JPH06505872A

JPH06505872A - １本鎖直鎖状ｄｎａ鋳型から全長２本鎖ｄｎａを合成する方法

Info

Publication number: JPH06505872A
Application number: JP4506198A
Authority: JP
Inventors: スケール　ジョージ; フクオカ　シンイチ
Original assignee: ベス　イスラエル　ホスピタル　アソシエーション
Priority date: 1991-01-18
Filing date: 1992-01-14
Publication date: 1994-07-07
Also published as: AU1341992A; EP0567587A1; WO1992013088A1; US5643766A; EP0567587A4; AU656175B2; CA2100788A1; US5162209A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１本鎖直鎖状ＤＮＡ鋳型から全長２本鎖ＤＮＡを合成する方法発明の背景本発明の分野は２本鎖ＤＮＡの合成である。

１本鎖（以下ｒｓ　ｓＪと略称する）ＤＮＡ鋳型を２重鎖（以下ｒｄｓＪと略称する）ＤＮＡ分子に転換するには、デオキシヌクレオチド三リン酸（以下ｒｄＮＴＰｓＪという）、すなわち、鋳型鎖を読み取り、相補関係にあるＤＮＡ第２鎖に適当なｄＮＴＰｓを取り込むことができる一種の酵素、ならびに第２鎖の出発材料となる遊離３′末端のヒドロキシル基を供給できるプライマーを必要とする。

プライマーの必要性により、５′末端でのヌクレオチド配列が不明な直鎖状鋳型鎖を補足する全長性第２鎖を合成することが困難になっている。この問題については、ｃＤＮＡライブラリー（細胞標本中のｍＲＮＡの全部または一部分画につきＤＮＡをクローン化したクローニングベクターのコレクシロン）の確立を目指す研究者たちがさまざまな方法で取り組んできている。上記のライブラリーには、細胞中の全ｍＲＮＡ種を補足するｒｃＤＮＡＪというＤＮＡ種を調製することが必要になる。マニアチス他によって詳細に記述されているように（「分子クローニング便覧（ラボラトリ−マニュアル）」、コールドスプリングハーバ−実験所、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ、１９８２）ｍＲＮＡからのｄｓ　ｃＲＮＡＪ製は蛋白を活性的に生成している細胞からポリ（ｒＡ）”　ｍＲＮＡを単離することに始まる数工程のプロセスである。［ここにいう「ポリ（ｒＡ）Ｊはアデノシンリボヌクレオチド−リン酸（ｒＡＭＰ）単体のみからなるＲＮＡホモポリマーのことである。「ポリ（ｄＡ）Ｊといった場合は、アデノシン・デオキシリボヌクレオチド・−リン酸（ｄＡＭＰ）単体をもつＤＮＡホモポリマーのことである。またその他のりボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから成る各ホモポリマーも本明細書では同様に表示する。たとえば、「ポリ（ｒＣ）ＪはｒＣＭＰ単体から成るＲＮＡホモポリマーのことである。「ポリ（ｄＣ）ＪはｄＣＭＰ単体から成るＤＮＡホモポリマーのことであり、「ポリ（ｒＧ）ＪはｒＧＭＰ単体から成るＲＮＡホモポリマーのこと、などである。コ前記のようにして単離されたポリ（ｒＡ）”　ｍＲＮＡ種は、以下のようにｃＤＮＡ合成用の鋳型として用いる。まず、合成ポリ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドをｍＲＮＡ分子３′ポリ（「Ａ）尾部にハイブリダイズ（対合）する。この場合、合成ポリ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡを鋳型とし逆転写酵素でｃＤＮＡ　（これを「アンチセンス１ストランドという場合もある）の第１本鎖合成のためのプライマーとして働く。好適条件下ではこの酵素により全長性ｃＤＮＡ鎖（すなわち、全ｍＲＮＡ鋳型を相補するＤＮＡ鎖である。ただし、ｍＲＮＡの３゛末端における若干のポリ（「Ａ）を除くことがある）を合成することができる。その結果、ｓｓ　ｃＤＮＡ全長がそのｍＲＮＡＪＩｍにハイブリダイズされる。前記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドは直接クローニングされてベクターとなり、これを用いて宿主細胞を形質転換することができるが、この方法では効率が悪く「多数のｃＤＮＡクローンを構成するには不適当である」　（マニアチス池、ｐ、２１１）。より多くの場合、以下のものを含む複数の方法のいずれかによりｓｓ　ｃＤＮＡから生成したｃＤＮＡを用いてクローニングを実行する（各添付図１〜４）。

（１）まずｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドをアルカリで処理し、ｍＲＮＡを加水分解してｓｓ　ｃＤＮＡを生成する。場合によっては、該分子の３′末端ないしその近傍に数個のヌクレオチドがセルフ−ハイブリダイゼーションすることによりｓｓ　ｃＤＮＡが第１鎖の３′末端のヒドロキシル基からＤＮＡＩｆ！２鎖（「センスコストランド）の合成を開始させる力をもつ一過性の「ヘアピンループ」　（図１を参照）を生成する場合があり、したがって、ｓｓ　ｃＤＮＡの全部ではないまでも多くがｃＤＮＡに形質転換されるならば、ｓｓ　ｃＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼおよび４つのｄＮＴＰの全部（すなわち、ｄＡＰＴＳｄＴＴＰ。

ｄＣＴＰとｄＧＴＰ）との長期的（たとえば、２０時間）加温放置が必要である。

ｄｓ　ｃＤＮＡ分子に対し相補的関係にある２本鎖を接合するｓｓ　ＤＮＡループは１本鎖ＤＮＡを特異的に消化する（Ｓｌヌクレアーゼのような）エンドヌクレアーゼとともに除去することができる。その結果、元のｍＲＮＡのプラント末端ｄｓ　ｃＤＮＡ複製から種々の量の各ｍＲＮＡの５′末末端列を差し引いたものが生成する。

（２）ガブラーとホフマン（遺伝子　２５：２６３−２６９　１９８３）は図２に示すような過程を開示している。すなわち、元のｍＲＮＡのフラグメントがプライマーとなってＤＮＡ第２鎖が合成される。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドの片方であるｍＲＮＡは、酵素リボヌクレアーゼＨで処理することにより無作為的にニックされ、その結果ハイブリッドの片方ｍ　ＲＮ　Ａ内に複数の３−ヒドロキシル末端が形成され、そのおのおのがｃＤＮＡ鋳型に沿って５−−３”ＤＮＡ合成のプライマーとなることができる。ＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレージランによりｃＤＮＡ！１ｉｉｌＤＮＡ第１ｉｉｌにあるｍＲＮＡ鎖の種々の長さの部分的ＤＮＡ複製のひとつずきが生成する。元のｍＲＮＡの５゛末端にもっとも近いニックで反応を開始したＤＮＡ鎖を合成するポリメラーゼ分子は鋳型に沿って移動するので、これにより下流のｍＲＮＡフラグメントと発生期のＤＮＡ鎖が分解され、その結果ｓｓ　ｃＤＮＡ全長１本鎖（ｃＤＮＡの第１鎖）ならびに、一部は種々の長さのｍＲＮＡ　（５−末端に位置）、一部は新生合成したＤＮＡである第２本鎖をもつｄｓハイブリッドになる。この分子のクローニングを作るためｍＲＮＡの残存部分を残存リボヌクレアーゼによって除去、その結果第１鎖に生じるｓｓ　ＤＮＡ尾部（テール）をクリップオッフすると元のｍＲＮＡの５′末末端列の幾分かを失ったプラント末端ｄｓ　ｃＤＮＡが残る。

（３）上記２つの方法と異なり、ランド他が報告しているｄｓ　ｃＤＮＡ合成方法（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　’Ｒｅｓ、９：２２５１−２２６６　１９８１）では、ｍＲＮＡ全体のｄｓ　ｃＤＮＡ複製ならびに初期にはｍ　ＲＮ　Ａになかった付加的配列が作出される。図３に示すランド他の方法の場合にはｓｓ　ｃＤＮＡから開始、アルカリ加水分解によってこれからｍ　ＲＮ　Ａが除去される。このｓｓ　ｃＤＮＡの３゛末端にポリ（ｄ　Ｃ）尾部を付加、これを酵素末端デオキシリボヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（Ｔ　ｄ　Ｔ）を触媒として合成する。ついでｃＤＮＡ第１鎖の３′末端に位置するこのホモポリマーの尾部は、相補関係にあるホモポリマーのオリゴデオキシヌクレオチド・プライマー、すなわちオリゴ（ｄＧ）とのハイブリダイゼーションのサイトの役割を果たす。第２鎖ＤＮＡ合成は、このプライマーの３゛末端のヒドロキシル基から進行し、元のｍＲＮＡの全長配列からだけでなく一端におけるポリ（ｄＣ−ｄＧ）拡張部からも形成されるｄｓｃＤＮＡが与えられる。本方法の変種も種々報告されており、これにはポリ（ｄＡ）尾部とオリゴ（ｄＴ）プライマーとの組み合わせ、またはポリ（ｄＴ）尾部とオリゴ（ｄＡ）プライマーとの組み合わせが含まれる。相捕的デオキシヌクレオチド・ホモポリマーの組み合わせのうちどれを用いても、合成ホモポリマー拡張、すなわちｃＤＮＡ第２鎖を生成するために利用する方法の人為構造は、クローニング過程全体を通じｄｓ　ｃＤＮＡの一部であるという性質を失なわない。

（４）オカヤマとベルクが報告している第４の方法（Ｍｏｌｅｃ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ、２：１６１−１７０．１９８２）を図４に示す。この方法の場合もポリ（ｄＧ−ｄＣ）尾部をｄｓ　ｃＤＮＡの一端に導入している。直鎖状ｄｓ　ＤＮＡベクターの一本鎖の３′末端にＳＳポリ（ｄＴ）尾部を酵素によって付加する。ポリ（ｒＡ）”　ｍＲＮＡがこのポリ（ｄＴ）尾部に直接へイブリダイズされ、これによりベクターのポリ（ｄＴ）尾部の３″末端のヒドロキシル基は、ｍＲＮＡの鋳型に沿ってｃＤＮＡＤＮＡ第１鎖合成を開始するような位置を占めることになる。つぎに、新生ｃＤＮＡ鎖の３′末端はポリ（ｄ　Ｃ）の末端につながり、ＳＳポリ（ｄＧ）尾部を含有するｄｓリンカ−は上記ベクターの両末端を結ぶブリッジを形成するために付加される（図４を参照）。このＤＮＡリガーゼとの構該体の処理ならびに前記分子のｍＲＮＡ部分の除去の後、ポリ（ｄＧ）ベクター尾部をプライマーとしｃＤＮＡ第１鎖を鋳型として用い、ＤＮＡポリメラーゼによってｃＤＮＡ第２鎖は生成させる。最後にＤＮＡリガーゼはｄｓｃＤＮＡ／ベクターのサイクルを閉じて、「センス」ストランドの５゛末端に全長ｄｓ　ｃＤＮＡにホモポリマーｄＧ−ｄＣ拡張部を含む組み換えＤＮＡベクターが得られる。ハイデツカ−とメッシングはこの方法の１変種について記述している（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１：４８９１−４９０４゜１９８３）。

発明の概要本発明による方法はｓｓ　ＤＮＡ鋳型からｄｓ　ＤＮＡを調製する新規の方法を提供するもので、本発明の方法は、（ａ）ＤＮＡ第１鎖を与える工程と、（ｂ）ＤＮＡ第１鎖の３′末端にホモポリマーのオリゴヌクレオチドを付加することにより尾部形成りＮＡＡｌ２Ｏ得る工程と、（Ｃ）前記尾部の一部と相補関係にあるホモポリマーのＳＳオリゴヌクレオチド・プライマーを提供する工程と、（ｄ）前記プライマーを尾部形成りＮＡＡｌ２Ｏ接触させる工程と、（ｅ）前記プライマーと尾部形成りＮＡＡｌ２Ｏ存在下で前記ＤＮＡ第１鎖と相補関係になるＤＮＡ第２鎖を合成する工程と、（ｆ）前記ＤＮＡ第１鎖と第２鎖のおのおのから尾部及びにプライマーを除去する工程と、を含む。ただし、この場合該尾部と該プライマーのいずれか、または両者はＲＮＡを含有する。

たとえば、尾部にＤＮＡを含有する場合、前記プライマーはＲＮＡを含有しなければならない（すなわち、そのヌクレオチド配列のある部分または全部がＲＮＡ配列でなければならない）。また、該プライマーがＤＮＡを含有する場合には、尾部はＲＮＡを含まなくてはならない。なお、代替方法として尾部およびプライマーの両者がＲＮＡを含有するとしてもよい。下記第１表に利用可能な特定ホモポリマーの種々の組み合わせを示す。

ポリ　（ｄＧ）　ポリ　（「Ｃ）ポリ　（ｄＡ）　ポリ　（「Ｕ）ポリ　（ｄ　Ｔ）　ポリ　（ｒＡ）ポリ（「Ｃ）　ポリ（「Ｇ）またはポリ（ｄＧ）ポリ（「Ｇ）　ポリ（「Ｃ）またはポリ（ｄＣ）ポリ（「Ａ）　ポリ（「Ｕ）またはポリ（ｄＴ）尾部およびプライマーのそれぞれは、長さが少なくとも５ヌクレオチド分あることが望ましい（より好ましくは、５〜３０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜１５ヌクレオチド分である）。

ＤＮＡ第１鎖が自然発生ＲＮＡ　（たとえば、ＲＮＡウィルスまたはｍＲＮＡ）の１本鎖のある部分と相補関係にあるヌクレオチド配列をもっている場合、本発明は当該ＤＮＡ第１鎖からｄｓ　ｃＤＮＡ全長を作出する方法を提供する。本発明による方法を用いた時、該ＤＮＡ第１鎖がｍＲＮＡないしｍＲＮＡフラグメントと相補関係にある場合には、クローニング実験に有益なｃＤＮＡライブラリー゛　を作成することができる。この場合、本発明の方法にはクローニングベクターにｄｓ　ｃＤＮＡ生成物全長を挿入する付加的工程を包含することになろう。

同様に、本発明の範囲に属するものとして、十分に精製された長さが少なくとも５リボヌクレオチド分（好ましくは、５〜３０リボヌクレオチド分）あるＳＳオリゴリボヌクレオチド・ホモポリマー［たとえば、ポリ（ｒＧ）、ポリ（「Ｃ）、ポリ（ｒＵ）、ポリ（ｒＡ）］からなるブプライマがある。当該プライマーは、１本のｓｓ　ＤＮＡ直鎖をｄｓ　ＤＮＡ二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ）に形質転換する（あるいはｍＲＮＡのようなｓｓ　ＲＮＡ鎖をｓｓ　ＤＮＡ直鎖に形質転換してから、ざらにｄｓ　ＤＮＡ二重鎖に形質転換する）場合に有益なキットの一部とすることができ、また場合によっては、当該キットは、ｓｓ　ＤＮＡ直鎖の３ −末端にホモポリマー尾部を付加することができる第１の酵素（たとえば、ＴｄＴないしポリＡポリメラーゼ）と、ＤＮＡ鋳型と相補関係にあるＤＮＡを合成する能力を有するｔＪ２の酵素（たとえば、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ）とを含む。またオプションとして当該キットを使用するについての取扱説明をキットに付は加えることも可能である。さらにまた、本キットは、デオキシヌクレオチド三リン酸単体（たとえば、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰから選択されたｄＮＴＰ）の製法を含み、第１酵素により当該単体をキットとともに供給するプライマーと相補的関係にあるホモポリマーのｓｓ　ＤＮＡ尾部に重合させることもできる。また、第２酵素とともに使用する４つのｄＮＴＰの混合物、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを除去しながら当該二重鎖のＤＮＡ部分をほとんど分解しない第３酵素（たとえば、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ））の製法も追加できよう。さらにオプションとしてｄｓ　ＤＮＡ分子の１本鎖に付着したｓｓ　ＤＮＡ尾部を消化できる第４の酵素（たとえば、Ｔ４ポリメラーゼ）の製法をも追加できるであろう。

本発明の方法は、従来のｓｓ　ＤＮＡ１本鎖からｄｓ　ＤＮＡを合成する方法と比較した場合、幾つかの利点を有する。ＤＮＡ第２鎖を合成後に３′尾部またはＲＮＡから成るプライマーを利用して周知のＲＮＡ加水分解方法（たとえば、酵素または高いｐＨによる）を用いることによって、ｄｓ　ＤＮＡ二重鎖からホモポリマー拡張部のうちのＲＮＡ部分を選択的に除去することができる。この方法によれば、（尾部とプライマーの両者がＲＮＡであった場合）拡張部も残存せず、（また、尾部とプライマーのいずれかがＤＮＡであった場合）ｓｓＤＮＡも残存しない。ｓｓ　ＤＮＡ拡張部は適当なｓｓ特異的ＤＮＡヌクレアーゼで簡単に除去することができる。すなわち、外来のＤＮＡ／ＤＮＡ拡張ホモポリマーを有しないプラント末端ｄｓ　ＤＮＡであり、これはｃ　ＤＮＡのクローニングや発現への干渉のような実験的人為構造に寄与するものである（クー（Ｘｕ）他、ＤＮＡ　６：５０５−５１３．１９８７）。さらには、頻繁に利用されている他の方法とはことなり、本発明による方法では元のｓｓ　ＤＮＡ鎖の３′末端（またはｓｓ　ＤＮＡ鎖がｍＲＮＡのようなＲＮＡの逆転写により生成する場合には、元のＲＮＡ鋳型の５′末端）に対応する配列が失なわれることがない。本発明によって生成される全長ｄｓ、ｃＤＮＡをｍＲＮＡのｄｓ　ｃＤＮＡ複製を作成するために使用した場合でも、本発明は元のｍＲＮＡ上に存在し、かつ潜在的にはクローン化したｃＤＮＡの全面的発現効率に必要な５′非翻訳部域のすべてを保持する。得られた全長ｄｓ　ｃＤＮＡは先行周知方法によって得られるｄｓ　ｃＤＮＡよりも高い効率でクローン化し発現させることができる。

なおまた、本発明によるキットは任意のｓｓ　ＤＮＡ鎖から全長ｄｓ　ＤＮＡを得るため本発明の方法を実施する好都合な方法を提供する。

本発明の他の特徴ならびに便益は下記の好適実施態様についての記述ならびに請求範囲から明らかになるであろう。

詳細な説明まず、図面について説明する。

図１は、従来のｄｓ　ｃＤＮＡ調製方法を説明する図である。

図２は、ｃＤＮＡを調製する第２の従来方法を説明する図である。

図３は、ｃＤＮＡを調製する第３の従来方法を説明する図である。

図４は、ｄｓ　ｃＤＮＡを調製する第４の従来方法である（オカヤマとベルクの図３、ｐ、１６３を応用）。

図５は、本発明による方法の実施態様のひとつを説明する図である。

図６は、アルカリ電気泳動ゲルのオートラジオグラフであって、レイン１はＤＮＡのサイズマーカー、レイン２及びレイン６はイヌ膵臓　ｍＲＮＡ標本から逆転写した　ｃＤＮＡの全長第１本鎖（アンチセンス）、レイン３．４および５はレイン他の方法により同一のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの第２鎖（センス）（レイン３）、ガブラーとホフマンの方法により同−ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの第２鎖（センス）（レイン５）または本発明の方法により同−ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡの第２鎖（センス）（レイン４）をそれぞれ示す図である。

ｓｓ　ＤＮＡ鋳型から全長ｄｓ　ＤＮＡを調製する方法図５に示す方法には、下記の諸工程が含まれる。

（ａ）ｓｓ　ＤＮＡ第１鎖（これは、たとえば、変性ゲノムＤＮＡ、、５ｓＤＮＡウイルス、ないしｍＲＮＡまたはＲＮＡウィルスのようなＲＮＡ鋳型から合成したＤＮＡでもよい）を出発物質として、ＤＮＡ鎖の３′末端にホモポリマーのオリゴヌクレオチド尾部が付加される。すなわち、この尾部は、ＴｄＴまたはポリＡポリメラーゼのような酵素によってヌクレオチドを順次付加してｓｓ　ＤＮＡ鎖の３−末端に付着させる。ただし、ＤＮＡ鎖の３′末端にあらかじめ形成した好適なホモポリマーのオリゴヌクレオチドを連結するだけでも十分であろう。

前記尾部は、ＤＮＡ　［ポリ（ｄＣ）、ポリ（ｄＧ）、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）］でもよく、またＲＮＡ　［ポリ（ｒＣ）、ポリ（ｒＧ）、ポリ（「Ａ）またはポリ（ｒＵ）］でもよい。下記に掲げる実施例では尾部がポリ（ｄ　Ｃ）となっている。ポリ（ｄ　Ｃ）尾部は、ポリ（ｄＧ）を含有する尾部に比較して若干の長所のあることが示されており、ＳＳ形式では、（相補的プライマーにハイブリダイズすることが困難など）実験的人為構造を作出する非生成２次構造に縮合することができる。加えて、ｄＧＴＰがヌクレオチドである場合よりもｄＣＴＰをヌクレオチドとして使用した場合の方が時間と温度を操作することでＴｄＴ（このような尾部長）による尾部合成比率が制御しやすくなる。各Ｇ−Ｃ対に形成される３つの水素結合はＡ−Ｔ対またはＡ−Ｕ対の間に形成される２つの水素結合よりもハイブリダイゼーションの安定性が高いので、ポリ（ｄＣ）尾部は、ポリ（ｄＡ）、ポリ（ｄＴ）、ポリ（「Ａ）やポリ（「Ｕ）尾部よりも幾分優れている。

さらに、ポリ（ｄＣ）尾部は、ポリ（「Ｇ）がプライマーとなる可能性を意味するから、ポリ（「Ｃ）またはポリ（「Ｕ）のプライマーより汚染性質をもつＲＮＡアーゼＡに対し強い耐性を呈示する。尾部の正確な長さはさして重要ではないが、プライマーと効率的かつ安定的にハイブリダイズするに十分な長さが必要である（すなわち、少なくとも５ヌクレオチド分の長さ）。尾部の長さとしてはほぼ５〜３０ヌクレオチドの長さが望ましい。

（ｂ）つぎに、尾部に対して相補性を有するホモポリマーの１本鎖オリゴヌクレオチド・プライマーを当該尾部とハイブリダイズ成させる。ＤＮＡ第２鎖の合成後、当該プライマーおよび尾部を容易に除去する手段を提供するためには、当該プライマーないし尾部、もしくは両者がＲＮＡでなくてはならない。したがって、もし、尾部がＲＮＡならばプライマーはＲＮＡまたはＤＮＡが好ましい。また、もし尾部がＤＮＡならばプライマーはＲＮＡでなくてはならない。言うまでもなく、プライマーを含有するホモポリマーの特定は、前記尾部を含むホモポリマーが上記第１表に示す尾部／プライマーの可能的組み合わせを特定できるかどうかに係わる。当該プライマーは合成したものでも、自然に存在するプライマーでもよい。プライマーの長さは重要ではないが、尾部と効率的かつ安定的に／＼イブリダイズするに十分な長さとする（すなわち、少なくとも５ヌクレオチド分の長さ）。プライマーの長さとしてはほぼ５〜３０ヌクレオチドの長さとすることが望ましい。下記の実施例で使用されているプライマーはオリゴ（ｒＧ）１５であった（すなわち、グアノシン・リボヌクレオチド−リン酸１５単体からなるＲＮＡオリゴマー）。

上記プライマーは尾部よりも短くても、長くても、また同じ長さであってもよいが、尾部がＤＮＡの場合には、プライマー全体を尾部にハイブリダイズさせた後でも尾部の５′末端における単一ないし複数のヌクレオチドがハイブリダイズしないままに残る（プライマーの方が短い場合またはプライマーと尾部が不揃の場合）可能性を最小限に抑制するためプライマーの長さは尾部の長さ以上とすることが望ましい。ヌクレオチドがハイブリダイズされないまま残った時には、尾部の非ハイブリダイズされた部分と相補的関係にあるデオキシヌクレオチドを取り込むとともにＤＮＡ第２鎖の後続合成が開始する。その結果、（もし尾部がＤＮＡであれば）一端に単一ないし複数のＤＮＡ塩基対からなるｄｓホモポリマー拡張部を有するｄｓ　ＤＮＡ分子が得られる。拡張部を極めて短いものとした場合（すなわち、５塩基対未満）にも、通常クローニング実験の結果にほとんど影響がない。しかしながら、（１）尾部をＤＮＡのホモポリマーではなくＲＮＡのホモポリマーとする、もしくは（２）尾部がＤＮＡのホモポリマーなら、プライマーが第１鎖の尾部にハイブリダイゼーションした後、かつＤＮＡポリマーとｄＮＴＰを添加する前にＲＮＡおよびプライマーを含有するｒＮＴＰと同じｒＮＴＰを付加することにより、この問題を完全に回避することができよう。このようにすれば、ＲＮＡプライマーを尾部の５′末端まで延長することができ、他の３つのｒＮＴＰが存在しないのでＲＮＡ合或は停止することになる。この時点で、ＲＮＡ合成がやり残したところをＤＮＡ合成が引き継ぐことができるようにＤＮＡポリメラーゼに４個のｒ、　Ｎ　Ｔ　Ｐを添加することができる。この後、ＲＮＡプライマーを除去すれば、ＲＮＡポリメラーゼがｉｎ　５ｉｔｕで合成した部分も除去され、ｓｓ　ＤＮＡに特異的な好適ヌクレアーゼによる消化を受けやすい　ＤＮＡホモポリマー尾部がそっくり残ることになる。

ＲＮＡが、至る所に存在するりボヌクレアーゼによる分解を受けやすいことは周知である。したがって、オリゴ（「Ｇ）またはその他のＲＮＡホモポリマーを扱う場合には細心の注意を払い、リボヌクレアーゼによる汚染やプライマーの喪失を防がなくてはならない。通常の注意を払っても、ＲＮＡプライマーの備蓄標本は徐々に変性し、これにより数か列後にはＤＮＡ合成用プライマーとしての効力を失なう、と考えられる。

（Ｃ）一旦、ＤＮＡ第１鎖に適当なプライマーをハイブリダイズさせた後（また、必要なら、ＲＮＡポリメラーゼに尾部のハイブリダイズされた５′末端を転写させた後）には、ＤＮＡ全長第２鎖は、プライミング後の鋳型にＤＮＡポリメラーゼと４１１１のｄＮＴＰ全部を添加することにより合成される。

（ｄ）ついで、その結果生成するＲＮＡ　（プライマー、尾部のいずれか、ないしはその両者）二重鎖核酸部分を除去する［たとえば、プライマーと尾部のいずれかがＲＮＡであるようなりボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、またはプライマーと尾部の両者がＲＮＡである（コブラのベーノムｄｓリボヌクレアーゼのような）ｄｓＲＮアーゼを用いて〕ことができる。また、プライマーと尾部のいずれかがＤＮＡであればその１本鎖となり、したがって適当なｓｓ　ＤＮＡヌクレアーゼを用いて都合よく除去することができる。たとえば、Ｔ４ポリメラーゼは尾部がＤＮＡになっている３−ｓｓ　ＤＮＡオーバーハングを除去するのに対し、（Ｓ１ヌクレアーゼ、ヤエナリ豆（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＶＩＩのような）他のヌクレアーゼは、プライマーがＤＮＡになっているような５−ｓｓ　ＤＮＡオーバーハングを除去する場合に有益である。このような、ＲＮＡプライマーないし尾部を除去した後に残るｓｓ　ＤＮＡオーバーハングを取り除くとクローニングを含む後日の実験に適したプラント末端ｄｓ　ＤＮＡが全長得られる。

実施例イヌの膵臓細胞からポリ（「Ａ）”ｍＲＮＡを単離し、標準方法を用いてポリ（ｄＴ）カラム上に精製した。トリ骨髄腫ウィルス（ＡＭＶ）転写酵素（ストラタゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョーラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、カリフォルニア州）およびアダプター−プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともに標準方法により４個のｄＮＴＰの存在下に静置したところ　ｍＲＮＡがｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリットに形質転換した。ｍＲＮＡをアルカリ加水分解（５０ｍＭＮａＯＨ）したところｓｓ　ｃＤＮＡが得られ、その３′末端はポリ（ｄ　Ｃ）の末端につながる。すなわち、水２μｌ中ｓｓ　ｃＤＮＡ２μｇを５ＸＴｄＴ緩衝液４ｕｌ　（０，５Ｍ力コダイル酸カリウム、ｐ）Ｉ７．２．１０ｍＭＣｏＣｌ２．１ｍＭ　ＤＴＴ）に添加、また水２μｌ中Ｂ５Ａ２μｍ１２５０μＭのｄＣＴＰ４μ！、１５ＵのＴｄＴ酵素（ＢＲＬ、ベッセースダ、メリーランド州）を水１μｌと水７μｍに加えた。２２℃で１分率放置した後０．５ＭのＥＤＴＡ溶液１μｌを加えて尾部反応を停止させた。尾部彰成されたｃＤＮＡをエタノールで析出させた後、１００ｎＨのＤＮＡ／μｍでＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ７゜５．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に再度懸濁させた。この条件下で約１５のヌクレオチドをＴｄＴにより順次ｓｓ　ＤＮＡの３゛末端に添加した。

温度６５℃で２分間、１〜２μｇのポリ（ｄ　Ｃ）を尾部とするｓｓ　ｃＤＮＡ（２μｍのＴＥ中）と、ＴＥ１μｍ中１１００ｎオリゴ（ｒＧ）１５プライマー（ベニンシュラ・ラボラトリ−社、カリフォルニア州）と１．５μｌのＬＭ　ＨＥＰＥＳと、ｐＨ７，５，２Ｍ　ＫＣＩ　１．２５μ１１ならびに０．１ＭのＭｇ　Ｃｌ　２を５μ１組み合わせることにより、ポリ（ｄ　Ｃ）を尾部とするＳＳ　ＣＤＮＡは、第２鎖ＤＮＡを合成開始する。反応混合物を１６℃までゆっくり冷却（１時間）させた。

以下のようにして第２鎖ｃＤＮＡ合成を実行した。すなわち、上記ハイブリダイゼーシ町ン反応混合物にＩＭのＤＴＴを０．５μＬ　１０ｍＭのｄＡＴＰ、１０ｍＭのｄＴＴＰ、１０ｍＭのｄＧＴＰと１０ｍＭのｄＣＴＰとを各１．２５μｍ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（３，８５Ｕ／ｕ　１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び水１．７５μｍを添加した。［後日第２鎖の長さを分析したい場合には、１０ｍＭのｄｃＴＰｌ、２５μｌ全部の代わりに１０ｍＭのｄｃＴＰＯ，５μｌに希釈しクレオチド混合物に入れる。］温度１６℃で３時間反応させた後、１５分間７０℃で加熱してＰｏｌ　！酵素を不活化しスナップバックしないようにした。これらの操作ならびに下記の温度操作はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験（パーキン−エルマー／シーラス）の温度調節用に設計された機械を使用して都合よ〈実施することができる。

次の工程はホモポリマーとしてのプライマーと尾部を除去することである。この時点では、ＤＮＡ第２鎖の５″末端を含有するオリゴ（「Ｃ）１５を酵素リボヌクレアーゼＨで処理して二重鎖分子から取り除く。これと同時にＴ４ポリメラーゼの３”−５−エキソヌクレアーゼ分解活性によりポリ（ｄ　Ｃ）尾部を除去する。

反応条件は以下の通りである。ｄｓ　ｃＤＮＡにポリ（ｄＣ）／ポリ（ｒＧ）拡張部を含む加熱不活化したＤＮＡポリメラーゼＩの反応混合物２０μｌを２．５ＵリボヌクレアーゼＨ（２，５Ｕ／μｍ、ＢＲＬ）及びＴ４ポリメラーゼ　２゜４Ｕ　（２，４Ｕ／μｍ、Ｓｔ　ｒａｔａｇｅｎｅ）と結合させ３７℃で３０分間加温放置した後、反応混合物を１５分間７０℃まで加熱してＴ４酵素を不活化した。

次いでフェノール抽出とエタノール析出によりこの反応生成物（ｄｓプラント末端ｃＤＮＡ）を精製させた。本方法の有効性を評定する目的で、イヌ膵臓ｍＲＮＡ標本からｃＤＮＡの第１鎖（アンチセンス）または第２鎖（センス）を合成するために反応混合物の一部として放射能標識をつけたα３２Ｐ−ｄｃＴＰを別途平行処理した。ｄｓ　ｃＤＮＡを調製し、またそれぞれの場合にホモポリマー拡張部を除去した後に、得られたｄｓ　ｃＤＮＡを変性させアルカリゲルの平行のレインで電気泳動により比較した。図６に示すように、本発明の方法によって調製した放射能標識つき第２鎖（レイン４）は、同−ｍＲＮＡ標本から逆転写した放射能標識つき第１鎖と同じサイズ分布である（レイン２と６）。さらに、ランド他（レイン３）ならびにガブラーとホフマン（レイン５）の方法により調製したｃＤＮ＾第２本第２木鎖明の方法で調製したもの（レイン４）と比較した。ランド他の方法（上記および図３に示された）によった場合５−ＤＮＡホモポリマー拡張部を有するｃＤＮＡ第２鎖が得られた。これは、レイン２．４および６と比較した時のレイン３に見られたＤＮＡ鎖の長さの増大と一致した。対照的にガブラポリ（ｄ　Ｃ）尾部に取り込んだｄＣＴＰに放射能標識をつけた別の実験で本発明の方法によって調製したりボヌクレアーゼＨ／Ｔ４ポリメラーゼ処理されたｄｓ　ｃＤＮＡをアルカリゲル電気泳動で分析した。この実験により、放射能標識を付けたＤＮＡ尾部のほとんどすべて（〜９８％）が上記のりボヌクレアーゼＨ／Ｔ４工程（データ示さず）により除去されることが示された。

用途本発明による方法は、ｓｓ　ＤＮＡ鎖の３′末端の配列が不明の場合でも、Ｓｓ　ＤＮＡ鎖を全長ｄｓ　ＤＮＡに形質転換することに有益である。本方法は、ｃＤＮＡのクローニングと発現を妨害することのある長いＤＮＡホモポリマーをクローンに導入しなくとも、非翻訳５゛部域を含むｍＲＮＡ配列全体を代表するｄｓ　ｃＤＮＡのクローニングを可能にするので、ｃＤＮＡクローニングの分野に幅広く適用することができる。なお、本方法は、ｓｓ　ＤＮＡウィルスなどの他のｓｓ　ＤＮＡソース、変性したＤＮＡないしＲＮＡウィルスその他のＲＮＡの逆転写からｄｓ　ＤＮＡ全長を作成する場合にも有益である。

また、本方法は以下のようにＰＣＨにより（ｃＤＮＡのような）ｄｓＤＮＡの標本を増幅する場合にも適用できるであろう。すなわち本発明の方法によって゛　調製されたｄｓ　ｃＤＮＡの標本に対し、そのＲＮＡプライマー／ＤＮＡ尾部拡張部をそのままにしながら、適当な温度安定性ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔａｑ）と４個のｄＮＴＰのすべてを伴なう反応混合物において過剰ＲＮＡプライマー（元のｄｓ　ｃＤＮＡを生成するのに用いたＲＮＡプライマーと同一のもの）および過剰オリゴ（ｄＴ）プライマーを添加する。標準ＰＣＲ工程にしたがって、ＰＣＲ機械のＰＣＲ温度サイクル（適当な数のサイクル、たとえば４０サイクルとする）にこの混合物を当てる。該ｄｓ　ｃＤＮＡをこのように増幅した後、上記のように生成させた各ｄｓ　ｃＤＮＡ上のＲＮＡ／ＤＮＡホモポリマー拡張部は上記の実施例に説明したようにしてリボヌクレアーゼＨとＴ４ポリメラーゼで除去される。また、代替方法として、ｓｓ　ＤＮＡだけで出発し、ＴｄＴを使用してｓｓ　ＤＮＡ鎖に３゛ホモポリマ−ＤＮＡ尾部を加え、上記に概略を説明したＰＣＲ工程により当該尾部ｓｓ　ＤＮＡから多重ｄｓ　ＤＮＡを生成させることもできよう。

その他の実施例他の実施例は以下の請求範囲に属するものである。たとえば、本発明を実施するための最重要要素は、同じく本発明の範囲に属するようなキットという形で組み合わせが可能であろう。このようなキットには以下のものを含めることができる。すなわち、キットは、（ａ）ｓｓ　ＤＮＡの３′末端にホモポリマーの尾部を付加するための（ＴｄＴのような）酵素、ならびにｒＮＴＰまたは（ｄＣＴＰのような）ｄＮＴＰと、（ｂ）［オリゴ（ｒＧ）、５のような］適当なホモポリマーのＲＮＡ　（または尾部がＲＮＡならＤＮＡ）と、（Ｃ）第２本鎖を合成するためのＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩなど）とｄＮＴＰの混合物と、（ｄ）ＮａＯＨまたはりボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の利用などによって（１）ＲＮＡ／ＲＮＡホモポリマーの拡張部を除去する手段、もしくは（２）（ｉ）酵素リボヌクレアーゼＨとＴ４ポリメラーゼ、または（ｉ　１）ＮａＯＨとｓｓ　ＤＮＡエキソヌクレアーゼないしエンドヌクレアーゼの利用などによって、ＲＮＡ／ＤＮＡホモポリマーの拡張部を除去する手段と、ｄ　Ｃｅ１ＣａＣａＣ− ｒＴＴＴ　５・ｃＤＮＡＦＩＧ、　３国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ｄｓ　ＤＮＡを作成する方法であって、（ａ）ＤＮＡ第１本鎖を供給する工程と、（ｂ）前記ＤＮＡ第１本鎖の３′末端にホモポリマーのオリゴヌクレオチド尾部を付加し尾部形成したＤＮＡ第１本鎖を得る工程と、（ｃ）前記尾部の一部と相補関係にあるｓｓホモポリマーのオリゴヌクレオチド・プライマーを供給する工程と、（ｄ）前記プライマーと前記尾部形成したＤＮＡ第１本鎖とを接触させる工程と、（ｅ）前記プライマーと前記尾部形成したＤＮＡ第１本鎖との存在下において、前記ＤＮＡ第１本鎖と相補関係にあるＤＮＡ第２本鎖を合成する工程と、（ｆ）前記ＤＮＡ第１本鎖および第２本鎖からの前記尾部とプライマーとを除去する工程と、からなり、前記尾部と前記プライマーのいずれか、または両者にＲＮＡを含む方法。
２．請求項１記載の方法であって、全長性ｄｓ　ｃＤＮＡを調製する方法であって、前記ＤＮＡ第１本鎖に自然発生ＲＮＡの１本鎖の一部分と相補関係にあるヌクレオチド配列からなる方法。
３．請求項２記載の方法であって、ｃＤＮＡライブラリーを作成する方法において、前記全長性ｄｓ　ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入する工程を含み、前記自然発生ＲＮＡがｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのフラグメントである方法。
４．請求項１記載の方法であって、前記尾部はＤＮＡからなり、前記プライマーはＲＮＡからなる方法。
５．請求項１記載の方法であって、前記尾部はＲＮＡからなり、前記プライマーはＤＮＡからなる方法。
６．請求項１記載の方法であって、前記尾部と前記プライマーの両者はともにＲＮＡからなる方法。
７．請求項４記載の方法であって、（ａ）前記尾部は、ポリ（ｄＣ）からなり、（ｂ）前記プライマーは、にポリ（ｒＣ）を含む方法。
８．請求項４記載の方法であって、（ａ）前記尾部は、ポリ（ｄＧ）からなり、（ｂ）前記プライマーは、ポリ（ｒＣ）からなる方法。
９．請求項４記載の方法であって、（ａ）前記尾部は、ポリ（ｄＡ）からなり、（ｂ）前記プライマーは、ポリ（ｒＵ）からなる方法。
１０．請求項４記載の方法であって、（ａ）前記尾部は、ポリ（ｄＴ）からなり、（ｂ）前記プライマーは、ポリ（ｒＡ）からなる方法。
１１．請求項１記載の方法であって、前記尾部と前記プライマーのおのおのは、５個のヌクレオチドからなる方法。
１２．請求項１１記載の方法であって、前記プライマーは、５から３０個のヌクレオチドからなる方法。
１３．実質的に精製された１本鎖ホモポリマーのオリゴリボヌクレオチドであって、長さは少なくとも５個分のヌクレオチドからなるプライマー。
１４．請求項１３記載のプライマーであって、前記オリゴリボヌクレオチドの長さは、５個から３０個分のヌクレオチドであるプライマー。
１５．請求項１３記載のプライマーであって、前記オリゴリボヌクレオチドは、ポリ（ｒＧ）からなるプライマー。
１６．請求項１３記載のプライマーであって、前記オリゴリボヌクレオチドは、ポリ（ｒＣ）からなるプライマー。
１７．請求項１３記載のプライマーであって、前記オリゴリボヌクレオチドは、ポリ（ｒＵ）からなるプライマー。
１８．請求項１３記載のプライマーであって、前記オリゴリボヌクレオチドは、ポリ（ｒＡ）からなるプライマー。
１９．直鎖状ｓｓ　ＤＮＡをｄｓ　ＤＮＡに形質転換するキットであって、（ａ）前記直鎖状ｓｓ　ＤＮＡの３′末端にホモポリマーの尾部を付加可能な第１の酵素と、（ｂ）５個のリボヌクレオチドからなるホモポリマーのオリゴリボヌクレオチドと、（ｃ）ＤＮＡ鋳型と相補関係にあるＤＮＡを合成できる第２の酵素と、からなるキット。
２０．請求項１９記載のキットであって、（ａ）前記第１酵素とともに使用するデオキシヌクレオチド三リン酸単体と、（ｂ）前記第２酸素とともに使用する４個のデオキシヌクレオチド三リン酸混合物と、（ｃ）ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖からＲＮＡを除去できる第３の酵素と、からなり、前記ホモポリマーの尾部は、ｓｓ　ＤＮＡであり、前記ホモポリマーのオリゴリボヌクレオチドは、前記ホモポリマーのｓｓ　ＤＮＡ尾部と相補関係にあるキット。
２１．請求項２０記載のキットであって、ｄｓ　ＤＮＡ分子の１本鎖に付着したｓｓ　ＤＮＡ尾部を消化できる４つの酵素からなるキット。
２２．請求項２１記載のキットであって、前記第１酵素は、末端デオキシヌクレオチディル・トランスフェラーゼであり、前記第２酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩであり、前記第３酵素は、リボヌクレアーゼＨであり、前記第４酵素は、Ｔ４ポリメラーゼであるキット。
２３．請求項２０または２２記載のキットであって、前記デオキシヌクレオチド三リン酸単体は、ｄＣＴＰであり、前記ホモポリマーのオリゴリボヌクレオチドは、５から３０個分のヌクレオチドを有するオリゴ（ｒＧ）であるキット。