CN113943834B

CN113943834B - 一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应用

Info

Publication number: CN113943834B
Application number: CN202111287242.XA
Authority: CN
Inventors: 习杨; 刘晏霖; 楼敬伟
Original assignee: Shanghai Biotecan Medical Diagnostics Co ltd; Shanghai Zhangjiang Medical Innovation Research Institute; Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Biotecan Medical Diagnostics Co ltd; Shanghai Zhangjiang Medical Innovation Research Institute; Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-02
Filing date: 2021-11-02
Publication date: 2023-11-28
Anticipated expiration: 2041-11-02
Also published as: CN113943834A

Abstract

本发明提供了一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019‑nCoV的引物探针组合及其应用，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019‑nCoV的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019‑nCoV的ORF1ab基因和核壳蛋白N基因的特异性引物对和探针；所述探针的结构包括从5’端到3’端顺次连接的5’端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3’端序列和C3阻断基团。本发明还提供了一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019‑nCoV的试剂盒及其以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法。所述试剂盒具有极好的灵敏度、特异性和准确性，检测效率高，具有极高的应用价值。

Description

一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应用

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，尤其涉及一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应用。

背景技术

新型冠状病毒2019-nCoV属于冠状病毒科、beta冠状病毒属，有包膜，病毒颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60～140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种SARS-CoV和MERS-CoV(中东呼吸综合症冠状病毒)则会引起严重的呼吸道病症。

新型冠状病毒(2019novel Coronavirus，2019-nCoV)是继SARS-CoV及MERS-CoV后一种新发现的传播力强、可感染人的冠状病毒。该病毒引发干咳、嗓子疼痛、头晕、乏力等症状，与普通感冒发烧不易区别，且现阶段由于新型冠状病毒的潜伏感染病例增多，很难从表型上有效判断潜在感染人群，增加了监控的难度。目前，核酸检测是判定该病毒的金标准，在普遍使用的自动化核酸抽提仪配套荧光定量PCR检测方法下，整个实验流程至少需要2.5～3小时，并且需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室。在大规模城市、进出口海关、机场或基层单位进行普筛时，急需更小型的POCT设备、方便快速的检测方法和相应的产品。部分研究人员利用恒温扩增方案进行相关的检测，但存在灵敏度低、易出现假阳性以及引物设计和反应体系复杂等问题。

因此，如何提供一种灵敏度高、特异性好、使用方便的新型冠状病毒的检测产品及对应的使用方法，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合具有良好的灵敏度，能在20min内快速、高特异性地检测到低水平的模板，与国内同类恒温扩增检测新冠核酸的产品相比，检测时间更短，灵敏度更高，且不易产生由高温引起的气溶胶污染；另外，恒温检测仪器相对低廉的价格为相关产品在基层技术条件落后地区的应用提供了条件。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因和核壳蛋白N基因的特异性引物对和探针；

所述探针的结构包括从5’端到3’端顺次连接的5’端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3’端序列和C3阻断基团。

本发明中，利用RPA(recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增)恒温扩增-实时荧光法结合水解探针技术，可以特异性对ORF1ab基因、N基因进行同步检测，从而快速、准确地对病毒进行有效预防和监控，灵敏度高，重复性好，精密度高，对于在基层进行大规模筛查具有极大的时效性和应用前景。

在所有恒温扩增技术中，RPA的检测时间仅需5～20min。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡聚核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也具有活性，其最佳反应温度在37～42℃。

RPA技术的反应原理如图1所示：

重组酶与引物结合，形成蛋白-DNA复合物，随后在dsDNA中寻找同源序列，引物定位同源序列后，就会发生链交换反应，形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。而被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步被替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在10分钟之内获得可检出水平的扩增产物。

RPA技术模拟了生物体内DNA复制、基于重组酶-聚合酶介导的扩增过程，它可以在极短的时间内使目的基因以指数级增长，若配合荧光标记的探针和荧光信号检测仪便可实现对模板扩增的实时监测。RPA恒温扩增技术可应用于生物防护、水体检验、食品检验、医疗诊断、微流体、兽医等于众多领域。此外，RPA恒温扩增技术对环境和硬件设施的要求相对很低，对于温度的要求也不是很高，它能够在恒定温度、较低温度下进行单分子核酸检测，大大降低了核酸检测的成本。

本发明中，通过将探针设计成具有从5’端到3’端顺次连接的5’端序列、荧光发生基团、四氢呋喃(THF)、间隔序列、荧光淬灭基团、3’端序列和C3阻断基团的结构，有利于同源重组反应以及引物与模板之间的替换。与传统探针相比，具有上述结构的探针提供了更多的互补位点，并且释放出可供检测的荧光信号，提高了检测反应的灵敏度；在探针末端设计C3阻断基团(C3 spacer)，可以抑制扩增反应，从而提高检测反应的特异性。

优选地，所述5’端序列的长度为不少于30bp，例如可以是30bp、31bp、32bp、33bp、34bp或35bp等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述荧光发生基团包括FAM、ROX或CY5中的任意一种。

优选地，所述间隔序列的长度为2～5bp，例如可以是2bp、3bp、4bp或5bp。

优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2中的任意一种。

优选地，所述3’端序列的长度为不少于13bp，例如可以是13bp、14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp或20bp等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，检测所述ORF1ab基因的探针的荧光发生基团包括FAM，荧光淬灭基团包括BHQ1。

优选地，检测所述核壳蛋白N基因的探针的荧光发生基团包括ROX，荧光淬灭基团包括BHQ2。

优选地，扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

优选地，扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.1：GCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGAT；

SEQ ID No.2：TGTAAGACGGGCTGCACTTACACCGCAAAC；

SEQ ID No.3：

AAGTATGTACAAATACCTACAACTTGTGCT-(FAM)-(THF)-AT-(BHQ1)-GACCCTGTGGGTTT-(C3 spacer)；

SEQ ID No.4：GTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCA；

SEQ ID No.5：GACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC；

SEQ ID No.6：

GCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCT-(ROX)-(THF)-CT-(BHQ2)-CTTGCTTTGCTGCT-(C3 spacer)。

优选地，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内标基因GAPDH的特异性引物对和探针。

本发明中，选用人管家基因GAPDH作为内标，用于监控样本采集、提取及检测整个实验流程，避免假阴性出现。

优选地，检测所述内标基因GAPDH的探针的荧光发生基团包括CY5，荧光淬灭基团包括BHQ2。

优选地，扩增所述内标基因GAPDH的特异性引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，检测所述内标基因GAPDH的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.7：AACCATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCA；

SEQ ID No.8：AGTCTTCTGGGTGGCAGTGATGGCATGGACT；

SEQ ID No.9：

GGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTAT(CY5)-(THF)-GT-(BHQ2)-GGAAGGACTCATGA-(C3 spacer)。

本发明中，选用不同的荧光发生基团对探针进行分别标记，可以在一次扩增反应中对多个待测基因进行同时检测，降低了检测成本，提高了检测效率。

第二方面，本发明提供了一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒包括第一方面所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合。

本发明中，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒设计科学，通过对反应体系进行优化，提高了检测的灵敏度与特异性，且使用方便，提高了检测效率。

优选地，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒还包括缓冲液、酶混合物、激活剂、阳性对照和阴性对照。

优选地，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合制成引物探针混合液。

优选地，所述酶混合物包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和解旋酶。

优选地，所述引物探针混合液、酶混合物和缓冲液制成预混液。

优选地，所述预混液中，引物探针混合液、酶混合物和缓冲液的体积比为1:(1～2):(3～5)，例如可以是1:1:3、1:1:3.5、1:1:4、1:1:4.5、1:1:5、1:1.5:3、1:1.5:3.5、1:1.5:4、1:1.5:4.5、1:1.5:5、1:2:3、1:2:3.5、1:2:4、1:2:4.5或1:2:5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为3:5:11。

本发明中，所述试剂盒适用于体外定性检测新型冠状病毒肺炎的疑似病例及其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、鼻咽拭子、痰液样本中的新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab和N基因的检测中，同时也适用于需要监控的产品或物品的检测中，如进出口货物等。

第三方面，本发明提供了第二方面所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，所述使用方法包括：

提取样本的RNA，使用第二方面所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒进行RPA恒温扩增，根据检测反应的Ct值进行判断。

本发明中，所述试剂盒的使用方法简单易行，检测时间短，检测效率高。

优选地，所述使用方法包括：

提取样本的RNA；

将所得RNA与预混液混合，再加入激活剂，进行RPA恒温扩增；

根据检测反应的Ct值进行判断。

优选地，所述RNA与预混液的体积比为1:(9～10)，例如可以是1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:9.5。

优选地，所述激活剂在反应体系中的体积分数为5％～10％，例如可以是5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:9.5。

优选地，所述RPA恒温扩增的温度为37～42℃，例如可以是37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃、40.5℃、41℃、41.5℃或42℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述使用方法还包括使用阳性对照和阴性对照进行同步检测的步骤。

本发明中，通过使用阳性对照和阴性对照进行同步检测，可以对检测过程进行监控，排除假阳性、假阴性结果的出现，提高检测的准确性。

本发明中，对待测样本、阳性对照以及阴性对照使用试剂盒进行恒温扩增的实时荧光检测，根据达到阈值时基因的Ct值范围定性判断基因检测的阴阳性，并最终结合ORF1ab及N基因的结果，判断样本的阴阳性。

作为优选技术方案，本发明所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，包括以下步骤：

(1)提取样本的RNA；

(2)将所得RNA与预混液按体积比为1:(9～10)混合，再加入体积分数为5％～10％的激活剂，在37～42℃下进行RPA恒温扩增，并使用阳性对照和阴性对照进行同步检测；

(3)根据检测反应的Ct值进行判断。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合和/或第二方面所述的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒在新型冠状病毒2019-nCoV检测装置中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合设计科学，通过对探针结构进行优化，提高了检测反应的灵敏度与特异性；

(2)本发明所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒使用方便，检测效率高，通过对反应体系进行优化，提高了扩增效率；通过使用阳性对照和阴性对照进行同步检测，提高了检测结果的准确性，实现了在20min内快速、特异地检测到低水平的新型冠状病毒，最低检出限低至50copies/mL，可稳定地对浓度为100copies/mL以上的样本进行高特异性、高准确性地检测；所述试剂盒还具有良好的平行性与重复性，批内变异系数均不大于4.75％，批间变异系数均不大于3.83％，应用价值更高。

附图说明

图1为本发明中RPA技术的反应原理；

图2为本发明测试例1中阳性对照的扩增曲线；

图3为本发明测试例1中阴性对照的扩增曲线。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料与方法：

酶混合物、缓冲液和激活剂均购自潍坊安普未来生物科技有限公司；

硕世检测试剂盒购自硕世生物科技股份有限公司，货号为Z-RR-0479-02-50；

之江检测试剂盒购自上海之江生物科技股份有限公司，货号为JC-10223-1N；

病毒RNA提取试剂盒购自硕世生物科技股份有限公司，货号为SDKF60101；

新型冠状病毒质控品来自北京康彻思坦生物技术有限公司。

实施例1

本实施例提供一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因和核壳蛋白N基因的特异性引物对和探针；

扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对包括SEQ ID No.1～2所示的核苷酸序列，检测所述ORF1ab基因的探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对包括SEQ ID No.4～5所示的核苷酸序列，检测所述核壳蛋白N基因的探针包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.1：GCCACATAGATCATCCAAATCCTAAAGGAT；

SEQ ID No.2：TGTAAGACGGGCTGCACTTACACCGCAAAC；

SEQ ID No.3：

SEQ ID No.4：GTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCA；

SEQ ID No.5：GACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC；

SEQ ID No.6：

所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合还包括特异性扩增并检测内标基因GAPDH的特异性引物对和探针；

扩增所述内标基因GAPDH的特异性引物对包括SEQ ID No.7～8所示的核苷酸序列，检测所述内标基因GAPDH的探针包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.7：AACCATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCA；

SEQ ID No.8：AGTCTTCTGGGTGGCAGTGATGGCATGGACT；

SEQ ID No.9：

本发明所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物对设计科学，探针结构合理，检测结果准确。

实施例2

本实施例提供一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒包括实施例1中的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合、缓冲液、酶混合物、激活剂、阳性对照和阴性对照。

所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合制成引物探针混合液；

所述酶混合物包括结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶和解旋酶；

所述引物探针混合液、酶混合物和缓冲液按体积比为3:5:11制成预混液；

所述激活剂为Mg²⁺；

所述阴性对照为无菌去离子水；

所述阳性对照为自配阳性标准品，其中，ORF1ab基因、N基因及内标基因GAPDH的企业阳性参考品按摩尔比为1:2:3混合。

本发明所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒通过对反应体系进行优化，提高了检测反应的特异性与灵敏度，且使用方便，操作简单，提升了检测效率。

对比例1

本对比例提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，为硕世生物科技股份有限公司生产的产品，货号为Z-RR-0479-02-50。

对比例2

本对比例提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒，为上海之江生物科技股份有限公司生产的产品，货号为JC-10223-1N。

测试例1

本测试例验证实施例2和对比例1～2中的试剂盒的最低检出限。

将已知拷贝数的新型冠状病毒质控品(北京康彻思坦)作为模板，进行梯度稀释，使体系中模板的浓度依次为1000copies/mL、500copies/mL、100copies/mL、50copies/mL和10copies/mL，同时设置自配阳性标准品作为阳性对照，以及无菌去离子水的阴性对照。

对比例1～2中的试剂盒的反应体系及检测方法参照说明书上的说明，实施例2中的试剂盒的反应体系如下：

检测方法如下：

(1)将模板与预混液按体积比为1:9.5混合，再加入激活剂，在42℃下进行RPA恒温扩增，并使用阴性对照进行同步检测；

扩增程序为：42℃，30s，循环40次；

将反应管放入荧光检测设备中，并提前设置仪器参数至“start”前；

(2)根据检测反应的Ct值进行判断：

选择FAM、ROX、CY5检测通道，淬灭基团选None；

根据分析后的图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值，将阴性对照的扩增曲线调整为平直或低于阈值线，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面查看结果。

其中，实施例2中的试剂盒的判断标准如下：

针对ORF1ab基因与N基因：

ORF1ab基因与N基因单通道或双通道的Ct值≤37，曲线有明显指数增长期，判定样本为阳性；

ORF1ab基因与N基因均为Ct值＞40或未检出，判定样本为阴性；

ORF1ab基因与N基因单通道或双通道37＜Ct值≤40时，进行重复检测，若复测结果显示ORF1ab基因与N基因单通道的Ct值≤37，或双通道37＜Ct值≤40，且曲线有明显的指数增长期，判定样本为阳性，否则判定为阴性；

针对内标基因：

内标GAPDH基因的Ct值≤37证明结果可信，否则进行复测；

当样本判定为阳性时若GAPDH基因的Ct值＞37或未检出，结果仍然可信。

对比例1中的试剂盒的判断标准如下：

针对ORF1ab基因与N基因：

ORF1ab基因与N基因单通道或双通道的Ct值≤37，曲线呈S型且有明显指数增长期，判定样本为阳性；

ORF1ab基因与N基因均为Ct值＞40或未检出，判定样本为阴性；

ORF1ab基因与N基因单通道或双通道37＜Ct值≤40时，进行重复检测，若复测结果显示ORF1ab基因与N基因单通道的Ct值≤37，或双通道37＜Ct值≤40，曲线呈标准S型且有明显的指数增长期，判定样本为阳性，否则判定为阴性；

针对内标基因：

内标基因的Ct值≤37证明结果可信，否则进行复测；

当样本判定为阳性时若内标基因的Ct值＞37或未检出，结果仍然可信。

对比例2中的试剂盒的判断标准如下：

ORF1ab基因、N基因与E基因三通道或双通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则判定样本为阳性；

ORF1ab基因或N基因单通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，与此同时，E基因单通道的Ct值>43或无数值，且内标通道Ct值≤35，则需复测。复测结果为ORF1ab、N和E三基因中至少一个基因单通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则判定样本为阳性；若复测结果三基因三通道的Ct值>43或无数值，且内标通道Ct值≤35均为阴性，则判定样本为阴性；

若三个基因中，仅E基因单通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则需重新采样检测：检测结果中若三个基因中至少2个基因单通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则判定样本为阳性；若三个基因单通道的Ct值>43或无数值，且内标通道Ct值≤35，则判定样本为阴性；若ORF1ab基因或N基因单通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则判定样本为阳性；若检测结果仍为E基因单通道的Ct值≤43，且扩增曲线呈典型的S型，则判定样本为2019-nCov阳性或其他近源冠状病毒阳性；

若ORF1ab基因、N基因与E基因三通道的Ct值>43或无数值，且内标通道Ct值≤35，则判定样本为阴性。

检测结果如表1所示，阳性对照和阴性对照的扩增曲线分别如图2和图3所示。

表1

由表1可以看出，实施例2中的试剂盒的最低检出限为50copies/mL，对比例1和对比例2中的试剂盒的最低检出限均为100copies/mL，说明本发明制备的试剂盒的灵敏度更高，检出限更低，效果优于市面上已有的产品。

由图2和图3可知，阳性对照有明显的扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，结果与预期相符，说明该检测系统符合检测要求。

测试例2

本测试例对实施例2中的恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒的批内精密度和批间精密度进行检测，步骤如下：

批内精密度检测

使用同一批试剂盒，参照测试例1中的体系及检测方法对同一个阳性参考品检测10次，通过分别统计三组荧光通道(FAM、ROX和CY5)的10个Ct值，计算变异系数，重复2组测试实验。

批间精密度检测

使用两批试剂盒，参照测试例1中的体系及检测方法对同一个阳性参考品检测10次，通过分别统计三组荧光通道(FAM、ROX和CY5)的20个Ct值，计算变异系数。

批内精密度的检测结果如表2和表3所示。

表2

表3

根据表2和表3的检测数据，计算批间精密度，结果如表4所示。

表4

荧光通道	变异系数(％)
		FAM	3.70
ROX	2.14
		CY5	3.83

根据表2、表3及表4的结果可以看出，所述试剂盒的批内变异系数均不大于4.75％，批间变异系数均不大于3.83％，满足变异系数小于5％的要求。证明所述试剂盒具有良好的平行性与重复性，检测结果更加准确。

综上所述，本发明所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合具有良好的扩增效率，配合优化后的反应体系，制成的试剂盒具有极高的灵敏度和极好的特异性，可以在20min内对低水平的样本模板进行快速、特异的检测；所述试剂盒还具有良好的平行性与重复性，使用方便，容易操作，在恒温下即可进行扩增，对检测设备的要求较低，且不易产生由高温引起的气溶胶污染，为相关产品的推广与使用奠定了基础。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 上海宝藤生物医药科技股份有限公司

上海宝藤医学检验所有限公司

上海张江医学创新研究院

<120> 一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合及其应

用

<130> 2021

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccacataga tcatccaaat cctaaaggat 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtaagacgg gctgcactta caccgcaaac 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagtatgtac aaatacctac aacttgtgct atgaccctgt gggttt 46

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcgcaacag ttcaagaaat tcaactccag gca 33

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacagtttgg ccttgttgtt gttggccttt ac 32

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct ctcttgcttt gctgct 46

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaccatgaga agtatgacaa cagcctcaag atca 34

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtcttctgg gtggcagtga tggcatggac t 31

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggccaaggtc atccatgaca actttggtat gtggaaggac tcatga 46

Claims

1.一种恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒以非疾病诊断和/或治疗为目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：

(1)提取样本的RNA；

(2)将所得RNA与预混液按体积比为1:9.5混合，再加入体积分数为5％～10％的激活剂，在37～42℃下进行RPA恒温扩增，并使用阳性对照和阴性对照进行同步检测；

(3)根据检测反应的Ct值进行判断；

所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒包括恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合；

所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒还包括缓冲液、酶混合物、激活剂、阳性对照和阴性对照；

所述激活剂为Mg²⁺；

所述引物探针混合液、酶混合物和缓冲液制成预混液；

所述预混液中，引物探针混合液、酶混合物和缓冲液的体积比为3:5:11；

所述恒温扩增快速核酸检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合包括特异性扩增并检测2019-nCoV的ORF1ab基因和核壳蛋白N基因的特异性引物对和探针；

所述探针的结构包括从5’端到3’端顺次连接的5’端序列、荧光发生基团、四氢呋喃、间隔序列、荧光淬灭基团、3’端序列和C3阻断基团；

扩增所述ORF1ab基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1～2所示，检测所述ORF1ab基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

扩增所述核壳蛋白N基因的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.4～5所示，检测所述核壳蛋白N基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

扩增所述内标基因GAPDH的特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.7～8所示，检测所述内标基因GAPDH的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

2.根据权利要求1所述的使用方法，其特征在于，检测所述内标基因GAPDH的探针的荧光发生基团包括CY5，荧光淬灭基团包括BHQ2；

检测所述ORF1ab基因的探针的荧光发生基团包括FAM，荧光淬灭基团包括BHQ1；

检测所述核壳蛋白N基因的探针的荧光发生基团包括ROX，荧光淬灭基团包括BHQ2。