CN116356005B - 一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 - Google Patents
一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116356005B CN116356005B CN202310478160.6A CN202310478160A CN116356005B CN 116356005 B CN116356005 B CN 116356005B CN 202310478160 A CN202310478160 A CN 202310478160A CN 116356005 B CN116356005 B CN 116356005B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- car
- gene
- seq
- composition
- wpre
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 63
- 101150058750 ALB gene Proteins 0.000 claims description 16
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 39
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 abstract description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 9
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 8
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 101150058049 car gene Proteins 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 5-carboxytetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C([O-])=O YMZMTOFQCVHHFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000005485 electric heating Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及检测CAR‑T细胞拷贝数；更具体地，涉及检测ALB基因、CAR基因，和WPRE基因。本发明提供了一种能够检测CAR‑T细胞拷贝数的组合物。本发明的组合物，结合荧光探针法，能够使用一个管在一次试验中同时，检测其成本低，通量高。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。通过CAR基因双靶点的设计，能够进一步的保证检测结果的准确性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及检测CAR-T细胞拷贝数；更具体地，涉及检测ALB基因、CAR基因，和WPRE基因。
背景技术
WPRE即土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件，长度大约600bp，属于顺式作用元件(DNA序列)，由gamma，alpha，beta等三部分构成。WPRE的主要功能如下：1)提高病毒的包装滴度；2)帮助检测病毒的滴度；3)同时有效帮助mRNA的polyA加尾效率，增强转基因的表达和稳定。虽然具体的机制仍不十分明确，但是WPRE元件仍然被广泛使用在各种病毒载体中。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)因其在血液肿瘤中的显著疗效已成为肿瘤免疫治疗领域中的国际研究新热点，成为肿瘤治愈新的希望。在实验室，技术人员通过基因工程技术，将T细胞激活，并装上定位导航装置CAR(肿瘤嵌合抗原受体)，将T细胞这个普通“战士”改造成“超级战士”，即CAR-T细胞，他利用其“定位导航装置”CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。而在CAR-T细胞产品的生产中，通常是利用慢病毒载体将CAR基因高效地导入T细胞中，慢病毒在感染细胞的过程中会将WPRE和CAR基因一起整合至T细胞基因组中，因此除了直接检测CAR基因的拷贝数，也可用检测WPRE基因拷贝数来代表CAR基因在样品中的拷贝数情况。
因此本领域上迫切需要一种简便、快速、客观的检测CAR-T细胞拷贝数的方法，从而合理指导临床用药。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够检测CAR-T细胞拷贝数的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1所示的CAR基因-1上游引物、如SEQ ID NO:2所示的CAR基因-1下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的CAR基因-1探针；
如SEQ ID NO:4所示的CAR基因-2上游引物、如SEQ ID NO:5所示的CAR基因-2下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的CAR基因-2探针；
如SEQ ID NO:7所示的WPRE基因上游引物、如SEQ ID NO:8所示的WPRE基因下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的WPRE基因探针；和
如SEQ ID NO:10所示的ALB基因上游引物、如SEQ ID NO:11所示的ALB基因下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的ALB基因探针。
进一步地，组合物内各探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰，并且第二组内的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在本发明中，荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:3所示的CAR基因-1探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的CAR基因-2探针的荧光报告基团为VIC；如SEQ ID NO:9所示的WPRE基因探针的荧光报告基团为CY3；如SEQ ID NO:12所示的ALB基因探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
进一步地，所述内标检测人管家基因ALB基因序列的引物和探针。
进一步地，所述组合物进一步包括标准品。
进一步地，所述组合物中检测引物的用量为25～500nM；所述组合物中检测探针的用量为20～500nM；所述组合物中内标引物的用量为12.5～250nM；所述组合物中内标探针的用量为10～250nM。
在本发明中，术语“检测引物”和“检测探针”是指用于扩增并检测靶标基因的引物和探针。
在本发明中，术语“内标引物”和“内标探针”是指用于扩增并检测内标的引物和探针。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物存在于单独包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测CAR-T细胞拷贝数的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测CAR-T细胞拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200μl。
进一步地，所述组合物中检测引物的用量为25～500nM；所述组合物中检测探针的用量为20～500nM；所述组合物中内标引物的用量为12.5～250nM；所述组合物中内标探针的用量为10～250nM；所述dNTP的用量为0.2～0.3mM。
进一步地，所述逆转录酶的浓度为5U/μL～15U/μL，例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶；所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL～15U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明组合物的每一组的PCR体系为：
进一步地，所述试剂盒含有标准品，用于定量拷贝数。
进一步地，试剂盒中含有阳性对照和阴性对照，且阴阳性对照与待测标本需同步处理。阳性对照中由含有靶标基因特定核酸序列，例如人工合成的质粒，模拟实际临床标本；阴性对照由含有ALB管家基因目的片段。
第四方面，提供了一种用于制备检测CAR-T细胞拷贝数的试剂的用途，所述用途包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
进一步地，所述3)获得并分析结果包括以下：
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测CAR-T细胞拷贝数的方法，所述方法包括以下步骤：
1)释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
本发明的组合物，结合荧光探针法，能够使用一个管在一次试验中同时，检测其成本低，通量高。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。通过CAR基因双靶点的设计，能够进一步的保证检测结果的准确性。
附图说明
图1～4为本发明标准曲线图；
图5～8为本发明组合物扩增曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示：
表1
| 名称 | 核苷酸序列 |
| CAR-1正向引物 | GAGCCTACGCTGACGGGTTA |
| CAR-1反向引物 | GGTCCACGGTTGCCCTTAG |
| CAR-1探针 | FAM-CCGAGGTTAGCGGCT-NFQ-MGB |
| CAR-2正向引物 | CTGAATCCTATAGGTCACCGCA |
| CAR-2反向引物 | TCCACGGTTGCCCTTAGGTA |
| CAR-2探针 | VIC-CTGACGGGTTATCCGA-NFQ-MGB |
| WPRE正向引物 | CCGTTGTCAGGCAACGTG |
| WPRE反向引物 | AGCTGACAGGTGGTGGCAAT |
| WPRE探针 | CY3-TGCTGACGCAACCCCCACTGGT-NFQ-MGB |
| ALB正向引物 | TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT |
| ALB反向引物 | CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT |
| ALB探针 | CY5-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-NFQ-MGB |
其中，如SEQ ID NO:3所示的CAR基因-1探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的CAR基因-2探针的荧光报告基团为VIC；如SEQ ID NO:9所示的WPRE基因探针的荧光报告基团为CY3；如SEQ ID NO:12所示的ALB基因探针的荧光报告基团为CY5，探针的3’末端还具有NFQ-MGB猝灭基团。
实施例2、检测CAR-T细胞拷贝数的方法
材料
待测样品：将CAR-T细胞加入全血样品中，制成待测样品。
仪器
QuantStudioTM 5实时定量PCR仪购自赛默飞世尔科技，基因扩增仪购自杭州博日科技股份有限公司，超微量分光光度计购自IMPLEN GMBH，电热恒温水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司。
试剂
QIAamp DNABlood Midi Kits购自Qiagen；TaqManTM Fast Advanced Master Mix购自ABI，人基因组DNA购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。
合成标准品
在苏州金唯智生物科技有限公司合成CAR+WPRE+ALB基因片段，将此基因片段连接至质粒Puc57，获得重组质粒Puc57-CAR-WPRE-ALB。需要说明的是，本发明实施例所用质粒标准品为Puc57-CAR-WPRE-ALB质粒(全长3222bp)的线性化产物，线性化反应步骤包括以下步骤：
(1)酶切的反应体系见表2；
表2Puc57-CAR-WPRE-ALB质粒单酶切反应体系
(2)酶切的反应条件为37℃30分钟，80℃20分钟，4℃5分钟：
(2)使用AMPure XP磁珠对线性化产物进行纯化；
(3)使用超微量分光光度计测定线性化质粒浓度；
(4)按标准品拷贝数浓度的计算公式计算质粒标准品拷贝数浓度：
CAR-WPRE-ALB线性化质粒DNA拷贝数浓度(拷贝/μL)＝CAR-WPRE-ALB线性化质粒DNA浓度(ng/μL)×10-9(g/ng)×6.022×1023(mol-1)/(3222×650)(g/mol)；
其中：
CAR-WPRE-ALB线性化质粒的长度为3222bp；
碱基核苷酸平均分子量＝650道尔顿(Daltons)；
NA(阿伏伽德罗常数)＝6.022×1023(mol-1)；
(5)标准品母液的储存：每个反应上样5μL，因此1拷贝/μL＝5拷贝/反应，将质粒标准品稀释到1×108拷贝/反应，命名为标准品母液，-70℃冰箱保存。
提取待测样品的基因组DNA，测定样品DNA浓度。
根据Qiagen的《QIAamp DNA Blood Midi Handbook》操作说明书提取全血样品中基因组DNA，使用超微量分光光度计测定基因组DNA浓度，将DNA稀释至40ng/μL备用。
制备qPCR反应体系，反应体系见表3。
表3 qPCR反应体系的配制
| 组分 | 每孔体积(μL) | 终浓度 |
| TaqManTM Fast Advanced Master Mix | 12.5 | NA |
| CAR-1正向引物 | 0.75 | 300nM |
| CAR-1反向引物 | 0.75 | 300nM |
| CAR-1探针 | 0.5 | 200nM |
| CAR-2正向引物 | 0.75 | 300nM |
| CAR-2反向引物 | 0.75 | 300nM |
| CAR-2探针 | 0.5 | 200nM |
| WPRE正向引物 | 0.75 | 300nM |
| WPRE反向引物 | 0.75 | 300nM |
| WPRE探针 | 0.5 | 200nM |
| ALB正向引物 | 0.5 | 200nM |
| ALB反向引物 | 0.5 | 200nM |
| ALB探针 | 0.25 | 100nM |
| DNase/RNase-Free去离子水 | 0.25 | NA |
| 样品DNA | 5 | NA |
| 总共 | 25 | NA |
配制标准曲线用标准品溶液，配制步骤见表4。
表4标准曲线点的配制
上样检测。
(1)参数设置
参比荧光为ROX，CAR-1的报告基团选择FAM，淬灭基团选NFQ-MGB；CAR-2的报告基团选择VIC，淬灭基团选NFQ-MGB；WPRE的报告基团选择CY3，淬灭基团选NFQ-MGB；ALB的报告基团选择CY5，淬灭基团选NFQ-MGB，基线均为automatic/自动，阈值均为0.2。
(2)qPCR反应程序如表5所示。
表5 qPCR反应程序
结果判定及计算
检测结果见表6-表9，标准曲线图和扩增曲线图见图1-图8。
表6 CAR-1基因检测结果
表7 CAR-2基因检测结果
表8 WPRE基因检测结果
表9 ALB基因检测结果
结果判定
4个基因标准曲线斜率的相关系数R2均≥0.99，扩增效率均在90％～110％之间，阴性对照的Ct值应为Undetermined，检测结果是有效的。
根据公式计算每μg DNA中CAR/WPRE的拷贝数(拷贝/μg DNA)，公式见表10。
表10每μg DNA中CAR/WPRE的拷贝数计算公式
每μg DNA中CAR-1的拷贝数为46951.950拷贝/μg DNA，每μg DNA中CAR-2的拷贝数为49997.142拷贝/μg DNA，每μg DNA中WPRE的拷贝数为51820.735拷贝/μg DNA，三者间数值是接近的。
实施例3、本发明组合物测试临床样本的检测结果
设置检测样品为：6名健康志愿者的全血样品、pUC57质粒DNA、TE缓冲液、人基因组DNA、6名加入了CAR-T细胞的健康志愿者全血样品。
将上述样品按实施例1所示方法进行荧光定量PCR检测，结果如表11-表14所示。
表11专属性验证试验结果(CAR-1基因)
/>
表12专属性验证试验结果(CAR-2基因)
/>
/>
表13专属性验证试验结果(WPRE基因)
/>
表14专属性验证试验结果(ALB基因)
/>
根据表11-表13可知，CAR-1、CAR-2基因和WPRE基因在6名健康志愿者的全血样品、pUC57质粒DNA、TE缓冲液、人基因组DNA这些阴性样品中均未检测出，在6名加入了CAR-T细胞的健康志愿者全血样品中均能够检测出。
根据表14可知，ALB基因在pUC57质粒DNA、TE缓冲液这些阴性样品中均未检测出，在6名健康志愿者的全血样品、人基因组DNA、6名加入了CAR-T细胞的健康志愿者全血样品这些阳性样品中均能够检测出。
因此，本发明提供的检测CAR-1、CAR-2、WPRE和ALB拷贝数的引物探针具有良好的特异性。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
将标准品母液用TE缓冲液稀释成一系列浓度梯度样品：1×106拷贝/反应，1×105拷贝/反应，1×104拷贝/反应，1×103拷贝/反应，100拷贝/反应，50拷贝/反应，10拷贝/反应，分别标记为STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6、STD7。额外进行2次重复实验，实验结果见表15-表18。
表15灵敏度试验标准曲线重复试验结果(CAR-1基因)
表16灵敏度试验标准曲线重复试验结果(CAR-2基因)
表17灵敏度试验标准曲线重复试验结果(WPRE基因)
表18灵敏度试验标准曲线重复试验结果(ALB基因)
从表15-表18可以看出，标准曲线在1×106拷贝/反应～10拷贝/反应之间的线性很好，R2均在0.99以上，扩增效率均在90％～110％之间，阴性对照均未检测出，所有本方法的定量下限可以达到10拷贝/反应。
实施例5、本发明组合物的精密性
在实施例3的基础上，以5个浓度的样品(1×106拷贝/反应、5×104拷贝/反应、5×103拷贝/反应、500拷贝/反应、10拷贝/反应)作为验证样品来评估方法的准确度和精密度，进行3个分析批，计算其批内和批间准确度和精密度，详细数据见下表19-表22。
表19准确度和精密度结果(CAR-1基因)
表20准确度和精密度结果(CAR-2基因)
表21准确度和精密度结果(WPRE基因)
/>
表22准确度和精密度结果(ALB基因)
根据表19-表22的结果可知，在三次实验中，5个浓度的验证样品批内、批间准确度在85％～101％之间，本发明的试剂盒及检测方法的准确度验证符合标准要求。
根据表19-表22的结果可知，在三次实验中，5个浓度的验证样品批内、批间变异系数不超过16％，本发明的试剂盒及检测方法的精密度验证符合标准要求。
实施例6、检出限验证试验
检出限定义为能够检测到95％的阳性样品的最低浓度。取5拷贝/反应、2拷贝/反应和1拷贝/反应3个浓度点，每个浓度检测20个孔。每个浓度点的20个孔的Ct值分别与分析批中空白对照Ct值进行比较，确定检出限；20个孔中至少95％以上的Ct值小于上述Ct值，满足该要求的最低浓度点即为检出限。检出限结果见表23-表25。
表23检出限结果(CAR-1基因)
表24检出限结果(CAR-2基因)
表25检出限结果(WPRE基因)
根据表23-表25结果可知，本方法CAR-1、CAR-2和WPRE基因的检出限均为5拷贝/反应。
实施例7、多种靶标联检，引物探针之间的相互干扰
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，本发明设计了其余的组合物体系(对比例1～3)，按照上述方法进行同样的检测，结果发现其检测效果不如本申请，要么出现Ct值拖后，要么出现无峰的现象。因此，本发明的组合物具有唯一性。
实施例8、CAR基因防漏检
为了进一步说明本发明组合物的优越性，使用本发明的组合物组成三个不同体系(即含有CAR基因-1和CAR基因-2、仅含有CAR基因-1、仅含有CAR基因-2的组合物(其余引物探针保持不变))，对样本进行检测，结果发现，含有CAR基因-1和CAR基因-2的检出率为100％，仅含有CAR基因-1的检出率为85％，仅含有CAR基因-2的检出率为90％，结果表明，本发明组合物具有防止漏检的效果，结果更为准确。
Claims (7)
1.一种能够检测CAR-T细胞拷贝数的组合物，包括：
如SEQ ID NO:1所示的CAR基因-1上游引物、如SEQ ID NO:2所示的CAR基因-1下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的CAR基因-1探针；
如SEQ ID NO:4所示的CAR基因-2上游引物、如SEQ ID NO:5所示的CAR基因-2下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的CAR基因-2探针；
如SEQ ID NO:7所示的WPRE基因上游引物、如SEQ ID NO:8所示的WPRE基因下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的WPRE基因探针；和
如SEQ ID NO:10所示的ALB基因上游引物、如SEQ ID NO:11所示的ALB基因下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的ALB基因探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括标准品。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:3所示的CAR基因-1探针的荧光报告基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的CAR基因-2探针的荧光报告基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的WPRE基因探针的荧光报告基团为CY3；如SEQ ID NO:12所示的ALB基因探针的荧光报告基团为CY5。
4.根据权利要求1或3所述的组合物，其中，所述组合物中各成分以混合的形式存在。
5.权利要求1~4中任一项所述的组合物在制备检测CAR-T细胞拷贝数的试剂盒中的用途。
6.一种用于检测CAR-T细胞拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~4中任一项所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括标准品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310478160.6A CN116356005B (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310478160.6A CN116356005B (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116356005A CN116356005A (zh) | 2023-06-30 |
| CN116356005B true CN116356005B (zh) | 2023-09-26 |
Family
ID=86920213
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310478160.6A Active CN116356005B (zh) | 2023-04-28 | 2023-04-28 | 一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116356005B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117535451A (zh) * | 2024-01-08 | 2024-02-09 | 浙江康佰裕生物科技有限公司 | 检测car-t细胞中逆转录病毒载体拷贝数的引物、探针及试剂盒 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107827990A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-03-23 | 河北森朗生物科技有限公司 | 一种多肽、编码其的核酸、其修饰的t淋巴细胞及其应用 |
| CN111334565A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-06-26 | 时力生物科技（北京）有限公司 | 一种荧光定量pcr检测t淋巴细胞中car基因拷贝数的方法 |
| CN112322711A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-05 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 一种检测小鼠模型中人源car-t细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法 |
| CN112481361A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-03-12 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法 |
| CN114410844A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-29 | 宁波熙宁检测技术有限公司 | 多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR-T细胞产品中RCR阴阳性的方法 |
| WO2022138736A1 (ja) * | 2020-12-25 | 2022-06-30 | 株式会社 TL Genomics | シングルセルごとの特定の核酸のコピー数の検出方法 |
| CN114686576A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-07-01 | 武汉科技大学 | 一种用于检测单个car-t细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用 |
-
2023
- 2023-04-28 CN CN202310478160.6A patent/CN116356005B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107827990A (zh) * | 2017-10-30 | 2018-03-23 | 河北森朗生物科技有限公司 | 一种多肽、编码其的核酸、其修饰的t淋巴细胞及其应用 |
| CN111334565A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-06-26 | 时力生物科技（北京）有限公司 | 一种荧光定量pcr检测t淋巴细胞中car基因拷贝数的方法 |
| CN112322711A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-05 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 一种检测小鼠模型中人源car-t细胞拷贝数的引物组、试剂盒及方法 |
| CN112481361A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-03-12 | 北京鼎成肽源生物技术有限公司 | 检测平均单个car-t细胞中car基因拷贝数的引物组、荧光探针组、试剂盒及方法 |
| WO2022138736A1 (ja) * | 2020-12-25 | 2022-06-30 | 株式会社 TL Genomics | シングルセルごとの特定の核酸のコピー数の検出方法 |
| CN114410844A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-29 | 宁波熙宁检测技术有限公司 | 多重qPCR检测GALV和ALB拷贝数判定CAR-T细胞产品中RCR阴阳性的方法 |
| CN114686576A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-07-01 | 武汉科技大学 | 一种用于检测单个car-t细胞的慢病毒载体拷贝数的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Cav2.2 e37a基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定;王维 等;军医进修学院学报;第31卷(第10期);第1016-1018页 * |
| 中国人RHD基因合子型检测分析;侯磊 等;中国输血杂志;第22卷(第2期);第110-113页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116356005A (zh) | 2023-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109706232B (zh) | 用于检测人类alk基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法 | |
| CN106811533B (zh) | 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒 | |
| JP2002530090A (ja) | 核酸の定量的検出方法 | |
| CN114085903B (zh) | 检测线粒体3243a＞g突变的引物对探针组合产品及其试剂盒与检测方法 | |
| CN116356005B (zh) | 一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 | |
| CN111926114B (zh) | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
| CN104805206A (zh) | 检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法 | |
| CN111926116A (zh) | 快速定量检测鸭腺病毒4型的引物和探针及其检测方法与应用 | |
| CN111534514A (zh) | 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒 | |
| EP4180538A1 (en) | Composition for determining false positives by using specific artificial nucleotide sequence and method for determining false positives by using same | |
| CN110938711A (zh) | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法 | |
| CN113186342B (zh) | 一种18联呼吸道病毒核酸联合检测装置 | |
| CN113621737A (zh) | 一种流感病毒检测试剂盒及其应用 | |
| CN114085929B (zh) | 一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株和疫苗株的试剂盒 | |
| CN114959081A (zh) | 一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用 | |
| CN115125330A (zh) | 一种检测新型冠状病毒不同变异株的检测试剂盒及其应用 | |
| CN112266978A (zh) | 引物探针组合、检测试剂盒及其应用 | |
| CN109136367B (zh) | 提高braf基因v600e突变的诊断效率的方法 | |
| CN115044675B (zh) | 一种检测bcr-abl1融合基因亚型p190型的引物组及试剂盒 | |
| RU2804110C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для определения аллей полиморфизма rs55986091 и способ его применения | |
| CN111944923B (zh) | 一种检测呼吸道病原体多重荧光pcr试剂盒、方法和应用 | |
| CN113186261A (zh) | 基于单个探针的自引物恒温指数扩增方法在检测长链核酸中的应用 | |
| CN117535447A (zh) | 一种鉴别非洲猪瘟病毒的多重荧光定量pcr引物、探针及检测方法 | |
| CN118207303A (zh) | 一种定量检测嵌合抗原受体基因含量的方法及其应用 | |
| CN118064565A (zh) | 一种竞争性CRISPR-Dx检测体系 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |