CN114317521B

CN114317521B - 寡核糖核苷酸的纯化方法及试剂盒

Info

Publication number: CN114317521B
Application number: CN202111411057.7A
Authority: CN
Inventors: 杜军; 李刚; 夏海原; 李妍; 王文朋; 吴慧
Original assignee: Tsingke Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Tsingke Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN114317521A

Abstract

本发明涉及生物化学领域，更具体地，本发明涉及一种用于纯化寡核糖核苷酸(RNA)的方法。该方法可以简单高效地纯化多种寡核糖核苷酸，包括高通量合成的寡核糖核苷酸、寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列，同时保证较高的回收率。

Description

寡核糖核苷酸的纯化方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物化学领域，更具体地，本发明涉及一种用于纯化寡核糖核苷酸(RNA)的方法。

背景技术

寡核苷酸通常由几十个核苷酸构成，是一类序列较短的单链核酸分子。寡合苷酸可作为引物、基因探针、合成基因基础片段、基因治疗相关药物等，广泛应用于现代分子生物学研究中。寡合苷酸的合成通常使用固相亚磷酰胺化学合成法，该方法现在仍被大多商业化DNA合成公司所采用。该合成方法是从3’端到5’端延长核苷酸链的循环过程，核苷酸链将从第一个被固定在载体表面的受保护的核苷酸分子开始延伸，其中，所述固定化载体可以是可控孔径玻璃微球(CPG)或聚苯乙烯微球(PS)，将试剂泵入并流经材质表面，诱导分步添加的核苷酸单体加入到寡核苷酸链上，使寡核苷酸链不断延长。每添加一个核苷酸单体到核苷酸链上都包括以下四个步骤：(1)脱保护：用三氯乙酸(TCA)或二氯乙酸(DCA)从延长的核苷酸链的5’端末端移除二甲氧三苯甲基(DMT)基团，并产生一个5’端活性羟基基团；(2)耦合：脱氧核苷亚磷酰胺分子在适当的活化剂(如四唑)作用下，会产生一个活性单体分子，与上一步产生的5’羟基基团进行反应；(3)盖帽：为了减少含有缺失碱基的产物，未耦合的5’羟基基团会被封闭，常用的封闭试剂是酰化试剂；(4)氧化：连接核苷酸分子之间的亚磷酯键是不稳定的，容易被酸、碱水解，所以需要被氧化成为更加稳定的磷酸三酯。不断重复进行上述四步反应，以将脱氧核苷单体分子不断加入到核苷酸链上。整个合成过程完成后，将寡核苷酸从固相上切除。

RNA和DNA的一级结构相似，但有两个重要区别：尿嘧啶取代胸腺嘧啶作为杂环碱基之一；RNA含有核糖而不是2’-脱氧核糖。因此，虽然RNA的固相合成是基于固相DNA合成的，但RNA呋喃核糖环的2’-位置上单一羟基的存在使得RNA的合成难度远远高于DNA。最常用的保护RNA合成的2’-OH的方法是叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)法。由于TBS基团的空间影响，RNA合成中亚磷酰胺偶联时间更长；而且2’-OH保护基团必须在整个固相合成循环中保留，然后在合成结束时干净地去除，并且在合成或脱保护过程中没有3’到2’磷酸盐迁移。

含有2’-O-TBDMS基团的寡核糖核苷酸脱保护包括2个步骤，首先需要类似于脱保护DNA的基本步骤，可以使用甲胺水溶液于65℃经1小时完成，从载体上切割寡聚体并将碱基和磷酸基团去除(US5804683)。该操作将RNA从固相载体上切割下来，且脱除磷酸上的氰乙基保护和碱基上胺基的保护。但是脱除的氰乙基具有高反应性，有可能重新加合到胸苷上产生杂质。第二步是从寡核糖核苷酸去除2’-O-TBDMS基团，采用三乙胺三氢氟化物作为脱硅烷基，N-甲基吡咯烷酮为溶剂，于65℃经30分钟-90分钟完成(US5831071)。专利CN101137662A描述了一种“一锅”脱保护法，采用三乙胺三氢氟化物在共溶剂(如DMSO)于65℃在60分钟完成，随后采用乙酸钠淬灭反应，通过Q-5PW等层析柱进行提纯。对于96通道或更高通量的RNA合成工作，要对每一个通道分别进行层析纯化，是费时费力且不现实的。

现有技术中，在从寡核糖核苷酸去除2’-O-TBDMS基团后，RNA的纯化技术中，部分技术采用层析纯化法进行除盐除杂提纯，该方法首先需要对层析柱进行清洗，然后将样品吸附在层析柱上，用缓冲液进行解析，收集特定组分，得到提纯后的RNA，该方法操作复杂，流程长，不适用于高通量合成的RNA。而部分技术采用叔丁醇沉淀法进行提纯，该方法通用性较差，对低于10nt长度的RNA和高U含量的RNA无产品沉淀，无法进行提纯。

因此，本领域亟需一种寡核糖核苷酸的纯化方法，该方法简单高效，适用于高通量合成的寡核糖核苷酸，同时还可以对寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列进行纯化。

发明内容

如上所述，现有的寡核糖核苷酸的纯化方法，存在不同的缺陷，无法适用于多种类型的寡核糖核苷酸的纯化。因此，本领域亟需一种寡核糖核苷酸的纯化方法，可广泛用于纯化多种寡核糖核苷酸，包括高通量合成的寡核糖核苷酸、寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列。

因此，在第一方面，本发明提供了一种用于纯化寡核糖核苷酸(RNA)的方法，包括以下步骤：

a)提供寡核糖核苷酸溶液；

b)用高氯酸盐溶液处理所述寡核糖核苷酸溶液以形成沉淀；

c)分离步骤b)中所得到的沉淀以得到经纯化的寡核糖核苷酸。

在第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：高氯酸盐溶液以及用于指导如何利用该试剂盒来纯化寡核糖核苷酸的说明书。

本发明的有益效果为：提供了一种寡核糖核苷酸的纯化方法，该方法可以简单高效地纯化多种寡核糖核苷酸，包括高通量合成的寡核糖核苷酸、寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列，同时保证较高的回收率。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施方案，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。

如上所述，现有的寡核糖核苷酸的纯化方法，无法满足纯化多种寡核糖核苷酸的需求。因此，本发明的目的在于提供一种新的寡核糖核苷酸的纯化方法，从而可用于纯化高通量合成的寡核糖核苷酸、寡核糖核苷酸的短序列和高U含量序列。

如上所述，现有技术中通常采用醇类例如叔丁醇沉淀对寡核糖核苷酸进行提纯，但该方法通用性差，并且无法对低于长度为10nt或高U含量的寡核糖核苷酸进行提纯。然而，发明人经试验意外地发现，使用高氯酸盐溶液对寡核糖核苷酸进行处理可以形成沉淀从而达到纯化多种寡核糖核苷酸的效果。由此，本发明人完成了本发明。

a)提供寡核糖核苷酸溶液；

b)用高氯酸盐溶液处理所述寡核糖核苷酸溶液以形成沉淀；

c)分离步骤b)中所得到的沉淀以得到经纯化的寡核糖核苷酸。

在本发明中，所述“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。所述“寡核糖核苷酸”是指具有两个或两个以上核糖核苷酸的分子，并且可以包含修饰的或未修饰的核苷酸或非核苷酸或其各种混合物和组合。所述术语包括分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及变更的RNA，即由于添加、缺失、取代和/或变更一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。这样的变更可以包括添加非核苷酸材料，例如在siRNA的末端或内部添加，例如在RNA的一个或多个核苷酸处添加。本发明的RNA分子中的核苷酸也可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在核苷酸或化学合成核苷酸或脱氧核苷酸。可将这些变更的RNA归类为类似物或衍生物。RNA可以是siRNA、酶促核酸、反义核酸、诱杀型RNA(decoy RNA)、衔接头RNA、形成三链的寡核苷酸、嵌合RNA、2-5A反义嵌合体、激动剂RNA(agonist RNA)、拮抗剂RNA或任何其它RNA种类。

在本发明中，所述寡核糖核苷酸通常采用亚磷酰胺化学合成法进行合成，例如固相亚磷酰胺、溶液相亚磷酰胺、固相H-膦酸酯、混合相亚磷酰胺或混合相H-膦酸酯。如在背景技术中所述，在采用亚磷酰胺合成法来合成寡核糖核苷酸的过程中，由于核糖核苷酸的2’-位置上存在一个活泼羟基，需要通过保护基在整个合成循环中对2’-羟基进行保护并保持稳定，在完成合成后再干净地去除保护基。因此，在使用本发明方法来纯化合成的寡核糖核苷酸时，需要先去除保护基。所述2’-羟基保护基团可以为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)及其衍生物。在一些实施方案中，步骤a)中的寡核糖核苷酸溶液是通过向合成的寡核糖核苷酸粗品中加入脱2’-羟基保护基的脱保护溶液获得的。在一些实施方案中，所述脱保护溶液为极性溶剂和三烷基胺-氢氟化物。在一个优选实施方案中，所述脱保护溶液为DMSO和三乙胺三氢氟酸盐。

本发明中所述的寡核糖核苷酸可以是不同长度甚至非常短的寡核糖核苷酸。作为示例，所述寡核糖核苷酸可以包含≤25个核糖核苷酸，例如包含5、6、7、8、9、10、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核糖核苷酸可以包含≤10个核糖核苷酸。

此外，所述寡核糖核苷酸还可以是富含尿嘧啶(U)的寡核糖核苷酸。在一个实施方案中，所述寡核糖核苷酸可以含有40％至100％的尿嘧啶，例如40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、100％或者其间任何数值的尿嘧啶。在一些具体实施方案中，所述寡核糖核苷酸可以含有50％、75％或100％的尿嘧啶。

在步骤b)中，用高氯酸盐溶液处理所述寡核糖核苷酸溶液以形成沉淀。在一些实施方案中，所述高氯酸盐为高氯酸的碱金属盐，例如高氯酸钠、高氯酸钾、高氯酸锂、高氯酸铯等。在一个优选的实施方案中，所述高氯酸盐为高氯酸钠。在一些实施方案中，所述高氯酸盐溶液的溶剂为偶极溶剂，例如丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、碳酸丙烯酯。在一个优选实施方案中，所述溶剂为丙酮。以上仅为示例，本领域技术人员能够理解，任何能够溶解高氯酸盐且不影响纯化过程的溶剂均可以在本发明中使用。

本文中所述“处理”是指将高氯酸盐溶液与寡核糖核苷酸溶液接触并充分混合，然后于低温条件下保持适当时间。在一个实施方案中，在步骤b)中，将所述高氯酸盐溶液与所述寡核糖核苷酸溶液混合，然后于20℃至-40℃保持10分钟至60分钟。在一个具体实施方案中，将所述高氯酸盐溶液与寡核糖核苷酸溶液混合后于-20℃保持30分钟。

在一些实施方案中，在步骤b)中，所述高氯酸盐溶液的质量体积浓度可以为0.1％w/v至10％w/v，例如0.1％w/v、0.25％w/v、0.5％w/v、0.75％w/v、1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、3％w/v、4％w/v、6％w/v、8％w/v、或10％w/v，优选为0.5％w/v至2％w/v；进一步地，所述高氯酸盐溶液与所述脱保护溶液的体积比可以为0.2至5:1。在一个优选实施方案中，所述高氯酸盐溶液与所述脱保护溶液的体积比为0.8至1.2:1。

在步骤c)中，将步骤b)中所得到的沉淀分离出来以获得经纯化的寡核糖核苷酸。所述分离可以通过本领域任何常规的一种或多种分离方法来进行，所述分离方法包括但不限于离心、重力沉降或过滤。在一个实施方案中，所述分离方法为离心分离法。

本发明这一方面的高氯酸盐溶液具有与本发明第一方面所述的高氯酸盐溶液相同或相似的性质。例如，在一些实施方案中，所述高氯酸盐为高氯酸的碱金属盐，例如高氯酸钠、高氯酸钾、高氯酸锂、高氯酸铯等。在一个优选实施方案中，所述高氯酸盐为高氯酸钠。所述高氯酸盐溶液的溶剂为偶极溶剂，例如丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、碳酸丙烯酯。在一个优选实施方案中，所述溶剂为丙酮。

实施例

下面结合实施例对本发明进行更为具体和详细的描述。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂商店购买所得。应注意，上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。

1.寡核糖核苷酸的合成

采用192合成仪，200nmol合成柱，按如表1所示的合成程序进行寡核糖核苷酸合成。

表1.合成程序

合成的寡核糖核苷酸如表2所示，在总共12条序列中，序列1-6为21nt正常序列；序列7-12为特殊序列，其中序列7-9为高U含量序列(50％、70％和100％)，序列10-12为11nt短序列。

表2.合成的寡核糖核苷酸序列

2.脱保护

合成后取出合成板，向每个合成柱中加入500μL二乙胺，静置5分钟后减压抽滤，去除二乙胺。再向每个合成柱中加入1mL乙腈溶液，减压抽干。将CPG(载体)加入到PE管中，再向管中加入400μL浓氨水于80℃反应2小时，或再向管中加入400μL甲胺-水溶液于60℃反应2小时，或向管中加入400μL甲胺-水溶液于60℃微波反应0.5小时。反应结束后取出CPG柱。将PE管中的液体于65℃烘干以获得合成的寡核糖核苷酸粗品。向PE管中加入100μL DMSO，200μL三乙胺三氢氟酸盐，于60℃反应2小时进行脱保护。反应完成后取样用酶标仪检测260nm吸光度(OD)，该OD值可以反映体系中脱保护的寡核糖核苷酸的含量，下文简称为脱保护OD值。

3.纯化

在经脱保的寡核糖核苷酸样品中加入300μL的1％高氯酸钠丙酮溶液、0.5％高氯酸锂丙酮溶液、1％高氯酸锂四氢呋喃溶液、或叔丁醇，充分震荡混匀。置于-20℃保持0.5小时。随后离心10分钟，除去上清液，所获得沉淀为寡核糖核苷酸，将其用纯化水溶解后取样用酶标仪检测260nm吸光度(OD)，该OD值可以反映体系中被沉淀的寡核糖核苷酸的含量，下文简称为沉淀OD值。

4.回收率

沉淀OD值与脱保护OD值的比值即可获得回收率，以反映所用纯化方法的回收率。表3中示出了通过相同合成方法合成并脱保护后的寡核糖核苷酸在经不同高氯酸盐溶液(不同浓度)或叔丁醇(作为对比实施例)纯化后的回收率。

表3.不同纯化方法的回收率的比较

从表3中的实验结果可以看出，在采用叔丁醇进行纯化的对比实施例中，寡核糖核苷酸中正常序列的回收率为67.9％(均值)，短序列(RNA-10、RNA-11和RNA-12)的回收率为47.3％，对于高U含量序列(RNA-7、RNA-8和RNA-9)的回收率极低，甚至无法对序列9进行沉淀。而采用高氯酸盐溶液进行沉淀时，正常序列的回收率都高于80％，对于短序列和高U含量序列的回收率也都高于69％，相对于叔丁醇有显著提高。此外，通过1％高氯酸钠丙酮溶液(高氯酸钠的终浓度为0.5重量％)进行沉淀可获得最佳回收率，其中正常序列的回收率为88.4％、短序列(RNA-10、RNA-11和RNA-12)的回收率72.6％、高U含量序列(RNA-7、RNA-8和RNA-9)的回收率78.4％。

综合以上结果可以明显看出，采用本发明的方法对寡核糖核苷酸进行纯化，可获得更高的回收率，并且对短序列和高U含量序列也有良好效果。

序列表

<110> 北京擎科生物科技有限公司

<120> 寡核糖核苷酸的纯化方法及试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ucaccuccgc cuuguaccct t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggucagccag guguacucat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ugaguacacc uggcugacct t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccagguguac ucaggcagut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acugccugag uacaccuggt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cucaggcagu cugcguguat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uauauguaua ucucuguaut u 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

guuauucuuc uuguucuuau u 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 21

<210> 10

<211> 11

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ugucucaaut t 11

<210> 11

<211> 11

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

uacacgcaga c 11

<210> 12

<211> 11

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcagucugc g 11

Claims

1.一种用于纯化寡核糖核苷酸(RNA)的方法，包括以下步骤：

a)通过向合成的寡核糖核苷酸粗品中加入脱2’-羟基保护基的脱保护溶液以提供寡核糖核苷酸溶液；

b)将高氯酸盐溶液与所述寡核糖核苷酸溶液混合，然后于20℃至-40℃保持10分钟至60分钟以形成沉淀；

c)分离步骤b)中所得到的沉淀以得到经纯化的寡核糖核苷酸；其中所述纯化寡核糖核苷酸的方法不包括使用醇类对寡核糖核苷酸进行沉淀；

其中所述高氯酸盐为高氯酸钠或高氯酸锂；

所述高氯酸盐溶液的溶剂为丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或碳酸丙烯酯；

其中在步骤b)中，所述高氯酸盐溶液的质量体积浓度为0.5％w/v至2％w/v；所述高氯酸盐溶液与所述脱保护溶液的体积比为0.8至1.2:1。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱保护溶液为极性溶剂和三烷基胺-氢氟化物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述脱保护溶液为DMSO和三乙胺三氢氟酸盐。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述高氯酸盐为高氯酸钠。

5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b)中，将所述高氯酸盐溶液与所述寡核糖核苷酸溶液混合，然后于-20℃保持30分钟。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中步骤c)中的分离通过离心、重力沉降或/和过滤中的一种或多种进行。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸的长度≤25个核糖核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸的长度≤10个核糖核苷酸。

9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸含有40％至100％的尿嘧啶。