CN112813195B - 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒 - Google Patents

基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括分别靶向靶向SARS‑CoV‑2 RNA的ORF1ab基因6513‑6537nt的O‑crRNA和靶向靶向SARS‑CoV‑2 RNA的N基因29214‑29238 nt的N‑crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液。本发明提供的检测方法无需反转录及核酸序列扩增步骤，避免了样品损失、扩增偏差和核酸复制产物可能造成的污染风险；操作步骤简单、无需昂贵的热循环仪且检测时间不超过1小时；可实现SARS‑CoV‑2 RNA单拷贝水平检测及绝对定量，无需内参校正和建立标准曲线。

Description

基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒核酸检测领域，特别涉及一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒SARS-CoV-2是引发全球性新冠肺炎(COVID-19)大爆发的致病原。目前用于检测SARS-CoV-2的方法主要有：病毒分离培养与电镜观察法、免疫学检测和分子生物学检测(包括核酸检测和测序)。其中，分子生物学检测方法中实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测是目前新冠肺炎确诊的金标准之一。但是在临床使用过程中也存在一些问题：包括当样品病毒核酸含量低、存在PCR抑制成分干扰和病毒发生变异与引物、探针结合能力下降等因素存在时，qRT-PCR检测阳性率低而需要反复检测或由此导致假阴性而漏检。
数字PCR包括微腔室数字PCR(chamber-based digital PCR，cdPCR)和微液滴数字PCR(droplet-based digital PCR，ddPCR)通过将样品分割到上千上万的微反应单元中，使得每个微反应单元中至多包含一个待测靶分子，然后进行PCR扩增使有无包含靶分子的微反应单元产生可检测的信号差别(如有无荧光)，分别计数对应微反应单元数目或比例，最后根据泊松分布原理即可推算出靶分子的原始拷贝数或浓度。相比于qRT-PCR，数字PCR在分散靶分子的同时液可以降低背景干扰和抑制，使得其定量过程受扩增效率的影响较小，因而对于新型病毒在靶标位置可能出现的变异有一定耐受性，可确保检出的稳定性与定量的精准性。而且，数字PCR不依赖阳性标准参照即可绝对定量病毒核酸含量。因此，数字PCR可用于对弱阳性标本或疑似病例进行较精确的复测，可用于新冠病毒早期感染筛查和无症状感染检测。
然而，包括数字PCR、qRT-PCR在内的基于核酸扩增的新冠病毒检测方法均涉及核酸的大量复制(数以万计)和反转录步骤。这些步骤也会带来一系列问题，包括不完全反转录造成的样品损失、引物及检测探针设计的复杂性、序列复制过程差错造成的扩增偏差以及扩增产物污染造成的假阳性风险。
发明内容
本发明为解决现有技术存在的不足，提供一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方实现的：
一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，包括分别靶向靶向SARS-CoV-2RNA的ORF1ab基因6513-6537nt的O-crRNA和靶向靶向SARS-CoV-2RNA的N基因29214-29238nt的N-crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液。
进一步，所述O-crRNA序列如SEQ ID No.1所示，所述N-crRNA序列如SEQ ID No.2所示。
进一步，所述反应缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl。
本发明还提供一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1准备样本：提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
S2配制反应体系：配制包含20nM Cas13a蛋白、100nM crRNAs、300nM单链RNA报告探针、1×反应缓冲液和0.02％(v/v)RNase抑制剂的反应体系，其中反应缓冲液包含10mMTris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl，pH 8.9；
S3制备微液滴：将上述反应混合液分散成直径约为30μm的微液滴，且有效微液滴总数目不低于20000个；
S4微液滴孵育反应：37℃恒温孵育上述微液滴60分钟；
S5微液滴反应结果的读取与分析：检测微液滴反应的结果，计算阳性液滴比例，并由泊松分布算法计算待测RNA的浓度。
相对于现有技术，本发明所述的基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒的有益效果是：
(1)本发明提供的检测方法无需反转录及核酸序列扩增步骤，避免了样品损失、扩增偏差和核酸复制产物可能造成的污染风险；
(2)检测方法为单步恒温反应，操作步骤简单、无需昂贵的热循环仪；
(3)可以用数字PCR阅读仪或荧光显微镜完成，检测时间不超过1小时；
(4)可实现SARS-CoV-2RNA单拷贝水平检测及绝对定量，无需内参校正和建立标准曲线。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是实施例1中SARS-CoV-2 RNA特征基因参考品定量检测的结果；
图2是实施例2中SARS-CoV-2 RNA检测特异性的测试结果；
图3是实施例3中SARS-CoV-2基因组RNA定量检测的结果；
图4是实施例4中临床样本SARS-CoV-2 RNA定量检测的结果。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，以便更清楚理解本发明的目的、特点和优点。应理解的是，附图所示的实施例并不是对本发明范围的限制，而只是为了说明本发明技术方案的实质精神。
一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括分别靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的ORF1ab基因6513-6537 nt的O-crRNA和靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的N基因29214-29238 nt的N-crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液。其中，O-crRNA序列如SEQ ID No.1所示，N-crRNA序列如SEQ ID No.2所示。反应缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl。
本发明所述的基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1准备样本：提取待测样本的核酸，得到核酸样本；
S2配制反应体系：配制包含20nM Cas13a蛋白、100nM crRNAs、300nM单链RNA报告探针、1×反应缓冲液和0.02％(v/v)RNase抑制剂的反应体系，其中反应缓冲液包含10mMTris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9；
S3制备微液滴：将上述反应混合液分散成直径约为30μm的微液滴，且有效微液滴总数目不低于20000个；
S4微液滴孵育反应：37℃恒温孵育上述微液滴60分钟；
S5微液滴反应结果的读取与分析：检测微液滴反应的结果，计算阳性液滴比例，并由泊松分布算法计算待测RNA的浓度。
本发明通过CRISPR-Cas13/crRNA复合体体系(Cas13体系)的特异性识别RNA序列且非特异性剪切周边单链RNA的特性，结合所形成的微液滴的限域作用，使得Cas13体系的RNA触发剪切效率更高，荧光信号强度也相对提高，便于靶分子RNA信号的识别或读取，从而达到达到无需核酸预扩增即可检测单个RNA分子的目的。本发明所述试剂盒包括靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的ORF1ab基因6513-6537 nt的O-crRNA(SEQ ID NO.1)，以及靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的N基因29214-29238 nt的N-crRNA(SEQ ID NO.2)。
以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、绝对定量检测SARS-CoV-2 RNA定量参考品
一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括分别靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的ORF1ab基因6513-6537 nt的O-crRNA和靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的N基因29214-29238 nt的N-crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液。
(1)RNA样品准备：用于本实验的SARS-CoV-2 RNA定量参考品购自中国计量科学研究院，该标准品内包含SARS-CoV-2的三种特征基因：全长N基因，全长E基因和orf1ab基因的片段(13201-15600nt)，其标称的RNA浓度是通过液滴数字PCR来测定的。
(2)反应体系配制：首先配制9μL反应预混液，其包含1μL反应缓冲液(Tris-HCl、MgCl2、KCl，pH 8.9)、1μL LubCas13a蛋白、1μL N-crRNA或O-crRNA、0.5μL单链RNA报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)和5.5μL DEPC处理水，然后添加1μL待测RNA样品混合均匀后形成本发明所述反应混合液。混合液中各组分的终浓度为Tris-HCl 1mM、MgCl2 0.15mM、KCl 5mM、LubCas13a蛋白2nM、N-crRNA或O-crRNA 10nM、单链RNA报告探针50nM。
(3)微液滴制备：将上述反应混合液分散成直径约为30μm的微液滴，且有效微液滴总数目不低于20000个。
(4)微液滴孵育反应：37℃恒温孵育上述微液滴60分钟；
(5)微液滴反应结果的读取与分析：检测微液滴反应的结果，计算阳性液滴比例p，并由泊松分布算法计算待测RNA的浓度。
利用该定量参考品梯度稀释测得的RNA浓度如图1所示，线性回归分析显示在RNA浓度为105-101copies/μL范围内测量浓度与预期浓度之间具有良好的线性关系(R2>0.999)，该结果同时显示本方法可以检测单拷贝SARS-CoV-2 RNA特征基因的能力。
实施例2、检测特异性测试
一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括分别靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的ORF1ab基因6513-6537 nt的O-crRNA和靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的N基因29214-29238 nt的N-crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液。
(1)用于测试N-crRNA特异性的3种冠状病毒——SARS-CoV-2、SARS病毒(SARS-CoV)和蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)对应的N基因体外转录产物，其相应的NCBI登录号分别为NC_045512、NC_004718和MG772933。测试前利用紫外分光光度计将上述体外转录产物调整至相同浓度水平。
(2)配制反应体系，其组分主要包含20nM LbuCas13a蛋白、100nM N-crRNA、300nMFQ 5U RNA荧光报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)、1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含10mMTris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9。
(3)将(1)所述3种体外转录产物以及无靶标对照品与上述(2)反应体系分别混合，随即在液滴发生芯片上分别形成直径为30μm的油包水离散微液滴，有效微液滴总数目不低于20000个。
(4)37℃孵育上述制备的液滴，持续时间为60分钟；
(5)将已完成步骤(4)的液滴至于荧光显微镜下扫描成像；
(6)设定液滴信号判定阈值为S/N≥3，其中S为液滴信号强度，N为平均背景信号。根据液滴的荧光强度阈值将液滴信号二值化，荧光强度高于判定阈值即为阳性“1”，否则判定为阴性“0”。统计液滴总数和阳性液滴数，根据阳性液滴比例p计算待测转录产物的含量C。
Figure GDA0003961554270000061
其中
Figure GDA0003961554270000062
该测试重复三次，其结果如图2所示，可以看出，本发明设计的适用于SARS-CoV-2检测的N-crRNA可以有效区分上述三种冠状病毒N-基因，非靶标测试物与无靶标对照均无阳性液滴出现，表现出了良好的特异性。
实施例3、全长SARS-CoV-2 RNA定量检测
一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括分别靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的ORF1ab基因6513-6537 nt的O-crRNA和靶向靶向SARS-CoV-2 RNA的N基因29214-29238 nt的N-crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液。
(1)样品准备：SARS-CoV-2基因组全长RNA样品由湖北省疾控中心以科研目的提供，测试前使用RNase-free水进行10倍梯度稀释。
(2)配制反应体系，其组分主要包含20nM LbuCas13a蛋白、100nM N-crRNA、300nMFQ 5U RNA荧光报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)、1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含10mMTris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9。
(3)将(1)所述样品RNA及无靶标对照品与上述(2)反应体系分别混合，随即在液滴发生芯片上分别形成直径为30μm的油包水离散微液滴，有效微液滴总数目不低于20000个。
(4)微液滴孵育反应：37℃恒温孵育上述微液滴60分钟；
(5)微液滴反应结果的读取与分析：检测微液滴反应的结果，计算阳性液滴比例p。
该测试重复三次，其结果如图3所示，液滴阳性率与梯度稀释倍数之间显示良好的线性响应关系提示本发明技术方案可以定量检测SARS-CoV-2基因组全长RNA。
实施例4、临床样本SARS-CoV-2 RNA定量检测
(1)样品准备：为验证本发明所述试剂盒在检测实际样品中的有效性，测试了40例疑似新冠肺炎患者咽拭子提取出来的核酸样品。该核酸样品由湖北省疾控中心以科研目的提供，并由该中心使用上海伯杰医疗科技有限公司提供的新冠病毒核酸定量检测试剂盒对上述核酸标本进行定量检测，其阳性标本的阈值循环数Ct结果如表1所示。
表1
Figure GDA0003961554270000081
(2)反应体系配制：首先配制7μL反应预混液，其包含1μL反应缓冲液(Tris-HCl、MgCl2、KCl，pH 8.9)、1μL LubCas13a蛋白、1μL N-crRNA或O-crRNA、0.5μL单链RNA报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)和2.5μL DEPC处理水，然后添加3μL待测RNA样品混合均匀后形成本发明所述反应混合液。混合液中各组分的终浓度为Tris-HCl 1mM、MgCl2 0.15mM、KCl 5mM、LubCas13a蛋白2nM、N-crRNA或O-crRNA 10nM、单链RNA报告探针50nM。
(3)微液滴制备：将上述反应混合液分散成直径约为30μm的微液滴，且有效微液滴总数目不低于20000个。
(4)微液滴孵育反应：37℃恒温孵育上述微液滴60分钟；
(5)微液滴反应结果的读取与分析：检测微液滴反应的结果，计算阳性液滴比例p，并由泊松分布算法计算待测RNA样品的浓度。
微滴法测试结果如图4所示，该结果表明本方法与qRT-PCR在检测结果上具有很好的一致性，由此证明了本方法用于实际标本检测的可行性。
以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）、华南师范大学
<120> 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAAC CCAACCUCUU CUGUAAUUUU UAAAC 55
<210> 2
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAAC AUGCCAAUGC GCGACAUUCC GAAGA 55

Claims (2)

1.一种基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括分别靶向SARS-CoV-2RNA的ORF1ab基因6513-6537nt的O-crRNA和靶向SARS-CoV-2RNA的N基因29214-29238nt的N-crRNA，Cas13a蛋白，单链RNA报告探针和反应缓冲液；
所述O-crRNA序列如SEQ ID No.1所示，所述N-crRNA序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mMKCl。
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