CN102719550A

CN102719550A - 一种基于分裂锁式探针的多重rca方法

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Publication number: CN102719550A
Application number: CN2012102377588A
Authority: CN
Inventors: 向阳; 黄庆; 府伟灵
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2012-10-10

Abstract

一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，新型分裂锁式探针长约90bp左右，包括4个部分，即检测臂、通用引物区、的HhaI内切酶位点、标签序列区；其扩增系统由连接体系和RCA体系两部分组成，具体检测方法为，首先进行连接反应：将靶序列DNA片段与终浓度为1mol/L的四种分裂锁式探针混合，煮沸变性后杂交15min，加入T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液，补足10uL反应体系，37℃，45min，exonucleaseI和exonuclease III外切，制备出环状模板，然后RCA反应：将10μL连接产物和通用引物混合煮沸变性后，分别加入dNTP，phi29DNA聚合酶和HhaI限制性内切酶和缓冲液，共20μL反应体系，置于37℃，60min；最后对携带特异性标签序列的RCA单链DNA产物检测，根据结果得出相应的实验结论。

Description

一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法

技术领域

本发明涉及一种分子探针的RCA方法，具体说是一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法。

背景技术

锁式探针（padlock probes）也称为环式寡核苷酸探针（circularizingoligonucleotide probes，OCP），是一种能满足生命科学需要的敏感、准确、特异的分子诊断方法。滚环放大扩增（rolling circle amplification，RCA）是模仿噬菌体感染细菌后进行自我复制形式的一种扩增方法，这种复制形式可在恒温下对环状单链DNA进行相对无限单链扩增。在一定条件下，我们利用锁式探针形成的环状单链DNA，对其进行滚环复制，从而实现在恒温条件下的核酸扩增。近年来在一些基因检测技术研究中被广泛采用,并将与之有关的技术统称为滚环放大技术。

核酸连接检测（Oligo ligation assay，OLA）用于点突变和SNP（单核苷酸多态性）的检测，其特异性是由连接酶的高特异性决定的。当检测的DNA或者RNA样本中含有与两条相邻的直链探针（即探针两端的检测臂）互补的靶序列时（突变靶点即在两段探针相邻处，突变靶点互补碱基位于等位特异性探针3′上），T4连接酶或E.coli连接酶在37℃恒温条件下可将杂交在DNA或者RNA样本上相邻的两条探针间的切口连接起来。然后利用线性RCA的放大作用，将这一点突变的特异信号扩增放大，然后通过生物传感器（表面等离子体共振传感器）等检测手段进行突变位点的无标记检测。

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是一种恒温的核酸扩增方法。是模拟噬菌体感染细菌后进行自我复制普遍采取的一种形式，因为滚环复制的模板必须是封闭的单链环状DNA，我们将这种特性用于单核苷酸的检测研究中，与核酸连接检测（OLA）和生物传感器相结合，在具有链置换活性的DNA多聚酶（phi29DNA polymerase）作用下，将滚环的无限复制作为一种信号放大系统。

目前常用的点突变检测技术主要有序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR-SSP）法，该方法是针对等位基因设计特异性引物，仅扩增突变基因而不扩增其他等位基因，扩增产物仍需凝胶电泳检测以判断有无扩增，或者荧光等标记以判断扩增。对引物设计要求较高，多位点要设计多重引物，需要对不同反应进行条件优化；对空气中DNA气溶胶污染比较敏感，易造成假阳性或假阴性；对少量样品的多位点分型特别是低频率位点的特异性较低。单链构象多态性（SSCP），该方法是基于相同长度的单链DNA碱基顺序或单碱基差异所形成的空间构想不同，导致凝胶电泳速度不同以检测。缺陷：需PCR扩增后电泳，对仪器条件要求较高；不能检测变异的位置；随DNA片段长度增加，检测的敏感性降低；假阴性高；对AT检出率无CG好，有局限性。限制性片段长度多态性（RFLP），该方法是需要和PCR技术联合应用（PCR扩增目的基因→限制性内切酶酶切目的基因片段→电泳分离）。缺陷：序列多态性座位中大约只有1/3的碱基涉及限制酶识别序列，对多位点检测的范围有限；限制酶消化条件较高，步骤繁琐。测序技术（sequencing）该方法是多重PCR扩增含有检测位点的区域→分离PCR产物并变性为单链座位延伸反应的模板进行单链延伸→电泳分离延伸产物或者通过荧光等标记方法检测。缺陷：成本较高，耗时较长。

发明内容

本发明提供了一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，该方法是综合锁式探针技术和滚环复制的原理发明的一种新型的检测特定DNA序列的方法。使用该方法检测特定的DNA序列不需要设计特定的引物，通用引物即可实现扩增，反应过程不需要反复的升温降温，操作方便，特异性强，其扩增产物含有设计好的标签探针序列，可直接采用基因芯片进行检测。

本发明中的新型分裂锁式探针（cleavable padlock probes，c-PLPs）长约100bp，其结构如图1，包括4个部分：

1）检测臂：探针的5′端和3′端为检测臂，检测臂与靶序列完全互补，只有当与靶序列完全碱基互补结合时，才可在连接酶作用下使探针两端连接环化；

2）通用引物区：探针的引物结合区为滚环扩增的通用引物区，实现混合靶序列的多重滚环扩增；

3）酶切区域：探针右侧的酶切区域包含一个硫代磷酸化的HhaI内切酶位点，生成的单链产物携带该位点，将在扩增的同时被HhaI内切酶切成与环状探针相同大小的单链DNA片段产物，而探针本身由于硫代磷酸化的保护而不会被酶切，从而始终作为模板进行复制；

4）特异性标签序列：探针左侧的标签序列区使RCA单链DNA产物带有各自的特异性标签序列，可与芯片表面固定的互补标签序列探针特异性碱基互补结合，实现多重扩增产物的特异性检测，部分特异性标签序列如序列表序列1-序列表序列9，其特性参数如表1。

表1特异性标签序列特性参数表

标签序列	溶解温度（Tm值；℃）	G+C含量（GC%）
			序列表序列1	63.6	60
序列表序列2	61.9	60
			序列表序列3	62.9	60
序列表序列4	60.4	60
			序列表序列5	58.1	60
序列表序列6	60.6	60
			序列表序列7	66.1	60
序列表序列8	63.5	60
			序列表序列9	60.6	60

本发明一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法的反应原理：

滚环放大扩增（rolling circle amplification，RCA）是模仿噬菌体感染细菌后进行自我复制形式的一种扩增方法，这种复制形式可在恒温下对环状单链DNA进行相对无限单链扩增，其扩增模型如图2。

该反应原理是在滚环扩增的同时，反应体系中的限制性内切酶HhaI对生成的单链产物进行酶切，生成与环状探针相同大小的单链DNA片段产物，产物携带的标签序列可直接与芯片表面的标签互补探针杂交。分裂锁式探针不但可实现恒温扩增DNA还可实现恒温扩增RNA，反应条件温和，其灵敏度能达到1个拷贝的核酸分子。

由于锁式探针和靶序列的杂交会产生较为稳定的拓扑结构，因而也保证了环化探针的稳定性。环化的锁式探针可通过通用引物进行滚环扩增，实现靶信号的放大以及多元检测。反之，如果体系中不存在需要检测的靶序列，线性锁式探针就不会被连接酶连接成环化的锁式探针，也就不会被通用引物扩增，其检测模式图如图3所示。

本发明一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其扩增系统由两部分组成：

连接体系：靶序列，C-PLPs探针，T4DNA连接酶。

RCA体系：成环C-PLPs探针，通用引物（其碱基序列如序列表序列10），phi29DNA聚合酶，HhaI限制性内切酶，dNTP。

选用T4DNA连接酶，因为不仅它可以连接DNA-DNA双链缺口也可以连接DNA-RNA双链缺口（即靶序列可以是DNA或者RNA）。

选用phi29DNA聚合酶是因为它具有很高的链置换活性，无须模板分离就可进行70kb的链置换DNA合成，且性能稳定，持续合成能力强，可持续数小时高效催化DNA合成，DNA链合成速度为1000nt/min，靶基因的放大效率在10⁵倍以上。此外，该聚合酶的纠错能力强，错误率显著低于Taq DNA聚合酶。

选用HhaI限制内切酶是因为它能够识别并特异性切割含有GCGC序列的单链核酸链，而其他大多数限制性内切酶仅对双链DNA具有内切能力，HhaI对单链DNA链的内切效率为双链的60%

一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，具体操作步骤：

步骤一、连接反应：将靶序列DNA片段（1pmoL）与终浓度为0.1μmol/L的四种分裂锁式探针混合煮沸变性后，立即置于冰上冷却5min，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，连接反应时间为45min，再加入10U exonucleaseI和10U exonuclease III，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/LMgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤二、滚环扩增反应（RCA）反应：取步骤一制得的混合连接产物10μL，与通用引物（其碱基序列如序列表序列10）混合煮沸变性后，分别加入dNTP（10mmol/L）2μL，phi29DNA聚合酶10U，HhaI限制性内切酶10U和由33mmol/L tris-Ac、10mmol/L MgAC₂、6mmol/L KAC和0.1μg/μL BSA组成的缓冲液2μL，去离子水补足20uLRCA反应体系，温度37℃，反应时间60min；

步骤三、RCA单链DNA产物检测：RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳（SYBRGreen II染色）、RCA单链产物测序确定、荧光定量检测RCA扩增产物或表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。

有益效果

1、高特异性本发明利用寡核苷酸连接检测（Oligo LigationAssay，OLA）的特异性和C-PLPs的特殊结构：C-PLPs探针3′端与5′端的连接，需要相邻位置的识别序列与靶序列碱基完全配对，当有错配存在时，探针的连接反应无法完成，从而保证检测的高特异性。因此可以区分单一位点的不同模式，广泛应用于点突变和单核苷酸多态性的检测。

2、多元性本发明与多重PCR相比，C-PLPs探针只同与其两端互补的靶序列位点进行特异性结合,即便有多个分裂锁式探针同时存在于一个检测体系中也不会相互干扰，探针中间的连接部分（即通用引物结合区域）对不同的锁式探针可以完全相同,在相同条件下可等效率发生扩增，并不影响对靶位点的检测，针对这段共同序列设计的一条通用引物,可用于所有锁式探针的扩增,避免了对不同靶序列扩增检测时的条件摸索，因此无需考虑多对引物复性动力学一致性问题。

3、高通量本发明探针所携带的20bp的标签序列（Tag sequence）作为不同扩增靶序列的标记。对于同一位点的不同突变类型，或相邻检测位点，可以通过标签序列予以区分，降低了相似靶序列之间的干扰并进一步提高检测的特异性。该标签序列的GC含量和Tm值经过特别设计，序列特异但热动力学基本相近，经过筛选的杂交探针（即包含在C-PLP中间的Tag序列的互补序列）具有均一的Tm值，保证了扩增的单链片段产物与相应探针杂交条件的一致性，使得扩增产物能在相同杂交条件下完成特异性杂交。增加新的靶序列检测种类时，只需更换新的tag序列，反应的通量大而灵活；

4、生物安全性本发明中RCA反应扩增的基因不是待测靶序列，而是环化的C-PLPs序列，靶序列只是提供一个环化的互补支架。这一方式既可减少具有感染或生物威胁的基因扩增可能造成的生物危害，又保证了扩增的特异性。

5、高灵敏度该方法中线性RCA的扩增效率为10⁵倍，结合生物传感器的芯片杂交后最低检测限为10^-12M（20amoL，20uL反应体系）。

6、简易操作（1）RCA是一种恒温扩增方式,不需要特别的热循环仪器,避免了传统热循环扩增对实验硬件的要求，实验仪器条件要求较低，仅需简单的水浴箱和SPR传感器即可在恒温条件下完成全部检测；（2）只要保证探针的识别序列与靶序列互补,待测靶序列既可以是RNA也可以是DNA,因此该方法较RT-PCR缩短了检测所需时间。

7、全部操作仅需3h，方便快捷，无需标记。

附图说明

图1为分列锁式探针结构示意图；

图2为滚环复制扩增模型图；

图3为分裂锁式探针检测模式图；

图4为分裂锁式探针扩增结果电泳图；图中标号1为DNA marker，2为空白对照，3为没有经过HhaI限制性内切酶酶切的扩增产物，4为经过HhaI限制性内切酶酶切的扩增产物，5、6、7均为阴性对照，8为分裂锁式探针；

图5为分裂锁式探针滚换扩增荧光定量结果分析图；

图6为结核杆菌异烟肼耐药临床分离株（katG315突变）作为靶序列的探针表面等离子体共振生物传感器测定结果；

图7为以结核杆菌异烟肼耐药临床分离株（inhA-15突变）作为靶序列的探针表面等离子体共振生物传感器测定结果；

图8为以结核杆菌利福平（RFP）耐药临床分离株（rpoB531突变），作为靶序列的探针表面等离子体共振生物传感器测定结果；

图9为以结核杆菌乙胺丁醇（EMB）耐药临床分离株（embB306）作为靶序列的探针表面等离子体共振生物传感器测定结果。

具体实施方式

实施例1：以结核杆菌异烟肼耐药临床分离株（katG315突变）作为靶序列的探针为例，其具体操作步骤为：

步骤一、连接反应：取临床分离株基因组提取物1uL与0.1μmol/L分裂锁式探针（四种探针终浓度为0.1umol/L）,其碱基序列如序列表序列11,靶序列和探针混合煮沸变性后立即置于冰上冷却5min，取出，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，反应时间为45min，再加入10U exonucleaseI和10U exonucleaseIII，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/L MgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤四、反应结果：

1）由图3可见，扩增产物加HhaI限制性内切酶酶切后大小与探针大小相同，不加HhaI限制性内切酶酶切其片段较大，印证RCA扩增产物为探针的互补序列，且其扩增为连续的滚环扩增。

2)荧光定量结果

荧光定量结果见图5，其扩增产物的量与反应循环次数和靶序列的浓度呈正相关。

3)表面等离子体共振生物传感器测定结果

由图6可见，杂交后基线水平升高，证明该杂交位点探针（与katG315突变型探针tag序列互补）检测靶序列阳性，即该分离株基因组靶序列中存在异烟肼katG315位点突变。

实施例2：以结核杆菌异烟肼耐药临床分离株（inhA-15突变）作为靶序列的探针为例，具体操作步骤为：

步骤一、连接反应：取临床分离株基因组提取物1uL与0.1μmol/L分裂锁式探针（四种探针终浓度为0.1umol/L）,其碱基序列如序列表序列12,靶序列和探针混合煮沸变性后立即置于冰上冷却5min，取出，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，反应时间为45min，再加入10U exonucleaseI和10U exonucleaseIII，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/L MgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤四、反应结果：表面等离子体共振生物传感器测定结果：由图7可见，杂交后基线水平升高，证明该杂交位点探针（与inhA-15突变型探针tag序列互补）检测靶序列阳性，即该分离株基因组靶序列中存在异烟肼inhA-15位点突变。

实施例3：以结核杆菌利福平（RFP）耐药临床分离株（rpoB531突变）作为靶序列的探针为例，具体操作步骤为：

步骤一、连接反应：取临床分离株基因组提取物1uL与0.1μmol/L分裂锁式探针（四种探针终浓度为0.1umol/L）,其碱基序列如序列表序列13,靶序列和探针混合煮沸变性后立即置于冰上冷却5min，取出，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，反应时间为45min，再加入10U exonucleaseI和10U exonucleaseIII，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/L MgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤三、RCA单链DNA产物检测：RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳、表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。

步骤四、反应结果：表面等离子体共振生物传感器测定结果：由图8可见，杂交后基线水平升高，证明该杂交位点探针（与rpoB531突变型探针tag序列互补）检测靶序列阳性，即该分离株基因组靶序列中存在异烟肼rpoB531位点突变。

实施例4：以结核杆菌乙胺丁醇（EMB）耐药临床分离株（embB306）作为靶序列的探针为例，其具体操作步骤为：

步骤一、连接反应：取临床分离株基因组提取物1uL与0.1μmol/L分裂锁式探针（四种探针终浓度为0.1umol/L）,其碱基序列如序列表序列14,靶序列和探针混合煮沸变性后立即置于冰上冷却5min，取出，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，反应时间为45min，再加入10U exonucleaseI和10U exonucleaseIII，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/L MgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤二、滚环扩增反应（RCA）反应：取步骤一制得的混合连接产物10μL，与通用引物（其碱基序列如序列表序列10）混合煮沸变性后，分别加入dNTP（10mmol/L）2μL，phi29DNA聚合酶10U，HhaI限制性内切酶10U和由33mmol/L tris-Ac、10mmol/L MgAC₂、6mmol/L KAC和0.1μg/μL BSA组成的缓冲液2μL，去离子水补足20uLRCA反应体系，温度37℃，反应时间60min；步骤三、RCA单链DNA产物检测：RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳、表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。

步骤四、反应结果：表面等离子体共振生物传感器测定结果;由图9可见，杂交后基线水平升高，证明该杂交位点探针（与embB306突变型探针tag序列互补）检测靶序列阳性，即该分离株基因组靶序列中存在异烟肼embB306位点突变。

Claims

1.一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于：具体操作步骤为：步骤一、连接反应：将靶序列DNA片段与终浓度为0.1μmol/L的四种分裂锁式探针混合煮沸变性后，立即置于冰上冷却5min，升温至37℃，杂交15min，加入2.5U的T4DNA连接酶和1μL的T4DNA连接酶缓冲液，去离子水补足10uL反应体系，连接反应时间：45min，再加入10U exonuclease I和10Uexonuclease III，37℃，反应15min，制备出含有环状模板的连接产物；其中T4DNA连接酶缓冲液的成份为40mmol/L Tris-HCL,10mmol/L MgCL₂,10mmol/L DTT和0.5mmol/L ATP；

步骤二、滚环扩增反应反应：取步骤一制得的混合连接产物10μL，与通用引物，其碱基序列如序列表序列10，混合煮沸变性后，分别加入摩尔浓度为的10mmol/LdNTP2μL，phi29DNA聚合酶10U，HhaI限制性内切酶10U和由33mmol/Ltris-Ac、10mmol/LMgAC₂、6mmol/LKAC和0.1μg/μLBSA组成的缓冲液2μL，去离子水补足20uLRCA反应体系，温度37℃，反应时间60min；

步骤三、RCA单链DNA产物检测：RCA反应结束后，取反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳、RCA单链产物测序、荧光定量RCA扩增或表面等离子体共振生物传感器检测方法中的一种方法进行检测。

2.如权利要求1所述的一种基于分裂锁式探针的多重RCA方法，其特征在于：所述的分裂锁式探针，包括以下4个部分：

3）酶切区域：探针右侧的酶切区域包含一个硫代磷酸化的HhaI限制性内切酶位点，生成的单链产物携带该位点，将在扩增的同时被HhaI限制性内切酶切成与环状探针相同大小的单链DNA片段产物，而探针本身由于硫代磷酸化的保护而不会被酶切，从而始终作为模板进行复制；

4）特异性标签序列：探针左侧的标签序列区使RCA单链DNA产物带有各自的特异性标签序列，可与芯片表面固定的互补标签序列探针特异性碱基互补结合，实现多重扩增产物的特异性检测。