CN112979737A - 一种降低Taqman探针荧光背景的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低Taqman探针荧光背景的方法，采用固相亚磷酰胺三酯法在全自动DNA合成仪上合成Taqman探针时3端淬灭基团CPG先加盖再脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应，再将合成板依次用DEA‑ACN混合液和ACN进行处理后，进行氨解，氨解结束后，进行脱洗将合成板中样品洗脱至全新96孔板中后，通过HPLC纯化分离得到探针，该方法在传统固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应中在首次脱保护前增加加帽步骤以阻止未标上淬灭基团的CPG参与后续反应，避免带荧光标记副产物存在，从而降低Taqman探针荧光背景。
Description
技术领域
本发明涉及DNA合成技术领域，具体涉及一种降低Taqman探针荧光背景的 方法。
背景技术
Taqman探针作为核酸检测试剂盒的核心原料，需要高质量来实现检测的精 准度，对其低背景荧光、高灵敏度有更高的要求。本发明中的Taqman探针合成 方法能较好的降低探针荧光背景，提高灵敏度，为高效的RT-PCR核酸检测提供 保障。
目前化学产品很难做到100％纯正，故Taqman探针3端淬灭基团CPG原料中会 存在少量未标记上淬灭基团的CPG，全自动DNA合成仪合成核酸引物探针时经脱 保护、耦连、加帽、氧化四步循环反应，得到的Taqman探针中会有纯化过程中 不易分离的微量荧光标记副产物存在，在后续qPCR检测中呈现出稍高的背景荧 光。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低Taqman探针荧光背景的方法。
本发明要解决的技术问题：
采用固相亚磷酰胺三酯法在全自动DNA合成仪上合成Taqman探针时3端淬灭 基团CPG先加盖再脱保护，以阻止未标上淬灭基团的CPG参与后续反应，避免带 荧光标记产物存在，从而降低Taqman探针荧光背景。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和 1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保 护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷 酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应 后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱 氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基 团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′ 端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10-15min后，在转速为 3500r/min的条件下，进行离心2-3次，每次离心2-3min后，加入质量分数90％ 的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3min，得到处理后的合成 板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压 强为70-90PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5-2h，氨解结束 后放掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为 3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min 的条件下，离心5min；
步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板 垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新 96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。
进一步，步骤A3所述的DEA-ACN混合液为体积比为2:8的DEA和ACN混合， DEA-ACN混合液的加入量为200μL，所得质量分数90％的ACN的加入量为300μL。
进一步，步骤A4所述的质量分数100％的ACN加入量为200μL，质量分数 90％的ACN加入量为200μL。
进一步，步骤A5所述的TEA的质量分数为5％，TEA的用量为260μL。
本发明的有益效果：在传统固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、耦连、加帽、 氧化四步循环反应中在首次脱保护前增加加帽步骤，以阻止未标上淬灭基团的 CPG参与后续反应，避免带荧光标记副产物存在，从而降低Taqman探针荧光背 景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要 使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一 些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还 可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Taqman探针全波长光谱扫描检测结果示意图；
图2为Taqman探针qPCR荧光背景检测结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造 性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和 1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保 护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷 酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应 后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱 氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基 团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′ 端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10min后，在转速为 3500r/min的条件下，进行离心2次，每次离心2min后，加入质量分数90％的 ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2min，得到处理后的合成板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压 强为70PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5h，氨解结束后放 掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为 3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min 的条件下，离心5min；
步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板 垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。
实施例2
一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和 1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保 护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷 酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应 后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱 氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基 团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′ 端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置15min后，在转速为 3500r/min的条件下，进行离心3次，每次离心3min后，加入质量分数90％的 ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心3min，得到处理后的合成板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压 强为90PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解2h，氨解结束后放掉 氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为3500r/min 的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条 件下，离心5min；
步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板 垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。
实施例3
一种降低Taqman探针荧光背景的方法，具体包括如下步骤：
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和 1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保 护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷 酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应 后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱 氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基 团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′ 端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10min后，在转速为 3500r/min的条件下，进行离心2次，每次离心2min后，加入质量分数90％的 ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2min，得到处理后的合成板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压 强为80PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5h，氨解结束后放 掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为 3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min 的条件下，离心5min；
步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板 垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针S2。
对比例
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT -BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入三氯乙酸 进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷 酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应 后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱 氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基 团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′ 端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10min后，在转速为 3500r/min的条件下，进行离心2次，每次离心2min后，加入质量分数90％的 ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2min，得到处理后的合成板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压 强为80PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5h，氨解结束后放 掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为 3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min 的条件下，离心5min；
步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板 垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新 96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针S1。
将实施例3制得的探针S2和对比例制得的探针S1经酶标仪OD260定量， 在保证探针浓度一致下，进行全波长光谱扫描，结果如下表1和图1所示；
表1
| 名称 | OD260 | 荧光强度 |
| 探针S1 | 0.115 | 872 |
| 探针S2 | 0.115 | 715 |
Taqman探针qPCR荧光背景检测：采用配套的已经成熟的引物及模板体系对 实施例3制得的探针S2和对比例制得的探针S1进行qPCR检测，结果如下表2 和图2所示；
表2
| 名称 | CT | 荧光信号 | 背景荧光 |
| 探针S1 | 25.45 | 52939 | 1404.9 |
| 探针S2 | 23.96 | 58043 | 1066.5 |
在保证只有探针不同的前提下：探针S2体系荧光信号是探针S1体系的1.1 倍，CT小1-1.5背景荧光值低30％。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技 术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替 代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本 发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
步骤A1：制备Taqman探针，该探针序列为5’FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ13’，将Taqman探针装填合成柱，将合成柱装入合成板中，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，封闭未标上淬灭基团的CPG后，加入三氯乙酸进行反应，脱去保护基团DMT，获得游离的5′羟基溶液；
步骤A2：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，制得核苷亚磷酸活化中间体，将核苷亚磷酸活化中间体与游离的5′羟基溶液进行缩合反应后，加入乙酸酐和1-甲基咪唑，终止反应后，加入碘，进行氧化反应，使得脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上后，加入三氯乙酸对5′羟基上的保护基团DMT进行脱保护，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上，再接5′端荧光基团；
步骤A3：向合成板中加入DEA-ACN混合液，静置10-15min后，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3次，每次离心2-3min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，进行离心2-3min，得到处理后的合成板；
步骤A4：向氨解仪中加入400mL水，将处理后的合成板加入氨解仪，在压强为70-90PSI，温度为90℃的条件下，通入氨基，进行氨解1.5-2h，氨解结束后放掉氨气，拿出合成板冷却至室温后，加入质量分数100％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min后，加入质量分数90％的ACN，在转速为3500r/min的条件下，离心5min；
步骤A5：向离心后的合成板中加入TEA，静置10min后置于全新96孔板垂直上方，在转速为3500r/min的条件下，进行离心5min，将样品洗脱至全新96孔板中后，进行HPLC纯化分离，得到探针。
2.根据权利要求1所述的一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：步骤A3所述的DEA-ACN混合液为体积比为2:8的DEA和ACN混合，DEA-ACN混合液的加入量为200μL，所得质量分数90％的ACN的加入量为300μL。
3.根据权利要求1所述的一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：步骤A4所述的质量分数100％的ACN加入量为200μL，质量分数90％的ACN加入量为200μL。
4.根据权利要求1所述的一种降低Taqman探针荧光背景的方法，其特征在于：步骤A5所述的TEA的质量分数为5％，TEA的用量为260μL。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113004342A (zh) * | 2021-03-02 | 2021-06-22 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 高gc含量的核酸引物的后处理方法 |
| WO2023019671A1 (zh) * | 2021-08-20 | 2023-02-23 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106868170A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-20 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 高信噪比多探针PCR Taqman探针及其应用 |
| CN111378783A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-07-07 | 杭州美中疾病基因研究院有限公司 | 新型冠状病毒2019-nCoV核酸试剂盒和病毒核酸采集方法 |
| CN111621601A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-09-04 | 绍兴同创医疗器械有限公司 | 一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法 |
-
2021
- 2021-03-01 CN CN202110226181.XA patent/CN112979737A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106868170A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-06-20 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 高信噪比多探针PCR Taqman探针及其应用 |
| CN111378783A (zh) * | 2020-03-04 | 2020-07-07 | 杭州美中疾病基因研究院有限公司 | 新型冠状病毒2019-nCoV核酸试剂盒和病毒核酸采集方法 |
| CN111621601A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-09-04 | 绍兴同创医疗器械有限公司 | 一种新型冠状病毒2019-nCoV数字PCR超敏检测试剂盒及检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李红霞: "两种Taqman探针的制备及荧光检测性能比较", 《化学研究与应用》 * |
| 阮红，等: "《基因工程原理》", 30 September 2007 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113004342A (zh) * | 2021-03-02 | 2021-06-22 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 高gc含量的核酸引物的后处理方法 |
| CN113004342B (zh) * | 2021-03-02 | 2022-12-23 | 通用生物(安徽)股份有限公司 | 高gc含量的核酸引物的后处理方法 |
| WO2023019671A1 (zh) * | 2021-08-20 | 2023-02-23 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种构建荧光寡核苷酸标准曲线的方法以及试剂盒 |
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