CN112359083A - 一种基于锁式探针技术生成单链环状dna的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法及其应用。本发明所述方法针对单链靶基因设计锁式探针以及blocker探针，然后使用DNA连接酶进行连接，连接后加入外切酶去除未连接的锁式探针，获得单链环状DNA。本发明利用Blocker探针介导的锁式探针技术生成环状DNA(cssDNA)及用于检测单位点变异，本发明提供的方法可以提高cssDNA的产量，减少多聚物的生成，同时该方法可以进行高特异性高灵敏度的核酸检测。

Description

一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法及其应用。
背景技术
锁式探针技术是指带有5’-PO4基团的ssDNA(single-stranded DNA)以首尾相连的方式特异性地结合到与其互补的靶基因序列上，在连接酶的作用下成环。该技术可应用于环状单链DNA(circular single-stranded DNA,cssDNA)的生产。另外，锁式探针结合滚环扩增技术可应用于分子生物学及医疗领域，如植物病毒分型检测、病原菌检测、SNP检测及癌症突变基因检测等。
单链环状DNA(cssDNA,15-200nt)对分子生物学、医药领域以及生物技术等方面都是具有重要的研究及应用价值的。因其相比线性单链DNA而言，其具有抗核酸外切酶的活性，使得cssDNA更稳定。该优势吸引了众多科学家的关注。Bio-Synthesis公司开展了一项合成单链cssDNA的业务，以应用于疾病诊断、RCA反应、miRNA传送载体以及突变的检测。
目前，cssDNA的合成主要有化学合成和酶促合成两种方法。化学合成：溴化氰是化学合成cssDNA过程中不可或缺的试剂，但其具有剧毒，对环境和人身健康都有重大的威胁；另外该方法合成周期较长。酶促催化合成：没有化学试剂的使用，所以不会对环境及人身健康造成危害；同时可以得到较高的产率。但其成本较高，而且有一定的副产物-多聚物(polymer)的生成。
同时，基于核酸检测的分子诊断技术正在越来越广泛地用于临床，为疾病的预防、预测、诊断及治疗提供信息和决策依据。人体体液中循环的片段化的DNA(Circulatingcell-free DNA,cfDNA)作为非侵入性筛查和诊断的遗传物质得到众多科学家及临床医生的关注。Fernando M R和其同事发现在血浆中包含76bp，135bp，490bp和905bp的DNA分别占比100％、39％、18％、5.6％，说明这些游离的DNA是高度片段化的。但高度片段的DNA对于目前已有的核酸检测技术具有很大的挑战性。
PCR技术尤其是荧光定量PCR(qPCR)是应用最为广泛的核酸检测技术之一。但由于PCR技术：1)需要精准的温控系统；2)qPCR技术需要昂贵的荧光染料或荧光探针，这也相对地增加了成本；3)对引物及探针的设计也极为严格；4)PCR技术尤其荧光定量PCR技术在核酸检测扩增的片段长度在150bp-250bp左右，且对引物的设计需要靶标序列已知，而cfDNA高度片段化，且基因组在片段化的位置不确定，所以对于cfDNA而言，其长度和序列均是未知，这对于设计PCR引物与探针具有很大的挑战性，造成较高的假阳性或假阴性。这些不利因素导致PCR技术在偏远地区及贫困地区受到了一定的限制。因此，开发灵敏度高、特异性好的恒温检测技术具有非常重大的意义。
近来，为解决核酸扩增在即时检测中的应用，科学家们开发了多种恒温核酸扩增技术，包括环介导的恒温扩增(Loop mediated Isothermal amplification,LAMP)、解旋酶依赖性扩增(Helicase-dependent Amplification,HDA)、链置换扩增(StrandDisplacement Amplification,SDA)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)以及滚环扩增(Rolling Circle Amplification,RCA)等。1)LAMP:LAMP是利用具有链置换能力的DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)和特异性识别靶标DNA的4-6条引物实现特异性、简便、快速且成本较低的恒温扩增反应。但由于其需要4-6条引物，这要求设计者有一定专业知识和经验。另外该反应容易产生非特异性扩增，而且在产物验证时可能会对实验室造成污染。这些因素导致了LAMP技术的使用受到了一些限制。2)HDA:HDA反应是指在ATP存在的情况下利用DNA解旋酶、单链结合蛋白、聚合酶、引物等实现的恒温扩增技术，该反应是在体外模拟体内的DNA复制过程。但由于其引物的设计也比较严格，而且目前商业化用于该反应的试剂盒价格比较昂贵，这也限制了HDA反应的广泛应用。3)SDA:SDA反应是依赖于切口酶和具有链置换能力的DNA聚合酶如Bst DNA polymerase或者Klenow Fragment(3’→5’exo-)而进行恒温扩增反应，其可以在各种不同的温度(37℃-70℃)进行。4)RPA:RPA的反应机制是利用重组酶促进引物链侵入并结合到目标DNA上形成D-环，然后由具有链置换功能的DNA聚合酶进行延伸。PRA反应的引物设计更为严格，而且其反应温度和反应时间也是很关键的因素。5)RCA:RCA反应是具有链置换功能的DNA聚合酶如Phi29 DNA polymerase以环状单链DNA为模板，进行边取代边聚合的恒温扩增，产生串联重复序列的长的互补于环状模板的单链DNA。因其扩增效率高、反应速度快而受到了众多科学家的喜爱。
目前，众多文献报道是利用锁式探针技术结合RCA扩增技术进行核酸序列、miRNA、SNP、单碱基变异等检测。锁式探针-RCA技术对核酸序列尤其是单位点变异的检测，主要是依赖于探针和靶标的碱基互补配对，而基于锁式探针-RCA技术对核酸序列检测由于连接酶忠实度的问题，造成一定的假阳性或者假阴性。以单碱基变异检测为例说明，利用锁式探针对单位点变异的检测，探针的设计基本上是将变异位点设计在探针的3’末端，探针的3’末端与突变型碱基完全互补配对、与野生型的只有该位点不匹配。理想情况下，仅突变型靶标存在的情况会形成环状单链DNA(cssDNA)。但在常温下，有些碱基对之间会出现一定的错配,此时连接酶并不能识别出错配，仍然可以将5’端磷酸基团与3’端羟基基团连接起来形成磷酸二酯键，从而形成cssDNA(即会导致在野生型靶标的存在下形成cssDNA)，进而进行RCA反应将信号放大。该结果就会导致假阴性的出现，而假阳性的产生与假阴性的产生正好相反。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法，使得所述方法在生成单链环状DNA时能够减少副产物-多聚物的产生；
本发明的另外一个目的在于提供一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法，使得所述方法在生成单链环状DNA时不仅能够减少多聚物的产生，而且能够增加单链环状DNA连接效率，实现模板的循环利用产生更多的单链环状DNA；
本发明的另外一个目的在于提供上述方法或将其结合RCA技术在检测核酸单位点变异中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法或将其结合RCA技术用于检测核酸单位点变异的方案，使得所述方案在检测核酸单位点变异时不仅能够减少多聚物的产生，而且能够避免假阳性或假阴性结果的出现，提高灵敏度和特异性，以及显著放大扩增结果。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法，针对单链靶基因设计锁式探针以及blocker探针，然后使用DNA连接酶(如T4 DNA连接酶)进行连接，连接后加入外切酶去除未连接的锁式探针，获得单链环状DNA；
所述blocker探针为单链DNA寡核苷酸，由3’→5’方向分为a和b两个区域序列，所述锁式探针分为I-III三个区域序列，并可按I→II→III→I顺序经DNA连接酶连接3’和5’成环；其中，I、III区域序列与靶基因互补，blocker探针序列(a+b区域序列)或其b区域序列与I区域序列相同，a区域序列与靶基因互补。
对于锁式探针的I和III两个区域序列，当其与靶序列互补结合且尚未被DNA连接酶连接成环时(即3’端和5’端未连接)，3’端和5’端之间的空缺称之为断点，该断点可出现在I区域序列上，也可出现在III区域序列上，或正好是I区域序列和III区域序列的分割点；断点的位置与blocker探针序列有关，一般位于I+III区域序列的中部。
对于锁式探针的II区域序列，其可以根据实际需要设计成不同的序列；目前，cssDNA已展现出潜在的临床应用，如2018年，J.Meng,et.al.设计了一个人工环状单链DNA(CSSD)分子，该分子包含连续的多个与miR-9互补的序列位点。从而使得miR-9通过碱基互补杂交在CSSD上，进而在体内上调抑癌基因(KLF17,CD17和LASS2)的表达，抑制了肿瘤的恶化和肺转移。该CSSD分子相比与miR的抑制剂更稳定且抗降解。同时，cssDNA也应用于适配体的筛选，M.Liu.et.al.从环状单链DNA文库中发现了两个高亲和力环状DNA适体，这两个适体可识别来自Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶(GDH)(这是一种应用于诊断Clostridium difficile感染的抗原)。该环状DNA适配体具有较高的稳定性，且其与滚环扩增结合更容易放大信号。因此，锁式探针I、III区域序列负责锁式探针成环，II区域序列根据目标设计成不同的序列，但需要避免与单链靶基因互补，且避免与I，III区域形成二级结构。
本发明是在Padlock(锁式探针)技术的基础上设计出另外一条DNA oligo即本发明称之为blocker探针。该blocker探针分为a、b两个区域，其与靶标DNA序列(黑色)互补配对，其中a区域(灰色)是blocker的toehold区域(相对于padlock探针与靶标DNA序列结合的位置而言，该区域与靶标DNA序列结合是突出来的)，可参考附图1。另外，padlock探针是一条5’端带有磷酸基团的单链DNA，其可分为I、II、III三个区域；其中I、III区域与靶标DNA序列互补配对，并且I区域(绿色)的序列与blocker探针的b区域(绿色)是相同的序列，III区域(紫色)的是padlock探针的toehold区域(相对于blocker与靶标DNA序列结合的位置而言，该区域与靶标DNA序列结合是突出来的)。其作用原理是：首先Blocker探针结合到靶标DNA序列上，接着padlock探针会通过其III区域即通过toehold区域优先结合于靶标DNA序列上，然后padlock探针通过链置换将blocker从靶标DNA序列上置换下来，最后T4 DNAligase会将padlock探针连接成环状单链DNA(即cssDNA)。
在没有Blocker探针作用的情况下，可能会有两条Padlock探针序列同时杂交到一条靶标序列上，这样就导致了多聚物的生成，参考附图2；但在有blocker探针作用的情况下，blocker探针优先结合到靶标序列上，然后Padlock探针通过III区域即toehold区域置换掉blocker，由于在同一条探针上有与靶标序列互补的序列(即5’端)，同一探针的5’端会优先结合在靶标上，这样就会减少多聚物的产生，促进目标cssDNA的生成，参考附图3。
作为优选，所述a区域序列长度为0或2-20nt，所述b区域序列长度以及I区域序列长度独立选自4-30nt，所述III区域序列长度为2-20nt。所述II区域序列长度为15-45nt。
作为优选，所述a区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能不高于III区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能。所述不高于指a区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能低于或约等于III区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能，所述约等于指两者吉布斯自由能相差不超过1-2Kcal/mol；相对于约等于的情形，低于的情形可以进一步提高单链环状DNA的连接效率(产率)；
作为优选，通过热动力学计算，在设计blocker探针和padlock探针时，可根据软件如NUPACK将blocker探针结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能设计成低于padlock结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能，如此一来便可在减少多聚物的基础上，增加单链环状DNA连接效率，实现模板的循环利用产生更多的单链环状DNA；其实现的原理是：blocker探针首先结合在靶标序列上，padlock探针会通过其III区域即toehold区域结合到靶标序列上进而置换下blocker，这样padlock探针以首末相连的方式互补配对于靶标序列上，进而通过连接酶的作用形成环状DNA，而由于padlock结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能大于blocker探针结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能，因此这个过程会更容易发生且使得padlock结合到靶标DNA上更稳定，从而可以形成更多的cssDNA。然后，blocker探针通过其a区域即toehold区域再次结合到靶标序列上进而置换下cssDNA，从而回到最初的状态。接着，未成环的padlock再次通过toehold区域结合到靶标序列上，进入下一轮的循环。如此循环下去，会促进更多的cssDNA的生成，具体可参考附图4。
在上述增加连接效率的过程中，blocker探针a区域(其toehold)的长度可以设定在3到20nt范围内，而padlock探针III区域(其toehold区域)的长度可以设定在4到20nt范围内；或者padlock探针和靶标序列的互补序列完全包含blocker探针和靶标序列的互补序列，也即blocker探针a区域为0，这同样可以通过软件设计具有最优结合参数的padlock探针III区域实现提高连接产率。
在生成cssDNA的过程中，可能会同时存在已经成环的padlock探针和线性padlock探针，为了避免电泳检测时线性padlock探针对cssDNA的影响，一般可利用外切酶特异性水解单链DNA而不水解环状单链DNA的特点，对残存的线性padlock探针消化酶解，在本发明中可优选为外切酶I和/或外切酶III。
此外，通过热动力学计算，在设计blocker探针和padlock探针时，可根据软件如NUPACK将blocker探针结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能设计成约等于(所述约等于指两者吉布斯自由能相差不超过1-2Kcal/mol)padlock结合于靶标DNA序列的吉布斯自由能，如此一来本发明生成cssDNA的过程就是一个动态平衡状态；用于检测核酸单位点变异时，Blocker探针与突变型DNA序列(S)有一个碱基的错配，此时padlock探针结合到靶标序列上的吉布斯自由能会大于blocker探针结合到发生单位点变异的靶标序列上的吉布斯自由能，因此padlock探针结合到靶标序列上更加稳定，从而形成的产物cssDNA更多，表现在电泳上的结果是cssDNA条带相对于没有发生单位点变异的对照条带会更亮，而结合RCA后可进一步将信号放大，参考附图5；
基于此，本发明提供了所述方法在检测核酸单位点变异中的应用。根据该应用，本发明具体提供了一种检测核酸单位点变异的方法，针对野生型单链靶基因设计锁式探针以及blocker探针，然后对待测样本(针对双链样本可按照常规方法先形成单链的待测样本，如生物素分离、Lambda外切酶降解、变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等方法，参见文献Hao,M.,Qiao,J.,and Qi,H.(2020)Current and Emerging Methods for the Synthesis ofSingle-Stranded DNA,Genes(Basel)11.)以及野生型单链靶基因分别进行连接，连接后加入外切酶去除未连接的锁式探针，获得待测样本单链环状DNA连接产物和野生型靶基因单链环状DNA连接产物；
将待测样本连接产物和野生型靶基因连接产物进行电泳或RCA，若待测样本单链环状DNA连接产物显著多于野生型靶基因单链环状DNA连接产物，则待测样本靶基因发生单位点变异；
所述blocker探针为单链DNA寡核苷酸，由3’→5’方向分为a和b两个区域序列，所述锁式探针分为I-III三个区域序列，并可按I→II→III→I顺序经DNA聚合酶连接3’和5’成环；其中，I、III区域序列与靶基因互补，b区域序列与I区域序列相同，a区域序列与靶基因互补；所述a区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能等于III区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能；所述靶基因单位点变异位置位于与a区域序列互补的靶基因序列上；在本发明具体实施方式中，所述靶基因单位点变异位置位于与a区域序列互补的靶基因序列上的3’端。
由以上技术方案可知，本发明利用Blocker探针介导的锁式探针技术生成环状DNA(cssDNA)及用于检测单位点变异，本发明提供的方法可以提高cssDNA的产量，减少多聚物的生成，同时该方法可以进行高特异性高灵敏度的核酸检测。
附图说明
图1所示为本发明所述方法的原理示意图；
图2所示为在没有Blocker探针下锁式探针形成多聚物的原理示意图；
图3所示为在有Blocker探针下锁式探针形避免多聚物产生的原理示意图；
图4所示为本发明方法促进cssDNA生成的原理示意图；
图5所示为本发明方法用于检测核酸单位点变异的原理示意图；其中，S表示发生单位点变异的靶基因，X为野生型的靶基因；
图6所示为验证本发明方法减少多聚物的试验结果；左图中，泳道1为仅线性padlock探针；泳道2为没有blocker探针作用的情况下，采用线性padlock探针连接；泳道3为在blocker探针作用的情况下采用线性padlock探针连接；*所在位置条带是生成的环状DNA产物；右图中，泳道1为仅线性padlock探针；泳道2为没有blocker探针作用的情况下，采用线性padlock探针连接；泳道3-6为在blocker3-6探针作用的情况下采用线性padlock探针连接；
图7所示为验证本发明方法促进cssDNA生成的试验结果；其中，泳道1为仅线性padlock探针(对照)；泳道2为没有blocker存在的情况下，采用线性padlock探针连接；泳道3为在blocker存在的情况下，采用线性padlock探针连接；*所在的位置条带为环状DNA产物；
图8所示为利用本发明方法对单位点变异的核酸进行检测的结果；其中，左图为凝胶图，右图为凝胶图的条带灰度值量化结果；泳道1：加入体系中的padlock探针(对照)；泳道2：没有加blocker，靶标为野生型序列的；泳道3：没有加blocker，靶标为突变型序列；泳道4：加入blocker，靶标为野生型序列；泳道5：加入blocker，靶标为突变型序列；Q值为靶标为突变型序列的已成环的条带灰度值/靶标为野生型序列的已成环的条带灰度值；A为没有加入blocker的Q值，B为加入blocker的Q值；
图9所示为验证本发明方法在检测单位点变异的核酸的特异性和灵敏度的RCA结果；左图曲线从上至下依次表示为含有100％、10％、1％、0.1％和0％的突变型序列的混合序列。
具体实施方式
本发明公开了一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明具体实施方式中，本发明选用表1中的序列进行可行性分析，但这并不应当成为本发明的限制，根据本发明提供的原理和方案可通过软件针对靶标设计出不同探针序列，而本发明不可能穷举；
表1
Figure BDA0002772001760000091
表1中，Padlockprobe(锁式探针)序列中斜体部分为I区域序列，下划线部分为III区域序列(自由能为-17.49Kcal/mol)，其余为II区域序列；野生型模板和突变型模板为第16个碱基发生G-T突变；Blocker 1序列中斜体部分为b区域序列，其他为a区域序列(自由能为-17.04Kcal/mol)；Blocker 2序列中斜体部分为b区域序列，也即没有a区域序列为0，其自由能也相应为0；
Blocker 3-6序列中，斜体部分为b区域序列，其他为a区域序列(自由能依次为-21.99Kcal/mol、-18.7Kcal/mol、-23.43Kcal/mol和-18.7Kcal/mol)；
根据吉布斯自由能可以采用Padlockprobe+Blocker 1检测单位点变异，采用Padlockprobe+Blocker 2用于单链环状DNA的产生，两者都可以抑制多聚物的产生；
上表1所用的寡核苷酸片段均购自苏州金唯智生物科技有限公司(序列依次如SEQID NO:1-9所示)，padlock探针5’端均进行磷酸化修饰。T4 DNA ligase,Exo I,Exo III，Bst DNA polymerase均购自New England Biolabs(NEB)。dNTPs购自北京全式金生物科技有限公司。SYBRGoldNucleic Acid Gel Stain购自赛默飞。SYBR Green I购自北京索莱宝生物科技有限公司。
本发明中采用的聚丙烯酰胺凝胶电泳均为15％变性聚丙烯酰胺凝胶。凝胶体系见表2：
表2
Figure BDA0002772001760000101
300V电压先进行预电泳30min，接着上样，120V电压电泳3h。然后SYBRGoldNucleic Acid Stain染色20min,凝胶成像仪(Azure C300)中成像。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：验证本发明方法减少多聚物的试验
按下表3的体系进行连接；
表3
Figure BDA0002772001760000102
将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III。最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图6。
图6左图中泳道1为仅线性padlock探针；泳道2为没有blocker探针作用的情况下，采用线性padlock探针扩增，可以看出有多聚物(polymer)的生成，*所在位置是生成的环状DNA产物；泳道3为在blocker探针作用的情况下采用线性padlock探针扩增，可以看出多聚物的生成大量减少甚至没有，而且环状产物的量还有所提高，说明其没有影响连接效率。
右图是使用其他几种blocker探针验证情况，结果和左图一致，能够看出多聚物的生成相比第2泳道不添加blocker探针大量减少，而且环状产物的量还有所提高，说明其没有影响连接效率。
实施例2：验证本发明方法增加cssDNA产量(连接效率)的试验
为了验证该优势，本实施例通过调节blocker、target(靶标序列)、padlock之间的比例进行连接，连接体系见下表4；
表4
Figure BDA0002772001760000111
将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III。最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果见图7。
图7中，泳道1为仅线性padlock探针(对照)；泳道2为没有blocker存在的情况下，*所在的位置为环状产物；泳道3为在blocker存在的情况下，*所在的位置为环状产物。从图中可以看出，在blocker作用的情况下，环状产物明显增加，说明本发明的方法的确能够促进靶标序列的循环作用，提高连接效率，从而提高cssDNA产量。
实施例3：利用本发明方法检测核酸单位点变异
1、单碱基变异的检测
按下表5进行连接；
表5
Figure BDA0002772001760000112
Figure BDA0002772001760000121
将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III。最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，条带灰度值量化，结果见图8。
图8中，泳道1为仅加入体系中的padlock探针(对照)；泳道2为没有加blocker，靶标为野生型序列的；泳道3为没有加blocker，靶标为突变型序列；泳道4为加入blocker，靶标为野生型序列；泳道5为加入blocker，靶标为突变型序列。从图中可以看出，在没有blocker存在的情况下，野生型模板与突变型模板对于padlock成环的效率是一致的(Q值约为1)；但在加入Blocker的情况下，突变型模板成环是野生型模板成环的16倍。这也说明了本发明方法中的blocker对于完全互补的序列是覆盖作用的；但对于有碱基变异的序列其结合模板作用是减弱的，正好验证了附图5描述的原理。这对于将来在临床上应用是很有意义的。因为临床上的样本中绝大多数为野生型序列，有极少的突变型序列，但对于目前的核酸检测技术来讲，野生型序列的信号会远远大于突变型序列的信号，这就造成了假阴性。
泳道2-5中*标记的为环状产物所在位置，与泳道1对照位于相同位置的条带是外切酶I/III没有降解完全导致。
2、特异性和灵敏性的检测
为了验证本发明对于单碱基变异检测的灵敏度和特异性，本实施例进行了0.1％的实验即在有999个野生型序列中有1个突变型序列的检测。即将突变型序列与野生型序列进行不同比例的混合，分别为0％，0.1％，1％，10％，100％。之后将其作为靶标序列进行检测，经过连接、外切酶降解、实时荧光滚环扩增收集扩增信号，PCR连接体系见表6；
表6
Figure BDA0002772001760000131
将上述连接体系置于PCR仪(Eppendorf Mastercycler)中37℃温育3h，之后65℃10min灭活T4 DNA ligase。然后加入2.5UExo I和10U Exo III，37℃温育3h，80℃20min灭活Exo I和Exo III。最后进行实时荧光滚环扩增，RCA扩增体系见表7；
表7
Figure BDA0002772001760000132
该扩增混合物置于QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems中55℃温育1h，并且每30s收集一次荧光信号，结果见图9。
从图9结果中可以看出，本发明方法实现了0.1％突变型序列的检测，说明本发明对于单碱基变异的检测具有较高的特异性和灵敏性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法及其应用
<130> MP1913803
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcataccgat cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg actcctcacc c 51
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgagtgcac catatgcggt atgagggtga ggatggagg 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgagtgcac catattcggt atgagggtga ggatggagg 39
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ataccgcata tggtgcact 19
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accctcatac cg 12
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgcatatgg tgcactca 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accgcatatg gtgcact 17
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taccgcatat ggtgcactca c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taccgcatat ggtgcactca 20

Claims (9)

1.一种基于锁式探针技术生成单链环状DNA的方法，其特征在于，针对单链靶基因设计锁式探针以及blocker探针，然后使用DNA连接酶进行连接，连接后加入外切酶去除未连接的锁式探针，获得单链环状DNA；
所述blocker探针为单链DNA寡核苷酸，由3’→5’方向分为a和b两个区域序列，所述锁式探针分为I-III三个区域序列，并可按I→II→III→I顺序经DNA连接酶连接3’和5’成环；其中，I、III区域序列与靶基因互补，blocker探针序列或其b区域序列与I区域序列相同，a区域序列与靶基因互补。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述a区域序列长度为0或2-20nt。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述b区域序列长度以及I区域序列长度独立选自4-30nt。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述III区域序列长度为2-20nt。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述II区域序列长度为15-45nt。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外切酶为外切酶I和/或外切酶III。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述a区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能不高于III区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能。
8.权利要求1-7任意一项权利要求所述方法在检测核酸单位点变异中的应用。
9.一种检测核酸单位点变异的方法，其特征在于，针对野生型单链靶基因设计锁式探针以及blocker探针，然后对待测样本以及野生型单链靶基因分别进行连接，连接后加入外切酶去除未连接的锁式探针，获得待测样本单链环状DNA扩增产物和野生型靶基因单链环状DNA连接产物；
将待测样本扩增产物和野生型靶基因连接产物进行电泳或RCA，若待测样本单链环状DNA产物显著多于野生型靶基因单链环状DNA扩增产物，则待测样本靶基因发生单位点变异；
所述blocker探针为单链DNA寡核苷酸，由3’→5’方向分为a和b两个区域序列，所述锁式探针分为I-III三个区域序列，并可按I→II→III→I顺序经DNA聚合酶连接3’和5’成环；其中，I、III区域序列与靶基因互补，b区域序列与I区域序列相同，a区域序列与靶基因互补；所述a区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能等于III区域序列结合到靶基因上的吉布斯自由能；所述靶基因单位点变异位置位于与a区域序列互补的靶基因序列上。
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