KR101231089B1 - 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 - Google Patents

기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101231089B1
KR101231089B1 KR1020087027939A KR20087027939A KR101231089B1 KR 101231089 B1 KR101231089 B1 KR 101231089B1 KR 1020087027939 A KR1020087027939 A KR 1020087027939A KR 20087027939 A KR20087027939 A KR 20087027939A KR 101231089 B1 KR101231089 B1 KR 101231089B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
site
nucleotide sequence
acp
primary
degenerate
Prior art date
Application number
KR1020087027939A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090005183A (ko
Inventor
천종윤
Original Assignee
주식회사 씨젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 씨젠 filed Critical 주식회사 씨젠
Publication of KR20090005183A publication Critical patent/KR20090005183A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101231089B1 publication Critical patent/KR101231089B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP) 및 기지의 뉴클레오타이드 서열 한 위치에 혼성화할 수 있는 제1차 타깃-특이적 프라이머 (TSP)를 이용하여 미지의 뉴클레오타이드 서열을 제1차 증폭 (primary amplification)하는 단계(a)를 포함하며, 상기 단계 (a)는 다음의 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 기지 (旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법에 관한 것이다. (a-1) (ⅰ) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 축퇴성 (degenerate) 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장산물이 생성되는, 제1차 어닐링 온도에서 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 제1단계 증폭 (first-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 제1차 어닐링 온도는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서 작용하도록 한다. 그리고 (a-2) 상기 제1차 어닐링 온도보다 높은 제2차 어닐링 온도에서 상기 단계 (a-1)에서 생성된 증폭 산물의 제2단계 증폭(second-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 단계 (a-1)에서 사용된 제1차 축퇴성 DW-ACP 및 상기 제1차 TSP를 이용하며, 상기 각 프라이머가 타깃 뉴클레오타이드 서열과 어닐링 되는 조건하에서, 제1차 증폭 산물이 생성된다.
핵산, 올리고뉴클레오타이드, 디옥시이노신, 프라이머, 서열, 증폭

Description

기지의 서열에 인접한 미지의 ＤＮＡ 서열을 증폭하는 방법{Method for Amplifying Unknown DNA Sequence Adjacent to Know Sequence}
본 발명은 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 특이적으로 디자인된 프라이머를 이용하여 미지 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법 및 그의 응용에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 가장 효과적인 방법이다. PCR 과정에서, 타깃 핵산에 인접해 있는 5' 및 3'서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 “프라이머”로 이용되며, 이는 중요한 역할을 한다.
특정 DNA 부위를 분리하고 분석하기 위하여 PCR을 적용하는 경우, 목적의 부위에 인접한 DNA 서열에 대한 정보가 요구된다. 이러한 요구는 기지 DNA 서열의 부위에 대한 증폭반응만을 가능하게 한다. 필수적인 서열 정보가 없는 경우, 복합적인 DNA 파퓰레이션에 있는 타깃 DNA 단편에 대한 PCR 증폭은 비-타깃DNA를 증폭하는 결과를 초래할 수 있다.
기지의 서열에 인접한 미지의 DNA 서열을 분리하기 위하여, 많은 PCR-기반 방법들이 개발되었다. 이 방법들은, 인버스 PCR(Triglia et al., 1988), 판핸들PCR(Shyamala et al., 1989; Jones 및 Winistorfer, 1997), 벡터레트 PCR(Arnold et al., 1991), 앵커드 PCR(Roux et al., 1990), AP-PCR(Dominguez et al.,1994; Trueba and Johnson, 1996), 캡쳐 PCR(Lagerstrom et al., 1991) 및 어댑터- 또는 카세트-연결 PCR(Iwahana et al., 1994; Riley et al., 1990; Siebert et al., 1995; Willems, 1998; Kilstrup and Kristiansen, 2000)을 포함한다.
그러나, 상기의 방법들은 제한효소로 DNA를 절단하고, 절단된 DNA를 링커 또는 이중쇄, 부분 이중쇄 또는 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 카세트와 라이게이션한 다음 시퀀싱 전에 생성물을 정제 및/또는 서브클로닝하여야 하는 필요성과 같은 제한점들을 가지고 있다. 이러한 여러 과정에 대한 필요성 때문에 상기의 방법들의 편의성 및 효율성이 감소된다. 또한, 상기의 방법들에 있어서, 벡터, 어탭터, 카세트 또는 테일 프라이머의 비-특이적 결합에 의해 초래되는 높은 백그라운드 및 비-특이적 산물의 형성과 같은 공통된 문제점이 발견된다.
따라서, 네스티드(nested) PCR을 실시하기 전에 바이오틴화 목적의 단편을 캡처링하는 바이오틴/스트렙타비딘 시스템이 신규한 방법론으로 제시되었다(Rosenthal and Jones, 1990; Mishra et al. 2002). 이 방법은 노이즈를 감소시키고 기지의 서열에 인접한 부위를 증폭할 수 있도록 하는 데 있어서 개선점을 나타내지만, 복잡한 고정화 단계를 요구하고 큰 비용이 소요되는 문제점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
상술한 종래의 기술들의 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자는 미지의 서열을 증폭하는 데 있어서 높은 백그라운드 문제점을 기본적으로 완벽하게 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 높은 신뢰성으로 보다 편이한 방식으로 미지의 서열을 증폭할 수 있는, 기지 (旣知, known)의 서열에 인접한 미지 서열의 신규한 증폭 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 타깃 특이적 프라이머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP) 및 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열 한 위치에 혼성화할 수 있는 제1차 타깃-특이적 프라이머(TSP)를 이용하여 미지의 뉴클레오타이드 서열을 제1차 증폭(primary amplification)하는 단계 (a)를 포함하며, 상기 단계 (a)는 다음의 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법을 제공한다: (a-1) 제1차 어닐링 온도에서 제1차 축퇴성 (degenerate) DW-ACP를 이용하는 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 제1단계 증폭 (first-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 단계는 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 (denaturing)의 최소 한 사이클을 포함하며, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP는 (ⅰ) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제1차 어닐링 온도는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서 작용하도록 하며, 이에 의해 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장 산물이 생성되고; 그리고 (a-2) 상기 제1차 어닐링 온도보다 높은 제2차 어닐링온도에서 단계 (a-1)에서 생성된 증폭 산물의 제2단계 증폭 (second-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 단계 (a-1)에서 사용된 제1차 축퇴성 DW-ACP 및 상기 제1차 TSP를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하며, 상기 제2단계 증폭은 상기 각각의 프라이머가 타깃 뉴클레오타이드 서열과 어닐링 되는 조건하에서 실시되며, 이에 의해 제1차 증폭 산물 (primary amplification product)이 생성된다.
본 발명은 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머 (이하, “DW-ACP"라 한다) 및 신규한 타깃 특이적 프라이머를 이용하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 기지의 서열의 일 부분에 인접한 미지의 DNA 서열을 선별적으로 증폭하는 독특한 방법에 관한 것이다.
복잡하고 많은 단계 및 PCR-기반 방법들의 내재적인 백그라운드 문제점의 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자에 의해 개발된 WO 03/050305에 개시되어 있는 어닐링 조절 프라이머 (Annealing Control Primer: ACP) 시스템을 변형시켜, 기지 서열의 일 부분에 인접한 미지 서열의 선별적 증폭에 적용하였다. ACP 시스템은 증폭반응의 특이성(specificity)을 크게 개선할 수 있기 때문에, ACP를 이용하는 것은 증폭 과정에서 프라이머의 비-특이적 프라이밍을 근본적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 본 발명에서 증폭 과정을 단순화시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP는 다음 일반식 Ⅰ로 표시된다:
5'-Xp-Yq-Zr-Qs-3'(Ⅰ)
상기 일반식에서, 상기 Xp는 전-선택 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-말단 부위를 나타내며, 상기 Yq는 최소 두 개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 상기 Zr는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 갖는 축퇴성 랜덤 서열 부위를 나타내며, 상기 Qs는 상기 미지 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-말단 부위를 나타내고, 상기 p, q, r 및 s는 뉴클레오타이드의 수이고, 상기 X, Y, Z 및 Q는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 제1차 축퇴성 DW-ACP는 기지 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 개발된 것으로서, 본 발명자에 의해 개발된 WO 03/050305에 개시되어 있는 어닐링 조절 프라이머의 원리를 이용하고 이를 변형하며, 상기 특허 문헌의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 원리는 최소 두 개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기를 포함하는 조절자 부위에 의해 분리된 명확한 3'- 및 5'-말단 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 조성, 그리고 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 있어서 3'- 및 5'-말단 부위에 대한 조절자 부위의 영향에 기초한다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'- 및 5'-말단 부위 사이에 있는 조절자 부위의 존재는, 프라이머 어닐링 특이성의 개선을 초래하는 주 요소로서 작용한다.
용어 “핵산” 또는 “뉴클레오타이드”는 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체이며, 다르게 특별하게 언급되지 않는 한 자연 뉴클레오타이드의 공지 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 제1차 축퇴성 DW-ACP는 단일쇄 또는 이중쇄 gDNA, cDNA 또는 mRNA 주형을 이용한 핵산 증폭에 이용될 수 있다. 본 발명의 프라이머와 관련하여 사용되는 용어 “부위(portion)”는 조절자 부위와 같은 개입 부위에 의해 분리된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 용어 “3-말단 부위” 또는 “5-말단 부위”는 조절자 부위에 분리된, 본 발명 프라이머의 3'-말단 또는 5'-말단에 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머와 관련하여 사용되는 용어 “실질적으로 상보적인(substantially complementary)”은 소정의 어닐링 조건하에서 프라이머가 주형 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 어닐링된 프라이머는 중합효소에 의해 연장되어 뉴클레오타이드 서열의 상보체를 생성한다. 따라서, 상기 용어는 용어 “완전히 상보적인(perfectly complementary)” 또는 이와 관련된 용어와 다른 의미를 갖는다.
축퇴성 프라이머에서 불확실한 위치의 뉴클레오타이드가 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체에 의해 치환되는 것은 공지된 사실이며, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신(Ohtsuka et al, 1985; Sakanari et al.,1989), 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤(Nichols et al., 1994) 및 5-니트로인돌 (Loakes and Brown, 1994)을 포함하며, 상기 염기들은 4종의 종래 염기들과 비특이적으로 염기쌍을 이루기 때문에 축퇴성 프라이머의 디자인과 관련된 문제점을 해결하는 데 이용된다. 그러나, 디옥시이노신, 1-(2‘-디옥시-베타 D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체가, 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 프라이머, 즉 DNA 워킹 프라이머에서 어닐링 온도에 따라 프라이머내의 각각의 기능적 부위를 구별케 하는 조절자 역할을 할 수 있다는 것에 대하여는 어떠한 보고도 없다.
용어 “유니버설 염기(universal base) 또는 비-구별성 염기 유사체(non-discriminatory base analog)”는 자연의 DNA/RNA 염기들에 대하여 구별 없이 자연의 DNA/RNA 염기들의 각각과 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이며, 가장 바람직하게는, 디옥시이노신이다.
프라이머 내에 상기 디옥시이노신 (deoxyinosines)과 같은 상기 유니버설 염기들을 가지는 폴리디옥시뉴클레오타이드 (polydeoxynucleotides)의 존재는, 염기쌍에서의 약한 수소결합 상호작용 때문에, 낮은 어닐링 온도를 초래한다. 이러한 이론을 확장하여, 본 발명자는, 프라이머의 축퇴성 서열 부위와 3'-말단 부위 및 5'-말단 부위 사이에 유니버설 염기들을 가지는 폴리디옥시뉴 클레오타이드가 존재하면 낮은 융해온도를 갖는 부분을 형성시키며, 이 부분은 축퇴성 서열 부위와 3'-말단 부위 및 5'-말단 부위 각각에 경계를 형성시키고, 이는 특정 온도에서 축퇴성 서열 부위와 3'-말단 부위가 타깃 서열에 어닐링 하는 것을 촉진시킬 것이라는 사실을 추론 하였다. 이러한 이론은 본 발명의 제1차 축퇴성 DW-ACP의 기초를 제공한다.
제1차 축퇴성 DW-ACP에서 조절자 부위는, 어닐링 온도에 따라 프라이머의 어닐링 부위(즉, 축퇴성 랜덤 서열 및 3'-말단 부위)를 조절할 수 있다. 상기 조절자 부위는 5'-말단 부위 서열이 주형에 어닐링하는 것을 억제할 뿐만 아니라, 제1차 어닐링 온도에서 프라이머의 어닐링 부위를 축퇴성 서열 부위와 3'-말단 부위로 한정하는 작용을 한다. 따라서 상기 조절자 부위는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 서열 부위와 3'-말단 부위의 주형에 대한 어닐링을 크게 개선한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 제1차 DW-ACP의 조절자 부위는, 5'-말단 부위와 축퇴성 서열 부위 사이에 최소 3개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하며, 보다 바람직하게는 최소 4개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함한다. 유리하게는, 상기 제1차 DW-ACP의 5'-말단 부위 및 축퇴성 서열 부위 사이에 있는 유니버설 염기 잔기의 길이는 최대 10잔기이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1차 DW-ACP의 조절자 부위는 2-10개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위 및 축퇴성 서열 부위 사이에 있는 유니버설 염기는 약 3-5잔기 길이를 갖는다. 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 연속적 또는 단속적 (intermittent), 바람직하게는 연속적 방식으로 존재할 수 있다.
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위는 어닐링 특이성에 부분적으로 기여한다. 중요하게는, 5'-말단 부위는, 증폭 반응의 첫 번째 라운드 이후의 후속의 증폭 반응에서 단독 또는 다른 부위와 함께 프라이밍 위치로 작용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-말단 부위의 전-선택 (pre-selected) 뉴클레오타이드 서열은 주형 핵산상의 어떠한 위치에 대하여도 실질적으로 상보적이지 않다.
일반적으로, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위는 최소 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 5'-말단 부위 서열의 길이는 최대 60 뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는, 5'-말단 부위 서열의 길이는 6-50 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 18-25 뉴클레오타이드이다. 5'-말단 부위에서 보다 긴 서열이 이용되면, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 효율이 감소될 수 있고, 보다 짧은 서열이 이용되면, 고엄격 조건 하에서 어닐링 효율이 감소될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 상기 5'-말단 부위의 전-선택 뉴클레오타이드 서열은 T3 프로모터 서열, T7 프로모터 서열, SP6 프로머터 서열 및 M13 전방향 또는 역방향 유니버설 서열과 같은 유니버설 프라이머 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 DW-ACP의 이점, 즉 어닐링 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위를 변형할 수 있다. 예를 들어, 5'-말단 부위는 제한효소(들)의 인식 서열(들)을 포함할 수 있으며, 상기 서열은 증폭 산물이 적합한 벡터 내로 클로닝하는 것을 용이하게 한다. 또한, 5'-말단 부위는 증폭 산물의 검출 또는 분리용 표지를 갖는 최소 하나의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 적합한 표지는 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소, 매스 표지, 전자밀집입자, 효소, 조인자, 효소에 대한 기질, 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 5'-말단 부위는 박테리오파아지 RNA 중합효소 프로모터 부분을 포함할 수 있다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 랜덤 서열 부위는 조절자 및 5'-말단 부위 사이에 위치한다. 용어 “축퇴성 랜덤 서열” 부위는 4종의 디옥시리보뉴클레오타이드, 즉 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 중 어느 하나(any one)에 의해 각각의 뉴클레오타이드가 차지되는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서 상기 축퇴성 랜덤 서열 부위는 다양한 뉴클레오타이드 서열들을 가지는 프라이머의 한 풀을 제공하며, 이 중에서 적어도 하나는 주형의 미지의 타깃 서열 상에 있는 어느 한 위치에 어닐링될 것으로 기대된다. 예를 들어, 상기 축퇴성 랜덤 서열 부위에 3종의 축퇴성 뉴클레오타이드를 포함하는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 합성되는 경우, 64종의 올리고뉴클레오타이드들이 생성될 수 있다. 따라서, 상기 축퇴성 랜덤 서열 부위의 이용은, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 특정되지 않은 타깃 핵산에 혼성화될 수 있는 가능성을 더욱 증가시킨다. 상기 축퇴성 서열 및 3'-말단 부위 서열을 포함하는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 타깃 코어 서열이 주형의 한 위치에 혼성화되는 경우, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 부위 및 3'-말단 부위 서열의 상보적 결합 위치가 주형의 미지의 타깃 서열에 몇 개 존재하게 된다. 흥미롭게는, 본 발명자는, 기지 서열의 타깃-특이적 프라이머 서열로부터 가장 근접한 거리에 있는 하나의 타깃-결합 위치에 제1차 축퇴성 DW-ACP가 결합하여 하나의 주 타깃 산물이 일반적으로 생성된다는 사실을 관찰하였다. 타깃-특이적 프라이머 서열로부터 보다 이격된 위치에 존재하는 다른 결합 위치들에 혼성화되는 프라이머들은 산물을 잘 생성하지 않으며, 그 이유는 타깃-특이적 프라이머 서열로부터 가장 근접한 결합 위치에 혼성화된 프라이머가 연장되면 이는 다른 결합 위치들에 혼성화된 프라이머들의 연장을 방해할 수 있기 때문이다.
상기 3'-말단 부위의 길이, 증폭 반응 수율 및 증폭될 뉴클레오타이드의 길이와 같은 다양한 고려 사항에 따라, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 랜덤 서열 부위의 길이가 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 축퇴성 서열 부위의 길이가 증가하면, 본 발명에서 증폭 수율이 감소한다. 일반적으로, 상기 축퇴성 서열 부위의 길이는 1-5, 바람직하게는 2-5, 보다 바람직하게는 2-4, 가장 바람직하게는 3이다.
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 미지의 뉴클레오타이드 서열 상의 한 위치에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는, 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서의 작용을 할 수 있는 범위 내에서, 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대한 하나 또는 그 이상의 미스매치를 가질 수 있다는 것은 당연하다. 가장 바람직하게는, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 완전히 상보적인, 즉 미스 매치되는 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 미지의 서열의 한 위치에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열, 즉 “아비트러리(arbitrary)” 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 용어 “아비트러리 뉴클레오타이드 서열”은 증폭될 미지의 핵산 서열에 대한 정보 없이 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
일반적으로, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위의 길이는 최소 3 뉴클레오타이드이다. 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 어닐링 부위(즉, 축퇴성 서열 및 3'-말단 부위)의 길이가 최소 6 뉴클레오타이드라는 것은 중요한 사항이며, 이 길이는 프라이머가 특이성을 가지고 어닐링하는 데 요구되는 최소 길이 요건으로 판단된다. 실제적으로, 상기 특이성을 가지는 프라이머 어닐링은 어닐링 부위가 최소 8 뉴클레오타이드일 경우 담보될 수 있다. 바람직하게는, 상기 3'-말단 부위의 길이는 3-20 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 4-6 뉴클레오타이드이다.
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 특정 아비트러리 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 준비된다. 상기 특정 아비트러리 뉴클레오타이드 서열은 5'-ANNATGN-3'과 같은 해독 개시 코돈 ATG를 포함하는 mRNA의 코자크 서열을 포함할 수 있으며, 상기 N은 4종의 디옥시뉴클레오타이드 중에서 어느 하나이다(McBratney and Sarnow, 1996). 또한, 상기 특정 아비트러리 뉴클레오타이드 서열은 표준의 폴리아데닐화 시그널 서열 'AATAAA을 포함할 수 있다(Juretic and Theus, 1991). 선택적으로, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위의 5'-말단에 있는 뉴클레오타이드는 4종의 디옥시뉴클레오타이드 중에서 어느 하나를 갖도록 다양화할 수 있으며, 이에 의해 3'-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열의 측면에서 4종류의 제1차 축퇴성 DW-ACP가 얻어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 DW-ACP의 3'-말단 부위의 서열은 다음 요소를 고려하여 선택된다: (1) 최소 2 kb 마다 한번 존재하는 서열 및 (2) 고 GC 비율(바람직하게는 75%이상). 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1차 DW-ACP의 3'-말단 부위의 서열은 GGTC 또는 CACG이다
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위의 길이는, 증폭될 뉴클레오타이드의 길이, 축퇴성 서열 부위의 길이 및 증폭 수율과 같은 다양한 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다. 예컨대, 상기 3'-말단 부위가 4개의 아비트러리 뉴클레오타이드를 가지는 경우, 이론적으로 4-염기 서열 조합은 주형에서 256 bp 마다 한번 씩 존재할 수 있다. 따라서, 증폭되는 뉴클레오타이드의 길이는 256 bp 이상이 된다.
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 전체 길이는 바람직하게는 20-80 뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 28-50 뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 30-40 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 방법에 있어서, 주형의 기지의 뉴클레오타이드 서열 상에 있는 한 위치에 대한 실질적으로 상보적인 제1차 타깃-특이적 프라이머가 이용된다. 제1차 타깃-특이적 프라이머를 언급하면서 사용되는 용어 “실질적으로 상보적”은 제1차 축퇴성 DW-ACP에 대하여 사용되는 용어와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타깃 특이적 프라이머들 (TSPs)은 다음 일반식(Ⅲ)을 갖는다:
5'-X"p-Y"q-Z"r-3' (Ⅲ)
상기 일반식에서, 상기 X"는 혼성화 하는 기지의 뉴클레오타이드의 한 위치와 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5'-고 Tm 특이성 부위 (5'-high Tm specificity portion)이고, 상기 Y"는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, 상기 Z"은 혼성화 하는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-저 Tm 특이성 부위 (3'-low Tm specificity portion)이고, 상기 p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, 상기 X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고 상기 분할 부위는 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위가 주형 핵산과 혼성화되는 경우 비 염기-쌍 버블(bubble) 구조를 형성하고, 상기 분할 부위는 주형 핵산에 대한 어닐링 특이성 측면에서 5'-고 Tm 특이성 부위가 3'-저 Tm 특이성 부위로부터 분할되도록 하며, 상기 프라이머의 어닐링 특이성은 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중적으로 결정되고, 이는 결국 상기 프라이머의 전체 어닐링 특이성은 증가된다.
상기 일반식 Ⅲ을 갖는 타깃 특이적 프라이머는 증폭 반응에 있어 어닐링 특이성을 크게 증가시키기 위해 본 발명자에 의해 새롭게 개발된 것이며 PCT/KR2006/000746으로 국제특허출원을 하였다. 상기 일반식 Ⅲ을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 이중 특이성 올리고뉴클레오타드 (dual specificity oligonucleotide) 라고 명명한다.
본 명세서에서 사용된 상기 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(이하 "DS oligo"라고 한다)에서 언급하는 용어 “이중 특이성”은 타깃 서열에 대한 어닐링 특이성이 두 부위(5'-고 Tm 특이성 부위와 3'- 저 Tm 특이성 부위)를 분할하여 이중으로 결정되는 독특한 특징을 기술하기 위하여 사용된 것이다. 일반적으로, 프라이머 또는 프루브의 어닐링 특이성은 연속된 염기 서열에 의해 결정된다. 대조적으로, 상기 DS oligo의 혼성화 특이성은 분할 부위에 의하여 분할된 두 부위(5'-고 Tm 특이성 부위와 3'- 저 Tm 특이성 부위)에 의해 이중으로 결정되고, 상기 세 부위는 하나의 올리고뉴클레오타이드 서열 위에 존재한다. 상기 이중 특이성은 프라이머 및 프루브로서 DS oligo가 매우 높은 특이성을 나타내도록 할 뿐만 아니라, 종래 기술에서 볼 수 없는 새로운 기술이다.
한편, 본 발명자에 의해 개발된 WO 03/050305에 개시되어 있는 어닐링 조절 프라이머 (ACP)의 원리를 이용하고 이를 변형하며, 상기 특허 문헌의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명인 상기 DS oligo는 다음과 같은 면에서 상기 ACP와 엄격하게 구별된다: (ⅰ) 상기 DS oligo는 타깃 서열과 혼성화 할 수 있는 두 개의 특이성 부위를 가지는 반면, 상기 ACP는 하나의 특이성 부위를 가지며, (ⅱ) 상기 DS oligo에서 세 개의 부위는 Tm의 관점에서 엄격히 구별되는 반면, 상기 ACP는 구별이 없고, (ⅲ) 상기 DS 프라이머는 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'- 저 Tm 특이성 부위에 의해 어닐링 되는 경우에만 주형에 상보적인 핵산 분자를 합성하여 연장되는 반면, 상기 ACP는 3'-말단 부위에 의해 어닐링하는 경우에만 연장되며, 그리고 (ⅳ) 그 결과, 상기 DS oligo의 어닐링 또는 혼성화 특이성은 두 부위(5'-고 Tm 특이성 부위와 3'- 저 Tm 특이성 부위)에 의한 이중으로 결정되는 반면, 상기 ACP의 특이성은 오직 3'-말단 부위에 의해서만 결정된다. 따라서, 상기 DS oligo의 어닐링 또는 혼성화 특이성은 상기 ACP의 특이성보다 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 상기 DS oligo는 상기 ACP에서는 볼 수 없는 새로운 특이성을 가지고 있다.
상기 DS oligo의 놀라운 특징은 하나의 올리고뉴클리오타이드 분자 안에 엄격한 특성을 가진 세 개의 다른 부위(5'-고 Tm 특이성 부위, 3'- 저 Tm 특이성 부위 및 분할 부위)를 가진다는 것이다.
상기 DS oligo는 주형-의존 연장 반응을 포함하는 폭 넓고 다양한 방법 및 분석에 유용하다. 본 발명의 명세서 용어 “주형-의존 연장 반응”은 타깃 서열에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드 분자의 말단 부위 (moiety)에 연속적인 뉴클레오타이드를 결합시키며 연장하는 반응을 의미하며, 연장된 서열은 상보적인 주형 서열에 의해 결정된다.
상기 DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위만 주형에 어닐링되는 경우, 주형-의존 연장에 있어 프라이밍 부위로서 작용할 수 없을 뿐만 아니라, 연장도 일어나지 않는다.
상기 DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위가 비-타깃 서열에 어닐링되는 경우, 짧은 서열을 갖는 3'- 저 Tm 특이성 부위는 비-타깃 서열에 어닐링되지 않는다. 그 이유는 분할 부위가 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위를 어닐링 발생의 관점에 있어서 분리시킨다는 것이다. 즉, 3'-저 Tm 특이성 부위가 5'-고 Tm 특이성 부위로부터 상대적으로 독립적인 방식으로 어닐링이 일어나고 5'-고 Tm 특이성 부위의 어닐링은 3'-저 Tm 특이성 부위의 어닐링을 하는데 있어서 영향을 거의 주지 못한다. 이러한 이유로, 비-타깃 서열에 대한 상기 3'-저 Tm 특이성 부위의 어닐링 경향은 매우 낮게 된다.
상기 3'-저 Tm 특이성 부위만 비-타깃 부위에 상보적인 서열을 가지고 있는 경우, 어느 정도의 고 엄격 조건(5'-고 Tm 특이성 부위의 어닐링에 대한 엄격 조건)에서 뿐만 아니라 상기 3'-저 Tm 특이성 부위의 어닐링도 발생하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 더 높은 어닐링 온도인 엄격 조건하에서 상기 DS oligo를 사용하는 주형-의존 연장 반응을 실시하는데 유리하다.
상기 5'-고 Tm 특이성 부위 및 상기 3'-저 Tm 특이성 부위 모두 주형과 실질적으로 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 DS oligo는 상기 주형과 어닐링이 일어날 수 있으며 그 결과 성공적인 연장을 한다.
상기 이론에 의한 결합이 없다면, 상기 분할 부위가 3'-저 Tm 특이성 부위를 어닐링 조건(온도 및 서열 상보성)에 더 민감하게 한다고 여겨진다. 이러한 점에서, 상기 3'-저 Tm 특이성 부위와 비-타깃 서열과의 비-특이적 혼성화는 어닐링(또는 엄격한) 조건하에서 보다 낮게 발생된다. 상기 3'-저 Tm 특이성 부위 뿐만 아니라 상기 5'-고 Tm 특이성 부위가 각각의 타깃 서열에 어닐링 되는 경우, 상기 3'-저 Tm 특이성 부위의 3'-말단이 DNA 폴리머라제 (polymerase)에 의하여 연장 할 수 있는 부위를 보다 많이 발생시킨다.
본 명세서에서 사용되는 "올리고뉴클레오타이드"는 타깃 뉴클레오타이드서열과 특이적으로 혼성화 할 수 있는 자연 선형 올리고머(linear oligomer), 변형된 모노머 (monomer), 또는 자연적으로 발생하거나 합성적으로 생산되는 디옥시리보뉴클레오타이드 (deoxyribonucleotide), 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide) 및 유사체를 포함하는 연결체를 의미한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 자연(naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
본 발명의 DS oligo와 연계된 용어 “부위(portion)”는 분할 부위에 의해 분리된 뉴클레오타이드 서열이다. 용어 “5'-고 Tm 특이성 부위” 또는 “3'-저 Tm 특이성 부위”는 본 발명의 DS oligo의 각 5'-말단과 3'-말단의 뉴클레오타이드를 각각 의미하고, 분할 부위에 의해 분리된다. DS oligo와 연계된 용어 “5'-고 Tm 특이성 부위”는 세 부위 중 가장 높은 Tm 을 가지는 부분이며 주형 핵산과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 상기 DS oligo와 연계된 용어 “3'-저 Tm 특이성 부위”는 5'-고 Tm 특이성 부위보다는 높은 Tm을 갖지만 분할 부위보다는 높은 Tm을 가지며 주형 핵산과 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 명세서에서 용어 “Tm”은 핵산 이중쇄 분자의 반이 단일쇄로 되어질 때의 멜팅(melting) 온도이다. DS oligo 부위와 연계된 용어 “고 Tm” 및 “저 Tm”은 절대적 Tm 값이 아니라 상대적인 Tm 값을 나타내는 의미이다. 즉, 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 값보다 상대적으로 높다는 것을 의미한다.
상기 5'-고 Tm 특이성 부위 및 상기 3'-저 Tm 특이성 부위는 주형 핵산과 혼성화하기 위하여 상기 주형 핵산의 부위와 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인된다. 상기 DS oligo와 관련하여 용어 “실질적으로 상보적”은 올리고뉴클레오타이드 분자가 지정된 어닐링 조건 또는 엄격 조건하에서 주형 핵산 서열과 선택적으로 혼성화하기 위하여 충분히 상보적인 것을 의미하고, 그 결과 어닐링된 올리고뉴클레오타이드는 폴리머라아제에 의해 주형의 상보적인 복제를 형성하여 연장될 수 있다. 그러므로, 상기 용어는 "완벽하게 상보적"과는 다른 의미를 가지거나 이것과 관련된 용어이다. 상기 DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위는 DS oligo가 프라이머 또는 프루브로 작용하는데 있어서 주형에 대한 하나 또는 둘 이상의 미스매치(mismatch)를 가질 수 있다. 가장 바람직하게는, DS oligo의 5'-고 Tm 특이성 부위 및/또는 3'-저 Tm 특이성 부위는 주형의 한 부위와 완벽하게 상보적인(미스매치 없는) 뉴클레오타이드 서열을 가진다.
상기 DS oligo의 성공적인 실시에 있어, 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 보다 높아야 하는 것이 필수적이다. 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 40-80℃이 바람직하고, 보다 바람직하게는 40-75℃이며, 보다 더 바람직하게는 50-68℃이고, 가장 바람직하게는 50-65℃이다. 또한, 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm은 10-40℃이 바람직하고, 보다 바람직하게는 15-40℃이며, 가장 바람직하게는 20-35℃이다. 바람직하게는, 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 보다 최소 5℃ 이상이며, 보다 바람직하게는 최소 10℃ 이상이며, 보다 더 바람직하게는 최소 15℃ 이상이고, 가장 바람직하게는 최소 20℃ 이상이다. 유리하게는, 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 보다 5-70℃이상이며, 바람직하게는 10-70℃이상이며, 보다 바람직하게는 적어도 10-60℃이상이고, 보다 더 바람직하게는 10-50℃이상이며, 보다 더욱 더 바람직하게는 10-40℃이상이고, 가장 바람직하게는 20-40℃이상이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 5'-고 Tm 특이성 부위의 길이는 3'-저 Tm 특이성 부위보다 길다. 5'-고 Tm 특이성 부위의 길이는 바람직하게는 15-40 뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 20-25 뉴클레오타이드이다. 3'-저 Tm 특이성 부위의 길이는 바람직하게는 3-15 뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 6-12 뉴클레오타이드이다.
적어도 2개 이상의 유니버설 염기 (universal base)를 포함하는 분할 부위는 DS oligo의 장점 및 특징 중의 하나이다. 본 명세서 용어 “유니버설 염기”는 각각의 자연 DNA/RNA 염기와 염기쌍을 형성할 수 있으며, 상기 자연 염기와 구별되는 염기이다.
상기 축퇴성 프라이머와 관련된 디자인의 문제점들을 해결하는데 있어서 축퇴성 프라이머의 다의(多義)로 해석되는 부위에서의 뉴클레오타이드들은 유니버설 염기로 대체되어 왔다는 사실은 이미 잘 알려졌다. 왜냐하면, 상기 유니버설 염기는 통상적인 4가지 염기와 비-특이적 염기쌍을 형성할 수 있기 때문이다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드의 한 부분을 형성하는 상기 유니버설 염기가 어닐링(혼성화) 또는 증폭하는 동안 버블 (bubble) 구조를 형성하고 두개의 인접한 서열을 분리하여, 두 개의 분리 특이성 (어닐링) 부위를 통한 이중 특이성에 의하여 타깃 서열에 대한 프라이머 또는 프루브의 어닐링 특이성이 증가한다라는 것에 대하여 아직 보고된 바 없다.
상기 유니버설 염기는 다른 뉴클레오타이드인 dNMPs와 함께 연속적인 방식 또는 비연속적 방식으로 분할 부위에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 분할 부위는 유니버설 염기, 가장 바람직하게는 디옥시이노신 (deoxyinosine)을 갖는 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 DS oligo 에서의 분할 부위는 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위가 주형 핵산과 어닐링되는 조건에서 상기 분할 부위가 비 염기-쌍을 형성하기 위해서 상기 세 부분 중에서 가장 낮은 Tm 을 갖는 것이 매우 중요하며, 주형 핵산에 대한 어닐링 특이성 측면에 있어서는 상기 5'-고 Tm 특이성 부위를 3'-저 Tm 특이성 부위와 분리되어야 하고, 그로 인하여 상기 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성은 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중적으로 결정이 됨으로써 총체적으로 상기 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 특이성은 상당히 증가된다. 바람직하게는, 분할 부위의 Tm은 3-15℃이고, 보다 바람직하게는 4-15℃이며, 가장 바람직하게는 5-10℃이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위와 상기 3'-저 Tm 특이성 부위 사이에 있는 상기 분할 부위는 적어도 3 이상의 유니버설 염기를 포함하고, 보다 바람직하게는 적어도 4개 이상의 유니버설 염기를 포함하고, 가장 바람직하게는 적어도 5개 이상의 유니버설 염기를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 분할 부위는 2-10 유니버설 염기를 포함하고, 보다 바람직하게는 3-10 유니버설 염기를 포함하며, 보다 더 바람직하게는 4-8 유니버설 염기를 포함하고, 가장 바람직하게는 5-7 유니버설 염기를 포함한다.
긴 서열의 프라이머 또는 프루브가 요구되는 경우에는, 본 발명인 DS oligo 의 유리한 점이 가장 큰 능력을 발휘한다. 예를 들면, 보편적인 기술에 따라, 혼성화 서열로서 35 bp 이상 긴 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머는 비-특이적 증폭 산물 (amplicons)들을 자주 발생시킨다. 반대로, 상기 DS oligo는 주형과 분자적 상호 반응면(예를 들면, 어닐링)에서 서로 분리된 두 개의 혼성화 서열 (5'-고 Tm 특이성 부위와 3'-저 Tm 특이성 부위)을 가지고 있기 때문에, 긴 서열의 특이적인 증폭 산물을 생산할 수 있다. 다른 예를 들면, 상기 DS oligo는 타깃 서열에 상보적인 혼성화 서열 35-45 bp을 포함한다. 이러한 측면에서 볼 때, 본 발명은 통상적인 프라이머 디자인 제작에 있어서 비-실시가능한 것으로 간주되는 매우 긴 서열을 가진 프라이머를 디자인할 수 있도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위는 15-25 뉴클레오타이드의 길이이고, 분할 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이이며, 3'-저 Tm 특이성 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이이다.
보다 바람직하게는, 5'-고 Tm 특이성 부위는 15-25 뉴클레오타이드의 길이이고, 분할 부위는 3-10 뉴클레오타이드의 길이이며, 3'-저 Tm 특이성 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이이다. 가장 바람직하게는, 5'-고 Tm 특이성 부위는 15-25 뉴클레오타이드의 길이이고, 분할 부위는 3-7 뉴클레오타이드의 길이이며, 3'-저 Tm 특이성 부위는 6-10 뉴클레오타이드의 길이이다. 본 발명의 실시예에 기재된 모범적이고 실례가 되는 DS oligo에 따르면, 5'-고 Tm 특이성 부위는 약 20 뉴클레오타이드의 길이이고; 분할 부위는 약 5 뉴클레오타이드의 길이이며; 3'-저 Tm 특이성 부위는 약 8-10 뉴클레오타이드의 길이이다.
가장 바람직한 구현예에 있어서, 상기 DS oligo는 다음 일반식으로 표현된다: 5'-X"p-(dI)q-Z"r-3'(상기 X"와 Z"의 정의와 특징은 상기 기술한 것과 동일하고, 상기 dI는 디옥시이노신을 의미하고, 상기 (dI)q는 유니버설 염기 서열을 갖는 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 분할 부위이며, q는 5-7사이의 정수이다.
본 발명의 제1차 증폭은 DW-ACP 시스템과 DS oligo를 이용하여 다른 어닐링 온도 조건에서 2 단계 증폭에 의하여 실시된다.
본 발명의 방법은 어떤 소망하는 핵산 분자를 증폭하는데 사용된다. 상기 분자들은 DNA 또는 RNA이다. 상기 분자들은 이중쇄 또는 단일쇄 형태이며, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발 물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 이중쇄를 단일쇄 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은 이미 잘 알려진 방법은 열, 알칼리, 포름아미드, 우레아(urea) 및 글리콕살 (glycoxal) 처리, 효소 방법 (예, 헬리카제 작용) 및 결합 단백질들을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 예를 들면, 쇄 분리는 80-105℃의 열에서 이루어진다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
증폭을 하기 위하여 출발 물질로 mRNA를 선택하는 경우, 역전사 단계는 증폭에 앞서 필수적이며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에 있어서, mRNA의 폴리 A 테일과 혼성화 할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머를 사용한다. 역전사 단계는 역전사효소와 함께 실시된다.
본 발명의 방법은 증폭될 분자가 특정 서열 또는 길이를 가질 것을 요구하지 않는다. 특히, 증폭될 수 있는 분자는 자연의 원핵세포 핵산, 진핵세포 (예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 저등동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스 (예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 및 비로이드 핵산을 포함한다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 합성되었거나 또는 합성될 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 자연에서 발견되거나 또는 발견되지 않는 것이다.
본 발명에서 이용되는 제1차 축퇴성 DW-ACP는 미지의 뉴클레오타이드 서열상의 한 위치에 혼성화 또는 어닐링되며, 결국 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 어닐링 부위(즉, 축퇴성 서열 및 3'-말단 부위)의 서열은 완전한 상보성을 나타낼 필요는 없고, 단지 안정된 이중쇄 구조를 형성할 수 있을 정도의 실질적으로 상보적인 서열을 가지면 된다. 따라서, 이중쇄 구조의 형성을 위한 혼성화를 완전히 배제하지 않는 한도 내에서 완전한 상보성 (complete complementarity)으로부터의 이탈이 허여된다. 미지 서열상의 한 위치에 제1차 축퇴성 DW-ACP가 혼성화되는 것은 중합효소에 의한 주형-의존성 중합반응의 선제 조건이다. 상보적인 핵산에 제1차 축퇴성 DW-ACP가 염기쌍을 형성하는 데 영향을 미치는 인자 (Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985))는 프라이밍 효율에 영향을 미친다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 뉴클레오타이드 조성은 최적 어닐링 온도에 영향을 미치며 따라서 프라이밍 효율에도 영향을 미친다.
다양한 DNA 중합효소는 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다.
본 발명의 두 증폭 단계는 단지 시간적으로만 분리된다. 제2단계 증폭은 제1단계 증폭 다음에 실시해야 한다. 따라서 상기 2-단계 증폭은 모든 종류의 프라이머, 제1차 DW-ACP, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 포함하는 하나의 반응 시스템에서 실시될 수 있다.
상기 2 단계 증폭에서의 어닐링 또는 혼성화는 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 본 방법에 있어서, 두 증폭 단계는 다른 조건, 특히 서로 다른 어닐링 온도에서 각각 실시된다. 바람직하게는, 제1단계 증폭은 저 엄격 조건, 특히 낮은 어닐링 온도에서 실시된다. 보다 바람직하게는, 제1차 어닐링 온도는 약 35-50℃이고, 가장 바람직하게는 40-48℃이다. 제1차 어닐링 온도에서, 제1차 DW-ACP의 어닐링 부위는 축퇴성 서열과 3'-말단 부위로 한정되며, 이는 어닐링 특이성을 향상시킨다.
본 방법에 따르면, 저 엄격 조건하에서의 제1단계 증폭 과정은 제1단계 증폭에서의 프라이머 어닐링의 특이성을 개선하기 위하여 어닐링, 연장 및 변성의 최소 1 사이클을 실시하며, 그 다음 제2단계 증폭 과정이 고 엄격 조건하에서 보다 효과적으로 진행된다. 가장 바람직하게는, 제1단계 증폭 과정은 1 사이클이 실시된다. 제1단계 증폭 과정의 1 사이클 실시는 중요한 사항이며, 이는 제1차 축퇴성 DW-ACP 단독으로 비-특이적 증폭 산물을 형성하는 것을 억제하기 때문이다. 상기 제1차 증폭의 1 사이클(제1단계 증폭) 동안에, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 상기 저 엄격 조건 하에서 주형의 미지 타깃 부위들에 결합한다. 그러나, 제1차 증폭의 다른 사이클들(제2단계 증폭)에서, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 제1차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외하고, 고 엄격 조건(예, 높은 어닐링 온도) 하에서 주형에 결합하는 또는 연장된 프라이머 서열에 결합하는 프라이머로 작동하지 않는다. 그 대신, 제1차 DW-ACP 뿐만 아니라 상기 제1차 TSP 모든 부위는 제1차 증폭 산물을 생성하기 위하여 제2단계 증폭에 포함된다.
바람직하게는, 제2단계 증폭 과정은 고 엄격 조건, 특히 높은 어닐링 온도에서 실시한다. 유리하게는, 제2차 어닐링 온도는 약 50-72℃, 보다 바람직하게는 50-65℃, 가장 바람직하게는 52-65℃이다. 제2차 어닐링 온도와 같은 높은 어닐링 온도에서, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위는 더 이상 프라이머로서 작용하지 않으며 대신에, 상기 제1차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머는 높은 특이성으로 프라이머로 작용한다.
고엄격 조건 하에서의 상기 제2단계 증폭 과정은, 최소 1 사이클, 바람직하게는 제1차 축퇴성 DW-ACP로부터 유래된 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열이 없는 제1차 증폭산물을 생산하기 위하여 최소 5 사이클 동안 실시된다. 보다 바람직하게는, 제2단계 증폭은 10-40 사이클, 보다 더 바람직하게는 10-30 사이클, 그리고 가장 바람직하게는 10-20 사이클 동안 실시된다.
고 엄격 및 저 엄격 조건은 당업계에 공지된 표준으로부터 용이하게 결정할 수 있다. 용어 “사이클”은 타깃 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 나타낸다. 사이클은 변성, 어닐링 및 연장 과정을 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
상기 제1차 증폭 반응의 제2단계 증폭에서, 상기 제1차 TSP는 타깃-특이적 프라이머 연장 산물을 생산하기 위하여 기지의 뉴클레오타이드 서열 상에 있는 상보적인 서열과 어닐링 된다. 바람직하게는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위가 유니버설 염기 또는 비-특이한 염기 유사체들을 포함하는 경우, 타깃-특이적 프라이머 연장 산물에 대한 반대 쇄 (strand)는 상기 기재된 DNA 폴리머라제에 의해 인식된 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들면, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위가 최소 2이상의 디옥시이노신 또는 이노신 잔기를 포함하는 경우, 최소 2이상의 디옥시사이티딘 (deoxycytidine) 뉴클레오타이드는 타깃-특이적 프라이머 연장 산물에서의 반대 쇄에 포함된다.
한편, 본 발명자들은 본 발명과 유사한 과정을 이미 개발하였으며 PCT 국제특허출원(WO 2005/045073)을 하였다. 이미 개발된 방법은 제1차 증폭의 제2단계 증폭에서 제1차 DW-ACP보다 제2차 DW-ACP를 이용한다. 그러므로, 제2단계 증폭은 두 가지 타입의 DW-ACP를 사용하고, 증폭 조건의 적용을 복잡하게 한다. 게다가, WO 2005/045073에는 어닐링 특이성을 매우 향상시키는 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 구조를 갖는 타깃-특이적 프라이머를 개시하고 있지 않다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법은 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 1 사이클 포함하며 제3차 어닐링 온도에서 제2차 증폭을 실시하는 단계 (b)를 추가적으로 포함하고, 상기 단계 (b)는 (ⅰ) 상기 제1차 증폭 산물의 3'-말단에 있는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 서열에 대한 반대-센스 (opposite-sense) 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제2차 DW-ACP 또는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머 및 (ⅱ) 상기 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위하여 디자인된 제2차 네스티드 (nested) TSP를 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2차 증폭 반응에 사용된 제2차 DW-ACP는 다음과 같은 일반식 Ⅱ로 표현한다:
5'-X'P-Su-Y'V-Z'W-3' (Ⅱ)
상기 일반식에서, 상기 X'p는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5'-말단 부위를 나타내며, 상기 Su는 단계 (a-2)의 제1차 증폭 산물에서 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위의 반대 부위와 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 보조 어닐링 부위를 나타내고, 상기 Y'v는 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기를 포함하는 조절자 부위를 나타내며 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 상기 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 방해하고, 상기 Z'w은 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-말단 부위를 나타내며, 상기 p, u, v 및 w는 뉴클레오타이드의 수이고 상기 X', S, Y', 및 Z'는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
두 개의 연관된 뉴클레오다이드 서열에 관하여 사용되는 용어 “해당하는 (corresponding to)"은 하나의 뉴클레오타이드 서열이 다른 비교 대상의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 될 정도로 서로 완전 동일하거나 혹은 부분적으로 동일한 서열임을 표현하기 위하여 사용되는 용어이다.
일반식 Ⅲ의 상기 제2차 DW-ACP는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 서열에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일반식 Ⅲ의 프라이머는 보다 높은 어닐링 특이성을 나타낸다.
상기 제2차 DW-ACP의 5'-말단 부위는 상기 제1차 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있다. 즉, 상기 제2차 DW-ACP의 5'-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열은 상기 제1차 DW-ACP의 5'-말단 부위의 서열과 완전 동일하거나 혹은 일부 동일하다. 상기 제2차 DW-ACP의 5'-말단 부위와 상기 제1차 DW-ACP의 5'-말단 부위에 대해 반대 센스(opposite sense)를 가지는 뉴클레오타이드 서열 사이에 이중쇄 구조가 형성되게 하는 혼성화를 완전히 배제하지 않는 범위에서, 완전 동일성으로부터의 이탈이 허용된다.
일반식 Ⅲ의 상기 제2차 DW-ACP에서 보조 어닐링 부위 (Su)는 매우 독특한 것이며, 이는 비특이적 위치에 대한 프라이머의 비특이적 결합으로부터 초래되는 높은 백그라운드 문제를 완벽하게 제거하는 데 어느 정도 기여를 하는 부위이다. 상기 보조 어닐링 부위는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위에 대해 반대쪽(opposite) 부위에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보조 어닐링 부위를 이와 같이 디자인한 전략은, DNA 중합효소(예컨대, Taq 중합효소)가 유니버설 염기를 인식하여 자연 NMPs의 삽입을 지시하는 방식을 이용한 것이다. DNA 중합효소가 유니버설 염기를 인식하는 방식은, Geoffrey C. Hoops, et al. (Nucleic Acids Research, 25(24):4866-4871(1997))이 발표를 하였으나, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 8-히드록시구아닌, 2-히드록시아데닌, 6-O-메틸구아닌 및 크산틴은 각각 (C 및 A), (T 및 A), (T 및 C) 및 (T 및 C)의 삽입을 지시한다. 또한, Geoffrey C. Hoops, et al.은, 니트로피롤 및 이노신을 포함하는 염기는, 가장 선호적으로, 각각dAMP 및 dCMP의 삽입을 지시한다고 발표하였다.
따라서, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위가 최소 2개의 디옥시이노신 또는 이노신 잔기를 포함하는 경우, 디옥시사이티딘 뉴클레오타이드가 조절자 부위의 반대쪽 부위에 가장 선호적으로 Taq 중합효소에 의해 삽입되기 때문에, 상기 보조 어닐링 부위는 최소 2개의 디옥시구아노신 (deoxyguanosine) 뉴클레오타이드를 포함하여야 한다.
상기 제2차 DW-ACP에서, Y'v, 조절자 부위는 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 억제한다. 또한, 상기 조절자 부위는, 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체의 비구별성 결합을 통하여 추가적인 어닐링 부위를 제공하며, 이는 제2차 DW-ACP가 결과 산물에 있는 제1차 축퇴성 DW-ACP 서열에 상보적인 서열에 선별적으로 어닐링 되도록 한다.
일반식 Ⅲ의 상기 조절자 부위는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 서열 부위에 반대쪽에 위치하는 부위에 혼성화된다. 조절자 부위에 적합한 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 당업계에서 잘 알려진 DNA 복제에 참여시 구별성을 상실하는 어떠한 염기도 가능하다.
일반식 Ⅲ의 상기 조절자 부위의 길이는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 서열 부위의 길이에 의해 주로 결정된다. 또한, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위의 5'-말단에 있는 뉴클레오타이드가 4가지 디옥시리보뉴클레오타이드에서 특정의 뉴클레오타이드를 갖도록 디자인된 경우, 조절자 부위는 1개의 뉴클레오타이드만큼 길어진다. 일반식 Ⅲ의 조절자 부위에 있는 유니버설 염기는, 바람직하게는, 연속적인 배열로 존재한다.
상기 제2차 DW-ACP의 3'-말단 부위는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있다. 상기 제2차 DW-ACP의 3'-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열은 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위의 서열과 완전 동일하거나 혹은 부분적으로 동일하다. 제2차 DW-ACP의 3'-말단 부위와 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위에 대해 반대 센스(opposite sense)를 가지는 뉴클레오타이드 서열 사이에 이중쇄 구조가 형성되게 하는 혼성화를 완전히 배제하지 않는 범위에서, 완전 동일성으로부터의 이탈이 허용된다. 가장 바람직하게는, 상기 제2차 DW-ACP의 3'-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열은 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위와 완전히 일치하는 것이며, 이는 주형에 프라이머의 3'-말단 부위가 완전히 일치하는 것이 성공적인 증폭을 위해 요구되기 때문이다.
상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머는 제2차 증폭에서 제2차 DW-ACP 대신 사용된다.
상기 제2차 증폭은 제1차 증폭 산물로부터 미지의 타깃 산물을 선택적으로 증폭하기 위하여 당업계에 공지된 네스티드 증폭 과정을 따른다. 제2차 네스티드 TSP는 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위하여 디자인된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 네스티드 TSP는 일반식 Ⅲ으로 표현된 DS oligo 구조를 갖는다.
바람직하게는, 상기 제2차 증폭반응은 고 염격 조건, 특히 높은 어닐링 온도에서 실시된다. 유리하게는, 상기 높은 어닐링 온도는 약 50-72℃, 보다 바람직하게는 50-70℃, 가장 바람직하게는 55-68℃이다. 높은 어닐링 온도에서, 상기 제2차 DW-ACP의 일부 부위가 아닌 전 부위들이 어닐링에 참여한다. 따라서, 상기 제2차 DW-ACP는, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에만 배타적으로 어닐링될 수 있다. 상기 고염격 조건 하에서의 상기 제2차 증폭 반응은 최소 1 사이클, 바람직하게는 최소 5 사이클 동안 실시되며, 이에 의해 제1차 증폭산물이 증폭된다. 보다 바람직한 구현예에서, 제2차 증폭반응은 10-40 사이클 동안 실시된다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2차 증폭반응은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
상기 제2차 증폭 반응은 제1차 DW-ACP로부터 유래된 축퇴성 랜덤 서열을 갖지 않는 증폭된 산물을 증가시킨다. 제3차 증폭 반응이 제2차 증폭 반응을 따르는 경우, 제2차 증폭 반응에서의 축퇴성 랜덤 서열 제거는 제3차 증폭 반응을 더욱 특이성 및 신뢰도를 갖게 한다.
비-특이적 증폭 반응을 완전히 극복한 소망하는 결과가 달성되지 않거나 혹은 의심스러운 경우, 또는 단계 (b)의 증폭 산물이 아가로스 젤에서 보이지 않는 경우, 제2차 증폭 산물의 안쪽 부위를 증폭하도록 디자인된 또 다른 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 추가적인 네스티드 증폭 반응을 최소 1 사이클 동안 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (i) 상기 제2차 DW-ACP 또는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머 및 (ii) 상기 제2차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위해 디자인된 제3차 네스티드 TSP를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성(denaturing)의 최소 1 사이클을 포함하고, 제4차 어닐링 온도에서 상기 제3차 증폭 반응을 실시하는 단계 (c)를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b)을 실시하는데 앞서 제1차 축퇴성 DW-ACP, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 제거하는 단계 (a)의 반응 결과물을 증폭하는 단계 (a')를 추가적으로 포함한다. 예를 들면, 증폭된 산물의 정제는 겔 전기영동, 컬럼 (column) 크로마토그래피, 친화성 크로마트그래피 또는 혼성화에 의하여 실시할 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 정제는 실리카-겔 막 (silica-gel membrane)을 이용하는 스핀 컬럼 (spin column)을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 방법은 컬럼을 통과하는 프라이머와 같은 오염원들을 제거하고 증폭된 산물이 고 염 (high salt)에서 흡수될 수 있도록 실리카-겔 막의 선택적 결합 특성을 이용한다. 따라서, 증폭된 산물은 증폭 반응으로부터 빠르게 정제하고 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법에 이용되는 타깃 특이적 프라이머를 제공한다. 상기 프라이머는 다음과 같은 일반식 Ⅲ로 나타낸다:
5'-X"p-Y"q-Z"r-3' (Ⅲ)
상기 일반식에서, 상기 X"는 혼성화 하는 기지의 뉴클레오타이드의 한 위치와 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5'-고 Tm 특이성 부위 (5'-high Tm specificity portion)이고, 상기 Y"는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역(separation portion)이며, 상기 Z"은 혼성화 하는 기지의 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'- 저 Tm 특이성 부위 (3'- low Tm specificity portion)이고, 상기 p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, 상기 X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고 5'- 고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'- 저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고 상기 분할 부위는 5'-고 Tm 특이성 부위와 3'- 저 Tm 특이성 부위가 주형 핵산과 혼성화되는 경우 비 염기-쌍 버블(bubble) 구조를 형성하고, 상기 분할 부위는 주형 핵산에 대한 어닐링(annealing) 특이성 측면에서 5'-고 Tm 특이성 부위가 3'- 저 Tm 특이성 부위로부터 분할되도록 하며, 상기 프라이머의 어닐링 특이성은 상기 5'-고 Tm 특이성 부위와 상기 3'-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중적으로 결정되며 그 결과 상기 프라이머의 전체 어닐링 특이성이 증가된다.
본 발명의 타깃 특이적 프라이머 (TSP)는 상술한 본 발명의 증폭 과정에 이용되는 것이기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 과도한 반복 기재를 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법에 이용되는 타깃 특이적 프라이머를 이용하는 키트를 제공하며, 상기 기재된 일반식 Ⅲ를 갖는 상기 타깃 특이적 프라미어를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 제1차 축퇴성 DW-ACP 및/또는 제2차 DW-ACP를 추가적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5'-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 항체를 포함 할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적의 양은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 구획에 상술한 성분들을 포함한다.
본 발명은 핵산 증폭반응, 바람직하게는 PCR을 실시하여 핵산 또는 핵산들(DNA 또는mRNA)의 혼합물로부터 미지의 뉴클레오타이드 서열을 선별적으로 증폭하는 개선된 방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 다양한 핵산 증폭-기반 기술에 적용될 수 있다. 대표적인 예는 다음과 같다:
(ⅰ) 기지의 뉴클레오타이드 서열의 크로모좀 부위의 어느 한쪽에 있는 미지의 연속의 DNA 부위들을 수득하는 지놈 워킹. 예로서 지놈 시퀀싱 프로젝트, 프로모터 부위의 클로닝, 엑손/인트론 연결부위와 같은 유전자 구조의 동정(identification), 갭 필링 및 트랜스유전자의 위치 또는 방향성을 포함한다
(ⅱ) 전장 cDNA의 클로닝 또는 시퀀싱, 또는 스플라이싱 분석을 위한 cDNA의 5'- 및 3'-말단의 신속한 증폭(RACE);
(ⅲ) 결실, 삽입 및 좌위을 포함하는 부위의 맵핑 그리고
(ⅳ) 전체 지놈 시퀀싱을 위하여 샷건 클로닝 없이 BAC 말단의 신속한 증폭.
하기의 특정 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 첨부된 청구항에 의하여 판단되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
도 1A는 제1차 축퇴성 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머 (DW-ACP) 및 이중 (dual) 특이성 올리고뉴클레오타이드 구조를 갖는 제1차 타깃-특이적 프라이머 (DSO-TSP1)를 이용하는 제1차 증폭 과정의 구체적인 일 구현예를 보여주는 도면이다.
도 1B는 제2차 DW-ACP 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 구조 제2차 타깃-특이적 프라이머 (DSO-TSP2)를 이용하는 제2차 증폭 과정의 구체적인 일 구현예를 보여주는 도면이다.
도 2는 트랜스유전자(레트로바이러스 MFG로부터 유래)에 인접한 인간 지놈 DNA 서열의 증폭을 위하여 DNA 워킹 ACP-DSO PCR에 의해 생성된 증폭 산물을 보여 준다. M 레인은 100 bp DNA 래더(ladder)를 의미한다. A, T, G 및 C 레인은 각각 DW-ACP1-A, DW-ACP1-T, DW-ACP1-G 및 DW-ACP1-C를 이용하여 증폭된 결과이다.
도 3은 인간 지놈 서열 내의 MFG 삽입 부위에 대한 동정 결과를 나타낸다. 클론된 PCR 산물은 DW#이라고 표기한다.
실시예 1: 트랜스유전자(transgene) 위치의 결정
본 발명의 DNA 워킹(walking) ACP-DSO PCR 방법의 적용을 기재하기 위하여, 말초혈액줄기세포(PBSCs)를 레트로바이러스 MFG-GFP로 감염시켰고 도입유전자의 위치를 결정하였다.
A. 프라이머 디자인
A-1: DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACPs)
트랜스유전자에 인접한 미지 서열을 증폭하기 위하여, DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머 (DW-ACPs)를 디자인 하였다. DW-ACP는 3'-말단 타깃 결합 서열과 5'-말단 비-타깃 테일 사이에 폴리디옥시이노신[폴리(dI)] 링커 (lingker)를 가지는 삼분할 구조를 갖도록 하였고, 상기 3'-말단 타깃 결합 서열은 3'-말단에 전결정 아비트러리 (arbitrary) 서열 및 5'-말단에 축퇴성 랜덤 서열을 포함하며, 3'-말단 타깃 결합 서열의 3'-말단과 5'-말단 사이에는 A, C, T 및 G 뉴클레오타이드 중 어느 하나를 포함되도록 하였다. 따라서, DW-ACP의3'-말단 부위의 3'-말단에 있는 아비트러리 서열에 따라, 최소 4종의 DW-ACP 프라이머가 생성된다.
4종의 축퇴성 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머 (DW-ACPs)는 다음과 같이 디자인되었으며, 어닐링 조절 프라이머 (ACP)는 본 발명자에 의해 개발되었고 WO 03/050305에 개시되어 있다:
DW-ACP1-A: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNACACG-3' (SEQ ID NO:1);
DW-ACPl-C: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNCCACG-3' (SEQ ID NO:2);
DW-ACPl-T: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNTCACG-3' (SEQ ID NO:3); 및
DW-ACPl-G: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINMNGCACG-3' (SEQ IDNO:4).
축퇴성 DW-ACPs에 있어서, CACG (제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위에 해당하는)는 전결정 (predetermined) 아비트러리 서열로서 선정되었다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단에 있는 전결정 아비트러리 서열은 다음과 같은 인자를 고려하여 선정되었다: (1) 서열이 2 Kb당 최소1이상 존재하고 (2) 바람직하게는, 서열의 GC 비율이 75% 이상 이어야 한다. 또한, 서열, CACG는 A-2에 기재된 TSPs의 결합 부위의 업스트림(upstream)에 포함되지 않는 센스(senses)에서 선정되었다.
제2차 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(second DW-ACPs) 또는 유니버설 프라이머는 제2차 증폭 반응에 이용하였다.
제2차 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머는 다음과 같이 디자인 되었다:
DW-ACP2-N: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGGGIIIICACG-3' (SEQ ID NO:5);
제2차 DW-ACP의 서열은 제1차 축퇴성 DW-ACPs의 모든 풀(pool)에 완벽하게 상보적인 서열에 배타적으로 어닐링하고, ACP 구조의 특성으로 인하여 주형의 어느 비-타깃 부위와 배타적으로 어닐링하지 못하게 디자인 되었다.
DW-ACPs의 5'-말단 부위 서열에 해당하는 유니버설 프라이머는 다음과 같다:
Universal primer: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA-3' (SEQ ID NO:6)
A-2: 타깃 특이적 프라이머 (TSP) 디자인
타깃 특이적 프라이머는 레트로바이러스 부위(transgene)를 고려하여 제작되었다.
MFG-TSPl: 5'-CGAAGTCCCTGGGACGTCTCCCAGGGTTGC-3' (SEQ ID NO:7);
MFG-TSP2: 5'-GTCAGTTCCACCACGGGTCCGCCAGATACAGAGCTA-3' (SEQ ID NO:8); 및
MFG-TSP3: 5'-ATAAGGCACAGGGTCATTTCAG-3 ' (SEQ ID NO:9).
MFG-TSPl 및 MFG-TSP2는 gag 유전자 부위로부터 선정되었으며, MFG-TSP3은 타깃 레트로바이러스의 5'-LTR 부위로부터 선정되었다.
본 발명자에 의해 개발된 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 (DSO)의 구조는 TSPs를 디자인하는데 적용하였으며, 어닐링 특이성을 우수하게 향상시켰다.
다음과 같은 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 5'-말단 부위 및 3'-부위 말단 사이에 폴리테옥시이노신[poly(dI)] 링커를 갖는 분할 부위를 포함한다. 또한, DS 프라이머는 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높고, 분할 부위는 3개의 부위 중 가장 낮은 Tm을 가지는 방식으로 5'-고 Tm 특이성 부위 및 3'-저 Tm 특이성 부위를 포함하도록 제작되었다.
타깃 특이적 이중 특이성 프라이머 (DSO-TSPs)는 다음과 같이 제작되었다:
MFG-DSO-TSPl: 5'-CGAAGTCCCTGGGACGIIIIICAGGGTTGC-3' (SEQ ID NO: 10); 및
MFG-DSO-TSP2: 5'-GTCAGTTCCACCACGGGTCCIIIIIATACAGAGCTA-3' (SEQ ID NO: 11);
B. 지놈 DNA 준비
레트로바이러스 MFG-GFP로 감염시킨 정상 인간 CD34+ 말초혈액줄기세포 (PBSCs)는 최의묵(National Institutes of Health: NIH) 박사로부터 제공받았으며, 지놈 DNA는 정제하여 PCR 주형으로 이용하였다.
C. 제1차 PCR
제1차 PCR은 축퇴성(degenerate) DW-ACPs 및 제1차 타깃 특이적 프라이머(DSO-TSP1)중 하나가 포함된 4개의 각각의 튜브에서 2-단계 PCR을 실시하였다.
상기 2-단계 PCR 증폭 반응은 PBSC 지놈 DNA 50 ng, 2 x SeeAmpTMACPTM Master mixⅡ(E10212) 25 ㎕과 DW-ACPs (2.5 μM) 4 ㎕ 및 타깃 특이성 프라이머 (MFG-DSO-TSP1, (10 μM)) 1 ㎕ 중 하나를 포함하는 반응액 50 ㎕를 2개의 다른 어닐링 온도에서 실시하였다. 반응액이 포함된 상기 튜브는 전처리된(94℃) 온도 순환기(thermal cycler)에 놓았다. 94℃ 5분, 40-45℃ 1분 및 72℃ 2분으로 하여 1-단계 PCR 증폭 반응을 1 사이클 실시하였으며, 94℃ 30초, 55-60℃ 30초 및 72℃ 100초로 하여 2-단계 PCR 증폭 반응을 10-30 사이클 실시하였고, 72℃에서 5분 최종 연장을 실시하였다.
D. 제1차 PCR 산물의 정제
제1차 PCR에서 이용된 축퇴성 DW-ACPs 및 제1차 DSO-TSP와 같은 프라이머를 제거하기 위하여, 제1차 증폭 반응 산물을 스핀 컬럼(PCR purification Kit, QIAGEN)을 이용하여 정제하였다.
E. 제2차 PCR
제1차 PCR에서 이용된 프라이머의 비-특이적 프라이밍 (priming)으로 인하여 비-특이적 산물이 포함된 제1차 PCR 산물로부터 미지의 타깃-특이적 산물만을 증폭하기 위하여, 제2차 DW-ACP2-N 또는 유니버설 프라이머 및 제1차 PCR 산물의 내부 부위를 증폭하기 위해 디자인된 네스티드 타깃-특이적 프라이머를 사용하여 제2차 PCR을 실시하였다. 상기 제2차 PCR 증폭 반응은 제1차 PCR 산물 1-5 ㎕, 2 x SeeAmpTMACPTM Master mixⅡ(E10212) 10 ㎕, 제2차 DW-ACP-N (2.5 μM) 1 ㎕ 및 네스티드 타깃 특이성 프라이머 (MFG-TS-DSP2, (10 μM)) 1 ㎕가 포함된 반응액 20 ㎕로 실시하였다. 반응액을 포함하는 상기 튜브는 전처리된(94℃) 온도 순환기에 놓았다. 94℃ 5분 동안 변성(denaturing)시키고, 94℃ 30초, 55-60℃ 30초 및 72℃ 100초로 하여 20-35 사이클로 PCR을 실시하였다. 그 다음, 최종 연장 반응은 72℃에서 5분 동안 실시하였다.
제2차 증폭 산물이 아가로스 겔 상에서 보이지 않는 경우에는, 다른 네스티 드 타깃-특이적 프라이머, 유니버설 프라이머와 함께 제2차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위하여 디자인된 MFG-TSP3을 이용하여 제3차 증폭 반응을 더 실시한다. 제3차 PCR 증폭 반응은 제1차PCR 산물 1-5 ㎕, 2 x SeeAmpTMACPTM Master mixⅡ(E10212) 10 ㎕, 유니버설 프라이머 (2.5 μM) 1 ㎕ 및 네스티드 타깃 특이성 프라이머 (MFG-TSP3, (10 μM)) 1 ㎕가 첨가된 반응액 20 ㎕로 실시하였다. 반응액이 포함된 상기 튜브는 전처리된(94℃) 온도 순환계에 놓았다. 94℃ 5분 동안 변성(denaturing)시키고, 94℃ 30초, 55-60℃ 30초 및 72℃ 100초로 하여 20-35 사이클로 PCR을 실시하였다. 그 다음, 최종 연장 반응은 72℃에서 5분 동안 실시하였다.
F. 젤 추출
증폭 산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동 한 다음, 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 또한 PCR 산물은, 변성 폴리아크릴아미드 젤에서 오토래디오그래피 또는 비-방사능 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. EtBr로 염색된 아가로스 젤에서 전기영동 한 다음, 각각의 PCR 산물을 GENECLEAN Ⅱ 키트(Q-BIOgene, 미국)를 이용하여 추출하였다.
G. 클로닝 또는 시퀀스
추출된 단편을 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, 미국)에 제조사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다. 플라스미드를 TOP-10 컴피던트(competent) 세포에 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 LB/암피실린 아가 플레이트에 플레이팅하였다. 단독의 백색의 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였다. 삽입 서열을 EcoRI 제한효소 처리로 확인하였다. 삽입 서열을 가지는 플라스미드를 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, 미국)를 사용하여 시퀀싱 하였다. 선택적으로, 추출 단편을 직접 시퀀싱의 주형으로 이용하여, BigDye Terminator cycle 시퀀싱 키트(Perkin Elmer)를 이용하는 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer)로 시퀀싱 하였다. 컴퓨터-보조 서열 분석을 GeneRunner 프로그램(Hastings, Inc.)을 이용하여 실시하였다.
도 2는 트랜스유전자(transgene)에 인접한 DNA 서열의 증폭을 위하여 DNA 워킹 ACP-DSO PCR에 의해 생산된 증폭 산물을 나타낸다. 서로 다른 제1차 DW-ACPs, DW-ACP-A(1 레인), DW-ACP-T(2 레인), DW-ACP-G(3 레인) 및 DW-ACP-C(4 레인)은 다른 크기(size)의 몇 개의 주요한 산물을 생산하였다.
도 2에서 나타내는 각각의 밴드를 클로닝 및 시퀀싱을 하였다. 시퀀싱 결과는 5'-LTR 서열이 모든 클론에 포함되었다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 클로닝된 PCR산물은 호스트 지놈 DNA 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
레트로바이러스 MFG-GFP의 삽입 부위는 클로닝된 PCR 산물의 시퀀싱 결과와 UCSC 지놈 브라우져(http://genome.ucsc.edu/)를 이용하여 결정하였다.
도 3은 MFG 삽입 부위의 동정의 결과를 요약한 것이다. 클로닝된 PCR 산물 은 도 2에 표시된 밴드 번호에 해당하는 DW#으로 명명하였다.
DSO-TSP1을 제1차 PCR에 이용하는 경우, 제2차 PCR을 실시하는데 있어 만족할 만한 수준의 증폭 반응 결과를 얻었다. 제3차 PCR 결과는 제2차 PCR 결과와 거의 비슷한 수준이었다. 따라서, DSO-TSP가 제2차 PCR에서 만족할 만한 수준의 증폭 결과를 얻을 수 있도록 작용한다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참조문헌
Arnold, C., Hodgson, I.J. (1991) Vectorette PCR: a novel approach to genomic walking. PCR Methods Appl. 1:39-42.
Chun, J.Y. (2001) Annealing control primers and its uses. PCT/KR02/01781.
Dominguez, O., Lopez-larrea, C. (1994) Gene walking by unpredictably primed PCR. Nucleic Acids Res.22:3247-3248.
Hwang, I.T., Kim, Y.H., Kim, S.H., Kwak, C.I,. Gu, Y.Y., Chun, J.Y. (2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques (in press).
Hwang, I.T., Lee, Y.H., Moon, B.C., Ahn, K.Y., Lee, S.W., Chun, J.Y. (2000) Identification and characterization of a new member of the placental prolactin-like protein-C (PLP-C) subfamily, PLP-C. Endocrinology 141:3343-3352.
Iwahana, H., Tsujisawa, T., Katashima, R., Yoshimoto, K., Itakura, M. (1994) PCR with end trimming and cassette ligation: a rapid method to clone exon-intron boundaries and a 5'-upstream sequences of genomic DNA based on a cDNA sequence. PCR Methods Appl. 4:19-25.
Jones, D.H., Winistorfer, S.C. (1997) Amplification of 4-9 kb human genomic DNA flanking a known site using a panhandle PCR variant. BioTechniques 23:132-138.
Juretic, N, Theus, M. (1991) Analysis of the polyadenylation consensus sequence context in the genes of nuclear encoded mitochodrial proteins. FEBS Lett. 290:4-8.
Kilstrup, M., Kristinansen, K.N. (2000) Rapid genome walking: a simplified oligo-cassette mediated polymerase chain reaction using a single genome-specific primer. Nucleic Acids Res. 28:e55.
Lagerstrom, M., Parik, J., Malmgren, H., Stewart, J., Pettersson, U., Landegren, U. (1991) Capture PCR: efficient amplification of DNA fragments adjacent to a known sequence in human and YAC DNA. PCR Methods Appl. 1:111- 119.
McBratney, S., Sarnow, P. (1996) Evidence for involvement of trans-acting factors in selection of the AUG start codon during eukaryotic translation initiation. Mol Cell Biol. 16:3523-3534.
Riley, J., Butler, R., Ogilvie, D., Finnear, R., Jenner, D., Powell, S., Anand, <224> R., Smith, J.C.,Mark ham, A.F. (1990) A novel, rapid method for the isolation of terminal sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucleic Acids Res. 18:2887-2890.
Rosenthal, A., Jones, D.S.C. (1990) Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18:3095-3096.
Roux, K.H., Dhanarajan, P. (1990) A strategy for single site PCR amplification of dsDNA: priming digested cloned or genomic DNA from an anchor-modified restriction and a short internal sequence. BioTechniques 8:48-57.
Shyamala, V., Ames, G.F.L. (1989) Genome walking by single-specific primer polymerase chain reaction: SSP-PCR. Gene 84:1-8.
Siebert, P.D., Chenchik., A., Kellogg., D.E., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A. (1995) An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res. 23:1087-1088.
Triglia, T., Peterson, M.G., Kemp, D.J. (1988) A procedure for in vitro amplification of DNA segements that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16: 8186.
Trueba, G.A., Johnson, R.C. (1996) Random primed genome walking PCR: a simple procedure to retrieve nucleotide fragments adjacent to known DNA sequences. BioTechniques 21:20.
Willems, H. (1998) Adaptor PCR for the specific amplification of unknown DNA fragments. BioTechniques 24:26-28.
<110> SeeGene, Inc. <120> METHOD FOR AMPLIFYING UNKNOWN DNA SEQUENCE ADJACENT TO KNOWN SEQUENCE <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-A <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnnac acg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-C <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnncc acg 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-T <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 3 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnntc acg 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-G <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 4 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnngc acg 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP2-N <220> <221> modified_base <222> (26)..(29) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 tcacagaagt atgccaagcg aggggnnnnc acg 33 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal primer <400> 6 tcacagaagt atgccaagcg a 21 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFG-TSP1 <400> 7 cgaagtccct gggacgtctc ccagggttgc 30 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFG-TSP2 <400> 8 gtcagttcca ccacgggtcc gccagataca gagcta 36 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFG-TSP3 <400> 9 ataaggcaca gggtcatttc ag 22 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFG-DSO-TSP1 <220> <221> modified_base <222> (16)..(21) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 cgaagtccct gggacgnnnn ncagggttgc 30 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MFG-DSO-TSP2 <220> <221> modified_base <222> (21)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 11 gtcagttcca ccacgggtcc nnnnnataca gagcta 36

Claims (34)

  1. DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP) 및 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열 한 위치에 혼성화할 수 있는 제1차 타깃-특이적 프라이머(TSP)를 이용하여 미지의 뉴클레오타이드 서열을 제1차 증폭(primary amplification)하는 단계 (a)를 포함하며, 상기 단계 (a)는 다음의 과정을 포함하고,
    (a-1) 제1차 어닐링 온도에서 제1차 축퇴성 (degenerate) DW-ACP를 이용하는 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 제1단계 증폭 (first-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 단계는 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성 (denaturing)의 최소 한 사이클을 포함하며, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP는 (ⅰ) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 (ⅱ) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
    상기 제1차 축퇴성 DW-ACP는 다음의 일반식 Ⅰ로 표시되고:
    5'-Xp-Yq-Zr-Qs-3'(Ⅰ)
    단, 상기 일반식 I에서, 상기 Xp는 전-선택 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5'-말단 부위를 나타내며, 상기 Yq는 최소 두 개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 상기 Zr는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 갖는 축퇴성 랜덤 서열 부위를 나타내며, 상기 Qs는 상기 미지 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-말단 부위를 나타내고, 상기 p, q, r 및s는 뉴클레오타이드의 수이고 상기X, Y, Z 및 Q는 디옥시리보뉴클레오타이드 (deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotide)이며; 상기 제1차 어닐링 온도는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서 작용하도록 하며, 이에 의해 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장 산물이 생성되고; 그리고,
    (a-2) 상기 제1차 어닐링 온도보다 높은 제2차 어닐링온도에서 단계 (a-1)에서 생성된 증폭 산물의 제2단계 증폭 (second-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 단계 (a-1)에서 사용된 제1차 축퇴성 DW-ACP 및 상기 제1차 TSP를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하며, 상기 제2단계 증폭은 상기 각각의 프라이머가 타깃 뉴클레오타이드 서열과 어닐링 되는 조건하에서 실시되며, 이에 의해 제1차 증폭 산물 (primary amplification product)이 생성되고, 그리고;
    프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 1 사이클 포함하며 제3차 어닐링 온도에서 제2차 증폭(secondary amplification)을 실시하는 단계 (b)를 추가적으로 포함하고, 상기 단계 (b)는 (ⅰ) 상기 제1차 증폭 산물의 3'-말단에 있는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 서열에 대한 반대-센스 (opposite-sense) 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 제2차 DW-ACP 및 (ⅱ) 상기 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위하여 디자인된 제2차 네스티드 (nested) TSP를 이용하는 것을 특징으로 하는 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단계 증폭은 한 사이클 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제2단계 증폭은 최소 5 사이클 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제1차 어닐링 온도는 35℃ 내지 50℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 어닐링 온도는 50℃ 내지 72℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 DW-ACP는 다음 일반식 Ⅱ로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    5'-X'p-Su-Y'v-Z'w-3'(Ⅱ)
    상기 일반식에서, 상기 X'p는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5'-말단 부위를 나타내며, 상기 Su는 단계 (a-2)의 제1차 증폭 산물에서 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위의 반대 부위와 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 보조 어닐링 부위를 나타내고, 상기 Y'v는 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기를 포함하는 조절자 부위를 나타내며 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 상기 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 방해하고, 상기 Z'w은 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3'-말단 부위를 나타내며, 상기 p, u, v 및 w는 뉴클레오타이드의 수이고 상기 X', S, Y', 및 Z'는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (b)를 실시하는데 앞서 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 및 상기 제1차 타깃-특이적 프라이머를 제거하기 위해 상기 단계 (a)의 반응 결과물을 정제하는 단계 (a')를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, (ⅰ) 상기 제 2차 DW-ACP 또는상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5'-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 프라이머 및 (ⅱ) 상기 제2차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위해 디자인된 제3차 네스티드 TSP를 이용하는 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하는, 제4차 어닐링 온도에서 제3차 증폭 반응 (third amplification)을 실시하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 제1차, 제2차 및/또는 제3차 타깃 특이적 프라이머들 (TSPs)은 다음의 일반식 Ⅲ을 가지는 것을 특징으로 하는 방법:
    5'-X"p-Y"q-Z"r-3' (Ⅲ)
    상기 일반식에서, 상기 X"는 혼성화 하는 기지의 뉴클레오타이드의 한 위치와 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5'-고 Tm 특이성 부위이고, 상기 Y"는 최소 두 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역이며, 상기 Z"은 혼성화 하는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3'-저 Tm 특이성 부위 (3'-low Tm specificity portion)이고, 상기 p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, 상기 X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고 상기 5'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3'-저 Tm 특이성 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고 상기 분할 부위는 상기 5'-고 Tm 특이성 부위와 상기 3'-저 Tm 특이성 부위가 주형 핵산과 혼성화되는 경우 비 염기-쌍 버블(bubble) 구조를 형성하고, 상기 분할 부위는 주형 핵산에 대한 어닐링(annealing) 특이성 측면에서 상기 5'-고 Tm 특이성 부위가 상기 3'-저 Tm 특이성 부위로부터 분할되도록 하며, 상기 프라이머의 어닐링 특이성은 상기 5'-고 Tm 특이성 부위와 상기 3'-저 Tm 특이성 부위에 의해 이중적으로 결정되며 그 결과 상기 프라이머의 전체 어닐링 특이성이 증가된다.
  12. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기는 디옥시이노신 (deoxyinosine), 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 조절자 부위 와 분할 부위는 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체 잔기를 갖는 뉴클레오타이드의 연속 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 p는 10 내지 60의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 q 또는 u는 최소 3의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 q 또는 u는 3 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 r 또는 v는 2 내지 5의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 s 또는 w는 3 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 8 항에 있어서, 상기 S는 최소 2개의 연속된 디옥시구아노신 (deoxyguanosine) 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 11 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위의 길이는 3'-저 Tm 특이성 부위보다 긴 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 11 항에 있어서, 상기 3'-저 Tm 특이성 부위는 기지의 서열 부위에 완전히 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법
  24. 제 11 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위는 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 14 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위는 15-25 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 11 항에 있어서, 상기 3'-저 Tm 특이성 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 11 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위는 15-25 뉴클레오타이드의 길이, 분할 구역은 3-10 뉴클레오타이드의 길이 및 3'-저 Tm 특이성 부위는 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 11 항에 있어서, 상기 5'-고 Tm 특이성 부위는 40-80℃의 Tm을 가지는 것 을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 11 항에 있어서, 상기 3'-저 Tm 특이성 부위는 10-40℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 11 항에 있어서, 상기 분할 구역은 3-15℃의 Tm을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
KR1020087027939A 2006-05-04 2006-05-04 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 KR101231089B1 (ko)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2006/001694 WO2007129778A1 (en) 2006-05-04 2006-05-04 Method for amplifying unknown dna sequence adjacent to known sequence

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090005183A KR20090005183A (ko) 2009-01-12
KR101231089B1 true KR101231089B1 (ko) 2013-02-07

Family

ID=38667879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087027939A KR101231089B1 (ko) 2006-05-04 2006-05-04 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8192940B2 (ko)
EP (1) EP2010670B1 (ko)
JP (1) JP5197579B2 (ko)
KR (1) KR101231089B1 (ko)
ES (1) ES2400805T3 (ko)
WO (1) WO2007129778A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3150619B1 (en) * 2009-05-21 2019-09-18 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Universal tags with non-natural nucleobases
US9670540B2 (en) 2011-07-21 2017-06-06 Cornell University Methods and devices for DNA sequencing and molecular diagnostics
ES2905448T3 (es) 2012-05-10 2022-04-08 Massachusetts Gen Hospital Métodos para determinar una secuencia nucleotídica
CN103397028B (zh) * 2012-07-19 2014-12-24 光明乳业股份有限公司 一种用于pcr步移技术的半随机引物及其试剂盒
CN103397029B (zh) * 2012-07-19 2015-01-14 光明乳业股份有限公司 一种pcr步移方法及其所使用的引物和试剂盒
EP3099820A4 (en) * 2014-01-27 2018-01-03 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
US20190345538A1 (en) * 2016-03-31 2019-11-14 PerkinElmer Health Sciences (Australia) Pty Ltd Amplification of target sequences
KR101856205B1 (ko) * 2017-11-16 2018-06-20 제노플랜코리아 주식회사 핵산의 대립형질 특이적 프라이머 및 이를 이용한 유전형 판별 방법
CN110540989A (zh) * 2019-09-09 2019-12-06 湖北伯远合成生物科技有限公司 基于pcr技术克隆已知区域旁邻的未知dna序列的引物及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003050305A1 (en) * 2001-12-08 2003-06-19 Seegene, Inc. Annealing control primer and its uses
WO2005045073A1 (en) * 2003-11-10 2005-05-19 Seegene, Inc. Method for amplifying unknown dna sequence adjacent to known sequence

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5998170A (en) * 1997-10-03 1999-12-07 Amgen Inc. Polynucleotides encoding hepatocyte-specific members of the FGF family
CA2332610A1 (en) * 2001-01-26 2002-07-26 Bio S & T Asymmetrical pcr applification
AU2002222737A1 (en) * 2001-12-08 2003-06-23 Seegene, Inc Annealing control primer system for regulating primer annealing specificity and its applications
WO2005083121A1 (en) 2004-02-27 2005-09-09 Seegene, Inc. Method for amplifying members of a gene family
KR101243266B1 (ko) * 2005-03-05 2013-03-25 주식회사 씨젠 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드
WO2006095941A1 (en) * 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003050305A1 (en) * 2001-12-08 2003-06-19 Seegene, Inc. Annealing control primer and its uses
WO2005045073A1 (en) * 2003-11-10 2005-05-19 Seegene, Inc. Method for amplifying unknown dna sequence adjacent to known sequence

Also Published As

Publication number Publication date
JP5197579B2 (ja) 2013-05-15
EP2010670A1 (en) 2009-01-07
ES2400805T3 (es) 2013-04-12
WO2007129778A1 (en) 2007-11-15
EP2010670A4 (en) 2010-05-05
ES2400805T9 (es) 2013-05-07
US8192940B2 (en) 2012-06-05
JP2009535054A (ja) 2009-10-01
US20090298128A1 (en) 2009-12-03
EP2010670B1 (en) 2012-11-28
KR20090005183A (ko) 2009-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101231089B1 (ko) 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법
KR101032750B1 (ko) 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드
KR101440404B1 (ko) 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드를 사용한 방법 및 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드
US8058032B2 (en) Method for amplifying unknown DNA sequence adjacent to known sequence
WO2005083121A1 (en) Method for amplifying members of a gene family
WO2008111741A1 (en) Method for detecting nucleotide variations using labelled primers
KR100812259B1 (ko) 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160105

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181115

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191209

Year of fee payment: 8