JP2002171983A - 核酸の連結方法 - Google Patents
核酸の連結方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 T4 RNA ligaseを用いた1本鎖核酸の連結方法
において、ＤＮＡ splintを用いることを特徴とする方
法を提供すること。 【解決手段】 第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸と
を連結する方法において、第１の一本鎖核酸の一部と相
補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列と
を有する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸の存在下に
おいて、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをＲＮ
Ａリガーゼで処理する工程を含み、第１の一本鎖核酸と
第２の一本鎖核酸の少なくとも片方がＤＮＡであること
を特徴とする方法。
において、ＤＮＡ splintを用いることを特徴とする方
法を提供すること。 【解決手段】 第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸と
を連結する方法において、第１の一本鎖核酸の一部と相
補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列と
を有する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸の存在下に
おいて、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをＲＮ
Ａリガーゼで処理する工程を含み、第１の一本鎖核酸と
第２の一本鎖核酸の少なくとも片方がＤＮＡであること
を特徴とする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一本鎖核酸の連結方
法およびその利用に関する。より詳細には、本発明は、
連結すべき２つの一本鎖核酸の各々の一部に相補的な配
列を有する一本鎖核酸の存在下において２つの一本鎖核
酸をＲＮＡリガーゼで処理することを特徴とする方法お
よびその利用に関する。
法およびその利用に関する。より詳細には、本発明は、
連結すべき２つの一本鎖核酸の各々の一部に相補的な配
列を有する一本鎖核酸の存在下において２つの一本鎖核
酸をＲＮＡリガーゼで処理することを特徴とする方法お
よびその利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学においてＤＮＡの切断および
連結は最も重要な基本的手法の一つである。一方、ＲＮ
Ａの連結はT4 RNA ligaseを用いて、主に人工ｒＲＮＡ
の合成（Bruce AG, Uhlenbech OC: Biochemistry,(198
2)21(5) 855-61）や全長ｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡ
の5’端へのプライマー付加する方法（Troutt AB, et a
l. : Proc Natl Acad Sci USA(1992) 89(20): 9823-5）
がある。最近になって進化分子工学の手法であるin vit
ro virus法(Nemoto,N., et al.(1997) FEBS Lett. 414,
405-408)が登場し、そこでｍＲＮＡとその3’末端にＤ
ＮＡを連結する必要がでてきた。従来の方法ではその効
率が悪く、in vitro virus法の利用にあたって大きな課
題となっている。さらに、遺伝子工学の発達に伴いＤＮ
Ａの特異的切断および結合のためのより効率の良い加工
技術が求められてきている。
連結は最も重要な基本的手法の一つである。一方、ＲＮ
Ａの連結はT4 RNA ligaseを用いて、主に人工ｒＲＮＡ
の合成（Bruce AG, Uhlenbech OC: Biochemistry,(198
2)21(5) 855-61）や全長ｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡ
の5’端へのプライマー付加する方法（Troutt AB, et a
l. : Proc Natl Acad Sci USA(1992) 89(20): 9823-5）
がある。最近になって進化分子工学の手法であるin vit
ro virus法(Nemoto,N., et al.(1997) FEBS Lett. 414,
405-408)が登場し、そこでｍＲＮＡとその3’末端にＤ
ＮＡを連結する必要がでてきた。従来の方法ではその効
率が悪く、in vitro virus法の利用にあたって大きな課
題となっている。さらに、遺伝子工学の発達に伴いＤＮ
Ａの特異的切断および結合のためのより効率の良い加工
技術が求められてきている。
【０００３】２種類の核酸を連結させる方法としては、
従来は制限酵素を用いた２本鎖核酸のライゲーションが
主であり、ＤＮＡリガーゼを用いたものがほとんどであ
った。最近になり西垣らが（Nishigaki K. et al. Mol
Divers 1998;4(3):187-90）２つのＤＮＡ断片の一部を
ハイブリダイズすることにより効率よくT4 RNA ligase
を用いてライゲーションする方法（Ｙ−ライゲーション
法）を見出した。Ｙ−ライゲーション法は、二本の一本
鎖ＤＮＡ（5'-ハーフおよび3'-ハーフ）の末端に互いに
相補的配列（ステム部分）を含めておき、ハイブリダイ
ゼーション後、一本鎖領域（ブランチ部分）の末端をＲ
ＮＡリガーゼで連結する方法である。しかし、この方法
では連結すべき二本の一本鎖ＤＮＡの末端に互いに相補
的な配列（ステム部分）を含めておく必要があった。
従来は制限酵素を用いた２本鎖核酸のライゲーションが
主であり、ＤＮＡリガーゼを用いたものがほとんどであ
った。最近になり西垣らが（Nishigaki K. et al. Mol
Divers 1998;4(3):187-90）２つのＤＮＡ断片の一部を
ハイブリダイズすることにより効率よくT4 RNA ligase
を用いてライゲーションする方法（Ｙ−ライゲーション
法）を見出した。Ｙ−ライゲーション法は、二本の一本
鎖ＤＮＡ（5'-ハーフおよび3'-ハーフ）の末端に互いに
相補的配列（ステム部分）を含めておき、ハイブリダイ
ゼーション後、一本鎖領域（ブランチ部分）の末端をＲ
ＮＡリガーゼで連結する方法である。しかし、この方法
では連結すべき二本の一本鎖ＤＮＡの末端に互いに相補
的な配列（ステム部分）を含めておく必要があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、T4 RNA lig
aseを用いた1本鎖核酸の連結方法において、ＤＮＡ spl
intを用いることを特徴とする方法を提供することを解
決すべき課題とした。さらに本発明は、ＤＮＡ splint
を用いる１本鎖核酸の連結方法において、（１）連結効
率が高く、（２）反応時間が短く、さらに（３）ＤＮＡ
splintを逆転写用プライマーとしても使用できる、と
いう条件を満たした方法を提供することを解決すべき課
題とした。
aseを用いた1本鎖核酸の連結方法において、ＤＮＡ spl
intを用いることを特徴とする方法を提供することを解
決すべき課題とした。さらに本発明は、ＤＮＡ splint
を用いる１本鎖核酸の連結方法において、（１）連結効
率が高く、（２）反応時間が短く、さらに（３）ＤＮＡ
splintを逆転写用プライマーとしても使用できる、と
いう条件を満たした方法を提供することを解決すべき課
題とした。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために、ＤＮＡ splintを用いて濃度効果を高
める際の配列条件および反応条件を検討し、さらにＤＮ
Ａ splintが逆転写プライマーとしての役割も果たすよ
うに工夫することにより、プロセスの短縮、ライゲーシ
ョンおよび逆転写の両プロセスにおける飛躍的な効率化
を達成した。即ち、本発明者らは、ｍＲＮＡとＤＮＡの
連結反応において、当該ｍＲＮＡおよび当該ＤＮＡに相
補的な各々１０残基の配列を両端にもつＤＮＡ splint
を加え、これによってmRNAの3’末端側3残基とＤＮＡス
ペーサの５’末端側数残基を突出させた状態で1本鎖化
し、ｍＲＮＡとＤＮＡとのT4 RNA ligaseによる連結効
率が濃度効果により飛躍的に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
解決するために、ＤＮＡ splintを用いて濃度効果を高
める際の配列条件および反応条件を検討し、さらにＤＮ
Ａ splintが逆転写プライマーとしての役割も果たすよ
うに工夫することにより、プロセスの短縮、ライゲーシ
ョンおよび逆転写の両プロセスにおける飛躍的な効率化
を達成した。即ち、本発明者らは、ｍＲＮＡとＤＮＡの
連結反応において、当該ｍＲＮＡおよび当該ＤＮＡに相
補的な各々１０残基の配列を両端にもつＤＮＡ splint
を加え、これによってmRNAの3’末端側3残基とＤＮＡス
ペーサの５’末端側数残基を突出させた状態で1本鎖化
し、ｍＲＮＡとＤＮＡとのT4 RNA ligaseによる連結効
率が濃度効果により飛躍的に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００６】即ち、本発明によれば、第１の一本鎖核酸
と第２の一本鎖核酸とを連結する方法において、第１の
一本鎖核酸の一部と相補的な配列と第２の一本鎖核酸の
一部と相補的な配列とを有する一本鎖核酸である第３の
一本鎖核酸の存在下において、第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸とをＲＮＡリガーゼで処理する工程を含
み、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の少なくとも
片方がＤＮＡであることを特徴とする方法が提供され
る。
と第２の一本鎖核酸とを連結する方法において、第１の
一本鎖核酸の一部と相補的な配列と第２の一本鎖核酸の
一部と相補的な配列とを有する一本鎖核酸である第３の
一本鎖核酸の存在下において、第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸とをＲＮＡリガーゼで処理する工程を含
み、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の少なくとも
片方がＤＮＡであることを特徴とする方法が提供され
る。
【０００７】好ましくは、本発明の方法は、第１の一本
鎖核酸の３’末端と第２の一本鎖核酸の５’末端とを連
結する方法において、第１の一本鎖核酸の３’末端側の
塩基配列であって３’末端の数塩基を除いた塩基配列に
対して相補的な配列と、第２の一本鎖核酸の５’末端側
の塩基配列であって５’末端の数塩基を除いた塩基配列
に対して相補的な配列とを有する一本鎖核酸である第３
の一本鎖核酸の存在下において、第１の一本鎖核酸と第
２の一本鎖核酸とをＲＮＡリガーゼで処理することを含
み、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の少なくとも
片方がＤＮＡであることを特徴とする方法である。
鎖核酸の３’末端と第２の一本鎖核酸の５’末端とを連
結する方法において、第１の一本鎖核酸の３’末端側の
塩基配列であって３’末端の数塩基を除いた塩基配列に
対して相補的な配列と、第２の一本鎖核酸の５’末端側
の塩基配列であって５’末端の数塩基を除いた塩基配列
に対して相補的な配列とを有する一本鎖核酸である第３
の一本鎖核酸の存在下において、第１の一本鎖核酸と第
２の一本鎖核酸とをＲＮＡリガーゼで処理することを含
み、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の少なくとも
片方がＤＮＡであることを特徴とする方法である。
【０００８】好ましくは、第１の一本鎖核酸はＲＮＡで
あり、第２の一本鎖核酸はＤＮＡである。好ましくは、
第１の一本鎖核酸は３’末端にポリＡ配列を有するｍＲ
ＮＡである。好ましくは、第２の一本鎖核酸は５’末端
に数個のＣを有する核酸であって、この数個のＣは第３
の一本鎖核酸と相補鎖を形成しない。好ましくは、第１
の一本鎖核酸または第２の一本鎖核酸は、（１）プロモ
ーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識
されるＤＮＡ配列、及び（３）目的タンパク質をコード
する配列を有する。
あり、第２の一本鎖核酸はＤＮＡである。好ましくは、
第１の一本鎖核酸は３’末端にポリＡ配列を有するｍＲ
ＮＡである。好ましくは、第２の一本鎖核酸は５’末端
に数個のＣを有する核酸であって、この数個のＣは第３
の一本鎖核酸と相補鎖を形成しない。好ましくは、第１
の一本鎖核酸または第２の一本鎖核酸は、（１）プロモ
ーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識
されるＤＮＡ配列、及び（３）目的タンパク質をコード
する配列を有する。
【０００９】好ましくは、第１の一本鎖核酸：第３の一
本鎖核酸：第２の一本鎖核酸のモル比は、１：１〜３：
１〜５であり、より好ましくは、１：１〜２：１〜３で
ある。好ましくは、ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガー
ゼである。好ましくは、本発明の方法では、第１の一本
鎖核酸と第２の一本鎖核酸と第３の一本鎖核酸とを混合
してアニーリングさせた後に、ＲＮＡリガーゼを添加し
て第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とを連結する。
本鎖核酸：第２の一本鎖核酸のモル比は、１：１〜３：
１〜５であり、より好ましくは、１：１〜２：１〜３で
ある。好ましくは、ＲＮＡリガーゼはＴ４ＲＮＡリガー
ゼである。好ましくは、本発明の方法では、第１の一本
鎖核酸と第２の一本鎖核酸と第３の一本鎖核酸とを混合
してアニーリングさせた後に、ＲＮＡリガーゼを添加し
て第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とを連結する。
【００１０】本発明の別の側面によれば、上記した本発
明の方法により得られる核酸連結体が提供される。本発
明のさらに別の側面によれば、本発明の方法により得ら
れるＲＮＡを含む核酸連結体を逆転写反応に付してＤＮ
Ａのみから成る核酸連結体を製造する方法が提供され
る。
明の方法により得られる核酸連結体が提供される。本発
明のさらに別の側面によれば、本発明の方法により得ら
れるＲＮＡを含む核酸連結体を逆転写反応に付してＤＮ
Ａのみから成る核酸連結体を製造する方法が提供され
る。
【００１１】本発明のさらに別の側面によれば、本発明
の方法により得られる核酸連結体をタンパク質翻訳系に
導入して第１の一本鎖核酸をタンパク質に翻訳すること
を特徴とする、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされ
るタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体の製造
方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、
上記した本発明の製造方法により製造されるＲＮＡ−タ
ンパク質複合体が提供される。
の方法により得られる核酸連結体をタンパク質翻訳系に
導入して第１の一本鎖核酸をタンパク質に翻訳すること
を特徴とする、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされ
るタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体の製造
方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、
上記した本発明の製造方法により製造されるＲＮＡ−タ
ンパク質複合体が提供される。
【００１２】本発明のさらに別の側面によれば、上記し
た本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を逆転写反応に付
することを特徴とする、ｃＤＮＡと該ｃＤＮＡによりコ
ードされるタンパク質から成るＤＮＡ−タンパク質複合
体の製造方法が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、上記した本発明の製造方法により製造されるＤ
ＮＡ−タンパク質複合体が提供される。本発明の別の側
面によれば、上記した本発明による核酸の連結方法にお
いて第３の一本鎖核酸として数種類の異なる核酸を利用
して、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをランダ
ムに連結することを特徴とする、核酸ライブラリーの製
造方法が提供される。
た本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体を逆転写反応に付
することを特徴とする、ｃＤＮＡと該ｃＤＮＡによりコ
ードされるタンパク質から成るＤＮＡ−タンパク質複合
体の製造方法が提供される。本発明のさらに別の側面に
よれば、上記した本発明の製造方法により製造されるＤ
ＮＡ−タンパク質複合体が提供される。本発明の別の側
面によれば、上記した本発明による核酸の連結方法にお
いて第３の一本鎖核酸として数種類の異なる核酸を利用
して、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをランダ
ムに連結することを特徴とする、核酸ライブラリーの製
造方法が提供される。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。本発明の方法は、第１の一本鎖核酸
と第２の一本鎖核酸とを連結する方法である。本発明の
方法の特徴の一つは、第１の一本鎖核酸の一部と相補的
な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列とを有
する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸の存在下におい
て、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをＲＮＡリ
ガーゼで処理することである。本発明で用いる第１の一
本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の種類は特に限定されず、
ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。但し、本発明の方法では、
第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の少なくとも片方
はＤＮＡである。従って、本発明における第１の一本鎖
核酸と第２の一本鎖核酸の組み合わせの例としては下記
の組み合わせが挙げられる。第１の一本鎖核酸 第２の一本鎖核酸 ＲＮＡ ＤＮＡ ＤＮＡ ＤＮＡＤＮＡ ＲＮＡ
て詳細に説明する。本発明の方法は、第１の一本鎖核酸
と第２の一本鎖核酸とを連結する方法である。本発明の
方法の特徴の一つは、第１の一本鎖核酸の一部と相補的
な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列とを有
する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸の存在下におい
て、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをＲＮＡリ
ガーゼで処理することである。本発明で用いる第１の一
本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の種類は特に限定されず、
ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。但し、本発明の方法では、
第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の少なくとも片方
はＤＮＡである。従って、本発明における第１の一本鎖
核酸と第２の一本鎖核酸の組み合わせの例としては下記
の組み合わせが挙げられる。第１の一本鎖核酸 第２の一本鎖核酸 ＲＮＡ ＤＮＡ ＤＮＡ ＤＮＡＤＮＡ ＲＮＡ
【００１４】第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の種
類はＲＮＡとＤＮＡに限定されるわけではなく、一般的
には、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸のそれぞれ
の連結する末端の数残基のみがＲＮＡもしくはＤＮＡタ
イプであればよく、それ以外の領域は、リボヌクレオチ
ドでもデオキシリボヌクレオチドでもＰＮＡタイプでも
よい。さらに、第３の一本鎖核酸に相補的な領域以外の
領域は、これら以外の何でもよく、例えば、ペプチドで
も糖などでもよい。第１の一本鎖核酸はＲＮＡであるこ
とが好ましく、その３’末端はＡであることが特に好ま
しい。また、第２の一本鎖核酸の５’末端はピリミジン
が好ましく、第１の一本鎖核酸の３’末端がＡである場
合には、第２の一本鎖核酸の５’末端はＣであることが
好ましい。さらに、本発明においては、第１の一本鎖核
酸の３’末端に一つだけリボヌクレオチドを連結して反
応を行なうことも可能であり、この方法は、進化分子工
学への応用などにも有用である。
類はＲＮＡとＤＮＡに限定されるわけではなく、一般的
には、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸のそれぞれ
の連結する末端の数残基のみがＲＮＡもしくはＤＮＡタ
イプであればよく、それ以外の領域は、リボヌクレオチ
ドでもデオキシリボヌクレオチドでもＰＮＡタイプでも
よい。さらに、第３の一本鎖核酸に相補的な領域以外の
領域は、これら以外の何でもよく、例えば、ペプチドで
も糖などでもよい。第１の一本鎖核酸はＲＮＡであるこ
とが好ましく、その３’末端はＡであることが特に好ま
しい。また、第２の一本鎖核酸の５’末端はピリミジン
が好ましく、第１の一本鎖核酸の３’末端がＡである場
合には、第２の一本鎖核酸の５’末端はＣであることが
好ましい。さらに、本発明においては、第１の一本鎖核
酸の３’末端に一つだけリボヌクレオチドを連結して反
応を行なうことも可能であり、この方法は、進化分子工
学への応用などにも有用である。
【００１５】本発明で用いるＤＮＡとしては、天然由来
のＤＮＡから作成した一本鎖ＤＮＡでもよいし、遺伝子
組換え技術により作成した一本鎖ＤＮＡでもよいし、化
学合成により作成した一本鎖ＤＮＡでもよい。また、本
発明で用いるＲＮＡの種類も特に限定されず、天然の組
織又は細胞由来のＲＮＡでも、ＤＮＡからインビトロで
発現させたＲＮＡでもよい。本発明の方法で連結される
第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の長さは、連結反
応が可能である限り、特に限定されない。一般的には、
第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の長さは、各々数
十塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば１０塩基か
ら５０，０００塩基程度であり、より好ましくは２０塩
基から１０，０００塩基程度である。
のＤＮＡから作成した一本鎖ＤＮＡでもよいし、遺伝子
組換え技術により作成した一本鎖ＤＮＡでもよいし、化
学合成により作成した一本鎖ＤＮＡでもよい。また、本
発明で用いるＲＮＡの種類も特に限定されず、天然の組
織又は細胞由来のＲＮＡでも、ＤＮＡからインビトロで
発現させたＲＮＡでもよい。本発明の方法で連結される
第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の長さは、連結反
応が可能である限り、特に限定されない。一般的には、
第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸の長さは、各々数
十塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば１０塩基か
ら５０，０００塩基程度であり、より好ましくは２０塩
基から１０，０００塩基程度である。
【００１６】本発明では、第１の一本鎖核酸の一部と相
補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列と
を有する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸を使用す
る。なお、本明細書中においてこの第３の一本鎖核酸
は、ＤＮＡ splintとも称される。第３の一本鎖核酸
（ＤＮＡ splint）はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、Ｄ
ＮＡであることが好ましい。第３の一本鎖核酸の長さは
第１の一本鎖核酸および第２の一本鎖核酸の長さなどに
応じて適宜選択することができ、一般的には１０塩基か
ら数百塩基であり、好ましくは１０塩基から１００塩基
程度である。第３の一本鎖核酸は、第１の一本鎖核酸の
一部と相補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的
な配列とを有するものである。このような配列を有する
第３の一本鎖核酸の存在下で第１の一本鎖核酸と第２の
一本鎖核酸とを混合することにより、第３の一本鎖核酸
に対して第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とがアニ
ーリングして、３種の一本鎖核酸から成る複合体が形成
され、これにより第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸
とが物理的に隣接し、その後にＲＮＡリガーゼで処理す
ることにより高効率で第１及び第２の一本鎖核酸を連結
することが可能になる。
補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列と
を有する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸を使用す
る。なお、本明細書中においてこの第３の一本鎖核酸
は、ＤＮＡ splintとも称される。第３の一本鎖核酸
（ＤＮＡ splint）はＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、Ｄ
ＮＡであることが好ましい。第３の一本鎖核酸の長さは
第１の一本鎖核酸および第２の一本鎖核酸の長さなどに
応じて適宜選択することができ、一般的には１０塩基か
ら数百塩基であり、好ましくは１０塩基から１００塩基
程度である。第３の一本鎖核酸は、第１の一本鎖核酸の
一部と相補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的
な配列とを有するものである。このような配列を有する
第３の一本鎖核酸の存在下で第１の一本鎖核酸と第２の
一本鎖核酸とを混合することにより、第３の一本鎖核酸
に対して第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とがアニ
ーリングして、３種の一本鎖核酸から成る複合体が形成
され、これにより第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸
とが物理的に隣接し、その後にＲＮＡリガーゼで処理す
ることにより高効率で第１及び第２の一本鎖核酸を連結
することが可能になる。
【００１７】本発明の好ましい実施態様では、第１の一
本鎖核酸の３’末端と第２の一本鎖核酸の５’末端とが
連結され、この場合において、第３の一本鎖核酸として
は、第１の一本鎖核酸の３’末端側の塩基配列であって
３’末端の数塩基を除いた塩基配列に対して相補的な配
列と、第２の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配列であっ
て５’末端の数塩基を除いた塩基配列に対して相補的な
配列とを有する一本鎖核酸が使用される。
本鎖核酸の３’末端と第２の一本鎖核酸の５’末端とが
連結され、この場合において、第３の一本鎖核酸として
は、第１の一本鎖核酸の３’末端側の塩基配列であって
３’末端の数塩基を除いた塩基配列に対して相補的な配
列と、第２の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配列であっ
て５’末端の数塩基を除いた塩基配列に対して相補的な
配列とを有する一本鎖核酸が使用される。
【００１８】上記したような第３の一本鎖核酸の存在下
で第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とを混合する
と、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸はそれぞれ第
３の一本鎖核酸にアニリーングして複合体を形成する。
この複合体においては、第１の一本鎖核酸の３’末端側
の塩基配列であって３’末端の数塩基を除いた塩基配列
と、第２の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配列であって
５’末端の数塩基を除いた塩基配列とが、第３の一本鎖
核酸にアニーリングするため、第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸とが隣接することになり、第１の一本鎖核
酸の３’末端の数塩基と、第２の一本鎖核酸の５’末端
の数塩基は一本鎖のまま隣接した状態で存在することに
なる。このような状況下で、当該複合体をＲＮＡリガー
ゼで処理することにより、第１の一本鎖核酸の３’末端
と第２の一本鎖核酸の５’末端とを効率よく連結するこ
とが可能になる。
で第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とを混合する
と、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸はそれぞれ第
３の一本鎖核酸にアニリーングして複合体を形成する。
この複合体においては、第１の一本鎖核酸の３’末端側
の塩基配列であって３’末端の数塩基を除いた塩基配列
と、第２の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配列であって
５’末端の数塩基を除いた塩基配列とが、第３の一本鎖
核酸にアニーリングするため、第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸とが隣接することになり、第１の一本鎖核
酸の３’末端の数塩基と、第２の一本鎖核酸の５’末端
の数塩基は一本鎖のまま隣接した状態で存在することに
なる。このような状況下で、当該複合体をＲＮＡリガー
ゼで処理することにより、第１の一本鎖核酸の３’末端
と第２の一本鎖核酸の５’末端とを効率よく連結するこ
とが可能になる。
【００１９】本明細書で言う「第１の一本鎖核酸の３’
末端側の塩基配列であって３’末端の数塩基を除いた塩
基配列」及び「第２の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配
列であって５’末端の数塩基を除いた塩基配列」におけ
る「数塩基」の数の範囲は特に限定されないが、一般的
には１塩基から１００塩基、好ましくは１塩基から５０
塩基、より好ましくは２塩基から１０塩基、さらに好ま
しくは２塩基から５塩基程度である。
末端側の塩基配列であって３’末端の数塩基を除いた塩
基配列」及び「第２の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配
列であって５’末端の数塩基を除いた塩基配列」におけ
る「数塩基」の数の範囲は特に限定されないが、一般的
には１塩基から１００塩基、好ましくは１塩基から５０
塩基、より好ましくは２塩基から１０塩基、さらに好ま
しくは２塩基から５塩基程度である。
【００２０】本発明の好ましい実施態様をさらに具体的
に説明する。第１の一本鎖核酸（塩基数はｎ）を５’−
Ｘ1Ｘ2．．．．．Ｘn-5Ｘn-4Ｘn-3Ｘn-2Ｘn-1Ｘn−３’
とし、第２の一本鎖核酸（塩基数はｍ）を５’−Ｙ1Ｙ2
Ｙ3Ｙ4Ｙ5Ｙ6．．．．Ｙm-1Ｙm−３’とする（ここで、
数字の添え字を付したＸおよびＹはそれぞれヌクレオチ
ドを示す）。このような第１の一本鎖核酸の３’末端と
第２の一本鎖核酸の５’末端とを連結する場合、第３の
一本鎖核酸としては、例えば、５’−．．．．Ｘ n-5Ｘ
n-4Ｘ n-3Ｙ 4Ｙ 5Ｙ 6．．．．−３’なる配列を有するも
のを使用できる。ここで、下線を付した部分は示したヌ
クレオチドに相補的なヌムレオチドを意味する。また、
「．．．．」は任意の数のヌクレオチドが存在すること
を意味する。この例の場合では、第１の一本鎖核酸の
３’末端の３個のヌクレオチドであるＸn-2Ｘn-1Ｘn部
分と、第２の一本鎖核酸の５’末端の３個のヌクレオチ
ドであるＹ1Ｙ2Ｙ3は第３の一本鎖核酸とはアニーリン
グせず、ＲＮＡリガーゼで処理することにより、第１の
一本鎖核酸の３’末端であるＸnと第２の一本鎖核酸の
５’末端のＹ1が連結するようになる。
に説明する。第１の一本鎖核酸（塩基数はｎ）を５’−
Ｘ1Ｘ2．．．．．Ｘn-5Ｘn-4Ｘn-3Ｘn-2Ｘn-1Ｘn−３’
とし、第２の一本鎖核酸（塩基数はｍ）を５’−Ｙ1Ｙ2
Ｙ3Ｙ4Ｙ5Ｙ6．．．．Ｙm-1Ｙm−３’とする（ここで、
数字の添え字を付したＸおよびＹはそれぞれヌクレオチ
ドを示す）。このような第１の一本鎖核酸の３’末端と
第２の一本鎖核酸の５’末端とを連結する場合、第３の
一本鎖核酸としては、例えば、５’−．．．．Ｘ n-5Ｘ
n-4Ｘ n-3Ｙ 4Ｙ 5Ｙ 6．．．．−３’なる配列を有するも
のを使用できる。ここで、下線を付した部分は示したヌ
クレオチドに相補的なヌムレオチドを意味する。また、
「．．．．」は任意の数のヌクレオチドが存在すること
を意味する。この例の場合では、第１の一本鎖核酸の
３’末端の３個のヌクレオチドであるＸn-2Ｘn-1Ｘn部
分と、第２の一本鎖核酸の５’末端の３個のヌクレオチ
ドであるＹ1Ｙ2Ｙ3は第３の一本鎖核酸とはアニーリン
グせず、ＲＮＡリガーゼで処理することにより、第１の
一本鎖核酸の３’末端であるＸnと第２の一本鎖核酸の
５’末端のＹ1が連結するようになる。
【００２１】本発明の好ましい実施態様では、第１の一
本鎖核酸は３’末端にポリＡ配列を有するｍＲＮＡであ
る。この場合、３’末端に存在するＡうちの数個が第３
の一本鎖核酸とは相補鎖を形成しない（アニーリングし
ない）配列となる。本発明の好ましい実施態様では、第
２の一本鎖核酸は５’末端に数個のＣを有する核酸であ
る。この場合、この数個のＣは第３の一本鎖核酸と相補
鎖を形成しない（アニーリングしない）配列となる。上
記したように、第１の一本鎖核酸の３’末端の数個のＡ
と第２の一本鎖核酸の５’末端の数個のＣを一本鎖とし
て存在させておくことにより、特に効率よく両者を連結
することができる。
本鎖核酸は３’末端にポリＡ配列を有するｍＲＮＡであ
る。この場合、３’末端に存在するＡうちの数個が第３
の一本鎖核酸とは相補鎖を形成しない（アニーリングし
ない）配列となる。本発明の好ましい実施態様では、第
２の一本鎖核酸は５’末端に数個のＣを有する核酸であ
る。この場合、この数個のＣは第３の一本鎖核酸と相補
鎖を形成しない（アニーリングしない）配列となる。上
記したように、第１の一本鎖核酸の３’末端の数個のＡ
と第２の一本鎖核酸の５’末端の数個のＣを一本鎖とし
て存在させておくことにより、特に効率よく両者を連結
することができる。
【００２２】本発明の方法で得られる連結体を転写翻訳
系に導入するような場合には、連結すべき一本鎖核酸に
は、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソ
ームによって認識されるＤＮＡ配列、及び（３）目的タ
ンパク質をコードする配列が含まれていることが好まし
い。
系に導入するような場合には、連結すべき一本鎖核酸に
は、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソ
ームによって認識されるＤＮＡ配列、及び（３）目的タ
ンパク質をコードする配列が含まれていることが好まし
い。
【００２３】プロモーター配列の種類は、適用する発現
系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されな
い。例えば、大腸菌ウイルスT7のRNA polymeraseによっ
て認識されるT7プロモーター配列などが挙げられる。
系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されな
い。例えば、大腸菌ウイルスT7のRNA polymeraseによっ
て認識されるT7プロモーター配列などが挙げられる。
【００２４】翻訳の際にリボソームによって認識される
ＤＮＡ配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソーム
によって認識されるＲＮＡ配列（Kozak配列）に対応す
るＤＮＡ配列や原核細胞のリボソームによって認識され
るシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno）などが挙
げられる。目的タンパク質をコードする配列の種類は特
に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。
ＤＮＡ配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソーム
によって認識されるＲＮＡ配列（Kozak配列）に対応す
るＤＮＡ配列や原核細胞のリボソームによって認識され
るシャイン・ダルガノ配列（Shine-Dalgarno）などが挙
げられる。目的タンパク質をコードする配列の種類は特
に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。
【００２５】本発明の方法は、第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸と第３の一本鎖核酸とを好適なモル比で混
合することにより行なわれる。第１の一本鎖核酸：第３
の一本鎖核酸：第２の一本鎖核酸のモル比はアニーリン
グ（第３の一本鎖核酸への第１の一本鎖核酸と第２の一
本鎖核酸のアニーリング）反応が進行する限り、特に限
定されないが、反応効率の観点からは、１：１〜３：１
〜５程度であることが好ましく、１：１〜２：１〜３程
度であることが特に好ましい。アニーリングは、上記３
種の一本鎖核酸を適当な緩衝液（以後の操作の便宜上か
ら言うと、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液が好ましい）に溶
解し、高温から段階的に低温にすることにより行なうこ
とができる。このような温度変化はＰＣＲ装置などを用
いて行なうこともできる。アニーリング条件の一例とし
ては、９５℃で２分間 →６０℃で５分間→４５℃で１
分間→４０℃で２分間→３０℃で１分間→２０℃で３分
間→４℃などを挙げることができるが、これは一例にす
ぎず、温度および保持時間は適宜変更することができ
る。
の一本鎖核酸と第３の一本鎖核酸とを好適なモル比で混
合することにより行なわれる。第１の一本鎖核酸：第３
の一本鎖核酸：第２の一本鎖核酸のモル比はアニーリン
グ（第３の一本鎖核酸への第１の一本鎖核酸と第２の一
本鎖核酸のアニーリング）反応が進行する限り、特に限
定されないが、反応効率の観点からは、１：１〜３：１
〜５程度であることが好ましく、１：１〜２：１〜３程
度であることが特に好ましい。アニーリングは、上記３
種の一本鎖核酸を適当な緩衝液（以後の操作の便宜上か
ら言うと、ＲＮＡリガーゼ用の緩衝液が好ましい）に溶
解し、高温から段階的に低温にすることにより行なうこ
とができる。このような温度変化はＰＣＲ装置などを用
いて行なうこともできる。アニーリング条件の一例とし
ては、９５℃で２分間 →６０℃で５分間→４５℃で１
分間→４０℃で２分間→３０℃で１分間→２０℃で３分
間→４℃などを挙げることができるが、これは一例にす
ぎず、温度および保持時間は適宜変更することができ
る。
【００２６】本発明の方法では、上記のような条件で３
種類の一本鎖核酸を混合してアニーリングさせた後に、
ＲＮＡリガーゼを添加して第１の一本鎖核酸と第２の一
本鎖核酸とを連結する。ＲＮＡリガーゼは２つの一本鎖
核酸同士を連結できるものであればよく、好ましくはＴ
４ＲＮＡリガーゼを使用できる。
種類の一本鎖核酸を混合してアニーリングさせた後に、
ＲＮＡリガーゼを添加して第１の一本鎖核酸と第２の一
本鎖核酸とを連結する。ＲＮＡリガーゼは２つの一本鎖
核酸同士を連結できるものであればよく、好ましくはＴ
４ＲＮＡリガーゼを使用できる。
【００２７】連結反応（ライゲーション反応）の条件
は、使用するＲＮＡリガーゼの活性が発揮される条件で
あればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、T4 RNA l
igasebuffer(50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM
DTT, 1mM ATP)など）中で、２５℃の温度一定で反応さ
せたり、あるいは２５℃で３０分間と４５℃で２分間の
サイクルを反復した後に２５℃で３０分間反応させたり
することができる。ここに示した温度及び反応時間は一
例に過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更する
ことができる。反応後にフェノール抽出及びエタノール
沈殿などの常法により反応生成物を精製することによ
り、核酸連結体を得ることができる。このようにして得
られる核酸連結体自体も本発明の範囲内である。
は、使用するＲＮＡリガーゼの活性が発揮される条件で
あればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、T4 RNA l
igasebuffer(50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM
DTT, 1mM ATP)など）中で、２５℃の温度一定で反応さ
せたり、あるいは２５℃で３０分間と４５℃で２分間の
サイクルを反復した後に２５℃で３０分間反応させたり
することができる。ここに示した温度及び反応時間は一
例に過ぎず反応効率が高くなるように適宜設定変更する
ことができる。反応後にフェノール抽出及びエタノール
沈殿などの常法により反応生成物を精製することによ
り、核酸連結体を得ることができる。このようにして得
られる核酸連結体自体も本発明の範囲内である。
【００２８】上記したような本発明の方法において、第
１の一本鎖核酸または第２の一本鎖核酸の何れかがＲＮ
Ａである場合、得られる核酸連結体の中にはＲＮＡが含
まれることになる。本発明によれば、このようなＲＮＡ
を含む核酸連結体を逆転写反応に付してＤＮＡのみから
成る核酸連結体を製造する方法が提供される。即ち、上
記した連結反応後に、ｍＲＮＡ精製カラムを用いて未反
応のＤＮＡを除いた後、逆転写酵素を用いて反応させる
とＤＮＡが連結されたｍＲＮＡにのみＤＮＡ splintが
アニーリング（ハイブリダイズ）しているため逆転写す
ることができる。このことは、ｍＲＮＡの安定化のため
に逆転写してＤＮＡ化する際に、別のプライマーを用意
する必要がなく、操作も簡単で済むため極めて有用であ
る。特に、in vitro virusの構築の際に、タンパク質と
ｍＲＮＡが結合しているため、逆転写用プライマーをハ
イブリダイズするために温度を上げるとタンパク質が失
活する可能性があるため、このことは重要である。
１の一本鎖核酸または第２の一本鎖核酸の何れかがＲＮ
Ａである場合、得られる核酸連結体の中にはＲＮＡが含
まれることになる。本発明によれば、このようなＲＮＡ
を含む核酸連結体を逆転写反応に付してＤＮＡのみから
成る核酸連結体を製造する方法が提供される。即ち、上
記した連結反応後に、ｍＲＮＡ精製カラムを用いて未反
応のＤＮＡを除いた後、逆転写酵素を用いて反応させる
とＤＮＡが連結されたｍＲＮＡにのみＤＮＡ splintが
アニーリング（ハイブリダイズ）しているため逆転写す
ることができる。このことは、ｍＲＮＡの安定化のため
に逆転写してＤＮＡ化する際に、別のプライマーを用意
する必要がなく、操作も簡単で済むため極めて有用であ
る。特に、in vitro virusの構築の際に、タンパク質と
ｍＲＮＡが結合しているため、逆転写用プライマーをハ
イブリダイズするために温度を上げるとタンパク質が失
活する可能性があるため、このことは重要である。
【００２９】さらに、本発明によれば、本発明の方法で
得られる核酸連結体を転写翻訳系に導入して第１の一本
鎖核酸をタンパク質に翻訳することを特徴とする、ｍＲ
ＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質から成
るＲＮＡ−タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製
造方法により製造されるＲＮＡ−タンパク質複合体が提
供される。
得られる核酸連結体を転写翻訳系に導入して第１の一本
鎖核酸をタンパク質に翻訳することを特徴とする、ｍＲ
ＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質から成
るＲＮＡ−タンパク質複合体の製造方法、並びに当該製
造方法により製造されるＲＮＡ−タンパク質複合体が提
供される。
【００３０】核酸からそれがコードするタンパク質を人
工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知であ
る。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有
する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を
合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このよう
な無細胞蛋白質合成系には、リボゾ−ム、開始因子、伸
長因子及びｔＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含
まれている。このような無細胞蛋白質合成系（細胞溶解
物由来の系）としては、例えば、真核生物の無細胞転写
翻訳系が挙げられ、より具体的には、ウサギ網状赤血球
抽出液や小麦胚芽抽出液などが挙げられるが、ＤＮＡ又
はＲＮＡから目的とする蛋白質を産生するものであれば
いずれでもよい。
工的に生成させるための転写翻訳系は当業者に公知であ
る。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有
する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的の蛋白質を
合成させる無細胞蛋白質合成系が挙げられる。このよう
な無細胞蛋白質合成系には、リボゾ−ム、開始因子、伸
長因子及びｔＲＮＡ等の転写・翻訳系に必要な要素が含
まれている。このような無細胞蛋白質合成系（細胞溶解
物由来の系）としては、例えば、真核生物の無細胞転写
翻訳系が挙げられ、より具体的には、ウサギ網状赤血球
抽出液や小麦胚芽抽出液などが挙げられるが、ＤＮＡ又
はＲＮＡから目的とする蛋白質を産生するものであれば
いずれでもよい。
【００３１】無細胞翻訳系はキットとして市販されてい
るものを使用することができ、例えば、ウサギ網状赤血
球抽出液 (Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nucl
easeTreated, Promega)や小麦胚芽抽出液 (Wheat Germ
Extract, Promega)などが挙げられる。本発明では、核
酸連結体を上記したような転写翻訳系に導入して第１の
一本鎖核酸をタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除
去することによって、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコー
ドされるタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体
を製造することができる。
るものを使用することができ、例えば、ウサギ網状赤血
球抽出液 (Rabbit Reticulocyte Lysate Systems, Nucl
easeTreated, Promega)や小麦胚芽抽出液 (Wheat Germ
Extract, Promega)などが挙げられる。本発明では、核
酸連結体を上記したような転写翻訳系に導入して第１の
一本鎖核酸をタンパク質に翻訳した後、リボゾームを除
去することによって、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコー
ドされるタンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体
を製造することができる。
【００３２】さらに本発明によれば、上記で得られるＲ
ＮＡ−タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特
徴とする、ｃＤＮＡと該ｃＤＮＡによりコードされるタ
ンパク質から成るＤＮＡ−タンパク質複合体の製造方
法、並びに当該製造方法により製造されるＤＮＡ−タン
パク質複合体が提供される。即ち、ｍＲＮＡと該ｍＲＮ
Ａによりコードされるタンパク質から成るＲＮＡ−タン
パク質複合体を逆転写酵素で処理することにより、ｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡへの逆転写が起こり、ｃＤＮＡと該ｃ
ＤＮＡによりコードされるタンパク質から成るＤＮＡ−
タンパク質複合体が製造されることになる。上記のよう
にして得られる、ＲＮＡ−タンパク質複合体及びＤＮＡ
−タンパク質複合体は、核酸の機能の解析などにおいて
有用な材料を提供するものである。
ＮＡ−タンパク質複合体を逆転写反応に付することを特
徴とする、ｃＤＮＡと該ｃＤＮＡによりコードされるタ
ンパク質から成るＤＮＡ−タンパク質複合体の製造方
法、並びに当該製造方法により製造されるＤＮＡ−タン
パク質複合体が提供される。即ち、ｍＲＮＡと該ｍＲＮ
Ａによりコードされるタンパク質から成るＲＮＡ−タン
パク質複合体を逆転写酵素で処理することにより、ｍＲ
ＮＡからｃＤＮＡへの逆転写が起こり、ｃＤＮＡと該ｃ
ＤＮＡによりコードされるタンパク質から成るＤＮＡ−
タンパク質複合体が製造されることになる。上記のよう
にして得られる、ＲＮＡ−タンパク質複合体及びＤＮＡ
−タンパク質複合体は、核酸の機能の解析などにおいて
有用な材料を提供するものである。
【００３３】
【実施例】以下の実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は実施例によって限定されることは
ない。なお、以下の実施例の概要を示す模式図を図４に
示す。 実施例：ＤＮＡ splintを用いたｍＲＮＡとＤＮＡのラ
イゲーションおよび逆転写 （１）転写用ＤＮＡの構築とｍＲＮＡの作製 転写効率の高い大腸菌ウイルスT7のRNA polymeraseによ
って認識されるＤＮＡ配列（T7プロモーター配列）と翻
訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮ
Ａ配列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによって
認識される（シャイン・ダルガノ配列：Shine-Dalgarn
o）を有し、その下流にThioredoxinをコードしたＤＮＡ
を、次のように構築した。まず、T7プロモーター配列(R
osenberg, A. H., et al., Gene, 56, 125-135(1987)
とKozakコンサンサス配列およびShine-Dalgarno配列を
含む１本鎖ＤＮＡ（配列番号１）を有機合成し、ＤＮＡ
プライマー（配列番号２）とthioredoxinの一部をコー
ドしたプライマー（配列番号３）によってポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）を行った。ＤＮＡ合成酵素はKOD Taq P
olymerase(TOYOBO製)を用いた。
説明するが、本発明は実施例によって限定されることは
ない。なお、以下の実施例の概要を示す模式図を図４に
示す。 実施例：ＤＮＡ splintを用いたｍＲＮＡとＤＮＡのラ
イゲーションおよび逆転写 （１）転写用ＤＮＡの構築とｍＲＮＡの作製 転写効率の高い大腸菌ウイルスT7のRNA polymeraseによ
って認識されるＤＮＡ配列（T7プロモーター配列）と翻
訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮ
Ａ配列（Kozak配列）と原核細胞のリボソームによって
認識される（シャイン・ダルガノ配列：Shine-Dalgarn
o）を有し、その下流にThioredoxinをコードしたＤＮＡ
を、次のように構築した。まず、T7プロモーター配列(R
osenberg, A. H., et al., Gene, 56, 125-135(1987)
とKozakコンサンサス配列およびShine-Dalgarno配列を
含む１本鎖ＤＮＡ（配列番号１）を有機合成し、ＤＮＡ
プライマー（配列番号２）とthioredoxinの一部をコー
ドしたプライマー（配列番号３）によってポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）を行った。ＤＮＡ合成酵素はKOD Taq P
olymerase(TOYOBO製)を用いた。
【００３４】一方、thioredoxinを載せたpTrxFusプラス
ミド（Invitrogen社製）を鋳型として配列番号３のアン
チセンスプライマー（配列番号４）とＤＮＡプライマー
（配列番号５）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこ
とにより、thioredoxinをコードしたＤＮＡ領域を増幅
した。これらの２つのPCR産物を重複伸長(Overlap exte
nsion)法(Horton RM, et al. (1989) Gene 77, 61-68)
に従って、結合させ、２つのプライマー（配列番号２と
配列番号５）でT７プロモーター配列−Kozakコンサンサ
ス配列−Shine-Dalgarno配列-Thioredoxinを作製した。
いずれのPCRにおいてもＤＮＡ合成酵素はKOD Taq Polym
erase(TOYOBO製)を用いた。
ミド（Invitrogen社製）を鋳型として配列番号３のアン
チセンスプライマー（配列番号４）とＤＮＡプライマー
（配列番号５）を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うこ
とにより、thioredoxinをコードしたＤＮＡ領域を増幅
した。これらの２つのPCR産物を重複伸長(Overlap exte
nsion)法(Horton RM, et al. (1989) Gene 77, 61-68)
に従って、結合させ、２つのプライマー（配列番号２と
配列番号５）でT７プロモーター配列−Kozakコンサンサ
ス配列−Shine-Dalgarno配列-Thioredoxinを作製した。
いずれのPCRにおいてもＤＮＡ合成酵素はKOD Taq Polym
erase(TOYOBO製)を用いた。
【００３５】上記した方法で作製したＤＮＡを、反応液
１００μｌあたり１０μｇ加え、ＲＮＡ合成キットRibo
max Large Scale RNA Production System(Promega社製)
を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率を上げるために
キャップアナログ（ＲＮＡ capping Analog; Gibco BRL
社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲ
ＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログおよび過剰
のＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）を除去するために、
プライマー除去剤(Primer Remover: Edge Biosystems社
製)を使ってエタノール沈殿を行った。
１００μｌあたり１０μｇ加え、ＲＮＡ合成キットRibo
max Large Scale RNA Production System(Promega社製)
を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率を上げるために
キャップアナログ（ＲＮＡ capping Analog; Gibco BRL
社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲ
ＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログおよび過剰
のＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）を除去するために、
プライマー除去剤(Primer Remover: Edge Biosystems社
製)を使ってエタノール沈殿を行った。
【００３６】（２）ＤＮＡ splintとライゲーション用
ドナーＤＮＡ ＤＮＡ splint（配列番号６）とライゲーション用ドナ
ーＤＮＡ（配列番号７）は、日本製粉で合成された。Ｄ
ＮＡ splintはthioredoxinの一部の配列とライゲーショ
ン用ドナーＤＮＡの配列の一部をアンチセンス配列とし
て持っている。また、ライゲーション用ドナーＤＮＡの
５’末端にはCCCの塩基配列を含み、これはＤＮＡ spli
nt（配列番号６）と相補鎖を作らない。
ドナーＤＮＡ ＤＮＡ splint（配列番号６）とライゲーション用ドナ
ーＤＮＡ（配列番号７）は、日本製粉で合成された。Ｄ
ＮＡ splintはthioredoxinの一部の配列とライゲーショ
ン用ドナーＤＮＡの配列の一部をアンチセンス配列とし
て持っている。また、ライゲーション用ドナーＤＮＡの
５’末端にはCCCの塩基配列を含み、これはＤＮＡ spli
nt（配列番号６）と相補鎖を作らない。
【００３７】（３）ｍRNAとドナーＤＮＡのアニーリン
グ条件 Thioredoxin ｍＲＮＡ、ＤＮＡ splint及びドナーＤＮ
Ａの割合（モル比）を図１に示す割合（即ち、ｍＲＮ
Ａ：ＤＮＡ splint：ドナーＤＮＡ＝１：１：１、１：
２：２または１：２：３の何れか）で混合し、T4 RNA l
igase buffer(50mMTris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM
DTT, 1mM ATP)に溶解した。得られた混合物は以下の条
件でＰＣＲ装置を用いてアニーリングした。 ９５℃で２分間 → ６０℃で５分間 → ４５℃で１
分間 → ４０℃で２分間 → ３０℃で１分間 →
２０℃で３分間 → ４℃
グ条件 Thioredoxin ｍＲＮＡ、ＤＮＡ splint及びドナーＤＮ
Ａの割合（モル比）を図１に示す割合（即ち、ｍＲＮ
Ａ：ＤＮＡ splint：ドナーＤＮＡ＝１：１：１、１：
２：２または１：２：３の何れか）で混合し、T4 RNA l
igase buffer(50mMTris-HCl, pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM
DTT, 1mM ATP)に溶解した。得られた混合物は以下の条
件でＰＣＲ装置を用いてアニーリングした。 ９５℃で２分間 → ６０℃で５分間 → ４５℃で１
分間 → ４０℃で２分間 → ３０℃で１分間 →
２０℃で３分間 → ４℃
【００３８】（４）T4 RNA ligaseによるライゲーショ
ン反応 （３）でアニーリングした溶液中にT4 RNA ligaseを５
０units加え、２５℃で温度一定あるいは以下の温度変
動条件のいずれかのライゲーション条件で反応させた。
２５℃で３０分間、次いで４５℃で２分間；これを４回
くり返した後、２５℃で３０分間反応後、フェノール抽
出、エタノール沈殿を行って反応生成物を精製した。
ン反応 （３）でアニーリングした溶液中にT4 RNA ligaseを５
０units加え、２５℃で温度一定あるいは以下の温度変
動条件のいずれかのライゲーション条件で反応させた。
２５℃で３０分間、次いで４５℃で２分間；これを４回
くり返した後、２５℃で３０分間反応後、フェノール抽
出、エタノール沈殿を行って反応生成物を精製した。
【００３９】（５）ライゲーション反応の確認 ライゲーションの効率を確認するために、６%アクリル
アミド８Ｍ尿素変性ゲル電気泳動、６５℃、２２０Ｖ、
１２０ｍＡ、５０分の条件で、サンプルを泳動し、Vist
ra Green(Amersham pharmacia)で染色し、Molecular Im
ager(Bio Rad)で画像化した。その結果を図１に示す。
図１では、ｍＲＮＡ：ＤＮＡ splint：donor ＤＮＡの
モル比、及び反応温度条件（２５℃で温度一定の場合と
上記（４）のように温度を変動した場合）の比較を行っ
ている。この結果から、ｍＲＮＡ：ＤＮＡ splint：don
or ＤＮＡのモル比は１：２：２、温度を変動させた上
記（４）の反応条件で十分であることがわかった。
アミド８Ｍ尿素変性ゲル電気泳動、６５℃、２２０Ｖ、
１２０ｍＡ、５０分の条件で、サンプルを泳動し、Vist
ra Green(Amersham pharmacia)で染色し、Molecular Im
ager(Bio Rad)で画像化した。その結果を図１に示す。
図１では、ｍＲＮＡ：ＤＮＡ splint：donor ＤＮＡの
モル比、及び反応温度条件（２５℃で温度一定の場合と
上記（４）のように温度を変動した場合）の比較を行っ
ている。この結果から、ｍＲＮＡ：ＤＮＡ splint：don
or ＤＮＡのモル比は１：２：２、温度を変動させた上
記（４）の反応条件で十分であることがわかった。
【００４０】（６）ＲＮＡ精製によるＤＮＡ splintの
除去とライゲーション産物にのみＤＮＡ splintがハイ
ブリダイズしていることの確認 ライゲーションした産物の中に混在する未反応のdonor
ＤＮＡとハイブリダイズしていないＤＮＡ splintを除
去するためにRneasy kit(QIAGEN)を用いた。その際、単
にｍＲＮＡとＤＮＡ splintを混合させたものとT4 RNA
ligaseを加えてライゲーション反応を行わせたものを比
較した（図２）。その結果、ライゲーション反応を行わ
ない場合は、ＤＮＡ splintがきれいに除かれているこ
とがわかった。一方、ライゲーション反応が行われてい
る場合は、ｍＲＮＡにハイブリダイズされていたＤＮＡ
splintが、６％アクリルアミド８Ｍ尿素変性ゲル電気
泳動、６５℃、２２０Ｖ、１２０ｍＡ、５０分の条件で
は離れるために、短いバンドとしてＤＮＡ splintを確
認することができた。
除去とライゲーション産物にのみＤＮＡ splintがハイ
ブリダイズしていることの確認 ライゲーションした産物の中に混在する未反応のdonor
ＤＮＡとハイブリダイズしていないＤＮＡ splintを除
去するためにRneasy kit(QIAGEN)を用いた。その際、単
にｍＲＮＡとＤＮＡ splintを混合させたものとT4 RNA
ligaseを加えてライゲーション反応を行わせたものを比
較した（図２）。その結果、ライゲーション反応を行わ
ない場合は、ＤＮＡ splintがきれいに除かれているこ
とがわかった。一方、ライゲーション反応が行われてい
る場合は、ｍＲＮＡにハイブリダイズされていたＤＮＡ
splintが、６％アクリルアミド８Ｍ尿素変性ゲル電気
泳動、６５℃、２２０Ｖ、１２０ｍＡ、５０分の条件で
は離れるために、短いバンドとしてＤＮＡ splintを確
認することができた。
【００４１】（７）ＤＮＡ splintによる逆転写の確認 （６）のように精製したＤＮＡ splintがハイブリダイ
ズしたｍＲＮＡが実際に逆転写できるかどうかを確認し
た。8pmolのＤＮＡ splintがハイブリダイズしたｍRNA
をAccess RT-PCR system(Promega)を用いて逆転写し
た。その後、半分をRNase H（Takara）２unitsで分解
し、逆転写したＤＮＡがあるかどうか確認したものが図
３である。図３において、逆転写産物をRnase Hで分解
した産物中にも約４００ｂｐのバンドが検出されたこと
から、逆転写産物中に逆転写されたＤＮＡが実際に存在
することが確認できた。
ズしたｍＲＮＡが実際に逆転写できるかどうかを確認し
た。8pmolのＤＮＡ splintがハイブリダイズしたｍRNA
をAccess RT-PCR system(Promega)を用いて逆転写し
た。その後、半分をRNase H（Takara）２unitsで分解
し、逆転写したＤＮＡがあるかどうか確認したものが図
３である。図３において、逆転写産物をRnase Hで分解
した産物中にも約４００ｂｐのバンドが検出されたこと
から、逆転写産物中に逆転写されたＤＮＡが実際に存在
することが確認できた。
【００４２】（８）In vitro virus形成の確認 調製したLigation産物が、無細胞翻訳系でIn vitro vir
us genomeとして働くことを確認するために，Rabbit Re
ticulocyte Lysate (Promega社製)を用いて，このLysat
e５０μlにLigation産物２μgを加えた。翻訳産物を確
認する目的で1MBqの35S Met（Amersham社）も同時に加
えた。その後、３０℃で３０分反応させ、これに最終濃
度が20mM MgCl2, 600mM KClになるようにそれぞれの塩
を加え、−２０℃で一晩、冷蔵した。次に翻訳産物に取
り込まれないフリーの35S Metを取り除くために、Micro
BioSpin Coloumn-6(Biolad社)を用いて精製後、EDTAを
最終濃度100μMになるように加えた。これによりmRNAを
加えたままのリボソームは完全に離れ、mRNAとタンパク
質が結合したin vito virus virionのみが残る。これを
１５％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
確認したものが図５である。図５では、スペーサの長さ
による結合効率の違いを見るために、長さの異なる５種
類のスペーサを用いて短いものから順に０，１，２，
３，４の番号を付けて示してある。
us genomeとして働くことを確認するために，Rabbit Re
ticulocyte Lysate (Promega社製)を用いて，このLysat
e５０μlにLigation産物２μgを加えた。翻訳産物を確
認する目的で1MBqの35S Met（Amersham社）も同時に加
えた。その後、３０℃で３０分反応させ、これに最終濃
度が20mM MgCl2, 600mM KClになるようにそれぞれの塩
を加え、−２０℃で一晩、冷蔵した。次に翻訳産物に取
り込まれないフリーの35S Metを取り除くために、Micro
BioSpin Coloumn-6(Biolad社)を用いて精製後、EDTAを
最終濃度100μMになるように加えた。これによりmRNAを
加えたままのリボソームは完全に離れ、mRNAとタンパク
質が結合したin vito virus virionのみが残る。これを
１５％SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
確認したものが図５である。図５では、スペーサの長さ
による結合効率の違いを見るために、長さの異なる５種
類のスペーサを用いて短いものから順に０，１，２，
３，４の番号を付けて示してある。
【００４３】
【発明の効果】本発明によるＤＮＡ splintを用いる一
本鎖核酸の連結方法は、（１）連結効率が高く、（２）
反応時間が短く、さらに（３）ＤＮＡ splintを逆転写
用プライマーとしても使用できるという利点を有する。
また、本発明の方法は一本鎖ＤＮＡ同士をライゲーショ
ンするためにも使えるため、例えば、様々な遺伝子ライ
ブラリのpolyAテールを利用して他の1本鎖ＤＮＡ領域と
結合することが可能となる。従来は、ＤＮＡライゲーシ
ョンの場合、制限酵素部位が必要であったが、この方法
ではそのような必要がなく、ライゲーション効率も良い
という利点を有する。さらに、本発明のこのような特徴
を生かして何種類かのＤＮＡ splintを利用して一本鎖
ＤＮＡをランダムにつなぎ合わせて人工的に様々なライ
ブラリーを作製することも可能である。これは、進化分
子工学において極めて有用な技術となる。
本鎖核酸の連結方法は、（１）連結効率が高く、（２）
反応時間が短く、さらに（３）ＤＮＡ splintを逆転写
用プライマーとしても使用できるという利点を有する。
また、本発明の方法は一本鎖ＤＮＡ同士をライゲーショ
ンするためにも使えるため、例えば、様々な遺伝子ライ
ブラリのpolyAテールを利用して他の1本鎖ＤＮＡ領域と
結合することが可能となる。従来は、ＤＮＡライゲーシ
ョンの場合、制限酵素部位が必要であったが、この方法
ではそのような必要がなく、ライゲーション効率も良い
という利点を有する。さらに、本発明のこのような特徴
を生かして何種類かのＤＮＡ splintを利用して一本鎖
ＤＮＡをランダムにつなぎ合わせて人工的に様々なライ
ブラリーを作製することも可能である。これは、進化分
子工学において極めて有用な技術となる。
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GenCom <120> A method for the ligation of nucleic acids <130> A01496MA <160> 7
【００４５】 <210> 1 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 1 gatcccgcga aattaatacg actcactata gggagaccac aacggtttcc ctctagaaat 60 aattttgttt aactttaaga aggagatgcc accatg 96
【００４６】 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 2 gatcccgcga aattaatacg actcactata ggg 33
【００４７】 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 3 caggtgaata attttatcgc tcatggtggc atctccttc 39
【００４８】 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 4 gaaggagatg ccaccatgag cgataaaatt attcacctg 39
【００４９】 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 5 tttcgccagg ttagcgtcga ggaactc 27
【００５０】 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 6 ccggtcgaaa cgccaggtta gc 22
【００５１】 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 7 ccctttcgac cggaaaaaaa aaaaa 25
【図１】図１は、ライゲーション反応の確認を示す図で
ある。
ある。
【図２】図２は、ＲＮＡ精製によるＤＮＡ splintの除
去とライゲーション産物にのみＤＮＡ splintがハイブ
リダイズしていることの確認を示す図である。
去とライゲーション産物にのみＤＮＡ splintがハイブ
リダイズしていることの確認を示す図である。
【図３】図３は、ＤＮＡ splintによる逆転写の確認を
示す図である。
示す図である。
【図４】図４は、本明細書に記載した本発明の実施例の
概要を示す模式図である。
概要を示す模式図である。
【図５】図５は、調製したLigation産物を用いてIn vit
ro virus形成を確認した図である。
ro virus形成を確認した図である。
Claims (17)
- 【請求項１】 第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸と
を連結する方法において、第１の一本鎖核酸の一部と相
補的な配列と第２の一本鎖核酸の一部と相補的な配列と
を有する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸の存在下に
おいて、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをＲＮ
Ａリガーゼで処理する工程を含み、第１の一本鎖核酸と
第２の一本鎖核酸の少なくとも片方がＤＮＡであること
を特徴とする方法。 - 【請求項２】 第１の一本鎖核酸の３’末端と第２の一
本鎖核酸の５’末端とを連結する方法において、第１の
一本鎖核酸の３’末端側の塩基配列であって３’末端の
数塩基を除いた塩基配列に対して相補的な配列と、第２
の一本鎖核酸の５’末端側の塩基配列であって５’末端
の数塩基を除いた塩基配列に対して相補的な配列とを有
する一本鎖核酸である第３の一本鎖核酸の存在下におい
て、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とをＲＮＡリ
ガーゼで処理することを含み、第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸の少なくとも片方がＤＮＡであることを特
徴とする方法。 - 【請求項３】 第１の一本鎖核酸がＲＮＡであり、第２
の一本鎖核酸がＤＮＡである、請求項１又は２に記載の
方法。 - 【請求項４】 第１の一本鎖核酸が３’末端にポリＡ配
列を有するｍＲＮＡである、請求項１から３の何れかに
記載の方法。 - 【請求項５】 第２の一本鎖核酸が５’末端に数個のＣ
を有する核酸であって、この数個のＣは第３の一本鎖核
酸と相補鎖を形成しない、請求項１から４の何れかに記
載の方法。 - 【請求項６】 第１の一本鎖核酸または第２の一本鎖核
酸が、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボ
ソームによって認識されるＤＮＡ配列、及び（３）目的
タンパク質をコードする配列を有することを特徴とす
る、請求項１から５の何れかに記載の方法。 - 【請求項７】 第１の一本鎖核酸：第３の一本鎖核酸：
第２の一本鎖核酸のモル比が、１：１〜３：１〜５であ
る、請求項１から６の何れかに記載の方法。 - 【請求項８】 第１の一本鎖核酸：第３の一本鎖核酸：
第２の一本鎖核酸のモル比が、１：１〜２：１〜３であ
る、請求項１から７の何れかに記載の方法。 - 【請求項９】 ＲＮＡリガーゼがＴ４ＲＮＡリガーゼで
ある、請求項１から８の何れかに記載の方法。 - 【請求項１０】 第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸
と第３の一本鎖核酸とを混合してアニーリングさせた後
に、ＲＮＡリガーゼを添加して第１の一本鎖核酸と第２
の一本鎖核酸とを連結する、請求項１から９の何れかに
記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項１から１０の何れかに記載の方
法により得られる核酸連結体。 - 【請求項１２】 請求項３の方法により得られる、ＲＮ
Ａを含む核酸連結体を逆転写反応に付してＤＮＡのみか
ら成る核酸連結体を製造する方法。 - 【請求項１３】 請求項１から１０の何れかに記載の方
法により得られる核酸連結体をタンパク質翻訳系に導入
して第１の一本鎖核酸をタンパク質に翻訳することを特
徴とする、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡによりコードされるタ
ンパク質から成るＲＮＡ−タンパク質複合体の製造方
法。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の製造方法により製
造されるＲＮＡ−タンパク質複合体。 - 【請求項１５】 請求項１４に記載のＲＮＡ−タンパク
質複合体を逆転写反応に付することを特徴とする、ｃＤ
ＮＡと該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質から成
るＤＮＡ−タンパク質複合体の製造方法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の製造方法により製
造されるＤＮＡ−タンパク質複合体。 - 【請求項１７】 請求項１から１０の何れかに記載の方
法において第３の一本鎖核酸として数種類の異なる核酸
を利用して、第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸とを
ランダムに連結することを特徴とする、核酸ライブラリ
ーの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000370426A JP2002171983A (ja) | 2000-12-05 | 2000-12-05 | 核酸の連結方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000370426A JP2002171983A (ja) | 2000-12-05 | 2000-12-05 | 核酸の連結方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002171983A true JP2002171983A (ja) | 2002-06-18 |
Family
ID=18840326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000370426A Pending JP2002171983A (ja) | 2000-12-05 | 2000-12-05 | 核酸の連結方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002171983A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2907794A1 (fr) * | 2006-09-29 | 2008-05-02 | Univ Case Western Reserve | Methode de detection d'oligonucleotides courts |
| WO2008108103A1 (ja) | 2007-03-07 | 2008-09-12 | Waseda University | 一本鎖ｄｎａを切断及び／又は連結するための組成物 |
| WO2011052013A1 (ja) * | 2009-10-29 | 2011-05-05 | 株式会社バイオダイナミクス研究所 | 核酸鎖の結合および修飾方法 |
| CN111235198A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-05 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 |
-
2000
- 2000-12-05 JP JP2000370426A patent/JP2002171983A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2907794A1 (fr) * | 2006-09-29 | 2008-05-02 | Univ Case Western Reserve | Methode de detection d'oligonucleotides courts |
| WO2008108103A1 (ja) | 2007-03-07 | 2008-09-12 | Waseda University | 一本鎖ｄｎａを切断及び／又は連結するための組成物 |
| WO2011052013A1 (ja) * | 2009-10-29 | 2011-05-05 | 株式会社バイオダイナミクス研究所 | 核酸鎖の結合および修飾方法 |
| CN111235198A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-06-05 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 |
| CN111235198B (zh) * | 2020-01-20 | 2021-06-15 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 |
| WO2021147570A1 (zh) * | 2020-01-20 | 2021-07-29 | 深圳市瑞吉生物科技有限公司 | 规模化合成长链rna的方法及其定点修饰的方法 |
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