CN111235198B - 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法，所述规模化合成长链RNA的方法包括：设计RNA短片段和夹板DNA片段；连接；加帽；去夹板DNA片段等步骤。本发明技术方案通过化学法合成大量RNA短片段和不同的夹板DNA片段，然后通过生物法将不同RNA短片段连接起来以形成目的RNA长链。整个工艺操作简单、生产成本低，产物长链RNA的突变率低，并且单次反应可对多条RNA短片段进行组装，可高通量合成长链RNA，以满足长链RNA的规模化生产。此外，通过在RNA短片段上进行化学修饰，可实现对长链RNA的定点修饰。相较传统RNA化学修饰方法，本方法得到的RNA产物稳定性更高、免疫源性降低、翻译效率明显增强，对于RNA药物在临床上的应用有极其重要的作用。

Description

规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及规模化合成长链RNA的方法及其定点修饰的方法。
背景技术
随着生物技术的迅猛发展，siRNA、非编码RNA、RNA适配体、核酶等RNA技术飞速发展，RNA在生物学上越来越受到重视(John C等.Chemistry&Biology.2012，19(1)：60-71)，以往的一些合成方法已逐渐不能满足科研试验和药物研发对RNA的需求，越来越多的RNA生物学研究和药物研发中需要用到毫克级甚至克级的高纯度RNA，与此同时对RNA产品的质量也提出了更高的要求(Laura E等.RNA.2010，16(3)：647-653)。目前RNA合成的主要方法是化学合成法，该方法的最大优点是可以规模化合成，但是也存在缺点和技术限制，其一是价格昂贵，其二是现有合成技术水平只能合成短链RNA分子，合成RNA的长度一旦超过170nt左右时，其合成效率大幅降低，副产物序列增多，这不仅加大了下游纯化的难度，还进一步推高了成本(张中华.生命科学.2004,16(4)：231-235)(Junichi Yano等.Advance inPolymerScience，2012,249:1-48)(赵松子等.西北农业学报.2010，16(5)：47-51)。目前，大多数研究人员往往通过转录合成的方法获得大于40nt左右的RNA，即用T7、T3或SP6 RNA聚合酶转录带有其启动子的双链DNA模板以获得长单链RNA(SA McKenna等.NatureProtocols.2007，2，3270-3277)。一般情况下，通过优化转录条件中的Mg2+、三磷酸核苷酸(rNTP)的浓度，一个拷贝DNA模板能产生几十到数百个拷贝的RNA，因此通过这种方法可以得到较大量的RNA产物。但是由于采用化学合成法的过程中需要对2'-OH进行保护，使得RNA的化学合成比DNA的化学合成更有难度。目前，通过化学合成法合成的RNA的长度不超过170nt，无法满足长链RNA的合成需求(其链长大于1000nt)。
采用生物合成RNA的方法具有诸多优点，例如可以进行同位素标记或荧光染料进行标记；转录长度不受限制等，因此其广泛用于核酸结构或生物学研究。然而，转录合成RNA分子也存在一些问题：无法实现稳定的规模化生产。其原因在于由于体外转录合成不同长度的RNA需要RNA聚合酶参与，其在生物反应上会造成一定几率的错配，从而引起RNA序列突变，不利于扩大生产。同时，需要制备大量的质粒并用DNA限制性内切酶切成线性质粒；或需要通过大量的PCR反应获得线性模板，而一些具有稳定二级结构的长链RNA(RNA分子5'端和3'端不完全或完全互补碱基数不少于5个)的DNA转录模板单链也会相应具有稳定二级结构，这导致利用DNA引物PCR扩增转录模板时产生非特异性或突变DNA产物，而这些非目的DNA转录的RNA与目的RNA的生物学功能截然不同，因此无法通过PCR方法获得足够量的正确DNA转录模板。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种规模化合成长链RNA的方法及定点修饰长链RNA的方法，该方法首先利用化学法合成大量RNA短链片段，然后通过生物合成法将RNA短链片段连接成长链RNA，以克服相关技术中无法规模化生产长链RNA的问题。
为实现上述目的，本发明提出一种规模化合成长链RNA的方法，所述规模化合成长链RNA的方法包括：
a、设计RNA短片段和夹板DNA片段：根据目的RNA单链设计多个RNA短片段，以使多个所述RNA短片段能通过组合形成至少一条完整的目的RNA单链；根据所述RNA短片段设计夹板DNA片段；混合多个所述RNA短片段与所述夹板DNA片段，得到连接混合物；
b、连接：向步骤a中的所述连接混合物中加入DNA连接酶和RNA连接酶，以通过DNA连接酶连接多个所述RNA短片段和多个夹板DNA片段，以及通过RNA连接酶连接所述RNA短片段和3'PolyA尾端，得到未加帽的长链RNA；
c、加帽：向步骤b中的所述未加帽的长链RNA中加入加帽酶，以给未加帽的长链RNA的5'端加上帽子结构，得到加帽的长链RNA；
d、去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA。
可选地，所述RNA短片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％；所述夹板DNA片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％。
可选地，所述步骤a中所述连接混合物的RNA短片段与夹板DNA片段的摩尔浓度之比为8～10:11。
可选地，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。
可选地，所述步骤c中的所述帽子结构包括Cap 0结构或Cap 1结构。
可选地，所述RNA短片段的长度为100～170nt；所述夹板DNA的长度为30bp～40bp。
可选地，所述步骤d去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA的步骤之后还包括：
e、纯化：将步骤d中得到的长链RNA进行氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的至少一种，以获得纯化后的长链RNA；
f、纯度检测：将步骤e中得到的纯化后的长链RNA进行琼脂糖或聚丙酰胺凝胶电泳、HPLC分析检测、内毒素残留检测、DNA残留检测以及蛋白残留检测中的至少一种。
本发明还提供一种定点修饰长链RNA的方法，所述定点修饰长链RNA的方法包括：
a1、设计合成如权利要求1至6任一项所述的规模化合成长链RNA的方法中的RNA短片段和夹板DNA片段，并对指定的RNA短片段进行定点化学修饰；
b1、连接步骤a1中合成的RNA短片段、定点修饰后的RNA短片段及夹板DNA片段，以得到经过定点修饰的未加帽的长链RNA；
c1、对上述步骤b1中得到的经过定点修饰的未加帽的长链RNA加帽，得到经过定点修饰的加帽的长链RNA；
d1、去除步骤c1中得到的经过定点修饰的加帽的长链RNA中的夹板DNA，以得到所需的经过定点修饰的长链RNA；
e1、对步骤d1中得到的经过定点修饰的长链RNA进行纯化和纯度检测。
本发明技术方案先通过化学法合成大量夹板DNA片段和不同的RNA短片段(包括未经化学修饰的RNA短片段以及定点修饰后的RNA短片段)，然后通过生物法将不同RNA短片段连接起来以形成目的RNA长链。具体的，通过DNA连接酶实现不同RNA短片段与夹板DNA片段之间的连接，通过RNA连接酶实现RNA短片段与3'PolyA尾端的连接，通过加帽酶(所述加帽酶包括但不限于二氧基甲基化转移酶(2'-OMethyltransferase)或者RNA三磷酸酶(triphosphatase)、RNA谷氨酰转移酶(guanyltransferase)及鸟嘌呤-7-甲基转移酶(Guanine-7-methyltransferase)中的一种或其组合)实现对未加帽长链RNA5'端的加帽，最后通过DNA酶去除加帽的长链RNA中的夹板DNA片段，得到真正所需的长链RNA。整个工艺操作简单、生产成本低，产物长链RNA的突变率低，并且一次反应可对多条RNA短片段进行组装，可高通量合成长链RNA，以满足长链RNA的规模化生产。此外，相较传统RNA化学修饰方法，本方法采用的定点化学修饰策略，使得RNA产物的稳定性更高、免疫源性降低、翻译效率明显增强，对于RNA药物在临床上的应用有及其重要的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明规模化合成长链RNA的工艺流程图；
图2为本发明实施例中RNA短片段与夹板DNA片段不同混合比例下的长链RNA连接合成电泳图；
图3为本发明实施例中有无夹板DNA片段连接的电泳图；
图4为本发明实施例中未使用夹板DNA片段连接的纯度检测图；
图5为本发明实施例中使用夹板DNA片段连接的纯度检测图；
图6为本发明实施例中采用K1单克隆抗体识别dsRNA的斑点印迹试验的结果图；
图7为本发明实施例中肿瘤坏死因子-α水平检测结果图；
图8至图10为本发明实施例中定点化学修饰基因的表达图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。且下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
参见图1至图3，其中，图1为本发明规模化合成长链RNA的方法一实施例的工艺流程图，图2为为本发明一实施例中获得的长链RNA的纯化图和纯度分析图，图3为本发明定点修饰长链RNA的方法一实施例中获得的定点修饰的长链RNA的蛋白表达图。
参见图1，可知，本发明规模化合成长链RNA的方法的工作原理如下：本发明先通过化学法合成大量不同的RNA短片段(包括未经化学修饰的RNA短片段以及定点修饰后的RNA短片段)以及夹板DNA片段，然后通过生物法将不同RNA短片段连接起来，以形成未加帽的长链RNA，最后给未加帽的长链RNA连接上帽子结构，以形成目的RNA长链。具体的，本实施例中通过化学合成法得到大量RNA短片段和大量夹板DNA片段；然后通过DNA连接酶将不同RNA短片段与夹板DNA片段连接起来，同时通过RNA连接酶连接RNA短片段与3'PolyA尾端，以形成未加帽的长链RNA；再后通过加帽酶对未加帽长链RNA5'端加上帽子结构，以形成加帽的长链RNA；最后通过DNA酶去除加帽的长链RNA中的夹板DNA片段，得到真正所需的长链RNA。整个工艺操作简单、生产成本低，并且产物长链RNA的突变率低，并且一次反应可对多条RNA短片段进行组装，实现了长链RNA的高通量合成，从而实现了长链RNA的规模化生产。此外，通过在RNA短片段上进行定点修饰，可实现对长链RNA的定点修饰，以增强RNA的稳定性和细胞内翻译效率，并降低RNA的免疫源性。
应当理解，于其他实施例中还可以通过RNA三磷酸酶(triphosphatase)、RNA谷氨酰转移酶(guanyltransferase)、鸟嘌呤-7-甲基转移酶(Guanine-7-methyltransferase)、二氧基甲基化转移酶(2'-OMethyltransferase)中的一种或其组合的加帽酶实现对未加帽长链RNA的加帽。其中，所述Cap 0型帽子结构为当G第7位碳原子被甲基化形成m7GPPPN时形成的帽子结构；所述Cap 1型帽子结构为转录本的第一个核苷酸的2'-O位也甲基化，形成m7GPPPNm时形成的帽子结构。
需要说明的是，RNA短片段和夹板DNA片段的序列可根据所要大规模合成的RNA的具体结构进行设计，但需满足以下要求：1)设计合成的RNA短片段的长度在100～170nt；2)RNA短片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％；3)夹板DNA片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％。强调的是，下述实施例中的具体参数值并不唯一，其仅仅为众多实施例组中的一组实施例数据。
实施例1 RNA短片段的合成
本实施例采用固相合成法合成所需的RNA短片段。进一步说明的是，整个反应由RNA的3'端向5'端进行。
1、脱去保护基。用三氯乙酸脱去预先连接在固相基质上的核苷酸的保护基团DMT(即二甲氧基三苯甲基)，以获得游离的5'-羟基端；
2、反应活化。将质子化的核苷3'-亚磷酰胺单体与四氮唑活化剂混合进入形成合成柱，以形成亚磷酸酰胺四唑活性中间体，此时，所述亚磷酸酰胺四唑活性中间体的5'端仍然受到DMT保护，3'端被活化。
3、连接反应。将步骤2中得到的亚磷酸酰胺四唑活性中间体进一步脱保护基，然后与步骤1中得到的核苷酸的5'-羟基端发生亲核反应，缩合、脱去四唑，以合成得到向前延伸一个碱基的寡糖核苷酸链。
4、氧化反应。应当理解，由于在发生步骤3中的缩合反应时，核苷酸单体通过亚磷酸脂键与连接在固相基质上的寡糖核苷酸连接，而亚磷酸脂键不稳定，易被酸/碱水解，因此，需用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酸酰胺转化为磷酸三酯，以得到稳定的寡糖核苷酸，此时，一个脱氧核苷酸就被连接到固相基质的核苷酸上。
5、粗品RNA的合成。重复上述步骤，然后用苯硫酚除去5'-羟基端上的保护基团DMT；用浓氢氧化铵断开RNA短片段与固相树脂之间的连接，使得RNA短片段能被洗脱下来；再用浓氢氧化铵在加热条件下去除碱基上的保护基团DMT，去除氢氧化铵，于真空中抽干，得到粗品RNA短片段。
6、分离提纯。用HPLC或PAGE对上述得到的粗品RNA短片段进行纯化分离，以得到所需的RNA短片段。
实施例2 RNA短片段、夹板DNA片段及3'PolyA尾端的连接
需要说明的是夹板DNA片段通过商业化学法合成，其具体的制备方法不再一一赘述。
1、原材料准备。量取50uL RNase-free重蒸水，然后按8～10uM的浓度计算称量实施例1中获得的RNA短片段、并按11uM的浓度计算称量商业化学法合成的夹板DNA短片段，混合，制备连接混合物的反应体系。
2、预处理。将上述反应体系于65℃下加热1～3min，室温冷却1～3min，以去除三级结构的RNA，得到二级结构的RNA；
3、连接反应。按0.1pM RNA短片段加入1uL T4 DNA连接酶和0.1uL T4RNA连接酶的比例，加入适量T4 DNA连接酶、T4 RNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液于冷却后的反应体系中，室温孵育30～60min，得未加帽的长链RNA。
4、过柱。将样本置于过滤器上，将上述未加帽的长链RNA使用离心柱于RCF 10，000–15，000×g下离心15～60秒以纯化RNA，洗涤，得到纯化的未加帽的长链RNA。具体结果参见图2。
5、数据结果分析。参见图2，选取了两个基因分别在RNA短片段与夹板DNA片段的混合比例为8:11、7:11、10:11、11:11下进行实验。条带1～4为基因1的实验结果，条带5～8为基因2的实验结果。可知，载RNA短片段与夹板DNA片段的混合比例为8:11和10:11时，得到的长链RNA更多。也即是说，在RNA短片段与夹板DNA片段的混合比例为8～10:11时，更利于RNA短片段的连接。
实施例3未加帽的长链RNA5'端的加帽
1、热变性RNA的制备。取50～60ug实施例2中制备的纯化后的未加帽的长链RNA(其体积小于68.5uL)，加入RNase-free重蒸水，以使整个体系的总体积为68.5uL；将上述体系于65℃下孵育5～10min，转移至冰上冷却，以将预处理好的未加帽的长链RNA快速降温，保持单链二级结构。
2、分离试管的制备。分别取10uL 10X加帽反应缓冲液，10uL浓度为10uM的GTP，5uL浓度为2mM的甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)，2.5uL RNA酶抑制剂，混合，使得整个分离试管体系的总体积为27.5uL。
3、加帽反应。将步骤1中制备的68.5uL的热变性RNA和步骤2中制备的27.5uL的分离试管体系混合，加入4uL加帽酶混合液(应当理解，本实施例中的所述加帽酶包括但不限于加入二氧基甲基化转移酶(2'-O-Methyltransferase)、RNA三磷酸酶(triphosphatase)、RNA谷氨酰转移酶(guanyltransferase)、鸟嘌呤-7-甲基转移酶(Guanine-7-methyltransferase)中的一种或其组合)，于37℃下孵育30min，进行加帽反应，以得到Cap0或Cap1帽子结构的长链RNA，此时，整个加帽反应体系的总体积为100uL。
实施例4夹板DNA片段的去除
1、实验步骤：于实施例3中获得的100uL的加帽反应体系中加入1uLDNA酶，混合均匀；然后，于37℃孵育15min，以去除加帽后的长链RNA中的夹板DNA，得到所需的长链RNA，具体结果参见图3。
2、结果分析。参见图3，为未经纯化步骤的RNA的凝胶电泳图，其中包括MarkerRNA、连接有夹板DNA片段的RNA(夹板DNA组，条带1～3)以及没有连接夹板DNA片段的RNA(无夹板DNA组，条带4～9)。具体地，夹板DNA组(条带1～3)的RNA的纯度较高，无杂带；无夹板DNA组(条带4～9)的RNA的纯度不高，杂带多；经比对，可知使用夹板DNA片段进行多个RNA短片段之间的连接能显著提高RNA的连接效率，大大减小了错配率。其次，夹板DNA组(条带1～3)为在不同GC含量的夹板DNA片段下的RNA的凝胶电泳结果，条带1为GC碱基含量为17％的夹板DNA片段，条带2为GC碱基的含量为12％的夹板DNA片段，条带3为GC碱基的含量为7％的夹板DNA片段，可知，在使用GC碱基含量为17％的夹板DNA片段连接多个RNA短片段使得长链RNA的连接效率更高。应当理解，这里的GC碱基含量为17％的夹板DNA片段为一具体实施例，于其他实施例中，只要GC碱基含量大于等于15％的夹板DNA片段均能显著提高长链RNA的连接效率。
实施例5长链RNA的纯化
应当理解，长链RNA的纯化方式有多种，包括但不限于：氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化和高效液相色谱纯化等。本实施例主要采用HPLC纯化。
1、洗脱。将使用烷基化的无孔聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物微球(2.1mm)(21mm*100mm柱)的柱基质，通过高效液相色谱仪(Akta净化器，通用电气保健)上直接纯化。其中，缓冲液A含有0.1M乙酸三乙基铵(TEAA)，pH＝7.0；缓冲液B含有0.1M TEAA，25％乙腈(转基因)，pH＝7.0。色谱柱用30％缓冲液平衡后装载实施例4中得到的长链RNA，于5mL/min的流速在20～30min内以单一或两个线性梯度运行至55％缓冲液或者65％缓冲液，以实现长链RNA的纯化。
2、分析。使用与步骤1中相同的柱基质和缓冲液系统，色谱柱规格为7.8mm*50mm，并于1.0mL/min的流速进行长链RNA的分析，结果如图5所示。
实施例6纯度检测
本实施例中采用凝胶电泳技术以对实施例4中获得的所需的长链RNA进行纯度分析。
1、制备2X RNA装载缓冲液。按以下配方进行胶体的制备：95％甲酰胺、0.025％SDS、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯氰基以及0.5mM乙二胺四乙酸，充分混合、溶解；静置24小时，以形成凝脂糖凝胶体。
2、电泳。用溴化乙锭染色后在上述制备的凝脂糖凝胶体上运行样品，于凝胶成像系统下观察拍照，具体结果参见图4和图5。
3、结果数据分析。具体地，参见图4，其左图所示的电泳图为整个合成长链RNA的过程中不使用夹板DNA片段的电泳图，其右图为对该电泳图结果的分析报告图，可以清楚地知道，在未使用夹板DNA片段连接时，得到的长链RNA的产物纯度不高，杂带较多，RNA短片段的连接效率低下。参见图5，其左图所示的电泳图为在合成长链RNA的过程中使用夹板DNA片段进行连接的电泳图，其右图为对该电泳图结果的分析报告图，可以清楚地知道，在使用夹板DNA片段连接后，得到的长链RNA产物的纯度大幅提高，没有杂带的出现，相较于传统化学法制备长链RNA的连接效率得以大幅提高，且大大减小了RNA短片段的连接错配率。
实施例7长链RNA的定点修饰
1、对实施例1中获得的指定的RNA短片段进行定点化学修饰。具体地，本实施例中在指定的RNA短片段中用Pseudo UTP代替天然UTP、5me CTP代替天然CTP，以实现对制定短片段的UTP和CTP进行定点化学修饰，而不影响其他未被选择的RNA短片段中的UTP和CTP碱基；然后通过实施例2至实施例6中的实验方案，实现RNA短片段到长链RNA的合成。整个过程由于只对指定的RNA短片段进行了定点修饰，从而在形成的长链RNA中只在指定的片段形成了顶点修饰，其完全区别于传统的长链RNA的定点修饰的方案，可以实现对长链RNA的局部进行定点修饰，以减少长链RNA二级结构(应当理解，二级结构和双链RNA会引起体内的免疫反应)，大大降低了长链RNA的免疫源性，更有利于对长链RNA进行分析，具有更广阔的医药试验前景。具体地，本实施例中用K1单克隆抗体(mAbs)识别dsRNA的斑点印迹试验(Schonborn,J.,Oberstrass,J.,Breyel,E.,Tittgen,J.,Schumacher,J.and Lukacs,N.(1991)双链单克隆抗体核糖核酸作为粗核酸提取物中核糖核酸结构的探针。核酸研究,19,2993–3000.)，以确定体外转录中RNA是否含有DNA。在本实施例分析的多个单克隆抗体中的任何编码序列或UTRs中均未发现识别长度至少为40bp的连续双链结构的单克隆抗体(Bonin,M.,Oberstrass,J.,Lukacs,N.,Ewert,K.,Oesterschulze,E.,Kassing,R.andNellen,W.(2000)(2000)通过扫描力显微镜确定双链核糖核酸上抗脱氧核糖核酸抗体的结合位点。核糖核酸,6,563–570.)。进一步测试哺乳动物和标记的编码蛋白的体外转录物，包括定点修饰、非修饰以及传统修饰，可以发现定点修饰能显著减少长链RNA的二级结构，参见图6和图7。
2、本实施例分别选用小鼠编码荧光素酶的基因和小鼠红细胞生成素基因进行实验。具体地，在对小鼠编码荧光素酶的基因的实验中，选择了两种合成长链RNA的反应以进行定点修饰实验，一是Ligation(modified)：商业途径化学法合成RNA短片段过程中利用Pseudo UTP代替天然UTP、5me CTP代替天然CTP，再在连接酶的作用下拼接合成长链RNA；一是IVT(umodified)：传统体外转录法合成修饰的长链RNA，利用Pseudo UTP代替天然UTP、5me CTP代替天然CTP。并且，对上述两种合成反应设置了两组对照组实验，即Ligation(unmodified)、IVT(unmodified)。得到如图8和图9所示的表达结果。进一步地，本实施例还对小鼠的血细胞比容进行了测定。得到如图10所示的表达结果。
3、结果数据分析。
参见图6，用200ng体外转录的RNA编码mEPO，并用如步骤1中提及的K1单克隆抗体识别dsRNA的斑点印迹试验和分析。其中，dsRNA阳性对照实验中含有328bp长的dsRNA(25ng)。可知，体外转录的RNA具有免疫原性，并且含有DNA污染物。
参见图7，图中包括分别用胞内肾素酶(T7TSRenA30)、荧光素酶(T7TSLucA30)、荧光素酶(T7TSMetlucA30)及甲氧磷(TEVmEPOA51)mRNAs治疗树突状细胞，24小时后在上清液中测量肿瘤坏死因子-α水平(TNF-a)。可知，在定点化学修饰的长链RNA中，肿瘤坏死因子-α水平最低，大大降低了长链RNA的免疫原性，有利于临床RNA药物的研究。
参见图8，分别向Hela细胞中转染5ng、50ng和500ng的长链RNA，所述长链RNA通过步骤2中不同条件Ligation(modified)、IVT(umodified)、Ligation(unmodified)和IVT(unmodified)获得，24小时后测定荧光素酶的表达。在Hela细胞中转染500ng长链RNA时，得到的荧光素酶的表达量最大；进一步地，经过定点化学修饰的长链RNA中的荧光素酶的表达量远远高于未经修饰的长链RNA中的荧光素酶的含量，且在修饰中的长链RNA中，经过本发明中定点化学修饰的长链RNA中表达的荧光素酶的含量比传统体外转录方法中经过定点化学修饰的长链RNA中表达的荧光素酶的含量高近一个量级。
参见图9，分别向Hela细胞中转染5ng、50ng和500ng的长链RNA，所述长链RNA通过步骤2中不同条件Ligation(modified)、IVT(umodified)、Ligation(unmodified)和IVT(unmodified)获得，24小时后测定红细胞生成素的表达。在Hela细胞中转染500ng长链RNA时，得到的红细胞生成素的表达量最大；进一步地，经过定点化学修饰的长链RNA中的红细胞生成素的表达量远远高于未经修饰的长链RNA中的红细胞生成素的含量，且在修饰中的长链RNA中，经过本发明中定点化学修饰的长链RNA中表达的红细胞生成素的含量比传统体外转录方法中经过定点化学修饰的长链RNA中表达的红细胞生成素的含量高近10倍。
参见图10，分别向小鼠中转染5ng、50ng和500ng经Ligation(modified)、IVT(umodified)、Ligation(unmodified)和IVT(unmodified)法获得的长链RNA，7天后测定血细胞比容的表达。在小鼠中转染500ng长链RNA时，得到的血细胞比容的表达量最大；进一步地，经过定点化学修饰的长链RNA中的小鼠中的血细胞比容远远高于未经修饰的长链RNA中的血细胞比容，且在修饰中的长链RNA中，经过本发明中定点化学修饰的长链RNA中表达的血细胞比容比传统体外转录方法中经过定点化学修饰的长链RNA中表达的血细胞比容高近2倍。
应当理解，本发明实施例中的规模化合成长链RNA的方法，相较于传统长链RNA的合成成本更低，且结构稳定；并且还提出了一种可在指定序列进行定点化学修饰的方法，其打破了传统定点化学修饰的方法中只能在整个RNA分子上进行定点修饰，实现了对长链RNA分子的不同指定片段进行不同定点修饰，并且，由于本发明实施例中提出的定点修饰长链RNA的方法的特殊性，其可实现对RNA分子上特定碱基进行多种修饰，有利于对细胞实验、动物实验等临床及临床RNA药物功能研究。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述规模化合成长链RNA的方法包括：
a、设计RNA短片段和夹板DNA片段：根据目的RNA单链设计多个RNA短片段和3'PolyA尾端，所述RNA短片段的长度为100～170nt，以使多个所述RNA短片段和所述3'PolyA尾端能通过组合形成至少一条完整的目的RNA单链；根据所述RNA短片段设计多个夹板DNA片段，任一所述夹板DNA片段与相邻两所述RNA短片段的3’端和5’端分别互补配对，所述夹板DNA片段的长度大于30bp，小于40bp；混合多个所述RNA短片段、所述3'PolyA尾端与所述夹板DNA片段，得到连接混合物；
b、连接：向步骤a中的所述连接混合物中加入DNA连接酶和RNA连接酶，以通过DNA连接酶连接多个所述RNA短片段和多个夹板DNA片段，以及通过RNA连接酶连接所述RNA短片段和3'PolyA尾端，得到未加帽的长链RNA；
c、加帽：向步骤b中的所述未加帽的长链RNA中加入加帽酶，以给未加帽的长链RNA的5'端加上帽子结构，得到加帽的长链RNA；
d、去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA；
所述RNA短片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％；所述夹板DNA片段在5'端和3'端的GC碱基含量高于15％。
2.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤a中所述连接混合物的RNA短片段与夹板DNA片段的摩尔浓度之比为8～10:11。
3.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述加帽酶包括RNA三磷酸酶、RNA谷氨酸转移酶、鸟嘌呤-7-甲基转移酶或二氧基甲基化转移酶中的一种或其组合。
4.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤c中的所述帽子结构包括Cap 0结构或Cap 1结构。
5.如权利要求1所述的规模化合成长链RNA的方法，其特征在于，所述步骤d去夹板DNA片段：向步骤c中的所述加帽的长链RNA中加入DNA酶，以去除所述加帽的长链RNA中连接的夹板DNA，得到所需的长链RNA的步骤之后还包括：
e、纯化：将步骤d中得到的长链RNA进行氯化锂/乙醇沉淀、离心柱、氯萃取/乙醇沉淀、凝胶纯化或高效液相色谱纯化中的至少一种，以获得纯化后的长链RNA；
f、纯度检测：将步骤e中得到的纯化后的长链RNA进行琼脂糖或聚丙酰胺凝胶电泳、HPLC分析检测、内毒素残留检测、DNA残留检测以及蛋白残留检测中的至少一种。
6.一种定点修饰长链RNA的方法，其特征在于，所述定点修饰长链RNA的方法包括：
a1、设计合成如权利要求1至5任一项所述的规模化合成长链RNA的方法中的RNA短片段和夹板DNA片段，并对指定的RNA短片段进行定点化学修饰；
b1、连接步骤a1中合成的RNA短片段、定点修饰后的RNA短片段及夹板DNA片段，以得到经过定点修饰的未加帽的长链RNA；
c1、对上述步骤b1中得到的经过定点修饰的未加帽的长链RNA加帽，得到经过定点修饰的加帽的长链RNA；
d1、去除步骤c1中得到的经过定点修饰的加帽的长链RNA中的夹板DNA，以得到所需的经过定点修饰的长链RNA；
e1、对步骤d1中得到的经过定点修饰的长链RNA进行纯化和纯度检测。
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