CN111621601A - 一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒2019‑nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法,所述新型冠状病毒2019‑nCoV包括ORF1ab基因、N基因和E基因,所述试剂盒包括数字PCR反应液A、数字PCR反应液B、数字PCR引物混合液C和阴性对照溶液D,所述数字PCR引物混合液C包括用于检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019‑nCoV的ORF1ab基因、N基因和E基因的正向引物、反向引物和引物探针,引物探针上设有至少一个荧光基团;检测方法包括以下几个步骤:核酸样本提取;PCR反应体系的配置;制备液滴;PCR扩增;结果分析与判定。本发明具有使快速准确检测新型冠状病毒2019‑nCoV的三个基因,检测过程不依赖于扩增曲线的阈值进行定量,不受扩增效率的影响,无需依靠标准曲线来测定核算量,操作简便,灵敏度高等优点。
Description
【技术领域】
本发明涉及新型冠状病毒检测的技术领域,特别是一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法的技术领域。
【背景技术】
2019年12月以来,陆续发现了多例不明原因肺炎病例,现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查,潜伏期一般为3-7天,最长不超过14天。鉴于该病潜伏期患者也可进行人传人现象,目前迫切需要一种灵敏和精确的方法,用于快速检测2019新型冠状病毒感染所引起的肺炎的。而《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》明确规定疑似病例,需要具备以下病原学证据之一者才能确诊:1.呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性;2.呼吸道标本或血液标本病毒基因测序,与已知的新型冠状病毒高度同源。
目前,各厂家快速研发的2019-nCov实时荧光RT-PCR试剂盒并不稳定,特别是个别病例在不同时间经5次以上的检测后结果由阴性转为阳性,为临床诊断和疾病控制带来极大的困难。因此实时荧光RT-PCR对有限的标本材料以及早期低病毒含量样本的检测仍存在一定的应用限制,如检测过程依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量,受扩增效率的影响。
与前述实时荧光RT-PCR相比,NGS虽然可以鉴定新的病毒株,也可用于早期低病毒含量样本的检测或实时荧光RT-PCR检测可疑或灰区结果的确认,但鉴于目前大多数医院缺乏测序设备、缺乏生信人员来协助测序结果的解读、缺乏研发阶段的流程和试剂配比的优化、缺乏阳性和阴性参考品的设立以及初步预临床试验的支持,再加上NGS的成本高和检测周期较长,目前还不适合于常规临床检测。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题,提出一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法,针对病毒3个靶基因设计特异性引物探针,数字PCR利用泊松分布计算出目标拷贝数,实现单分子检测,能够使快速准确检测新型冠状病毒2019-nCoV的三个基因,且操作简便灵敏度高。
为实现上述目的,本发明提出了一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,所述新型冠状病毒2019-nCoV包括ORF1ab基因、N基因和E基因,所述试剂盒包括数字PCR反应液A、数字PCR反应液B、数字PCR引物混合液C和阴性对照溶液D,所述数字PCR引物混合液C包括用于检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因和E基因的正向引物、反向引物和引物探针,引物探针上设有至少一个荧光基团。
作为优选,所述检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为ORF1ab-F、ORF1ab-R和ORF1ab-P,所述ORF1ab-F的正向引物序列为5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’,所述ORF1ab-F的反向引物序列为5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’,所述ORF1ab-P的探针序列为5’-ROX-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ2-3’,其中,ROX为荧光基团,BHQ2为淬灭基团。
作为优选,所述检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因的N基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为N-F、N-R、N-P,所述N-F的引物序列为5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’,所述N-R的引物序列为5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’,所述N-P的探针序列为5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3’,其中,FAM为荧光基团,BHQ1为淬灭基团。
作为优选,所述检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的E基因的F基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为E-F、E-R、E-P,所述E-F的引物序列为5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’,所述E-R的引物序列为5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’,所述E-P的探针序列为5’-CY5-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2-3’,其中CY5为荧光基团,BHQ2为淬灭基团。
作为优选,所述正向引物和反向引物的浓度为600nM,所述引物探针的浓度为200nM。
作为优选,所述数字PCR反应液A包括PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs、逆转录酶、热启动DNA酶,所述数字PCR反应液B为DTT溶液,所述阴性对照溶液D为生理盐水,所述PCR缓冲液为Tris-Hcl缓冲液。
本发明还提出了一种采用上述新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒的检测方法,包括以下几个步骤:
第一步,核酸样本提取;
第二步,PCR反应体系的配置;
第三步,制备液滴:取适量PCR反应液转移至液滴芯片中并进行油相封闭,放入样本制备仪中进行液滴制备处理,液滴芯片上生成液滴;
第四步,PCR扩增:将生成好液滴的液滴芯片放入PCR扩增仪中,设置PCR反应程序进行PCR扩增;
第五步,结果分析与判定:将经过PCR扩增后的液滴芯片放入生物芯片阅读仪中,生物芯片阅读仪对液滴芯片进行拍照并依据软件进行液滴定位和计算,获得各通道的阳性拷贝数浓度并根据各通道的阳性拷贝数浓度判定核酸样本的阴阳性;
其中,各通道的阳性拷贝数浓度判定时,若ROX≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若ROX<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若ROX≥0.1copy/μL且ROX<0.2copy/μL,则为灰区,需重新检测;若复检ROX<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若ROX≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
若FAM≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若FAM<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若FAM≥0.1copy/μL且FAM<0.2copy/μL,则为灰区,需重新检测;若复检FAM<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若FAM≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
若CY5≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若CY5<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若CY5≥0.1copy/μL且CY5<0.2copy/μL,则为灰区,该通道报告疑似阳性,需重新检测;若复检CY5<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若CY5≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
其中,以上3通道中至少2通道为阳性则核酸样本结果判定为阳性;若只有1通道为阳性,则核酸样本结果判读为疑似阳性;若3通道均为阴性,则核酸样本结果判读为阴性。
作为优选,所述第二步中PCR反应体系总体积为15μL且依次为2μL的数字PCR反应液A、1μL的数字PCR反应液B、1μL的数字PCR引物混合液C、5μL的核酸样本、6μL的DEPC H2O。
作为优选,所述第四步中的PCR反应程序设置为:45℃逆转录10min;95℃预变性5min;95℃变性15s,58℃退火30s,反应40个循环;28℃延伸10min,28℃保存。
作为优选,所述液滴芯片采用领航基因科技(杭州)有限公司的液滴芯片,所述第五步中的软件采用GenePMS软件。
本发明的有益效果:本发明对病毒3个靶基因设计特异性引物探针,通过多基因检测提高检测准确性,数字PCR利用泊松分布计算出目标拷贝数,实现单分子检测,能够使快速准确检测新型冠状病毒2019-nCoV的三个基因,与qRT-PCR相比,检测过程不依赖于扩增曲线的阈值(CT)进行定量,不受扩增效率的影响,且操作简便灵敏度高。
本发明的特征及优点将通过实施例进行详细说明。
【具体实施方式】
本发明一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,新型冠状病毒2019-nCoV包括ORF1ab基因、N基因和E基因,试剂盒包括数字PCR反应液A、数字PCR反应液B、数字PCR引物混合液C和阴性对照溶液D,所述数字PCR引物混合液C包括用于检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因和E基因的正向引物、反向引物和引物探针,引物探针上设有至少一个荧光基团,ORF1ab基因、N基因和E基因的正向引物、反向引物和引物探针的基因序号和序列号如下表所示:
序号 | 名称 | 序列 |
SEQ ID NO:1 | ORF1ab正向引物 | 5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’ |
SEQ ID NO:2 | ORF1ab反正向引物 | 5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’ |
SEQ ID NO:3 | ORF1ab探针 | 5’-ROX-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ2-3’ |
SEQ ID NO:4 | N基因正向引物 | 5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’ |
SEQ ID NO:5 | N基因反正向引物 | 5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’ |
SEQ ID NO:6 | N基因探针 | 5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3’ |
SEQ ID NO:7 | E基因正向引物 | 5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’ |
SEQ ID NO:8 | E基因反向引物 | 5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’ |
SEQ ID NO:9 | E基因探针 | 5’-CY5-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2-3’ |
由上表可知,检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为ORF1ab-F、ORF1ab-R和ORF1ab-P,所述ORF1ab-F的正向引物序列为5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’,所述ORF1ab-F的反向引物序列为5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’,所述ORF1ab-P的探针序列为5’-ROX-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ2-3’,其中,ROX为荧光基团,BHQ2为淬灭基团;
检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因的N基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为N-F、N-R、N-P,所述N-F的引物序列为5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’,所述N-R的引物序列为5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’,所述N-P的探针序列为5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3’,其中,FAM为荧光基团,BHQ1为淬灭基团;
检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的E基因的F基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为E-F、E-R、E-P,所述E-F的引物序列为5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’,所述E-R的引物序列为5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’,所述E-P的探针序列为5’-CY5-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2-3’,其中CY5为荧光基团,BHQ2为淬灭基团;
正向引物和反向引物的浓度为600nM,所述引物探针的浓度为200nM;
数字PCR反应液A包括PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs、逆转录酶、热启动DNA酶,所述数字PCR反应液B为DTT溶液,所述阴性对照溶液D为生理盐水,所述PCR缓冲液为Tris-Hcl缓冲液。
本发明还提出了一种采用上述新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒的检测方法,包括以下几个步骤:
第一步,核酸样本提取,取适量痰液、咽拭子、肺泡灌洗液中的至少一种作为样本,采用QIAGEN公司的试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(Cat#:52904)并根据操作说明书进行核酸样本的提取;
第二步,PCR反应体系的配置,PCR反应体系具体配置如下:
其中,PCR反应体系总体积为15μL且依次为2μL的数字PCR反应液A、1μL的数字PCR反应液B、1μL的数字PCR引物混合液C、5μL的核酸样本、6μL的DEPC H2O,DEPC H2O是一种灭菌水;
第三步,制备液滴:取第二步所配置15μL的PCR反应体系中的14μL转移至液滴芯片中并进行油相封闭,放入样本制备仪中进行液滴制备处理,液滴芯片上生成液滴,具体操作如下:
S01液滴生成前,请先开启样本制备仪,进行预热;
S02在超净工作台或生物安全柜中打开包装盒,取出液滴芯片,小心撕下芯片托架外包装及芯片杯子上方的密封膜,其中,使用前需先检查芯片,若有气泡或杯子内液面明显偏高则该芯片通道不可使,液滴芯片使用过程中,需放置在芯片托架上,且放置方向正确,芯片上的“pilot”图标需与芯片托架上的一致;
S03将15μL PCR反应体系沿杯壁缓慢加入到进口杯子内,再加入约16μL油相至进口杯子补满,后取出硅胶帽盖在进出口杯子上完成油相密封,其中,盖硅胶帽时,需捏住帽子两侧,切勿按压上方通气孔;
S04将液滴芯片及托架放在样本制备仪中,按“启动按钮”,进行液滴生成,液滴生成时,若托架上芯片不足4张,则需用配平芯片配平,以免影响液滴生成效果;
第四步,PCR扩增:将生成好液滴的液滴芯片放入PCR扩增仪中,设置PCR反应程序进行PCR扩增,PCR反应程序设置为:45℃逆转录10min;95℃预变性5min;95℃变性15s,58℃退火30s,反应40个循环;28℃延伸10min,28℃保存;
第五步,结果分析与判定:将经过PCR扩增后的液滴芯片放入生物芯片阅读仪中,生物芯片阅读仪对液滴芯片进行拍照并采用GenePMS软件进行液滴定位和计算,获得各通道的阳性拷贝数浓度并根据各通道的阳性拷贝数浓度判定核酸样本的阴阳性;
其中,阳性拷贝数浓度=阳性拷贝数/反应体系,如阳性拷贝数为3拷贝,反应体系为15μL,阳性拷贝数浓度=3/15=0.2copy/μL,各通道是指ROX通道、FAM通道和CY5通道,三个通道在滤光器下对应不同荧光;
各通道的阳性拷贝数浓度判定时,若ROX≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若ROX<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若ROX≥0.1copy/μL且ROX<0.2copy/μL,则为灰区,需重新检测;若复检ROX<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若ROX≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
若FAM≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若FAM<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若FAM≥0.1copy/μL且FAM<0.2copy/μL,则为灰区,需重新检测;若复检FAM<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若FAM≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
若CY5≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若CY5<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若CY5≥0.1copy/μL且CY5<0.2copy/μL,则为灰区,该通道报告疑似阳性,需重新检测;若复检CY5<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若CY5≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
其中,以上3通道中至少2通道为阳性则核酸样本结果判定为阳性;若只有1通道为阳性,则核酸样本结果判读为疑似阳性;若3通道均为阴性,则核酸样本结果判读为阴性;
上述的液滴芯片采用领航基因科技(杭州)有限公司的液滴芯片。
采用该试剂盒及上述检测方法对Ct值在36~39的qPCR检测灰区的样本进行快速复核检测,如取qPCR检测灰区的样本S1(36<Ct<37),S1(37<Ct<39),每个样本分为检测值1和检测值2两组,具体检测结果如下:
(+)代表阳性,(-)代表阴性
由上述检测结果可知,样本S1和样本S2中各组3通道的阳性拷贝数浓度均≥0.2copy/μL,三个通道均判定为阳性,而由于以上3通道任意2通道为阳性则四组样本结果判定为阳性。
采用该试剂盒及上述检测方法也可对Ct值在40以上的qPCR检测灰区的样本进行快速复核检测,如取qPCR检测灰区的样本S3(40<Ct<41),S1(Ct>41),每个样本分为检测值1和检测值2两组,具体检测结果如下:
(+)代表阳性,(-)代表阴性
由上述检测结果可知,样本S3中检测值1、2两组的ROX>0.2copy/μL、FAM>0.2copy/μL,CY5<0.2copy/μL,两个通道为阳性,则检测值1、检测值2结果判定为阳性,而样本S4中检测值2这组的ROX<0.2copy/μL、FAM=0.1copy/μL,CY5<0.2copy/μL,两个通道为阴性,一个通道为灰区,则S4样本检测值2结果判定为疑似阳性,样本S4中检测值1这组ROX>0.2IU/mL、FAM<0.1copy/μL,CY5>0.2IU/mL,则样本S4中检测值1结果判定为阳性。
上述实施例是对本发明的说明,不是对本发明的限定,任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,所述新型冠状病毒2019-nCoV包括ORF1ab基因、N基因和E基因,其特征在于:所述试剂盒包括数字PCR反应液A、数字PCR反应液B、数字PCR引物混合液C和阴性对照溶液D,所述数字PCR引物混合液C包括用于检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因、N基因和E基因的正向引物、反向引物和引物探针,引物探针上设有至少一个荧光基团。
2.如权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,其特征在于:所述检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因用的正向引物、反向引物和引物探针分别为ORF1ab-F、ORF1ab-R和ORF1ab-P,所述ORF1ab-F的正向引物序列为5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’,所述ORF1ab-F的反向引物序列为5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’,所述ORF1ab-P的探针序列为5’-ROX-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ2-3’,其中,ROX为荧光基团,BHQ2为淬灭基团。
3.如权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,其特征在于:所述检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因的N基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为N-F、N-R、N-P,所述N-F的引物序列为5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’,所述N-R的引物序列为5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’,所述N-P的探针序列为5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3’,其中,FAM为荧光基团,BHQ1为淬灭基团。
4.如权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,其特征在于:所述检测新型冠状病毒新型冠状病毒2019-nCoV的E基因的F基因的正向引物、反向引物和引物探针分别为E-F、E-R、E-P,所述E-F的引物序列为5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’,所述E-R的引物序列为5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’,所述E-P的探针序列为5’-CY5-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2-3’,其中CY5为荧光基团,BHQ2为淬灭基团。
5.如权利要求1所述的新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,其特征在于:所述正向引物和反向引物的浓度为600nM,所述引物探针的浓度为200nM。
6.如权利要求1至5中任一项所述的新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒,其特征在于:所述数字PCR反应液A包括PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs、逆转录酶、热启动DNA酶,所述数字PCR反应液B为DTT溶液,所述阴性对照溶液D为生理盐水,所述PCR缓冲液为Tris-Hcl缓冲液。
7.一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒的检测方法,其特征在于:包括以下几个步骤:
第一步,核酸样本提取;
第二步,PCR反应体系的配置;
第三步,制备液滴:取适量PCR反应液转移至液滴芯片中并进行油相封闭,放入样本制备仪中进行液滴制备处理,液滴芯片上生成液滴;
第四步,PCR扩增:将生成好液滴的液滴芯片放入PCR扩增仪中,设置PCR反应程序进行PCR扩增;
第五步,结果分析与判定:将经过PCR扩增后的液滴芯片放入生物芯片阅读仪中,生物芯片阅读仪对液滴芯片进行拍照并依据软件进行液滴定位和计算,获得各通道的阳性拷贝数浓度并根据各通道的阳性拷贝数浓度判定核酸样本的阴阳性;
其中,各通道的阳性拷贝数浓度判定时,若ROX≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若ROX<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若ROX≥0.1copy/μL且ROX<0.2copy/μL,则为灰区,需重新检测;若复检ROX<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若ROX≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
若FAM≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若FAM<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若FAM≥0.1copy/μL且FAM<0.2copy/μL,则为灰区,需重新检测;若复检FAM<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若FAM≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
若CY5≥0.2copy/μL,该通道判定为阳性;若CY5<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限;若CY5≥0.1copy/μL且CY5<0.2copy/μL,则为灰区,该通道报告疑似阳性,需重新检测;若复检CY5<0.1copy/μL,则该通道阴性或低于本试剂盒的检测下限,若CY5≥0.1copy/μL,则报告该通道阳性;
其中,以上3通道中至少2通道为阳性则核酸样本结果判定为阳性;若只有1通道为阳性,则核酸样本结果判读为疑似阳性;若3通道均为阴性,则核酸样本结果判读为阴性。
8.如权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述第二步中PCR反应体系总体积为15μL且依次为2μL的数字PCR反应液A、1μL的数字PCR反应液B、1μL的数字PCR引物混合液C、5μL的核酸样本、6μL的DEPC H2O。
9.如权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述第四步中的PCR反应程序设置为:45℃逆转录10min;95℃预变性5min;95℃变性15s,58℃退火30s,反应40个循环;28℃延伸10min,28℃保存。
10.如权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述液滴芯片采用领航基因科技(杭州)有限公司的液滴芯片,所述第五步中的软件采用GenePMS软件。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112813195A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-05-18 | 广州市第一人民医院(广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院) | 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒 |
CN112831600A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-05-25 | 连云港市妇幼保健院(连云港市第三人民医院) | 一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合及其应用 |
CN112979737A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-06-18 | 通用生物系统(安徽)有限公司 | 一种降低Taqman探针荧光背景的方法 |
CN113215312A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-06 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒及其应用 |
CN113388699A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-09-14 | 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司 | 数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
CN114480727A (zh) * | 2020-11-12 | 2022-05-13 | 台达电子国际(新加坡)私人有限公司 | 检测人类冠状病毒感染力的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111088405A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-05-01 | 苏州行知康众生物科技有限公司 | 用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法 |
CN111118225A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 新型冠状病毒核酸检测微滴式数字pcr试剂盒及其应用 |
CN111187858A (zh) * | 2020-02-11 | 2020-05-22 | 四川省医学科学院(四川省人民医院) | 新型冠状病毒检测试剂盒 |
CN111197112A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-05-26 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒 |
CN111270017A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-12 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 |
-
2020
- 2020-06-19 CN CN202010568888.4A patent/CN111621601A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111088405A (zh) * | 2020-02-06 | 2020-05-01 | 苏州行知康众生物科技有限公司 | 用于检测冠状病毒2019-nCoV的引物探针组合物、试剂盒及方法 |
CN111187858A (zh) * | 2020-02-11 | 2020-05-22 | 四川省医学科学院(四川省人民医院) | 新型冠状病毒检测试剂盒 |
CN111118225A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-08 | 苏州锐讯生物科技有限公司 | 新型冠状病毒核酸检测微滴式数字pcr试剂盒及其应用 |
CN111197112A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-05-26 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 一种检测新型冠状病毒的引物、探针及试剂盒 |
CN111270017A (zh) * | 2020-04-03 | 2020-06-12 | 深圳华因康基因科技有限公司 | 一种基于数字pcr检测新型冠状病毒的引物探针组合及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WANG X等: "Limits of Detection of 6 Approved RT-PCR Kits for the Novel SARS-Coronavirus-2 (SARS-CoV-2)" * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114480727A (zh) * | 2020-11-12 | 2022-05-13 | 台达电子国际(新加坡)私人有限公司 | 检测人类冠状病毒感染力的方法 |
CN112813195A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-05-18 | 广州市第一人民医院(广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院) | 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒 |
CN112813195B (zh) * | 2020-12-09 | 2023-04-18 | 广州市第一人民医院(广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院) | 基于微液滴数字分析的新型冠状病毒核酸定量检测试剂盒 |
CN112831600A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-05-25 | 连云港市妇幼保健院(连云港市第三人民医院) | 一种检测SARS-CoV-2病毒的引物探针组合及其应用 |
CN112979737A (zh) * | 2021-03-01 | 2021-06-18 | 通用生物系统(安徽)有限公司 | 一种降低Taqman探针荧光背景的方法 |
CN113215312A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-08-06 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一种冠状病毒SARS-CoV-2数字PCR多重检测试剂盒及其应用 |
CN113388699A (zh) * | 2021-06-17 | 2021-09-14 | 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司 | 数字pcr技术检测新型冠状病毒的试剂盒及方法 |
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