CN108384832B

CN108384832B - 一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法

Info

Publication number: CN108384832B
Application number: CN201810129724.4A
Authority: CN
Inventors: 周翔; 姚倩; 袁荃; 王颖倩
Original assignee: Wuhan Shunkeda Biotech Co ltd; Wuhan University WHU
Current assignee: WUHAN SHUNKEDA BIOTECH Co.,Ltd.; Wuhan University WHU
Priority date: 2018-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2038-02-08
Also published as: CN108384832A

Abstract

本发明公开了一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法。该方法由四个部分组成：a.制备点状光子晶体；b.5’端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用T4RNA ligase 2连接成环；c.以成环的锁式探针作为模板，靶标miRNA作为引物，在phi29DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过加入二级引物，使线性滚环扩增沿着支链方向扩增，达到信号进一步放大；d.往滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料后加到点状光子晶体上进行检测。本发明通过利用光子晶体效应对发光的调控，增强荧光强度，从而增强检测的灵敏度，降低检测下限，在最优实验条件下，该方法的线性范围为0.1aM‑1pM，miRNA的检测限低至1aM。本发明无需对循环miRNA进行分离提取，可直接用于实际样本中循环miRNA的检测。

Description

一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法。

背景技术

癌症早期诊断对于实现早发现早治疗的目的，从而提高癌症患者存活率是非常重要的。癌症早期诊断主要是针对于癌症标记物的检测，DNA、RNA、蛋白、小分子等都可以作为癌症标记物。其中，miRNA(微小RNA)转录后水平可调控基因表达而参与调控了一些生命活动，包括细胞增殖、分化、细胞凋亡等多种生理和病理过程。目前研究表明，血清和其他体液中的循环miRNA的表达水平与癌症的发展、治疗响应和病人的存活直接相关，因此，以循环miRNA作为癌症标记物的研究对于癌症早期诊断具有重大的意义。然而，血清中的循环miRNA的含量通常都极低，如何准确地检测血清中超痕量的循环miRNA一直以来都是困扰人们的重要问题。另一方面，传统的miRNA检测方法，如RT-PCR、微阵列、第二代测序多局限于实验室昂贵而精密的仪器、前处理复杂、耗时较长，无法实现临床应用中简单便携、灵活、经济的诊断要求。因此，为了实现癌症早期诊断的需要，开发一种即时、有效的可以实现多种循环miRNA的超痕量检测方法势在必行。

滚环扩增(RCA)是一种高效的等温酶促核酸扩增技术，该方法因具有操作简单、普适性强、特异性高、灵敏度高而被广泛地运用于DNA、RNA、蛋白的检测中。由于miRNA可以作为锁式探针链的连接模板，同时也可以作为等温扩增的引物这一巧妙设计而为miRNA的检测提供了新的检测途径。Li课题组提出超分支滚环扩增的方法，将微量检测物信号放大，从而提高了检测灵敏度，检出限可达到10fM。然而10fM的检出限还是没有达到超痕量的检测目的。

光子晶体是介质的周期排列而构成的一种人工微结构材料，具有光子带隙和周期性变化的折射率。近年来，由于光子晶体(PC)能够增强特定波长的光且能够实现在传播过程中最小损失的理想材料，而被广泛地运用于离子、DNA、蛋白等分子的低浓度检测中。最近有研究报道将光子晶体和荧光方法结合检测可卡因，可以将检出限降低到100aM。为了实现对miRNA的超痕量检测，设计一种运用光子晶体与滚环扩增双重增强的生物器件是一种理想的解决方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明通过光子晶体的分支滚环扩增的方法检测血清中的循环miRNA，该方法简单、用时短，且能够高灵敏地检测miRNA。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法，由以下四个部分组成：

一、向载玻片上涂覆PDMS层，烘干后向PDMS层上滴加微球分散液，加热，通过溶液挥发过程中的表面张力将微球有序的组装到PDMS基底上，形成点状光子晶体；所述微球为修饰或未修饰的二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯微球；

二、5’端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用T4RNA ligase2连接酶连接成环；

三、分支滚环扩增：以成环后的锁式探针作为模板、靶标miRNA作为引物，在Phi29DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过引入二级引物，与线性滚环扩增产物互补配对，沿着支链方向扩增，达到信号扩增的目的；

四、向滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料，孵育后将其滴加到光子晶体上进行检测。

所述的5’端磷酸化的锁式探针的两端序列分别与靶标miRNA互补配对，且无二级结构；所述的二级引物能与线性滚环扩增的产物互补配对，但不与靶标miRNA完全互补配对。

所述微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球。

优选地，上述结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法包括如下步骤：

(1)将PDMS预混液旋涂于载玻片上，60～70℃恒温20-30小时，完全烘干，得到PDMS基底；将微球分散在水中，形成浑浊液，将浑浊液滴于PDMS基底上，恒温30～40℃，微球在PDMS基底上形成点状光子晶体；

(2)在连接体系中加入连接酶缓冲液、5’端磷酸化的锁式探针、待测样品、T4 RNAligase 2和水进行连接反应；

(3)向上一步体系中加入phi29 DNA聚合酶缓冲液、二级引物、phi29 DNA聚合酶、dNTPs和水进行滚环扩增反应，反应结束后对酶进行灭活；

(4)向上一步得到的滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料，避光孵育后滴于点状光子晶体上，使用固体荧光定量仪器定量，荧光激发波长为488nm，发射波长为524nm；靶标miRNA存在的情况下荧光强度增强，且荧光强度随着miRNA浓度增强而增强。

进一步优选地：

步骤(1)中将浑浊液滴于PDMS基底上后恒温温度为40℃。

步骤(2)中所述的连接反应的条件为16-39℃孵育1-3小时。

步骤(3)中，滚环扩增反应的条件为30-37℃孵育1.5-3小时，灭活的条件为60-70℃10-20分钟灭活。

步骤(4)中所述的避光孵育的条件为25-37℃避光孵育10-15分钟。

步骤(4)中所述的固体荧光定量仪器为荧光光谱仪或活体成像仪。

所述的活体成像仪是用PE Spectrum。

本发明的检测原理如图1所示。靶标miRNA能与5’端磷酸化的锁式探针的末端互补配对，T4 RNA ligase 2连接酶可识别该缺口并将其连接成环，形成miRNA和环状锁式探针的杂合体。在加入phi29 DNA聚合酶以及二级引物后，以miRNA为引物、环状锁式探针为模板发生分支滚环扩增，得到几千个重复序列的长线形双链DNA，加入荧光染料嵌入剂SYBRGREENⅠ，嵌入长线形双链DNA，在室温下孵育10分钟后加到点状光子晶体上，测试荧光强度。所述的活体成像仪是用PE Spectrum，激发波长488nm，发射波长为524nm。

与现有技术比较，本发明所述的结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法具有以下优点：

1.本发明利用光子晶体效应对发光的调控，增强荧光强度，从而增强检测的灵敏度，降低检测下限。

2.本发明结合滚环放大技术来检测血液中循环miRNA，所建立的方法具有超高的灵敏度，在最优实验条件下，该方法的线性范围为0.1aM-1pM，miRNA的检测限低至1aM。

3.本发明无需对循环miRNA进行分离提取，可直接用于实际样本中循环miRNA的检测。

4.本发明可以定量检测血清中循环miRNA。

附图说明

图1为本发明检测miRNA的原理示意图。

图2为let-7a的工作曲线。

图3为相同浓度下不同种类miRNA的荧光强度对比图。

图4展示了PC-RCA方法与RT-qPCR方法测得的4个健康的捐赠者(样品1-4)和4个非小细胞肺癌(NSCLC)患者(样品5-8)血清中let-7a的荧光强度响应值的对比情况。

具体实施方式

以下以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例以let-7a(序列为5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’)作为检测靶标。

(一)5’端磷酸化锁式探针padlock-7a、二级引物SP-7a的设计合成

(1)5’端磷酸化锁式探针padlock-7a的序列为：

5’-CTACTACCTCATTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGGATTTCGCAATTTTAACTATACAAC-3’

其中，两端标下划线的序列可与let-7a分别互补配对，中间式一段序列为38个碱基长度。

(2)二级引物SP-7的序列为：5’-CAACCTACTACCTCATTTGC-3’，与磷酸化锁式探针部分序列相同，可与线性滚环扩增产物互补配对，从而引发分支滚环扩增。

(二)点状光子晶体的制作

(1)PDMS基底的制作

PDMS与固化剂以10：1的质量分数比混合，剧烈搅拌30min，并且置于真空环境中以除气泡。之后将PDMS与固化剂的混合物旋涂到载玻片上，60℃烘干过夜，载玻片负载有干燥的PDMS基底。

(2)点状光子晶体的制作

将10μL单分散的羧基修饰的聚苯乙烯微球(2wt％的水分散液)垂直滴到疏水的PDMS基底上，之后在40℃加热板上加热，直至完全干燥，此时PDMS基底上负载有点状光子晶体，将其置于干燥环境中备用。

(三)let-7a的检测

(1)连接反应

在10μL连接反应体系中，加入20nM的磷酸化锁式探针padlock-7a，一系列浓度梯度的let-7a(0，0.1aM，1aM，10aM，100aM，1fM，10fM，100fM，1pM)2μL，1μL 10×T4 RNAliagse 2连接酶缓冲液，20U RNase inhibitor，用无酶水补齐到10μL，65℃加热5分钟，然后缓慢降温至39℃，然后在39℃下预孵育30分钟，加入2U T4 RNAligase 2，39℃孵育90分钟。

(2)分支滚环扩增反应

在上一步连接体系中直接加入2μL 10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、1μL浓度为10mM的dNTPs溶液、2μL浓度为1μM二级引物SP-7a，2U Phi29 DNA聚合酶，加入无酶水补齐至20μL，30℃孵育2小时，之后65℃灭活10分钟。

向步骤(2)得到的产物中加入1μL 40×SYBR GREENⅠ染液，混匀后25℃避光孵育10分钟，然后取4μL培养液加到点状光子晶体上，然后使用活体成像仪拍摄其在525nm处的荧光照片。结果图2所示，可检测到低至0.1aM的let-7a，随着let-7a浓度增加，荧光强度逐渐增强。荧光比值(F-F₀)/F₀在let-7a浓度的对数范围在一定范围内(0.1aM-1pM)呈良好的线性关系，线性方程为(F-F₀)/F₀＝20.32lg(C_let-7a)+403.52(R²＝0.9976)。此处，F₀和F分别式在不含和含有let-7a时的荧光强度。检测限为1aM(信噪比S/N＝3)。

(四)特异性检测

特异性检测所用到的其他miRNA如下：

let-7c：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU-3’

let-7f：5’-UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU-3’

miR-21：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’

miR-122：5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’

miR-155：5’-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGG-3’

miR-199：5’-ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA-3’

所用探针及二级引物、方法等均与let-7a的检测相同，所用miRNA的浓度均为1nM，结果见图3。

(五)血清样本的检测

为了验证本发明方法在实际样品检测中的使用性，对来自4个健康的捐赠者和4个NSCLC患者的血清样本进行了检测。

血清的处理方式为取20μL血清与80μL灭菌的1×PBS混合，95℃加热5分钟，快速降温到4℃，17,000×g离心20分钟，取上清备用。检测方法同步骤2。

检测结果如图4所示，荧光强度的变化值(ΔF)根据下列方程进行计算：ΔF＝F-F₀(F₀和F分别是血清样本和胎牛血清在524nm处的荧光强度)。检测发现，NSCLC患者的血清比健康人血清产生的荧光强度低，表明NSCLC患者血清中let-7a表达下调，这一结果与有关文献报道相一致。

为了验证本发明方法定量的准确性，运用qPCR分析方法对癌症患者血清样本中let-7a晶型分析，并将获得的结果与本发明所建立的荧光检测结果进行比较。结果表明这两种方法测得的结果基本一致。说明本发明方法有望用于实际样本中miRNA的准确和可靠检测。

上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方法并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方法，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉顺可达生物科技有限公司

武汉大学

<120> 一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 4

<211> 60

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cuacuaccuc auuugcauuu caguuuacgg uuuaggauuu cgcaauuuua acuauacaac 60

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caaccuacua ccucauuugc 20

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ugagguagua gguuguaugg uu 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ugagguagua gauuguauag uu 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uuaaugcuaa ucgugauagg gg 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acaguagucu gcacauuggu ua 22

Claims

1.一种结合光子晶体的分支滚环扩增检测miRNA的方法，其特征在于，由以下四个部分组成：

(1)向载玻片上涂覆PDMS层，烘干后向PDMS层上滴加微球水分散液，加热，通过溶液挥发过程中的表面张力将微球有序的组装到PDMS基底上，形成点状光子晶体；所述微球为修饰有羧基的二氧化硅、聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯微球；

(2)5’端磷酸化的锁式探针的两末端与靶标miRNA互补配对后利用T4 RNA ligase 2连接酶连接成环；连接条件为：2U T4 RNA ligase 2，39℃孵育90分钟；

(3)分支滚环扩增：以成环后的锁式探针作为模板、靶标miRNA作为引物，在Phi29 DNA聚合酶的作用下发生线性滚环扩增，通过引入二级引物，与线性滚环扩增产物互补配对，沿着支链方向扩增，达到信号扩增的目的；

(4)向滚环扩增产物中加入SYBR GREENⅠ染料，孵育后将其滴加到光子晶体上进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的5’端磷酸化的锁式探针的两端序列分别与靶标miRNA互补配对，且无二级结构；所述的二级引物能与线性滚环扩增的产物互补配对，但不与靶标miRNA完全互补配对。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微球为羧基修饰的聚苯乙烯微球。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中将浑浊液滴于PDMS基底上后恒温温度为40℃。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，滚环扩增反应的条件为30-37℃孵育1.5-3小时，灭活的条件为60-70℃灭活10-20分钟。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的避光孵育的条件为25-37℃避光孵育10-15分钟。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的固体荧光定量仪器为荧光光谱仪或活体成像仪。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的活体成像仪是用PE Spectrum。