JP2007520191A - Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド、及びそれを用いた目的遺伝子の発現方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、恒常的な高発現ベクター由来のＨＣＥプロモーターにＴベクターとしての機能を付与し、簡単で、かつ速かに目的蛋白質を発現させうるＴベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）、該プラスミドに目的遺伝子が挿入されている発現ベクター及びそれを用いた目的遺伝子の発現に関する。
本発明に係るプラスミドは、ただ一回のＴベクタークローニング過程のみでも、簡単で、かつ速かに目的蛋白質を発現するベクターに転換することが可能であり、該発現ベクターに転換されたプラスミドは、再形質転換段階が必要なく、高価な誘導物質を添加せずとも、形質転換された大腸菌の培養のみで目的蛋白質の高発現が可能である。したがって、多量の目的遺伝子に対する発現プラスミドの同時製造が可能であり、特定の微生物ゲノムの発現システムの構築及び特定の遺伝子群の発現システムの構築に非常に効率的であると期待される。

Description

本発明は、Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド、前記プラスミドに目的遺伝子が挿入されている発現ベクター、及びそれを用いた目的遺伝子の発現に関する。

目的とする遺伝子をベクターに挿入して発現させる代表的な方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を利用して目的遺伝子を増幅させた後、発現ベクターに挿入する方法がある。このＰＣＲで生成された遺伝子増幅産物は、反応に利用するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの末端転移酵素の活性によって、３’−末端にアデニン塩基を有するヌクレオチドがさらに一つ追加された状態で得られる（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１６：９６７７，１９８８）。

前記遺伝子増幅産物の特異的な特性によって、目的遺伝子の増幅産物は、制限酵素処理や末端変移酵素処理によって平滑末端や粘着末端を有するように製造する過程を経た後、プラスミドベクターにクローニングしなければならないが、これは、複数の段階を経なければならず、効率が低下し、かつ難しいという短所がある。

このような問題点を克服し、ＰＣＲで増幅された遺伝子産物を容易にクローニングするためにＴベクターが開発されたが、これは両端の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドがさらに一つ追加されている線形のベクターである。

Ｔベクターを製造する方法としては、第一に、人為的に３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドを追加させる方法がある。平滑末端化できる制限酵素を使用してクローニングベクターを切断し、この平滑末端の線形ベクターにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｒｃｈｕｎｋ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：１１５４，１９９１）を利用して、デオキシチミジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＴＴＰ）を添加するか、または末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を利用して（Ｈｏｌｔｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：１１５６，１９９１）ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｉｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄｄＴＴＰ）を添加することによって、３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドが追加された線形のＴベクターを製造できる。

しかし、この方法では末端転移酵素の活性効率に依存的にＴベクターが製造されるため、最適の反応条件が備えられないか、または非活性化された酵素によって、チミジンヌクレオチドが追加されていない不完全なＴベクターが製造されうる。これにより、クローニング過程で遺伝子増幅産物がクローニングされていない、セルフライゲーション産物の頻度が高まるという短所がある。また、このような産物で宿主細胞が形質転換されて、結局、遺伝子増幅産物のクローニング効率が低下するという短所がある。

Ｔベクターを製造する第二の方法は、制限酵素で遺伝子を切断した時、遺伝子の３’−末端にチミン塩基を有する一つのみのヌクレオチドを残し得る制限酵素であるＡｓｐＥＩ（Ｙｏｓｈｉｋａｚｕ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３０：１５２，１９９３）、ＨｐｈＩ（Ｄａｖｉｄ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：６５，１９９１）、ＭｂｏＩＩまたはＸｃｍＩなどを利用する方法である。

この方法は、使用される制限酵素の認識部位を２個並べて配列し、制限酵素で切断した時、切断されたベクターの３’−末端にチミジンヌクレオチドの一つずつを残すようにデザインした、オリゴヌクレオチドを合成して母ベクターに挿入した後、制限酵素で切断してＴベクターを製造する方法であって、母ベクターに制限酵素の認識部位が存在する時には使用できないという短所がある。

母ベクターとして多く使用されるｐＵＣ１９を基準に分析すると、ＨｐｈＩ及びＭｂｏＩＩの認識部位はそれぞれ７個に存在し、ＡｓｐＥＩの認識部位は１個に存在し、ただＸｃｍＩの認識部位のみが存在していないため、ＸｃｍＩを用いたＴベクターの開発に多くの研究が集中している（Ｋｏｖａｌｉｃ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：４５６０，１９９１；Ｃｈａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３６：３６９，１９９３；Ｔｅｓｔｏｒｉｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１４３：１５１，１９９４；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６：２３５，１９９４；Ｂｏｒｏｓｋｏｖ，Ａ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２２：８１２，１９９７）。

しかし、この場合にも、Ｔベクターを製造するために制限酵素で切断した時、遊離される遺伝子断片が小さすぎて、アガロースゲル電気泳動上で不完全に切断されたベクターと完全に切断されたベクターとの移動距離の差が小さいという問題点がある。したがって、ゲル抽出法で完全に切断されたＴベクターのみを分離しようとしても、不完全に切断されたベクターが混在する。その結果、制限酵素によって不完全に切断された一部のベクターが、そのまま遺伝子増幅産物のクローニングに利用されて、セルフライゲーションされたベクターが形質転換された大腸菌で高い割合で発見され、これによる遺伝子増幅産物のクローニング効率が低下するという短所を有している。

このような短所を克服するために、アガロースゲル電気泳動上で切断されて分離される遺伝子断片を明確に識別し、不完全なベクターが製造されて、セルフライゲーションによって遺伝子増幅産物がクローニングされていないベクターのみが形質転換されるという問題点を解決して、形質転換時にセルフライゲーションされたベクターが発見される比率を下げることによって、遺伝子増幅産物のクローニング効率を向上させうるＴベクターの製造技術を開発しようとする努力が進んできた。

一方、目的蛋白質を大量発現するための一般的な研究では、発現システムに適した発現用プラスミドの構築段階がまず行なわれる。発現用プラスミドの構築時、ベクターに挿入される目的蛋白質の遺伝子を増幅する時に使用するオリゴヌクレオチドは、増幅産物を発現ベクターに容易にクローニングするために、目的蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を分析した後、目的遺伝子の塩基配列に存在していない制限酵素の認識部位を挿入し作製する。

その結果、前記得られたオリゴヌクレオチドには、鋳型として使用される目的遺伝子の塩基配列の以外に、制限酵素の認識部位を添加するための余分のヌクレオチドが追加されるため、これを利用してＰＣＲで目的遺伝子を増幅する時、オリゴヌクレオチドが鋳型遺伝子に特異的にアニーリングされる効率が低下して、目的遺伝子のみを選択的に増幅させ難いという短所がある。また、クローニングの便宜性のために、遺伝子の増幅に使用されるオリゴヌクレオチドに挿入した制限酵素の認識部位は、目的遺伝子増幅産物の両末端に位置するため、切断される効率が低いという短所がある。

したがって、増幅された目的遺伝子産物をＴベクターにクローニングして、目的遺伝子が含まれたＴベクタークローンを選別した後、これを制限酵素で切断して最終発現プラスミドの構築に使用することにより、目的蛋白質の発現用プラスミドの効率を向上させているが、この方法は、２つの段階を経なければならないという不便がある。

目的蛋白質を大量発現する場合、その目的の大部分が、より簡便で、かつ効率的であり、そして、経済的な方法による産業的な生産であるため、優れた産業的な利用価値、例えば、より安定した遺伝子の発現及びコスト低減を有した遺伝子発現システム開発の必要性が絶え間なく提起され、このための努力が続いている。

これにより、本発明者らは、目的蛋白質を発現させるために簡単なＴベクタークローニングのみで目的蛋白質の高発現の可能な最終発現ベクターを構築するために努力した結果、恒常的な高発現のＴベクターを製作し、ＰＣＲで増幅された目的蛋白質の遺伝子を前記ベクターに一回のみクローニングしても高発現が可能であるということを確認すると共に、これを利用して微生物ゲノムの全体発現システムの構築のような、多量の目的遺伝子の大量発現に非常に効率的に使用できるということを確認し、本発明を完成させることに至った。

本発明の目的は、簡単で、かつ速かに目的蛋白質の遺伝子を発現させるベクターの製作に有効な、Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド及びその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記プラスミドに目的遺伝子が挿入されている発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された微生物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的遺伝子の発現方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、同時に多量の目的遺伝子を効率的で、かつ経済的に発現するベクターライブラリシステムを提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、宿主細胞に制限されずに、恒常的に発現されるベクターのプロモーターの下流にＴベクタークローニングの可能な制限酵素の認識部位を２個導入して、Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有し、１段階のＴベクタークローニングのみでも目的遺伝子の発現確認が可能な特性を有することを特徴とするプラスミドを提供する。

前記Ｔベクタークローニングの可能な制限酵素の認識部位は、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＡｓｐＥＩ及びＸｃｍＩから構成された群から選択された何れか一つであることが好ましく、前記２個の制限酵素の認識部位の間にポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とすることができる。

本発明に係るプラスミドは、前記制限酵素で切断する場合、前記挿入されたポリヌクレオチドの除去位置の両側の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドが露出されて、Ｔベクターとしての機能を有する。

本発明の好適な具現例において、前記恒常的に高発現されるベクターは、ｐＨＣＥであることを特徴とし、ｐＨＣＥのＨＣＥプロモーターの下流に２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位が導入されており、前記２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位の間に、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有するポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とするＴベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）を提供する。

本発明は、また、前記ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸをＡｓｐＥＩ制限酵素で切断して、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有するポリヌクレオチドを除去して得られ、前記ポリヌクレオチドの除去位置の両側の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドが露出されていることを特徴とする恒常的な高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）を提供する。

本発明は、また、（ａ）ｐＨＣＥベクター内のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位に点突然変異を誘発させて、前記制限酵素の認識部位が除去されたｐＨＣＥ−Ｍ１を製作する段階と、（ｂ）ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を含むプライマーを用いた、ＰＣＲによって２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を恒常的な高発現ベクター（ｐＨＣＥ）のＨＣＥプロモーターの下流に導入してｐＨＣＥ−Ｍ２を製作する段階と、（ｃ）ｐＨＣＥベクターの前記２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位の間に、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有するポリヌクレオチドを挿入する段階を含む、Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）の製造方法を提供する。

また、本発明は、前記プラスミドを前記制限酵素で切断して、前記挿入されたポリヌクレオチドを除去し、前記ポリヌクレオチドが除去された位置に目的蛋白質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする発現ベクターを提供する。

また、本発明は、前記高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）に目的蛋白質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする発現ベクターを提供する。

前記目的蛋白質をコードする遺伝子は、ＰＣＲで増幅したものであることを特徴とすることができる。また、前記遺伝子は、アミノ末端がＡＴＧであるプライマーと、前記遺伝子の塩基配列に特異的なプライマーとを使用して増幅したＰＣＲ産物であることを特徴とし、前記遺伝子の挿入部位にＮｄｅＩ制限酵素の認識部位が形成されていることを特徴とすることができる。

また、本発明は、前記発現ベクターで形質転換された微生物及び前記形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的蛋白質の発現方法を提供する。

また、本発明は、前記プラスミドに多様な遺伝子のライブラリが挿入された発現ベクターライブラリ及び前記高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）に多様な遺伝子のライブラリが挿入されていることを特徴とする発現ベクターライブラリを提供する。

また、本発明は、（ａ）前記発現ベクターライブラリで微生物を形質転換する段階と、（ｂ）前記形質転換された微生物を培養する段階とを含む目的遺伝子のクローニングの確認方法を提供する。

前記目的遺伝子のクローニングの確認方法は、前記（ｂ）段階以後にプラスミドを分離し、前記プラスミドをＮｄｅＩ制限酵素で切断する段階をさらに含むことが好ましい。

以下、本発明の高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）の製造方法及びそれを用いた発現方法を段階別に分けて、さらに具体的に説明する。

第１段階：２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位が添加されたｐＨＣＥ−Ｍ１の製造
恒常的な高発現プロモーター及びサブクローニングに有効なマルチクローニングサイトを有している恒常的な高発現ベクター（ｐＨＣＥ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ：ＦＥＲＭ Ｐ−１７８１４）を基本骨格としてＴベクターを製造するために、前記ｐＨＣＥベクターに存在するＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位に点突然変異を誘発させて、前記制限酵素の認識部位が除去されたｐＨＣＥ−Ｍ１を製造した。

２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによって、前記ｐＨＣＥ−Ｍ１のＨＣＥプロモーターの下流に２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位が導入されたｐＨＣＥ−Ｍ２を得た。

第２段階：恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）の製造
ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を含むプライマーを用いたＰＣＲによって、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素を有する約８００ｂｐのポリヌクレオチドを得、これをｐＨＣＥ−Ｍ２のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位に挿入して、恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）を得た。これは、以後にＴベクターへの転換時にＤＮＡ断片の分離を容易にするためである。

第３段階：恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）の恒常的な高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）への転換
恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）で形質転換された大腸菌からプラスミドを分離し、ＡｓｐＥＩ制限酵素で切断して、これをアガロースゲル電気泳動で展開し、約８００ｂｐのポリヌクレオチドを分離後に残った、遺伝子の両端の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドを一つずつ含む約３０００ｂｐの恒常的な高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）を得た。

第４段階：目的蛋白質をコードする遺伝子のクローニング及び高発現
目的蛋白質をコードする遺伝子をＰＣＲで増幅させた後、前記恒常的な高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）にクローニングした。前記目的蛋白質の遺伝子が挿入された高発現Ｔベクターは、目的蛋白質をコードする遺伝子増幅用のアミノ末端プライマーの開始コドンをＡＴＧとして製造すれば、Ｔベクタークローニング後に正方向に挿入された場合、ＮｄｅＩ制限酵素の認識部位が生成されて、容易にクローニングの成敗を確認できるように設計されている。

このように正方向に発現させようとする遺伝子が挿入された場合、このプラスミドを有する形質転換された大腸菌を培養して、発現誘導物質を処理せずに所定時間後に目的蛋白質の過剰発現が確認できる。

本発明の高発現Ｔベクター用のプラスミドは、Ｔベクター用のプラスミドによって形質転換された大腸菌からプラスミドを分離し、これをＡｓｐＥＩ制限酵素で切断した後、約８００ｂｐのポリヌクレオチド部分を除いた残りのプラスミド部分を分離精製することによって容易に高発現Ｔベクターに転換でき、大腸菌内に形質転換された状態でプラスミドの保管が可能な優れた保存性を有する。また、発現を所望する目的蛋白質をコードする遺伝子を一回のみクローニングしても、直ぐに発現の確認まで可能であり、これは、宿主細胞の種類に関係なく発現が可能なシステムとしての長所も有する。

また、本発明に係るプラスミドシステムは、大量の目的遺伝子を同時に発現するシステムの構築時に、既存の他のシステムに比べて優れた効率性を表す。これは、本発明のプラスミドシステムのみが有しうる長所であり、Ｔベクタークローニングにより製造される発現用プラスミドは、使用するプロモーターが恒常的な高発現プロモーターであり、宿主細胞に制限されずに発現可能な特徴により、一回のクローニングによって得られた形質転換体から直ぐに発現の確認まで可能である。このような長所により、微生物ゲノムの発現システムの構築などの効率を画期的に改善することが可能である。

本発明の高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）をＡｓｐＥＩで切断した時、切断されたＤＮＡ断片に対するアガロースゲル電気泳動を示す写真である。 本発明に係る新規高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）の概略図である。 ＰＣＲにより増幅されたｈＴＮＦ−αのアガロースゲル電気泳動を示す写真である。 本発明の高発現Ｔベクターを用いたクローニングを確認するために無作為的に選別された１２個のコロニーを、ＮｄｅＩ制限酵素で切断したＤＮＡ切片に対するアガロースゲル電気泳動を示す写真である。 クローニング確認のために選別された１２個の形質転換体から得た蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す写真である。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは当業者にとっては明らかであろう。

特に、下記実施例では、恒常的な発現ベクターとしてｐＨＣＥを使用したが、宿主細胞に制限されずに発現されるベクターであれば何れも制限無しに使用できる。

また、下記実施例では、ｐＨＣＥのＨＣＥプロモーターの下流に２個のＡｓｐＥＩ認識部位を導入したが、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＸｃｍＩ等の制限酵素で切断する場合、両側の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドを露出させるＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＸｃｍＩなどの制限酵素の認識部位を導入しても、同じ結果が得られるということは当業者にとっては明らかな事実であると言えるであろう。ただし、使用するもとの恒常的発現ベクターに前記制限酵素の認識部位が存在する場合には、その部位を突然変異させて除去しなければならない。

実施例１：恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミドの製造
既存のｐＣＨＥベクターに存在するＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を除去するために、下記配列番号１のプライマーを用いたＰＣＲによって、ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位に点突然変異を誘発させて、前記制限酵素の認識部位が除去されたｐＨＣＥ−Ｍ１を得た。
配列番号１：５’−ＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＣＧＴＴＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣ−３’

前記ＰＣＲは、５０μｌ当り１０ｍＭのトリス塩化水素（ｐＨ ９．０）、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、０．１％のトリトンＸ−１００、及び１５０μＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）を含む試薬の組成に、５０ｎｇの恒常的な高発現ベクター（ｐＨＣＥ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ）を鋳型とし、前記配列番号１のプライマー１０ｐｍｏｌ及びＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）２ユニットを添加した後、ＰＣＲ反応器（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）で９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルの温度変化とする３０回のサイクルを行った。

次いで、ｐＨＣＥ−Ｍ１のプロモーターの下流にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を生成するために、ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位（５’−ＧＡＣＮＮＮ↓ＮＮＧＴＣ−３’）を含む下記配列番号２及び配列番号３のプライマーを用いたＰＣＲによって、ｐＨＣＥ−Ｍ１のＨＣＥプロモーターの下流に２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位が導入されたｐＨＣＥ−Ｍ２を得た。下記配列番号２及び配列番号３のプライマー塩基の配列番号は、ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位は下線で表示された部分である。
配列番号２：５’−ＴＣＣＧＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＧ−３’
配列番号３：５’−ＧＧＡＣＴＴＡＡＧＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＣ−３’

前記ＰＣＲ時のように、ｐＨＣＥ−Ｍ１を鋳型とし、前記配列番号２及び配列番号３のプライマー１０ｐｍｏｌ及びＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）２ユニットを添加した後、ＰＣＲ反応器（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）で９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルの温度変化とする３０回のサイクルを行った。

このようにして得られたプラスミドｐＨＣＥ−Ｍ２をＴベクターに転換する場合、ＤＮＡ分離を容易にするために、前記２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位の間に、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有する８００ｂｐのＤＮＡ増幅産物を挿入してｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸを得た。前記８００ｂｐのＤＮＡ増幅産物は、ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を含む下記配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いたＰＣＲによって得た。このＰＣＲも、前記行ったものと同じ条件の試薬の組成を使用し、ＰＣＲ反応器（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）で９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルの温度変化とする３０回のサイクルで行った。
配列番号４：５’−ＧＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＴＡＧＴＧＣＡＧ−３’
配列番号５：５’−ＧＡＣＣＴＴＡＡＧＴＣＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＣＧ−３’

このようにして得られた恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）は、Ｔベクターとしての機能だけでなく、発現ベクターとしての機能も有する。

実施例２：Ｔベクター用のプラスミドのＴベクターへの転換
実施例１で得たＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を末端に含み、長さが８００ｂｐであるＤＮＡ断片がクローニングされた恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）をＴベクターに転換するために、高純度で分離及び精製したＴベクター用のプラスミドをＡｓｐＥＩ制限酵素（３μｇ ＤＮＡ当り１０ユニット）で３７℃で６時間処理した後、１％のアガロースゲル上で電気泳動した（図１）。

図１において、第１レーンは、１ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．ＵＳＡ）を表し、第２レーンは、高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）をＡｓｐＥＩ（２回切断）で処理した時に切断されたベクター及び遺伝子の位置を表す。図１に示すように、ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸＴベクター用のプラスミドをＡｓｐＥＩ制限酵素によって２回切断した場合、切断されたポリヌクレオチドの間にアガロースゲル上での移動距離が互いに非常に異なるということが確認された。これは、Ｔベクター用のＤＮＡ断片を容易に分離できるということを意味する。ＡｓｐＥＩで処理した時、切断された約３０００ｂｐのＴベクターＤＮＡ断片をゲル精製キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を使用して精製した後、Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）として使用した。図２は、新規な恒常的な高発現ＴベクターであるｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔの構造及び構成についての概略図である。

実施例３：ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸから転換されたＴベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）を用いたクローニング
恒常的な高発現Ｔベクター用のプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）を制限酵素ＡｓｐＥＩで処理して転換されたＴベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）のクローニング効率を検証するために、ｈＴＮＦ−α（ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）遺伝子をＰＣＲで増幅した後、前記Ｔベクターに連結してクローニングした。

まず、ｈＴＮＦ−α遺伝子を増幅するために、前記遺伝子塩基配列の断片にＡＴＧが挿入された配列番号６のプライマーと、塩基配列の特異的な配列番号７のプライマーとをデザインした。
配列番号６：５’−ＡＴＧＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’
配列番号７：５’−ＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＡＧ−３’

前記遺伝子の増幅のために、５０μｌ当り１０ｍＭのトリス塩化水素（ｐＨ ９．０）、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、５０ｍＭの塩化カルシウム、０．１％のトリトンＸ−１００、及び１５０μＭの４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ）を含む試薬の組成に、前記配列番号６及び配列番号７のプライマー１０ｐｍｏｌ及びＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）２ユニットを添加した後、ＰＣＲ反応器（ｉＣｙｃｌｅｒ，ＢＩＯ−ＲＡＤ，ＵＳＡ）で９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で４０秒を１サイクルの温度変化とする３０回のサイクルでＰＣＲを行った。

遺伝子増幅産物を１％のアガロースゲルで電気泳動して確認した後、ゲル精製キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ，Ｋｏｒｅａ）を使用して精製した（図３）。図３において、第１レーンは、１ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．ＵＳＡ）を表し、第２レーンは、４７２ｂｐの大きさの精製されたｈＴＮＦ−α遺伝子増幅産物を表す。実施例２で準備された５０ｎｇのＴベクター及び増幅精製されたｈＴＮＦ−ａ遺伝子増幅産物を５ユニットのＴ４ ＤＮＡ連結酵素（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）で連結して大腸菌ＪＭ１０９に導入した。前記形質転換された大腸菌を５ｍｌ ＬＢ培地で培養した後、プラスミドを分離し、ｈＴＮＦ−αのクローニングされるか否かを確認した。

得られた形質転換体のうち、無作為的に選別された１２個のコロニーを確認した結果、何れもｈＴＮＦ−αが挿入されており、非常に高いクローニング効率を表した。ＡＴＧで始まるプライマーを用いた遺伝子増幅産物をクローニングする場合、ＨＣＥプロモーターに正方向に挿入されれば、ＮｄｅＩ制限酵素の認識部位が生成されることを利用して、ＮｄｅＩ制限酵素の切断によってクローニング方向を確認した結果、ｈＴＮＦ−αが挿入された１２個のコロニーのうち、６個がＨＣＥプロモーターに正方向にクローニングされていることを確認した（図４）。

図４において、第１レーン及び第９レーンは、１ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏ．ＵＳＡ）を示し、第２レーンは、ＤＮＡの大きさの比較のための対照群であって、１個の認識部位のみを有するＥｃｏＲＩでｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸを切断したものを示し、第３レーンないし第８レーン及び第１０レーンないし第１４レーンは、前記１２個のコロニーから得たＤＮＡをＮｄｅＩ制限酵素で切断した後に展開したものを示す。第５レーン、第７レーン、第８レーン、第１２レーン、第１３レーン及び第１４レーンに展開された６個の場合、ＮｄｅＩにより切断されて約３．５ｋｂの単一のＤＮＡ断片が観察され、これから、これらの６個のコロニーは、ｈＴＮＦ−αが正方向にＴベクターにクローニングされていることが確認された。

実施例４：クローニングされた遺伝子増幅産物から発現される蛋白質の確認
ＮｄｅＩ制限酵素の処理によって確認された６個のコロニーは、ｈＴＮＦ−αをコーディングする遺伝子がＨＣＥプロモーターに正方向に挿入されたため、Ｔベクターが有する発現ベクターとしての特性を利用して、リクローニングの過程や他の宿主細胞への形質転換の必要なしに、直ぐにｈＴＮＦ−αの発現を確認できる。

前記クローニングが確認されたコロニー１２個をＬＢ培地で２０時間培養した後、各培養細胞から得た蛋白質１０μｇずつを１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、染色剤（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ２５０）で蛋白質を染色して、ｈＴＮＦ−αの発現の有無を確認した（図５）。

結果的に高発現されたｈＴＮＦ−αバンドが第４レーン、第６レーン、第７レーン、第１２レーン及び第１３レーンで確認され、ＨＣＥプロモーターに正方向に遺伝子が挿入された６個のコロニーのうち、５個で高発現が成功した。図５において、第１レーン及び第８レーンは、低分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）であり、第２レーンないし第７レーン及び第９レーンないし第１４レーンは、前記で得られた１２個の形質転換体を培養して得た蛋白質１０μｇずつを展開したものである。ここで、実験群の展開順序は、図４の展開順序と同じである。

以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施例であり、これによって本発明の範囲が制限されるものではないということは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されると言えるであろう。

以上で具体的に説明及び証明したように、本発明に係るＴベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミドは、Ｔベクターに転換することが容易であり、一回のクローニング段階を経て、その目的蛋白質の発現まで確認することができる。特に、ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位間の間隔が約８００ｂｐ離れており、制限酵素の切断時に切断されたベクターの区別が容易であり、プラスミド状であるため、優れた保存性を有する。

また、本発明の発現ベクターは、一回のクローニングでも再度のサブクローニング（ｒｅ−ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）の必要なしに発現を確認できる非常に効率的な特性を有しているため、発現しようとする目的蛋白質をコードする遺伝子のクローニングに広く活用されうる。特に、多量の目的遺伝子に対する発現プラスミドの同時製造が可能であり、短時間で特定の微生物ゲノムの発現システムの構築及び特定の遺伝子群の発現システムの構築に応用できる。また、恒常的な高発現システムの発現ベクターであるため、発現誘導物質の処理が必要なく、特異的な宿主細胞を必要としない発現システムと結合されているベクターであって、その有効性が非常に高い。

Claims (18)

1. 宿主細胞の種類に制限されずに、恒常的に高発現されるベクターのプロモーターの下流にＴベクタークローニングの可能な制限酵素の認識部位を２個導入して、Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有し、１段階のＴベクタークローニングのみでも目的遺伝子の発現確認が可能な特性を有することを特徴とするプラスミド。
2. 前記Ｔベクタークローニングの可能な制限酵素の認識部位は、ＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＡｓｐＥＩ及びＸｃｍＩから構成された群から選択された何れか一つであって、前記２個の制限酵素の認識部位の間にポリヌクレオチドが挿入されている請求項１に記載のプラスミド。
3. 前記プラスミドを前記制限酵素で切断する場合、前記挿入されたポリヌクレオチドの除去位置の両側の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドが露出されている請求項２に記載のプラスミド。
4. 前記恒常的に高発現されるベクターは、ｐＨＣＥである請求項１に記載のプラスミド。
5. ｐＨＣＥのＨＣＥプロモーターの下流に２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位が導入されており、前記２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位の間に、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有するポリヌクレオチドが挿入されていることを特徴とするＴベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）である請求項４に記載のプラスミド。
6. 請求項５のｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸをＡｓｐＥＩ制限酵素で切断して、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有するポリヌクレオチドを除去して得られ、前記ポリヌクレオチドの除去位置の両側の３’−末端にチミン塩基を有するヌクレオチドが露出されていることを特徴とする恒常的な高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）。
7. 下記の段階を含むＴベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）の製造方法：
   （ａ）ｐＨＣＥベクター内のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位に点突然変異を誘発させて、前記制限酵素の認識部位が除去されたｐＨＣＥ−Ｍ１を構築する段階；
   （ｂ）ＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を含むプライマーを用いた、ＰＣＲによって２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を恒常的な高発現ベクター（ｐＨＣＥ）のＨＣＥプロモーターの下流に導入してｐＨＣＥ−Ｍ２を構築する段階；及び
   （ｃ）前記ｐＨＣＥ−Ｍ２ベクターの２個のＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位の間に、両末端にＡｓｐＥＩ制限酵素の認識部位を有するポリヌクレオチドを挿入して、Ｔベクター及び発現ベクターとしての機能を共に有するプラスミド（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ）を製作する段階。
8. 請求項２のプラスミドを前記制限酵素で切断して、前記挿入されたポリヌクレオチドを除去し、前記ポリヌクレオチドが除去された位置に目的蛋白質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする発現ベクター。
9. 請求項６の高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）に目的蛋白質をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴とする発現ベクター。
10. 前記目的蛋白質をコードする遺伝子は、ＰＣＲで増幅したものである請求項８または請求項９に記載の発現ベクター。
11. 前記目的蛋白質をコードする遺伝子は、アミノ末端がＡＴＧであるプライマーと、前記遺伝子の塩基配列に特異的なプライマーとを使用して増幅したＰＣＲ産物である請求項８または請求項９に記載の発現ベクター。
12. 前記目的蛋白質をコードする遺伝子の挿入部位にＮｄｅＩ制限酵素の認識部位が形成されている請求項８または請求項９に記載の発現ベクター。
13. 請求項８乃至請求項１２の中何れか一項に記載の発現ベクターで形質転換された微生物。
14. 請求項１３の形質転換された微生物を培養することを特徴とする目的蛋白質の発現方法。
15. 以下の工程を含む方法によって製造される発現ベクターライブラリであって、
    （ａ）請求項２のプラスミドをＨｐｈＩ、ＭｂｏＩＩ、ＡｓｐＥＩ及びＸｃｍＩから構成された群から選択された、前記制限酵素で切断して前記挿入されたポリヌクレオチドを除去する段階、
    （ｂ）前記ポリヌクレオチドが除去された位置に多様な遺伝子のライブラリを挿入する段階
    により得られる発現ベクターライブラリ。
16. 請求項６の高発現Ｔベクター（ｐＨＣＥ−ＦＯＲＥＸ−Ｔ）に多様な遺伝子のライブラリが挿入されていることを特徴とする発現ベクターライブラリ。
17. （ａ）請求項１５または請求項１６の発現ベクターライブラリで微生物を形質転換する段階、及び
    （ｂ）前記形質転換された微生物を培養する段階、
    とを含む目的遺伝子のクローニングの確認方法。
18. 前記（ｂ）段階以後にプラスミドを分離し、前記プラスミドをＮｄｅＩ制限酵素で切断する段階をさらに含む請求項１７記載の目的遺伝子のクローニングの確認方法。

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