CN115873927B - 一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用，所述核酸恒温滚环扩增方法包括：靶核酸与探针退火互补配对形成环状退火结构，所述环状退火结构在具有链置换功能的聚合酶的作用下进行延伸和滚环扩增；所述环状退火结构包括首尾相连接的退火结合区一、未配对的单链靶核酸、退火结合区二和未配对的单链探针；所述退火结合区一为所述靶核酸的5’端与所述探针的3’端100％互补配对形成的；所述退火结合区二为所述靶核酸的3’端与所述探针的5’端100％互补配对形成的。本发明所述扩增方法不通过自连反应成环也能启动RCA，不仅避免了自连效率低的问题也能保留原有RCA的优点。

Description

一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用。
背景技术
近年来，恒温扩增技术的优势正逐渐取代传统的qPCR技术，已经在临床医学、检验医学、分子生物学、水和食品安全等不同领域中的发挥着重要作用，特别是在致病菌、病毒等传染微生物的检测中。2019年恒温核酸扩增技术的市场总额为19亿美元，2024年其市场总额预计达到33亿美元。
恒温扩增技术的基本原理和反应成分各不相同，主要包括LAMP(loop-mediatedisothermal amplification，环介导恒温扩增)、NEAR(Nicking enzyme amplificationreaction，切口酶恒温扩增反应)、SDA(Strand Displacement Amplification，链替代扩增)、NASBA(Nuclear acid sequence-based amplification，依赖核酸序列的扩增)、RCA(Rolling Cycle Amplification，滚环扩增)、HAD(Helicase-dependent Amplification，依赖解旋酶的恒温基因扩增)、SPIA(Single primer isothermal amplification，单引物等温扩增)、RPA(Recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)、RAA(Recombinase Aided Amplification，重组酶介导等温核酸扩增)、SAT(Simultaneousamplification and testing，实时荧光核酸恒温扩增检测)以及CPA(Crossing PrimingIsothermal Amplification，交叉引物扩增)技术。这些技术本质上是使新合成的DNA模板在恒定的温度下退火变性进而引发进一步的扩增反应，这使得恒温扩增技术具备检测快速、价格低廉等优势。
滚环扩增是1998年开发出来的，在恒定温度下以单链环状DNA为模板，在链置换活性聚合酶的作用下，通过引物与模板环退火而进行滚环式DNA合成。RCA的优点包括：(1)高灵敏度：RCA有很强的扩增能力，线性RCA的效率可达到105倍，而指数RCA的效率可达到109倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单拷贝水平；(2)高序列特异性：可以区分单一位点的不同模式；(3)扩增产物经过磷酸化处理后可以直接用来测序；(4)高通量：RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增；(5)RCA只要保证探针的识别段序列和靶序列互补，不需要考虑靶序列的性质，因此检测RNA时不再需要预先进行RNA的逆转录。
RCA的缺点是线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒和质粒或者通过首尾连接形成环状的核酸，所以成环的效率高低直接影响RCA方法学的表现。然而成环的主要方法是通过单链核酸片段的自连，自连反应不仅效率低只有30％甚至更低，而且环化酶的成本很高不适合规模化生产和降成本。
因此，开发一种不通过自连反应成环也能启动RCA的方法，在核酸扩增领域中具有重要的应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法及其应用。本发明所述滚环扩增方法不通过自连反应成环也能启动RCA，不仅避免了自连效率低的问题也能保留原有RCA的优点。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，所述核酸恒温滚环扩增方法包括如下步骤：
靶核酸与探针退火互补配对形成环状退火结构，所述环状退火结构在具有链置换功能的聚合酶的作用下进行延伸和滚环扩增；
所述环状退火结构包括首尾相连接的退火结合区一、未配对的单链靶核酸、退火结合区二和未配对的单链探针；
所述退火结合区一为所述靶核酸的5’端与所述探针的3’端100％互补配对形成的；
所述退火结合区二为所述靶核酸的3’端与所述探针的5’端100％互补配对形成的。
在本发明中，靶核酸与探针进行单链DNA退火结合形成环状退火结构，从环状退火结构的3’端作为延伸的起始位置，在聚合酶的作用下靶核酸和探针相互作为延伸模板链进行延伸至5’端，得到双链环状中间产物，之后启动聚合酶酶的DNA置换功能进行滚环扩增(RCA)。
在退火阶段靶核酸DNA的3’和5’两端必须和探针骨架两端100％配对才能启动整个反应顺利进行，滚环扩增产生双臂单链DNA不断延长后会在空间上形成纳米球结构(nanoball)，因此，一个反应理论上可以产生两个纳米球。和已有的MIPS方法或通过单链DNA环化的RCA相比，本发明所述方法学不仅简单快速，而且还有成本低、转化效率高等优点，非常适合开发POCT(point-of-care testing)产品。
优选地，所述退火结合区一和退火结合区二的GC含量各自独立的为20-70％，例如可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％等；优选为35-65％，进一步优选为40-60％。
在本发明中，GC含量会影响探针和模板的结合，影响最终RCA产物的量。在发明中，GC含量在20-70％之间均可以实现扩增，GC含量在40-60％之间RCA产物的量较高。
优选地，所述退火结合区一和退火结合区二的长度各自独立的为8-40bp，例如可以是8bp、10bp、12bp、15bp、17bp、19bp、21bp、23bp、25bp、27bp、29bp、30bp、31bp、33bp、35bp、37bp、39bp或40bp等；优选为25-30bp。
在本发明中，靶核酸与探针退火后形成两个结合区域(退火结合区一和退火结合区二)，结合区域长度确实会影响RCA扩增效果，结合区域长度在10-40bp均可以实现扩增，当结合区域长度在25-30bp范围内，扩增效果较好。
优选地，所述探针的碱基数大于等于30bp，例如可以是30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp或100bp等。
优选地，所述具有链置换功能的聚合酶包括Bst聚合酶或Phi29聚合酶。
本发明中，根据聚合酶的特性选择合适的具有链置换功能的聚合酶。Bst聚合酶：具有5’→3’的聚合酶活性和强链置换活性，但没有5’→3’核酸外切酶活性，常用于LAMP等温扩增；Phi29聚合酶：有链置换活性，会把酶前行方向上的前链从原来的模板链上进行解链移开，有5’→3’的聚合酶活性，同时有3’→5’外切酶活性，常用于滚环扩增RCA；BSU聚合酶：有链置换活性，5’→3’聚合酶活性，但缺失了5’→3’和3’→5’核酸外切酶活性，因此不能切除3’未配对的突出末端，因而不适用于生成平滑末端有链置换功能；Sau聚合酶：具有链置换活性的DNA恒温扩增聚合酶，主要应用于RPA重组酶扩增，Sau聚合酶具有DNA聚合酶的5’→3’聚合酶活性，和BSU酶类似缺失了5’→3’和3’→5’核酸外切酶活性；Vent聚合酶：具有5’→3’DNA聚合酶活性，兼有3’→5’外切酶活性，保真度比Taq DNA聚合酶高5-15倍，不确定是否有链置换活性。本发明中以Bst聚合酶或Phi29聚合酶进行扩增，扩增效果较好。
优选地，所述靶核酸包括单链DNA或单链RNA。
本发明中，所述不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法可以直接对片段化的单链DNA和RNA进行滚环扩增，不需要RNA反转录成cDNA的环节，同时也不需要使用连接酶，摆脱了单双链核酸酶连效率低的限制，同时降低了成本。
优选地，所述核酸恒温滚环扩增方法包括如下步骤：
(1)将靶核酸和探针混合，进行退火，得到含有环状退火结构的反应液；
(2)将所述含有环状退火结构的反应液、具有链置换功能的聚合酶、酶缓冲溶液、dNTP和BSA混合，进行延伸和滚环扩增。
优选地，步骤(1)中，所述靶核酸与探针的摩尔比为(0.3-0.7):1，例如可以是0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1或0.7:1等。
优选地，步骤(1)中，所述退火的温度为50-70℃，例如可以是50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃或70℃等。
优选地，步骤(1)中，所述退火的时间为10-60min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等。
本发明中，所述退火的反应体系为：50mM Tris-HCl、10mM MgCl2和10mM(NH4)2SO4。
优选地，步骤(2)中，所述延伸的步骤包括：
分别以退火结合区一和退火结合区二的3’端作为延伸的起始位置，在具有链置换功能的聚合酶的作用下，未配对的单链靶核酸和未配对的单链探针相互作为延伸模板链延伸至5’端，得到双链环状中间产物。
优选地，步骤(2)中，所述滚环扩增的步骤包括：
以双链环状中间产物为模板，启动所述具有链置换功能的聚合酶的置换功能进行滚环扩增。
本发明中，所述延伸和滚环扩增的温度为所采用的具有链置换功能的聚合酶的最优反应温度，所述具有链置换功能的聚合酶为Bst聚合酶时，所述温度为65℃，所述具有链置换功能的聚合酶为Phi29聚合酶时，所述温度为30℃。
优选地，所述滚环扩增后还包括对游离的靶核酸和探针进行消化。
优选地，所述消化采用单链DNA消化酶进行处理。
本发明中，RCA反应后体系中残留的很多的单链状态的靶核酸和探针。因此，为了进一步纯化和提高RCA产物比例，使用Exo I单链DNA消化酶进行处理。退火产物消化后单链状态的模板和探针浓度降到1ng/μL以下，说明大部分消化的是游离的模板和探针。RCA后产物经过消化单链状态的模板和探针浓度降低大概40％，剩余60％主要是滚环后的纳米球，虽然滚环后的纳米球是单链，但纳米球的3D空间结构使Exo I酶无法结合并启动降解。
第二方面，本发明提供一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增系统，所述核酸恒温滚环扩增系统包括：
退火模块：将靶核酸和探针混合，进行退火，得到含有环状退火结构的反应液；
扩增模块：将所述含有环状退火结构的反应液、具有链置换功能的聚合酶、酶缓冲溶液、dNTP和BSA混合，进行延伸和滚环扩增。
本发明中，所述核酸恒温滚环扩增系统利用靶核酸与探针退火互补配对形成环状退火结构，所述环状退火结构在具有链置换功能的聚合酶的作用下进行延伸和滚环扩增。
优选地，所述退火模块中，所述环状退火结构包括首尾相连接的退火结合区一、未配对的单链靶核酸、退火结合区二和未配对的单链探针。
优选地，所述退火结合区一为所述靶核酸的5’端与所述探针的3’端100％互补配对形成的。
优选地，所述退火结合区二为所述靶核酸的3’端与所述探针的5’端100％互补配对形成的。
优选地，所述退火结合区一和退火结合区二的GC含量各自独立的为20-70％，例如可以是20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％等；优选为35-65％，进一步优选为40-60％。
优选地，所述退火结合区一和退火结合区二的长度各自独立的为8-40bp，例如可以是8bp、10bp、12bp、15bp、17bp、19bp、21bp、23bp、25bp、27bp、29bp、30bp、31bp、33bp、35bp、37bp、39bp或40bp等；优选为25-30bp。
优选地，所述探针的碱基数大于等于30bp，例如可以是30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp或100bp等。
优选地，所述具有链置换功能的聚合酶包括Bst聚合酶或Phi29聚合酶。
优选地，所述靶核酸包括单链DNA或单链RNA。
优选地，所述退火模块中，所述靶核酸与探针的摩尔比为(0.3-0.7):1，例如可以是0.3:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1或0.7:1等。
优选地，所述退火模块中，所述退火的温度为50-70℃，例如可以是50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、68℃或70℃等。
优选地，所述退火模块中，所述退火的时间为10-60min，例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min等。
优选地，所述扩增模块中，所述延伸的步骤包括：
分别以退火结合区一和退火结合区二的3’端作为延伸的起始位置，在具有链置换功能的聚合酶的作用下，未配对的单链靶核酸和未配对的单链探针相互作为延伸模板链进行延伸至5’端，得到双链环状中间产物。
优选地，所述扩增模块中，所述滚环扩增的步骤包括：
以双链环状中间产物为模板，启动所述具有链置换功能的聚合酶的置换功能进行滚环扩增。
优选地，所述扩增模块中，所述滚环扩增后还包括对游离的模板和探针进行消化；
优选地，所述消化采用单链DNA消化酶进行处理。
第三方面，本发明提供第一方面所述的不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法在核酸扩增中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述滚环扩增方法可以直接对片段化的单链DNA或RNA进行滚环扩增，不需要RNA反转录成cDNA的环节。
(2)本发明所述滚环扩增方法中只使用一种聚合酶，不需要延伸酶和连接酶的参与，减少连接步骤能够降低成本，也摆脱了单双链核酸酶连效率低的限制。
(3)本发明所述滚环扩增方法操作简单，扩增时间短，只需要一步退火就可以进行RCA，整体操作时间小于两个小时。
(4)本发明所述滚环扩增属于恒温扩增技术，对设备依赖性低，应用范围广。
(5)本发明所述滚环扩增方法和普通的PCR相比，RCA属于单分子扩增，没有扩增偏好性不引入偏差，可以进行准确的定量分析。
附图说明
图1为实施例1中不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法的基本原理。
图2A为测试例1中低浓度0.6％琼脂糖胶电泳结果。
图2B为测试例1中高浓度3.5％琼脂糖胶电泳结果。
图3A为测试例1中靶核酸的Qsep100检测结果。
图3B为测试例1中探针的Qsep100检测结果。
图3C为测试例1中模板探针混合后的Qsep100检测结果。
图4为测试例2中环状退火结构的示意图。
图5为测试例3中RCA反应后和消化后的产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图6A为测试例4中Phi29聚合酶的扩增产物的测试结果。
图6B为测试例4中Bst聚合酶的扩增产物的测试结果。
图7A为测试例4中Phi29聚合酶的扩增产物的扫描电镜检测结果(比例尺100μm)。
图7B为测试例4中图7A中方框中的区域的放大图(比例尺10μm)。
图7C为测试例4中无RCA产物的空白对照的扫描电镜检测结果(比例尺100μm)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，所述扩增方法的基本原理如图1所示，将探针和靶核酸进行单链DNA退火结合形成中间产物，然后从双链结构的3’端作为延伸的起始位置，在聚合酶的作用下靶核酸和探针相互作为延伸模板链进行延伸至5’端，之后启动酶的DNA置换功能进行滚环扩增(RCA)。
所述方法包括如下步骤：
(1)将靶核酸、探针和退火缓冲溶液混合，进行退火，得到含有环状退火结构的反应液；
(2)将所述含有环状退火结构的反应液、具有链置换功能的聚合酶、酶缓冲溶液、dNTP和BSA混合，进行延伸和滚环扩增。
靶核酸和探针序列如下所示：
SEQ ID NO:1：
ggtgatccacctgtctcagcctcccaaagttgtaatcccagctggttgggaggctgaggtgggagacgtacacctatacagagatcgtgccattgcactccagcctgggc。
SEQ ID NO:2：
ctctagcacggtaacgtgaggtcggacccgctggtcaatgattgactggcatttcacacccagcctgttgacttagaggtcaccctcggaagctagagccctgtcctgcctcttcagtgtccactaggtggacagagtcggagggtttca。
SEQ ID NO:3：
tccacctgtctcagcctcccaaagttgtaatcccagctggttgggaggagacgtacacctatacacgtgccattgcactccagcctgggc。
SEQ ID NO:4：
ctctagcacggtaacgtgaggtcggacccgctggtcaatgaacggaagctagatcagtgtccactaggtggacagagtcggagggtttca。
SEQ ID NO:5：
ggtgatccacctgtctcagcctcccaaagttgtaatccagctgagacgtacacctatacagagatcgtgccattgcactccagcctgggc。
SEQ ID NO:6：
ggtgatccacctgtctcagcctcccaaagttgtaatccagacttactgagacgtacacctatacacgtgccattgcactccagcctgggc。
SEQ ID NO:7：
tccacctgtctcagcctcccaaagttgtaatccagacttactgagacgtacacctatacagagatcgtgccattgcactccagcctgggc。
SEQ ID NO:8：
tccacctgtctcagcctcccaaagttgtaatcccagctggttgggaggagacgtacacctatacacgtgccattgcactccagcctgggc。
SEQ ID NO:9：
agtgatatacatgtcgcagcatcacatagttgtactcgcagctggttgcgagtctgaggtgatatcgtgtaattacagtggagtctgaat。
SEQ ID NO:10：
ctatagcacattaatgtcacctcagacttactggtcaatgattgaccgcctcttcagtgttcactatatgtacagcgtcgtagtgtatca。
SEQ ID NO:11：
cacatagttgtaatcgcagctgcttgagaggctgaggtgagagacgtacacctatacaactcgcagctgacgtacacctatagatatcgt。
SEQ ID NO:12：
gttgagccaccggccgccgcctcgcatagttgtactcgcagctggttgcgagtctgaggtgtgagtaagccgctgcgcgccagcctgatt。
SEQ ID NO:13：
cactcattcggcgacgcgcggtcggactaacacccagcctggcgactgagaggtcaccgacaactcggtggccggcggcggagcgtatca。
SEQ ID NO:14：
agtaatatacatgtagaagcataacatagttgtactcgcagctggttgcgagtctgaggtgatattatgtaattaatgtggagtatgaat。
SEQ ID NO:15：
ctataatacattaattacacctcatacttactgatcaatgattaaccatctcttcagtgttcattatatgtacatcttcgtattgtatca。
退火体系如下所示：
探针P1和靶核酸T1的退火体系的退火条件为60℃、15min。
所述退火的反应体系为：50mM Tris-HCl、10mM MgCl2和10mM(NH4)2SO4。
延伸和滚环扩增的体系(使用Phi29聚合酶的RCA体系)如下所示：
RCA反应的条件为30℃、1h。
延伸和滚环扩增的体系(使用Bst聚合酶的RCA体系)如下所示：
RCA反应的条件为65℃、1h。
本实施例中所使用的样品的来源如下所示：
Bst聚合酶：NewEngland Biolabs(NEB)#M0537；
Phi29聚合酶：NewEngland Biolabs(NEB)#M0269；
dNTPs：NewEngland Biolabs(NEB)#N0447；
BSA：NewEngland Biolabs(NEB)#B9200。
测试例1
本测试例采用电泳和片段分析的方法进行扩增效果评估。
(1)电泳
普通电泳使用两种浓度的胶(0.6％和3.5％)，由于RCA产物直径较大，中间产物环状双链结构不能轻易进入高浓度琼脂糖胶的孔隙，所以使用低浓度0.6％胶用来检测。高浓度用来区分投入靶核酸、探针以及退火后的结构。
琼脂糖胶电泳结果如图2A和图2B所示，图2A为低浓度0.6％琼脂糖胶电泳结果，泳道M：marker；泳道1：P1T1；泳道2：P1T1重复；泳道3：P2T2；泳道4：P2T2重复；泳道5：P3T3；泳道6：P3T3重复1；泳道7：P3T3重复2。图2B为高浓度3.5％琼脂糖胶电泳结果，泳道M：marker；泳道1：P1T1；泳道2：P1T1重复；泳道3：P2T2；泳道4：P2T2重复；泳道5：P3T3；泳道6：P3T3重复1；泳道7：P3T3重复2。从电泳结果上看，高浓度3.5％的胶图可以很好的区分投入的靶核酸、探针和退火结构，因此可以用于分析模板和探针的利用率。
(2)片段分析
因为琼脂糖胶的分辨率低，所以片段分析仪比如Qseq100和Agilent2100也可以作为另一种判断和质控的方法，本发明采用Qseq100和专门检测单链DNA的卡夹进行测试。
测试样本包括：人工合成的76bp靶核酸(T2)、人工合成的100bp探针(P1)、靶核酸和探针混合物。
测试结果如图3A、图3B和图3C所示，其中图3A为靶核酸的Qsep100检测结果，图3B为探针的Qsep100检测结果，图3C为模板探针混合后的Qsep100检测结果。从测试结果可知，对于人工合成的76bp靶核酸和100bp的探针单独，或者混合，Qsep100都可以很精准的判断单链DNA的片段大小。
测试例2
本测试例研究了环状退火结构对产物浓度的影响，包括环状退火结构的GC含量和长度(碱基数)。
(1)GC含量对产物浓度的影响
待测样本核酸片段化随机情况和基因组GC不同，因此，对测试例进行了退火结合区域长度和GC差异的测试，采用Bst聚合酶和Phi29聚合酶进行平行测试。
GC含量20％ P5T5
GC含量40％ P3T3
GC含量70％ P4T4
GC设置了三个梯度分别是20％、40％和70％。退火和RCA的体系和条件参照实施例1，使用Thermofisher公司的Qubit ssDNA Assay kit对单链DNA的浓度进行测定，测定结果如表1所示。
表1
酶 GC20％ GC40％ GC70％
Bst聚合酶 18.2 35.4 16.8
Phi29聚合酶 10.1 24.8 13.4
从表1的结果可知，产物浓度结果显示和预期一样，过高或低的GC含量会影响探针和模板的结合，影响最终RCA产物的量。
(2)长度对产物浓度的影响
靶核酸和探针退火后形成的环状退火结构有两个结合区域(binding region，BR)，左右各一个，环状退火结构的示意图如图4所示。所以通过序列设计分别形成左右30bp的BR长度(探针P2-30-30；SEQ ID NO:5)，左边30bp和右边25bp的组合(探针P2-30-25；SEQID NO:6)，左边25bp和右边30bp的组合(探针P2-25-30；SEQ ID NO:7)，左右各25bp的BR组合(探针P2-25-25；SEQ ID NO:8)，还有一个极端的左边8bp和右边8bp组合(探针P3-8-8；SEQ ID NO:11)。
采用Bst聚合酶和Phi29聚合酶进行平行测试。退火和RCA的体系和条件参照实施例1，使用Thermofisher公司的Qubit ssDNA Assay kit对单链DNA的浓度进行测定，测定结果如表2所示。
表2
酶 30/30bp 30/25bp 25/30bp 25/25bp 8/8bp
Bst聚合酶 34.2 31.6 30.4 30.2 13.8
Phi29聚合酶 25 22.3 22.6 20.7 11.6
表2的结果显示两端BR越短RCA产物浓度越低，说明结合区域长度确实会影响RCA效果，BR长度越短RCA产物浓度越低，当BR长度降到8bp时产物浓度成倍下跌，说明BR太短的情况下对整个反应影响巨大。从结果上看Bst聚合酶和Phi29聚合酶两种酶的效果类似。
测试例3
本测试例研究了产物降解情况，RCA反应后体系中残留的很多的单链状态的靶核酸和探针。因此，为了进一步纯化和提高RCA产物比例，因此使用Exo I单链DNA消化酶进行处理。退火和RCA的体系和条件参照实施例1。单链DNA的浓度测定使用ThermoFisher公司的Qubit ssDNA Assay kit。
本测试例中使用的探针和靶核酸如下所示：
探针为：P2
靶核酸为：T2
对退火后和RCA后分别使用Exo I单链DNA消化酶进行处理。处理步骤如下所示：
按照每20μL溶液加入1μL Exo I单链DNA消化酶(单位：200U/μL)，消化条件为：37℃、30min；
消化后，使用ThermoFisher公司的Qubit ssDNA Assay kit对单链DNA的浓度进行测定，结果如表3所示。
表3
测试样本 Bst聚合酶(ng/μL) Phi29聚合酶(ng/μL)
退火后产物 6.86 2.86
退火后消化产物 0.92 0.64
RCA反应后产物 20.6 26.8
RCA反应后消化产物 13.3 15.9
从表3可知，退火后和RCA后分别做了Exo I酶消化，退火后产物消化后单链DNA的浓度降到1ng/μL以下，说明大部分消化的是游离的模板和探针。RCA反应后产物经过消化后浓度降低大概40％，剩余60％主要是滚环后的纳米球，虽然是单链但纳米球的3D空间结构使Exo I酶无法结合并启动降解。
含有Phi29聚合酶的反应体系中RCA反应后和消化后的产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示，从电泳胶图上可以看出，Exo I酶(exo I)处理后小片段条带很淡，剩余的应该是非单链状态的退火结构，但对双链的中间产物并不产生影响。
测试例4
本测试例对RCA反应产物进行分析。
本测试例中使用的探针和靶核酸如下所示：
探针为：P2
靶核酸为：T2
退火和RCA的体系和条件参照实施例1。
通过Qseq100对单链DNA扩增产物进行片段分析，Phi29聚合酶的扩增产物的测试结果如图6A所示，Bst聚合酶的扩增产物的测试结果如图6B所示；结果显示Phi29聚合酶扩增产物的大片段大小在27k左右，Bst聚合酶的RCA产物的大片段大小大于50k，说明Bst聚合酶的产生的纳米球直径更大。
将Phi29聚合酶的扩增产物进行处理，送扫描电镜观察，扫描电镜检测结果如图7A和图7B所示，其中图7A为Phi29聚合酶的扩增产物的扫描电镜检测结果(100μm)，图7B为图7A中方框中的区域的放大图(10μm)；图7C为无RCA产物的空白对照的扫描电镜检测结果(100μm)。电镜结果显示，没有RCA产物的空白对照在电镜下几乎看不到任何东西，Phi29聚合酶的扩增产物在电镜看到明显不规则纳米结构的DNA产物，大小在500-1000nm左右。
综上，本发明所述不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法不通过自连反应成环也能启动RCA，不仅避免了自连效率低的问题也能保留原有RCA的优点。所述滚环扩增方法中只用一种聚合酶，不需要延伸酶和连接酶的参与，减少连接步骤能够降低成本，摆脱了单双链核酸酶连效率低的限制；同时，所述方法使用简单，操作方便，属于恒温扩增技术，对设备依赖性低，有利于推广应用。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (6)

1.一种不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述核酸恒温滚环扩增方法包括如下步骤：
（1）将靶核酸和探针混合，进行退火，得到含有环状退火结构的反应液；所述靶核酸包括单链DNA或单链RNA；所述环状退火结构包括首尾相连接的退火结合区一、未配对的单链靶核酸、退火结合区二和未配对的单链探针；所述退火结合区一为所述靶核酸的5’端与所述探针的3’端100%互补配对形成的；所述退火结合区二为所述靶核酸的3’端与所述探针的5’端100%互补配对形成的；所述退火结合区一和退火结合区二的GC含量各自独立的为40-60%；所述退火结合区一和退火结合区二的长度各自独立的为25-30 bp；所述探针的碱基数大于等于90 bp；
（2）将所述含有环状退火结构的反应液、具有链置换功能的聚合酶、酶缓冲溶液、dNTP和BSA混合，进行延伸和滚环扩增；所述具有链置换功能的聚合酶包括Bst聚合酶或Phi29聚合酶；
所述延伸的步骤包括：分别以退火结合区一和退火结合区二的3’端作为延伸的起始位置，在具有链置换功能的聚合酶的作用下，未配对的单链靶核酸和未配对的单链探针相互作为延伸模板链延伸至5’端，得到双链环状中间产物；所述滚环扩增后还包括采用单链DNA消化酶对游离的靶核酸和探针进行消化。
2.根据权利要求1所述的不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，所述靶核酸与探针的摩尔比为(0.3-0.7):1。
3.根据权利要求1所述的不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，所述退火的温度为50-70℃。
4.根据权利要求1所述的不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，所述退火的时间为10-60 min。
5.根据权利要求1所述的不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法，其特征在于，步骤（2）中，所述滚环扩增的步骤包括：
以双链环状中间产物为模板，启动所述具有链置换功能的聚合酶的置换功能进行滚环扩增。
6.权利要求1-5中任一项所述的不依赖连接的核酸恒温滚环扩增方法在核酸扩增中的应用。
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