CN115010769B

CN115010769B - 固相亚磷酰胺三酯法合成长链rna核酸的方法

Info

Publication number: CN115010769B
Application number: CN202210929386.9A
Authority: CN
Inventors: 苏敏; 王舒心; 蔡晶晶; 李星豪
Original assignee: Shanghai Bioligo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Briggs Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2022-08-04
Filing date: 2022-08-04
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2042-08-04
Also published as: CN115010769A

Abstract

本发明提供一种固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA核酸的方法，所述RNA核酸至少分成三段合成，合成的每段RNA核酸长度在30‑60碱基，第一段RNA核酸合成依照固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、活化耦合、盖帽、氧化四个步骤完成第一段RNA核酸的合成，第二段以上每段RNA核酸合成依照固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、活化耦合、盖帽、氧化和盖帽五个步骤完成第二段以上每段RNA核酸的合成。本发明方法可以稳定合成长达100个碱基左右的长链RNA核酸，避免了生物转录方法合成RNA存在的蛋白宿主残留等问题。

Description

固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA核酸的方法

技术领域

本发明涉及核酸合成领域，特别涉及一种固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA核酸的方法。

背景技术

单链核酸由一定数量的脱氧核苷酸或者核苷酸组合而成。长链RNA核酸一般是由50个以上的核苷酸（rA、rG、rC、rU）组合而成。长链RNA核酸广泛应用于新型治疗策略开发、Crispr基因编辑、FISH（荧光原位杂交技术）以及RNA修饰对RNA-蛋白质复合物影响等领域。

长链RNA核酸在基因组功能研究、药物发现和生物合成等方面的作用日益重要。然而，长链RNA核酸合成一直面临着序列组成复杂、二级结构、修饰标记困难等挑战，尽管已经开发了一些巧妙的策略来优化这些问题并提高长链RNA核酸的合成效率，但受序列结构位阻效应影响，大于50个碱基长度的长链RNA核酸仍无法稳定且高效的合成。因此，迫切需要寻找一种合成长链RNA核酸的新方法。

在目前固相亚磷酰胺三酯法合成核酸合成中，当合成链过长，可采用分段合成，在合成到50及以上碱基时，可适当增加单体反应遍数，并适当加长试剂反应时长，以便充分反应。这种方法在合成长链DNA核酸时是可以实现长链DNA核酸的合成，但是在长链RNA核酸合成时则不能够实现。

DNA与RNA核酸的主要结构相似，最大的区别是RNA相比DNA，在糖基的2’具有一个羟基，而这个羟基是一个活性基团，它们结构式如以下式1所示。在合成过程中必须要进行预保护，避免在合成过程2’端发生副反应，用来保护2’羟基的保护基团（如叔丁基二甲基硅基（TBS）、三异丙基甲硅烷氧基甲基（TOM）等）会产生很大的空间位阻，从而导致长链RNA核酸的活化耦合效率降低。相比而言，现有的固相亚磷酰胺三酯法工艺最长可以合成至160个碱基长度的DNA核酸，而用于RNA核酸合成时一般最多只能合成50-55个碱基长度，合成超过50个碱基长度的RNA核酸就会逐渐出现严重的脱嘌呤与缺碱基的情况。并且合成RNA核酸的粗品纯度低于30%，则很难拿到合格的RNA核酸产品。

式1

目前超过50个碱基长度的长链RNA核酸的生产，往往只能采用生物转录合成的方法，即带有启动子的双链DNA模板，在T7，T3，SP6RNA聚合酶作用下，转录合成长单链RNA核酸。但是，该方法无法实现稳定的大规模生产，一些具有特殊结构的RNA，无法通过PCR方法获得足够量的DNA转录模板；传统的RNA转录合成方法往往要用到DNA聚合酶、RNA聚合酶、质粒、大肠杆菌等生物材料，会带有一定量的内毒素，宿主DNA和蛋白残留；凝胶电泳或氯仿抽提等纯化方法无法得到大规模且质量高的长链RNA核酸。

美国坎姆根公司在2014年公开了专利“反向高效合成长链RNA”，该制备方法也是基于固相亚磷酰胺三酯合成法的化学固相合成，其通过有机合成出反相RNA单体原料，使RNA核酸的合成方向从3’→5’转变为5’→3’。该方法无法实现稳定的大规模生产，反相RNA单体原料需要特殊定制，价格昂贵，且稳定性差，对长链RNA核酸标记修饰时，需要特殊定制修饰原料，不能满足目前的应用需求。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种固相亚磷酰胺三酯法合成RNA核酸的方法，所述RNA核酸至少分成三段合成，合成的每段RNA核酸长度在30-60碱基，第一段RNA核酸合成依照固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、活化耦合、盖帽、氧化四个步骤完成第一段RNA核酸的合成，第二段以上每段RNA核酸合成依照固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、活化耦合、盖帽、氧化和盖帽五个步骤完成第二段以上每段RNA核酸的合成；

在第二段以上每段RNA核酸合成步骤中第二段以上每段RNA核酸总的活化耦合时间多于第一段RNA核酸合成总的活化耦合时间，每段总的活化耦合时间是每段活化耦合的次数与每次活化耦合时间的乘积之和，每段总的活化耦合时间逐渐增加。

在一种实施方式中，所述RNA核酸分成三段合成，合成1-40个碱基的第一段RNA核酸；合成41-80个碱基的第二段RNA核酸；和合成81碱基以上的第三段RNA核酸。

在一种实施方式中，所述第一段RNA核酸合成的步骤是脱保护2次、每次30秒，活化耦合2次、每次120秒，盖帽1次、每次60秒，和氧化1次、每次60秒。

在一种实施方式中，所述第二段RNA核酸合成的步骤是脱保护2次、每次30秒，活化耦合2次、每次150s，盖帽1次、每次60秒，氧化1次、每次60秒，和盖帽1次、每次60秒。

在一种实施方式中，所述第三段RNA核酸合成的步骤是脱保护2次、每次30秒，活化耦合3次、每次180秒，盖帽1次、每次60秒，氧化1次、每次60秒，和盖帽1次、每次60秒。

在一种实施方式中，合成的RNA核酸通过反相HPLC纯化，流动相为0.15-0.3 M三乙胺乙酸盐的水溶液。

在一种实施方式中，流动相为0.2 M三乙胺乙酸盐的水溶液。

本发明提供了一种基于固相亚磷酰胺三酯法最长可合成到100个碱基长度的RNA核酸化学制备方法，合成的长链RNA粗品纯度提高，通过纯化后可以得到纯度可达95%以上的长链RNA产品。

采用本发明的分段式合成方法，使用较高浓度的活化耦合剂和减少总的活化耦合时间能够有效的提升耦合效率和提高合成的粗品纯度，并且使得RNA核酸合成中缺碱基现象明显减少，脱嘌呤的情况也有很大的改善；通过再增加一步盖帽反应减少脱保护过程中的副反应，进一步提高RNA核酸合成中的粗品纯度。

本发明方法避免了生物转录方法合成RNA核酸存在的蛋白宿主残留等问题，同时也最小化核苷酸组合序列的复杂性，可以扩展至对RNA核酸进行标记修饰，同时可满足大规模生产；并且解决了长链RNA核酸纯度偏低的问题。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明。显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

实施例一本发明的固相亚磷酰胺三酯法合成RNA核酸的方法

1. 固相亚磷酰胺三酯法合成RNA核酸的原理

现有技术固相亚磷酰胺三酯法合成RNA核酸具体合成步骤分为以下四步：

第一步是脱保护，将固相载体CPG与二氯乙酸/二氯甲烷溶液反应，脱去其5'-羟基的保护基团二甲氧基三苯甲基（DMT），获得活性的5'-羟基；

第二步是活化耦合，RNA核酸亚磷酰胺单体与活化剂四氮唑混合，得到反应活性很高的核酸亚磷酰活性中间体（它的3’端被活化，5’-羟基仍然被DMT保护），与第一步脱保护得到的活性5'-羟基发生缩合反应；

第三步，盖帽反应，缩合反应中可能有少量5'-羟基没有参加反应，用乙酸酐和1-甲基咪唑进行乙酰化反应封闭，阻止其后面继续发生反应产生副产物；

第四步，氧化反应，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。

经过以上四个步骤，一个核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以二氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去新核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的核苷酸依次被连接上去。

通过氨水处理，连接在固相载体CPG上的RNA核酸被切割下来，并脱去保护基团，粗产物通过高效液相色谱（HPLC）方法纯化，测定OD260的吸收值对RNA核酸进行定量，根据要求分装。

在本发明依照以下步骤合成和纯化本发明的长链RNA核酸：

第一步：长链RNA核酸的合成

1. 依照固相亚磷酰胺三酯法合成RNA核酸的方法，调整RNA核酸合成仪的合成条件参数一至参数十，使用RNA核酸合成仪进行长链RNA核酸的合成；

2. 准备合成使用的脱保护剂、活化耦合剂、盖帽剂、氧化剂，其中脱保护剂为3%(w/v)二氯乙酸的二氯甲烷溶液，每次使用量为200ul；活化耦合剂为0.25M乙巯基四氮唑的乙腈溶液，每次使用量为75ul；盖帽剂CAPA为10%（v/v）乙酸酐的四氢呋喃溶液，每次使用量为80ul，盖帽剂CAPB为16%（v/v）1-甲基咪唑的四氢呋喃溶液，每次使用量为80ul，盖帽剂CAPA和盖帽剂CAPB由机器自动同时加入到仪器中；氧化剂为0.05M碘的四氢呋喃/吡啶/超纯水（v/v/v=7/2/1）的混合溶液，每次使用量为150ul。用450ml无水乙腈溶解20gRNA核酸亚磷酰胺单体并用氩气保护，每次使用量为63ul；将上述所有合成试剂装载至RNA核酸合成仪上。

3. 称取10-16mg的固相载体CPG，制作合成柱；装载至合成仪的柱座上。

4. 检查设备压力，试剂瓶压力，试剂用量等参数，确认无误后点击“开始合成”按钮开始合成。

5. 合成过程中检查试剂用量，设备运行状态直至合成结束。

第二步：氨解与脱硅基保护

1.合成结束后采用水浴氨解脱保护，将合成结束后连接有RNA核酸的CPG粉末放入1 ml浓氨水（28%）中加热至45℃，反应8小时；反应结束后冷却至室温。

2.将上述氨解后的浑浊液过滤，得到溶有RNA核酸的浓氨水溶液，并将其浓缩至干粉状态，再加入1 ml的二甲基亚砜（DMSO）将RNA核酸完全溶解，溶解后继续加入1 ml三乙胺三氢氟酸盐加热至80℃，反应10分钟。得到脱除2’端的硅基保护基（TBS/TOM）RNA核酸粗品。

3．酒沉。向步骤2得到的核酸粗品中加入10ml无水乙醇，放置-20℃冰箱中，等待2小时取出。经12000r/min离心得到白色RNA核酸固体。

第三步：纯化

将上述白色固体用无核酸酶的水溶解，装载至高效液相色谱仪上，采用乙腈与0.2M 三乙胺乙酸盐（TEAA）水溶液进行纯化。通过比例阀调节在30min内乙腈的比例从2%提升至35%，而0.2M三乙胺乙酸盐（TEAA）水溶液的比例从98%下降至65%，纯化得到高纯度的长链RNA核酸。

实施例二固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA实验一

固相亚磷酰胺三酯法合成最主要依赖于RNA核酸合成仪器中的合成参数，其中每个步骤的反应次数、等待时间，随着碱基长度的增加都会对合成的反应效率产生影响，因此通过测试验证获得最佳的合成反应参数。

下表1所示参数一是一组常规的RNA核酸的合成参数组合，合成一个碱基需要循环一次脱保护、活化耦合、盖帽和氧化这四个步骤，表参数一中反应次数是指向固相载体中打入相应试剂的次数，单次反应时间指的是每打入一次试剂后反应等待的时间。

表1

使用参数一对不同碱基长度的RNA核酸进行合成测试，结果显示参数一最多只能合成至55个碱基左右；超过55个碱基的RNA核酸的粗品纯度很差无法通过纯化得到产品，具体结果如下表2所示。

表2

根据表2数据，使用参数一合成65个碱基的RNA粗品核酸纯度只有20.1%，已经低于纯化所要求的30%，很难拿到合格的产品，分析可能的原因是合成超过55个碱基的RNA核酸时，活化耦合反应总的时间和试剂用量（即反应次数）不够，因此将合成反应分为两段式合成，改变50个碱基以后的耦合反应次数与时间，增加活化耦合反应次数和减少单次反应的时间，总体上增加了反应时间。本实施例筛选了三种参数，其中合成1-50个碱基时参数二的活化耦合次数为2次，单次反应时间为360s；参数三的活化耦合次数为3次，单次反应时间为245s，参数四的活化耦合次数为3次，单次反应时间为255s，从51个碱基后参数二的活化耦合次数为3次，单次反应时间为245s；参数三的活化耦合次数为3次，单次反应时间为255s，参数四的活化耦合次数为3次，单次反应时间为265s；具体反应参数为见下表3。

表3

根据所设置的三种参数进行测试验证，验证数据参见表4，5，6。

表4

表5

表6

通过对三组合成参数进行测试验证，结果显示分两段式合成并增加总的活化耦合时间和次数，参数二的数据显示55个碱基的RNA核酸粗品只提升了3%左右的纯度，而参数三、四的粗品纯度比参数一还要差。同时可以看出65、75个碱基的粗品纯度小于30%，不满足纯化要求。通过质谱分析，主要的杂质成分为碱基缺失、脱嘌呤的短链杂质，较多的副产物杂质会严重影响耦合效率，导致粗品纯度低。

实施例三固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA实验二

根据实例二测试数据可以得出，只是简单的增加反应时间，并不能提高RNA核酸的合成效率，结果显示出现了严重的脱嘌呤和缺碱基的现象，这也造成了粗品纯度非常差。其原因在于只是单纯的增加反应时间，并不能解决RNA核酸的空间位阻问题，因此为了最小化RNA核酸合成的空间位阻问题，将活化耦合步骤的活化耦合剂的浓度提高，通过浓度效应尽可能的提升耦合效率。筛选浓度如表7所示。

表7

使用实施例二中的合成参数二对活化剂浓度进行筛选，筛选结果如下表8所示。

表8

表8对活化剂浓度的筛选显示提高浓度的情况下，相同碱基数的RNA核酸的合成效率会有所提升，使用0.25M的活化剂合成时，会出现严重的碱基缺失的情况，质谱分析缺碱基占比20%~40%左右，脱嘌呤占比1%~4%，增加浓度至0.5M，RNA核酸合成的缺碱基现象有所改善，质谱分析缺碱基占比14%~25%左右，脱嘌呤占比4.3%~5.1%。将浓度增加至0.75M时，缺碱基明显改善，但还是会存在少部分脱嘌呤的情况，质谱分析缺碱基占比9%~14%左右，脱嘌呤占比达到了7%~9%。可能的原因是活化耦合试剂偏酸性，在提高了活化耦合剂的浓度后，其酸性也随之增加，随着活化耦合时间越长，脱嘌呤的情况就会越严重。

因此考虑到需要减少核酸碱基过多暴露于酸性活化耦合试剂的时间，同时考虑碱基越长，空间位阻造成的耦合难度越大，将合成参数设置为三段式合成，随着碱基数的增加，适当增加第二段和第三段耦合程序的时间。设置参数五、六、七见表9。

表9

通过减少耦合的时间验证筛选出最佳的活化耦合反应参数，测试结果如下表10，11，12所示。

表10

表11

表12

参数七测试结果显示，分段式合成，且使用0.75M的活化耦合剂通过减少总的活化耦合时间能够有效的提升耦合效率和产品纯度，并且RNA核酸合成中脱嘌呤和缺碱基现象有很大的改善，参数七程序设置为1-40碱基活化耦合两次，活化耦合时间为120s，41-80碱基活化耦合次数是2次，活化耦合时间为150s，81个碱基至结束，活化耦合3次，活化耦合时间为180s，用此参数合成85个碱基，粗品纯度从参数五的26.8%提升至参数七的33.2%，对于RNA核酸合成来讲已经可以拿到合格的产品。但是用此程序合成更长碱基时还是出现部分碱基缺失的情况，粗品纯度较低。测试结果如表13所示。

表13

表13测试结果显示，使用参数七且活化耦合剂的浓度为0.75M时，最多只能合成到95个碱基，100个碱基的RNA核酸粗品纯度低于30%，很难得到合格的产品。

实施例四固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA实验三

RNA核酸固相亚磷酰胺三酯法相比DNA核酸的固相亚磷酰胺三酯法合成，其对脱保护过程的水分要求更高，而在氧化步骤中氧化剂是一个含水的试剂，尽管氧化后会用乙腈清洗，但还会有微量水分残留，在下一个合成循环中，这些水分影响到脱保护的效率，从而影响整个RNA核酸反应步效率和粗品纯度。为了进一步提升RNA核酸粗品纯度及平均反应效率，在氧化结束后用盖帽试剂再次清洗固相载体，去除残留水分。其原理在于水可与盖帽试剂中的乙酸酐/甲基咪唑体系反应后去除，从而大幅度降低基础含水量，在下个循环减少了脱保护过程的副反应，提高了核酸合成的粗品纯度。因此设置仪器参数如下所示。参数八、参数九和参数十具体参见表14。

表14

参数八、参数九和参数十结果具体参见表15，16，17。

表15

表16

表17

测试结果显示，参数八的测试结果比参数九、参数十的差，其中的可能的原因是在前40个碱基的合成过程中，固相载体通透性较高，水分较容易洗涤，基础水分很少，随着碱基数增加，固相载体通透性不断较低，水分逐步难以去除，影响合成效率，需要增加盖帽试剂除水步骤。参数九、十的测试结果相差不大，但是参数十在前40个碱基增加一次盖帽，会浪费时间和试剂，因此参数九为最优的合成参数设置，且能保证合成效率最高。

实施例五固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA核酸纯化实验

为了获得高纯度的超长链RNA核酸，需要对合成结束的超长链RNA核酸粗品进行反相HPLC纯化。

本实施例根据反相HPLC的纯化原理，采用流动相A（乙腈）以及流动相B(三乙胺乙酸盐的水溶液；TEAA）进行纯化，其中三乙胺乙酸盐的水溶液是将超长链RNA核酸附着在纯化柱上，乙腈的作用是将附着的RNA核酸根据梯度洗脱下来。为了节约纯化的时间成本，规定每次反相HPLC纯化的时间为30min；具体梯度方案为在30min内流动相A(乙腈)占比比例从2%提升至35%，流动相B(TEAA)的比例从98%下降至65%。

本实施采用上述方案针对性的对三乙胺乙酸盐的水溶液浓度进行了优选。实验数据如表18所示。

表18

从表18的数据可以看到，当使用0.2M的TEAA水溶液进行纯化时，能提高纯度达到95%以上。其可能的原因是低于0.2M的浓度下，长链RNA核酸无法很好的吸附在纯化柱上，从而降低了分离度。而过高的TEAA浓度使得长链RNA核酸在纯化柱上吸附性过高，难以被乙腈梯度洗脱，反而得不到更纯的长链RNA核酸。所以0.2M的三乙胺乙酸盐水溶液是最优的纯化选项。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

Claims

1.一种固相亚磷酰胺三酯法合成长链RNA核酸的方法，其特征在于，所述RNA核酸至少分成三段合成，合成的每段RNA核酸长度在30-60碱基，第一段RNA核酸合成依照固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、活化耦合、盖帽、氧化四个步骤完成第一段RNA核酸的合成，第二段以上每段RNA核酸合成依照固相亚磷酰胺三酯法的脱保护、活化耦合、盖帽、氧化和盖帽五个步骤完成第二段以上每段RNA核酸的合成；

第二段以上每段RNA核酸总的活化耦合时间多于第一段RNA核酸合成总的活化耦合时间，每段总的活化耦合时间是每段活化耦合的次数与每次活化耦合时间的乘积之和；每段总的活化耦合时间逐渐增加；

所述RNA核酸分成三段合成，合成1-40个碱基的第一段RNA核酸；合成41-80个碱基的第二段RNA核酸；合成81碱基以上的第三段RNA核酸；

所述第一段RNA核酸合成的步骤是脱保护2次、每次30秒，活化耦合2次、每次120秒，盖帽1次、每次60秒，和氧化1次、每次60秒；

所述第二段RNA核酸合成的步骤是脱保护2次、每次30秒，活化耦合2次、每次150秒，盖帽1次、每次60秒，氧化1次、每次60秒，和盖帽1次、每次60秒；

所述第三段RNA核酸合成的步骤是脱保护2次、每次30秒，活化耦合3次、每次180秒，盖帽1次、每次60秒，氧化1次、每次60秒，和盖帽1次、每次60秒。

2.根据权利要求1所述的合成长链RNA核酸的方法，其特征在于，活化耦合步骤中活化耦合剂为0.50M-0.75M乙巯基四氮唑的乙腈溶液。

3.根据权利要求1所述的合成长链RNA核酸的方法，其特征在于，合成的RNA核酸通过反相HPLC纯化，流动相为0.15-0.3 M三乙胺乙酸盐的水溶液。

4.根据权利要求3所述的合成长链RNA核酸的方法，其特征在于，流动相为0.2 M三乙胺乙酸盐的水溶液。