions and methods for quantifying a nucleic acid sequence in a sample | |
| CN109097448A (zh) | 一种基于解旋酶和切刻酶的等温扩增核酸检测方法及试剂盒 | |
| Xu et al. | Dual-cyclical nucleic acid strand-displacement polymerization based signal amplification system for highly sensitive determination of p53 gene | |
| US20110294125A1 (en) | Colorimetric biosensor with allosteric dnazyme activation and rolling circle signal amplification | |
| CN113481283A (zh) | 等温扩增核酸靶序列的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160615 Address after: 266061 Shandong Province, Qingdao city Laoshan District Songling Road No. 99 Patentee after: QINGDAO AIFE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Address before: 266061 Shandong Province, Qingdao city Laoshan District Songling Road No. 99 Patentee before: Qingdao University of Science & Technology |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180329 Address after: 266000 Shandong province Qingdao City, Shandong Road No. 171 room 702 B Patentee after: Qingdao Snyder Biological Technology Co. Ltd. Address before: 266061 Shandong Province, Qingdao city Laoshan District Songling Road No. 99 Patentee before: QINGDAO AIFE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |