JP2002253255A - ランダム挿入削除ｄｎａ変異法 - Google Patents
ランダム挿入削除ｄｎａ変異法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】蛋白質をコードする遺伝子の連続した３塩基
を、ランダムに、かつ変異率がほぼ一定で、特定の配列
を有する他の塩基配列に置換する新規な変異法、そのた
めのアンカー及び変異遺伝子ライブラリー、変異蛋白質
ライブラリーの簡便な製造方法の提供。 【解決手段】ＤＮＡを環化して、環状の１本鎖ＤＮＡを
作成し、この環状のＤＮＡの任意の１カ所を切断し、得
られた鎖状の１本鎖ＤＮＡの両端にアンカーを結合さ
せ、これをＰＣＲ法により増幅させ、次に認識配列の外
側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてアンカー中の認
識配列の外側を切断し、片側の末端にアンカー中に調製
しておいた特定の塩基配列が挿入されるようにしてお
き、もう一端は他端に挿入された塩基数と同数の塩基配
列が削除されることを特徴とするＤＮＡの変異方法、そ
のためのアンカー、及びこの方法による変異ＤＮＡ及び
変異蛋白質のライブラリー。
を、ランダムに、かつ変異率がほぼ一定で、特定の配列
を有する他の塩基配列に置換する新規な変異法、そのた
めのアンカー及び変異遺伝子ライブラリー、変異蛋白質
ライブラリーの簡便な製造方法の提供。 【解決手段】ＤＮＡを環化して、環状の１本鎖ＤＮＡを
作成し、この環状のＤＮＡの任意の１カ所を切断し、得
られた鎖状の１本鎖ＤＮＡの両端にアンカーを結合さ
せ、これをＰＣＲ法により増幅させ、次に認識配列の外
側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてアンカー中の認
識配列の外側を切断し、片側の末端にアンカー中に調製
しておいた特定の塩基配列が挿入されるようにしてお
き、もう一端は他端に挿入された塩基数と同数の塩基配
列が削除されることを特徴とするＤＮＡの変異方法、そ
のためのアンカー、及びこの方法による変異ＤＮＡ及び
変異蛋白質のライブラリー。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡの連続した
３塩基を、ランダムに、かつ変異率がほぼ一定で、特定
の配列を有する他の塩基配列に置換する新規な変異法に
関する。また、本発明はそのためのオリゴヌクレオチド
からなる新規なアンカーに関する。また、本発明は、従
来の変異法の問題点を一挙に解決する新規な変異法であ
り、ランダムに切断されたＤＮＡの切断箇所にアミノ酸
をコードするコドンを指定したコドン単位で変異させる
ことができるものであり、本発明の方法によりランダム
な位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異蛋白
質のライブラリーを簡便に作成することができる。した
がって、本発明は、本発明の変異法によって製造される
変異した遺伝子ライブラリー、変異した蛋白質ライブラ
リーに関する。さらに、本発明は、アンカー、好ましく
は本発明のアンカーとして、塩基配列のわかっている２
本鎖の領域と標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイ
ズするための１本鎖の塩基配列の部分とを有するアンカ
ーを用いて、当該アンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列
とハイブリダイズするための１本鎖の塩基配列がランダ
ムな種々の塩基配列を有するアンカー群と１本鎖ＤＮＡ
とを接触させることからなる末端の塩基配列が未知な１
本鎖ＤＮＡにアンカーを連結させる方法に関する。
３塩基を、ランダムに、かつ変異率がほぼ一定で、特定
の配列を有する他の塩基配列に置換する新規な変異法に
関する。また、本発明はそのためのオリゴヌクレオチド
からなる新規なアンカーに関する。また、本発明は、従
来の変異法の問題点を一挙に解決する新規な変異法であ
り、ランダムに切断されたＤＮＡの切断箇所にアミノ酸
をコードするコドンを指定したコドン単位で変異させる
ことができるものであり、本発明の方法によりランダム
な位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異蛋白
質のライブラリーを簡便に作成することができる。した
がって、本発明は、本発明の変異法によって製造される
変異した遺伝子ライブラリー、変異した蛋白質ライブラ
リーに関する。さらに、本発明は、アンカー、好ましく
は本発明のアンカーとして、塩基配列のわかっている２
本鎖の領域と標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイ
ズするための１本鎖の塩基配列の部分とを有するアンカ
ーを用いて、当該アンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列
とハイブリダイズするための１本鎖の塩基配列がランダ
ムな種々の塩基配列を有するアンカー群と１本鎖ＤＮＡ
とを接触させることからなる末端の塩基配列が未知な１
本鎖ＤＮＡにアンカーを連結させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学の発展により、多数の蛋白質
の構造が解析されてきた。さらに近年、「進化分子工
学」と呼ばれる手法を用いて有用な蛋白質が見出され、
研究や産業に利用されている。進化分子工学では、まず
天然のＤＮＡにランダムに変異を加えたＤＮＡの集合体
（ＤＮＡライブラリー）を作成し、そのＤＮＡを用いて
変異した蛋白質の集合体（蛋白質ライブラリー）を作成
する。この蛋白質ライブラリーから、耐熱性や触媒能が
向上した蛋白質を選択して、それをコードしているＤＮ
Ａだけを増幅する。このサイクルを繰り返して、最終的
に最適のアミノ酸配列を持っている蛋白質を探索する。
この変異した蛋白質ライブラリー作成の手段として、ま
ず変異したＤＮＡを作成するのであり、このＤＮＡを変
異させる方法としては、例えば、突然変異法などによる
オリゴヌクレオチドを利用した変異法やカセット変異法
などの部位特異的変異法が古くから知られているが、ラ
ンダムな変異はできなかった。ランダムな変異法として
は、ＤＮＡ合成酵素による塩基取り込みの誤りを利用す
る方法（エラープローンＰＣＲ法）が、最も一般的に使
用されている。
の構造が解析されてきた。さらに近年、「進化分子工
学」と呼ばれる手法を用いて有用な蛋白質が見出され、
研究や産業に利用されている。進化分子工学では、まず
天然のＤＮＡにランダムに変異を加えたＤＮＡの集合体
（ＤＮＡライブラリー）を作成し、そのＤＮＡを用いて
変異した蛋白質の集合体（蛋白質ライブラリー）を作成
する。この蛋白質ライブラリーから、耐熱性や触媒能が
向上した蛋白質を選択して、それをコードしているＤＮ
Ａだけを増幅する。このサイクルを繰り返して、最終的
に最適のアミノ酸配列を持っている蛋白質を探索する。
この変異した蛋白質ライブラリー作成の手段として、ま
ず変異したＤＮＡを作成するのであり、このＤＮＡを変
異させる方法としては、例えば、突然変異法などによる
オリゴヌクレオチドを利用した変異法やカセット変異法
などの部位特異的変異法が古くから知られているが、ラ
ンダムな変異はできなかった。ランダムな変異法として
は、ＤＮＡ合成酵素による塩基取り込みの誤りを利用す
る方法（エラープローンＰＣＲ法）が、最も一般的に使
用されている。
【０００３】しかし、エラープローンＰＣＲ法では、
（１）変異がＤＮＡ上の１塩基ずつしか起こらないた
め、置換されるアミノ酸の種類に偏りが生じていた。
（２）特定の塩基配列をランダムな箇所に導入して、特
定のアミノ酸を蛋白質のランダムな位置に導入すること
ができなかった。（３）１個の蛋白質あたり１箇所の変
異を導入するような条件設定が困難であり、数カ所が同
時に変異した蛋白質ができ得られた性質がどのアミノ酸
の変異であるかを特定することが困難であった。また、
従来の変異法ではヌクレオチド単位で変異させるため、
３個の塩基からなるコドンを全部同時にランダムな位置
に変異させることはできなかった。さらに、非天然アミ
ノ酸を部位特異的に導入することも不可能であった。こ
のように、従来用いられているＤＮＡの変異法は十分な
ものとは言えず、コドン単位でランダムに、かつ１蛋白
質当たり１箇所のみの変異方法の開発が望まれていた。
このような変異法が開発されれば、天然の蛋白質におけ
る各アミノ酸の機能解析も容易に行えるようになる。
（１）変異がＤＮＡ上の１塩基ずつしか起こらないた
め、置換されるアミノ酸の種類に偏りが生じていた。
（２）特定の塩基配列をランダムな箇所に導入して、特
定のアミノ酸を蛋白質のランダムな位置に導入すること
ができなかった。（３）１個の蛋白質あたり１箇所の変
異を導入するような条件設定が困難であり、数カ所が同
時に変異した蛋白質ができ得られた性質がどのアミノ酸
の変異であるかを特定することが困難であった。また、
従来の変異法ではヌクレオチド単位で変異させるため、
３個の塩基からなるコドンを全部同時にランダムな位置
に変異させることはできなかった。さらに、非天然アミ
ノ酸を部位特異的に導入することも不可能であった。こ
のように、従来用いられているＤＮＡの変異法は十分な
ものとは言えず、コドン単位でランダムに、かつ１蛋白
質当たり１箇所のみの変異方法の開発が望まれていた。
このような変異法が開発されれば、天然の蛋白質におけ
る各アミノ酸の機能解析も容易に行えるようになる。
【０００４】一方、「進化分子工学」においては、非天
然アミノ酸を天然の蛋白質の部位特異的に導入すること
で、新しい機能を持った蛋白質を作成することも志向さ
れている。天然の蛋白質に非天然アミノ酸を導入する方
法として、４塩基コドンＣＧＧＴを用いる方法が開発さ
れている。しかし、天然の蛋白質に大きな非天然アミノ
酸を導入すると、活性を失ってしまうことが多く、特定
の部位にひとつひとつ４塩基コドンＣＧＧＴを入れてゆ
く方法では、非天然アミノ酸を導入した蛋白質ライブラ
リーを作成することが困難となる。この４塩基コドンＣ
ＧＧＴを、天然のアミノ酸をコードする遺伝子の中に、
１個の蛋白質に対して１箇所づつランダムに導入するこ
とができれば、非天然アミノ酸を導入した蛋白質ライブ
ラリーを容易に作成することができるようになる。この
ようなライブラリーができれば、これをスクリーニング
することにより機能が最適化された変異蛋白質が容易に
得られるようになる。
然アミノ酸を天然の蛋白質の部位特異的に導入すること
で、新しい機能を持った蛋白質を作成することも志向さ
れている。天然の蛋白質に非天然アミノ酸を導入する方
法として、４塩基コドンＣＧＧＴを用いる方法が開発さ
れている。しかし、天然の蛋白質に大きな非天然アミノ
酸を導入すると、活性を失ってしまうことが多く、特定
の部位にひとつひとつ４塩基コドンＣＧＧＴを入れてゆ
く方法では、非天然アミノ酸を導入した蛋白質ライブラ
リーを作成することが困難となる。この４塩基コドンＣ
ＧＧＴを、天然のアミノ酸をコードする遺伝子の中に、
１個の蛋白質に対して１箇所づつランダムに導入するこ
とができれば、非天然アミノ酸を導入した蛋白質ライブ
ラリーを容易に作成することができるようになる。この
ようなライブラリーができれば、これをスクリーニング
することにより機能が最適化された変異蛋白質が容易に
得られるようになる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の変異
法における問題点を解決するための新規なＤＮＡ変異法
の開発を目的としている。本発明は、蛋白質をコードす
る遺伝子の連続した３塩基を、ランダムに、かつ変異率
がほぼ一定で、特定の配列を有する他の塩基配列に置換
する新規な変異法を提供するものである。また、本発明
は、遺伝子の連続した３塩基を、ランダムに、かつ変異
率がほぼ一定で、非天然アミノ酸に対応する４塩基コド
ン、例えばＣＧＧＴに置換できる新規な変異法を提供す
る。さらに本発明は、遺伝子のランダムな箇所の連続し
た３塩基が、特定の配列を有する他の塩基配列にランダ
ムに置換された、遺伝子ライブラリー、及び蛋白質ライ
ブラリーの簡便な製造方法を提供する。また、本発明
は、コドン単位でランダムに、変異率がほぼ一定である
変異方法に仕様するためのオリゴヌクレオチドからなる
新規なアンカーを提供する。さらに、本発明は、末端の
塩基配列が未知の１本鎖ＤＮＡにアンカーを連結させる
ための方法も提供する。
法における問題点を解決するための新規なＤＮＡ変異法
の開発を目的としている。本発明は、蛋白質をコードす
る遺伝子の連続した３塩基を、ランダムに、かつ変異率
がほぼ一定で、特定の配列を有する他の塩基配列に置換
する新規な変異法を提供するものである。また、本発明
は、遺伝子の連続した３塩基を、ランダムに、かつ変異
率がほぼ一定で、非天然アミノ酸に対応する４塩基コド
ン、例えばＣＧＧＴに置換できる新規な変異法を提供す
る。さらに本発明は、遺伝子のランダムな箇所の連続し
た３塩基が、特定の配列を有する他の塩基配列にランダ
ムに置換された、遺伝子ライブラリー、及び蛋白質ライ
ブラリーの簡便な製造方法を提供する。また、本発明
は、コドン単位でランダムに、変異率がほぼ一定である
変異方法に仕様するためのオリゴヌクレオチドからなる
新規なアンカーを提供する。さらに、本発明は、末端の
塩基配列が未知の１本鎖ＤＮＡにアンカーを連結させる
ための方法も提供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
従来の変異法の問題点（１）〜（３）を改善するため
に、（１）については、ランダムな位置の塩基配列を、
指定した塩基配列に置き換えることを可能にする、
（２）についてはランダムな位置の塩基配列を、指定し
た塩基配列に置換できることを可能にする、（３）につ
いては、変異率がほぼ一定のＤＮＡを作成することを可
能にすることにより解決するために、鋭意研究した結
果、一方のアンカーが、認識配列の外側でＤＮＡを切断
する制限酵素の認識配列、挿入される塩基配列、及び標
的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖
の相補的な塩基配列を含有しており、他方のアンカー
が、認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素の認識
配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズ
し得る１本鎖の相補的な塩基配列を含有しているアンカ
ーを用いることにより、これらの目的を達成できること
を見出した。
従来の変異法の問題点（１）〜（３）を改善するため
に、（１）については、ランダムな位置の塩基配列を、
指定した塩基配列に置き換えることを可能にする、
（２）についてはランダムな位置の塩基配列を、指定し
た塩基配列に置換できることを可能にする、（３）につ
いては、変異率がほぼ一定のＤＮＡを作成することを可
能にすることにより解決するために、鋭意研究した結
果、一方のアンカーが、認識配列の外側でＤＮＡを切断
する制限酵素の認識配列、挿入される塩基配列、及び標
的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖
の相補的な塩基配列を含有しており、他方のアンカー
が、認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素の認識
配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズ
し得る１本鎖の相補的な塩基配列を含有しているアンカ
ーを用いることにより、これらの目的を達成できること
を見出した。
【０００７】即ち、本発明は、ＤＮＡを環化して、環状
の１本鎖ＤＮＡを作成し、この環状のＤＮＡの任意の１
カ所を切断し、得られた鎖状の１本鎖ＤＮＡの両端にア
ンカーを結合させ、これをＰＣＲ法により増幅させ、次
に認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いて
アンカー中の認識配列の外側を切断し、片側の末端にア
ンカー中に調製しておいた特定の塩基配列が挿入される
ようにしておき、もう一端は他端に挿入された塩基数と
同数の塩基配列が削除されるようにしておくことを特徴
とするＤＮＡの変異方法に関する。また、本発明は、少
なくとも認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素の
認識配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダ
イズし得る１本鎖の相補的な塩基配列を含有してなるオ
リゴヌクレオチドからなる前記変異方法に用いるための
アンカーに関する。
の１本鎖ＤＮＡを作成し、この環状のＤＮＡの任意の１
カ所を切断し、得られた鎖状の１本鎖ＤＮＡの両端にア
ンカーを結合させ、これをＰＣＲ法により増幅させ、次
に認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いて
アンカー中の認識配列の外側を切断し、片側の末端にア
ンカー中に調製しておいた特定の塩基配列が挿入される
ようにしておき、もう一端は他端に挿入された塩基数と
同数の塩基配列が削除されるようにしておくことを特徴
とするＤＮＡの変異方法に関する。また、本発明は、少
なくとも認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素の
認識配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダ
イズし得る１本鎖の相補的な塩基配列を含有してなるオ
リゴヌクレオチドからなる前記変異方法に用いるための
アンカーに関する。
【０００８】また、本発明は、従来の変異法の問題点を
一挙に解決する新規な変異法であり、ランダムに切断さ
れたＤＮＡの切断箇所にアミノ酸をコードするコドンを
指定したコドン単位で変異させることができるものであ
り、本発明の方法によりランダムな位置のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換された変異蛋白質のライブラリーを簡
便に作成することができる。したがって、本発明は、本
発明の変異法によって製造される変異した遺伝子ライブ
ラリー、変異した蛋白質ライブラリーに関する。さら
に、本発明は、アンカー、好ましくは本発明のアンカー
として、塩基配列のわかっている２本鎖の領域と標的Ｄ
ＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズするための１本鎖
の塩基配列の部分とを有するアンカーを用いて、当該ア
ンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズす
るための１本鎖の塩基配列がランダムな種々の塩基配列
を有するアンカー群と１本鎖ＤＮＡとを接触させること
からなる末端の塩基配列が未知な１本鎖ＤＮＡにアンカ
ーを連結させる方法に関する。
一挙に解決する新規な変異法であり、ランダムに切断さ
れたＤＮＡの切断箇所にアミノ酸をコードするコドンを
指定したコドン単位で変異させることができるものであ
り、本発明の方法によりランダムな位置のアミノ酸が他
のアミノ酸に置換された変異蛋白質のライブラリーを簡
便に作成することができる。したがって、本発明は、本
発明の変異法によって製造される変異した遺伝子ライブ
ラリー、変異した蛋白質ライブラリーに関する。さら
に、本発明は、アンカー、好ましくは本発明のアンカー
として、塩基配列のわかっている２本鎖の領域と標的Ｄ
ＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズするための１本鎖
の塩基配列の部分とを有するアンカーを用いて、当該ア
ンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズす
るための１本鎖の塩基配列がランダムな種々の塩基配列
を有するアンカー群と１本鎖ＤＮＡとを接触させること
からなる末端の塩基配列が未知な１本鎖ＤＮＡにアンカ
ーを連結させる方法に関する。
【０００９】まず、本発明の変異法について説明する。
本発明の変異法では、ＤＮＡのランダムな位置の塩基を
任意の数だけ切り取り、その位置に任意の数の塩基を挿
入することができる。本発明者らは、本発明の変異法を
ランダムコドン変異法（random position codon mutati
on（ＲＰＣＭ））と命名したので、以下、本発明の変異
法をＲＰＣＭと略称することがある。図１は、本発明の
変異法の概要を示したものである。図１の上段に変異し
ようとするＤＮＡが示されている。まず、目的ＤＮＡを
ＰＣＲ法により増幅する（ステップＩ）。このとき、セ
ンス鎖のプライマーの５’末端をリン酸化しておく。次
に増幅したＤＮＡを環化し（ステップII）、Ｔ４ ＤＮ
Ａ合成酵素を用いてアンチセンス鎖のみを分解する（ス
テップIII）。続いて生成物である環状１本鎖センス鎖
ＤＮＡをランダムな１箇所で切断する（ステップIV）。
これにより、ランダムな位置で切断された１本鎖のＤＮ
Ａとなる。切断は酵素や物理的な手段によって行うこと
ができるので、特定の位置で切断されるのではなく、い
ろんな位置で切断された１本鎖のＤＮＡの混合物が得ら
れることになる。また、切断は、原則的には１個のＤＮ
Ａについて１箇所が切断される条件にすることが好まし
い。
本発明の変異法では、ＤＮＡのランダムな位置の塩基を
任意の数だけ切り取り、その位置に任意の数の塩基を挿
入することができる。本発明者らは、本発明の変異法を
ランダムコドン変異法（random position codon mutati
on（ＲＰＣＭ））と命名したので、以下、本発明の変異
法をＲＰＣＭと略称することがある。図１は、本発明の
変異法の概要を示したものである。図１の上段に変異し
ようとするＤＮＡが示されている。まず、目的ＤＮＡを
ＰＣＲ法により増幅する（ステップＩ）。このとき、セ
ンス鎖のプライマーの５’末端をリン酸化しておく。次
に増幅したＤＮＡを環化し（ステップII）、Ｔ４ ＤＮ
Ａ合成酵素を用いてアンチセンス鎖のみを分解する（ス
テップIII）。続いて生成物である環状１本鎖センス鎖
ＤＮＡをランダムな１箇所で切断する（ステップIV）。
これにより、ランダムな位置で切断された１本鎖のＤＮ
Ａとなる。切断は酵素や物理的な手段によって行うこと
ができるので、特定の位置で切断されるのではなく、い
ろんな位置で切断された１本鎖のＤＮＡの混合物が得ら
れることになる。また、切断は、原則的には１個のＤＮ
Ａについて１箇所が切断される条件にすることが好まし
い。
【００１０】次に元のＤＮＡの全長の長さを有する１本
鎖ＤＮＡを集め、１本鎖のＤＮＡの両端にアンカーＤＮ
Ａを連結させる（ステップＶ）。アンカーの２本鎖部分
の塩基配列はわかっているので、この配列に基づいてＰ
ＣＲにより増幅する（ステップVI）。そして、認識配列
の外側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてＤＮＡを切
断（ステップVII）することで、片側の末端に特定の配
列を挿入し、もう一方は指定した数の塩基を削除する。
ここで挿入配列と削除塩基数は、ステップＶのアンカー
の種類によって任意に決めることができる。最後に、末
端を平滑化したのち再び環化し（ステップVIII）、変異
ＤＮＡを得る。図１の灰色部分は新たに挿入された塩基
配列部分を示している。この方法により、ランダムな位
置に指定した塩基配列が置換された（図１の灰色部分）
変異ＤＮＡのライブラリーが作成される。この変異ＤＮ
Ａのライブラリーを用いて、通常の方法により蛋白質を
発現させると、変異蛋白質のライブラリーを得ることが
できる。図１の下段にはこの方法により得られた変異蛋
白質のライブラリーが示されている（灰色部分が置換さ
れた他のアミノ酸を示す。）。
鎖ＤＮＡを集め、１本鎖のＤＮＡの両端にアンカーＤＮ
Ａを連結させる（ステップＶ）。アンカーの２本鎖部分
の塩基配列はわかっているので、この配列に基づいてＰ
ＣＲにより増幅する（ステップVI）。そして、認識配列
の外側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてＤＮＡを切
断（ステップVII）することで、片側の末端に特定の配
列を挿入し、もう一方は指定した数の塩基を削除する。
ここで挿入配列と削除塩基数は、ステップＶのアンカー
の種類によって任意に決めることができる。最後に、末
端を平滑化したのち再び環化し（ステップVIII）、変異
ＤＮＡを得る。図１の灰色部分は新たに挿入された塩基
配列部分を示している。この方法により、ランダムな位
置に指定した塩基配列が置換された（図１の灰色部分）
変異ＤＮＡのライブラリーが作成される。この変異ＤＮ
Ａのライブラリーを用いて、通常の方法により蛋白質を
発現させると、変異蛋白質のライブラリーを得ることが
できる。図１の下段にはこの方法により得られた変異蛋
白質のライブラリーが示されている（灰色部分が置換さ
れた他のアミノ酸を示す。）。
【００１１】図２にステップＩ及びステップIIをより具
体的に例示する。ステップＩのＰＣＲ法のためにアンチ
センスプライマーＷ３（図２では、上段右端の斜線部及
び灰色部分を有する四角印で示されている。）、５’−
をリン酸化したセンスプライマーＶ２（図２では、上段
右から２番目に縦線の四角印で示されている。）、及び
アンチセンスプライマーＷ２（図２では、上段右から３
番目に斜線の四角印で示されている。）、５’−をリン
酸化したセンスプライマーＶ３（（図２では、上段左端
の縦線部及び黒色部分を有する四角印で示されてい
る。）を用いた。プライマーＷ２及びＶ２は標的のＤＮ
Ａの末端塩基配列に相補的な配列である。また、プライ
マーＷ３及びＶ３は、プライマーＷ２及びＶ２の塩基配
列を含有している。標的ＤＮＡとして緑色蛍光蛋白質
（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡを用いた場合のプライマ
ーＶ３及びＷ３の塩基配列を例示する。
体的に例示する。ステップＩのＰＣＲ法のためにアンチ
センスプライマーＷ３（図２では、上段右端の斜線部及
び灰色部分を有する四角印で示されている。）、５’−
をリン酸化したセンスプライマーＶ２（図２では、上段
右から２番目に縦線の四角印で示されている。）、及び
アンチセンスプライマーＷ２（図２では、上段右から３
番目に斜線の四角印で示されている。）、５’−をリン
酸化したセンスプライマーＶ３（（図２では、上段左端
の縦線部及び黒色部分を有する四角印で示されてい
る。）を用いた。プライマーＷ２及びＶ２は標的のＤＮ
Ａの末端塩基配列に相補的な配列である。また、プライ
マーＷ３及びＶ３は、プライマーＷ２及びＶ２の塩基配
列を含有している。標的ＤＮＡとして緑色蛍光蛋白質
（ＧＦＰ）をコードするＤＮＡを用いた場合のプライマ
ーＶ３及びＷ３の塩基配列を例示する。
【００１２】 Ｖ３： 5'P-acctgctgcatcg-ccatgattacgaattcg Ｗ３： attcgaaccgtgacc-tggacgacgtagc-5'-OH 下線部は、両者で相補的な塩基配列となっている部分で
ある。上段のＶ３の相補的配列部分を図２では黒色四角
で示しており、下段の相補的配列部分を図２では灰色四
角で示している。これらのプライマーを用いてＰＣＲに
より図２の（１）及び（２）の２本鎖ＤＮＡを製造す
る。ＰＣＲの詳細を図２の中段に示している。これを環
化すると、図２の（３’）及び（４’）として示される
２本鎖環状ＤＮＡが得られる。この２本鎖環状ＤＮＡの
アンチセンス鎖は５’−末端がリン酸化されていないの
で、５’−末端において開裂した環となっている。この
２本鎖環状ＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡ合成酵素を用いてア
ンチセンス鎖のみを分解し（ステップIII）、続いて生
成物である環状１本鎖センス鎖ＤＮＡをランダムな１箇
所で切断し（ステップIV）、これにより、ランダムな位
置で切断された１本鎖のＤＮＡが得られる。
ある。上段のＶ３の相補的配列部分を図２では黒色四角
で示しており、下段の相補的配列部分を図２では灰色四
角で示している。これらのプライマーを用いてＰＣＲに
より図２の（１）及び（２）の２本鎖ＤＮＡを製造す
る。ＰＣＲの詳細を図２の中段に示している。これを環
化すると、図２の（３’）及び（４’）として示される
２本鎖環状ＤＮＡが得られる。この２本鎖環状ＤＮＡの
アンチセンス鎖は５’−末端がリン酸化されていないの
で、５’−末端において開裂した環となっている。この
２本鎖環状ＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡ合成酵素を用いてア
ンチセンス鎖のみを分解し（ステップIII）、続いて生
成物である環状１本鎖センス鎖ＤＮＡをランダムな１箇
所で切断し（ステップIV）、これにより、ランダムな位
置で切断された１本鎖のＤＮＡが得られる。
【００１３】得られた１本鎖のＤＮＡの処理について、
制限酵素の認識配列として制限酵素ＢｃｉVIの認識配列
（ｇｔａｔｃｃ）を、挿入される塩基配列として４塩基
のｃｇｇｔを用いた場合の具体例により、詳細に説明す
る。図３はこの具体例によりステップＶ〜ステップVII
を説明するためのものである。図３の太線は、ランダム
に切断されたＤＮＡを示す。ＤＮＡの５’−末端に５’
−末端用のアンカーを連結させる。図３の５’−末端用
のアンカーのＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨは、標的ＤＮ
Ａの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補
的な塩基配列を示している。このアンカーは挿入される
塩基配列ｃｇｇｔ、及び，制限酵素ＢｃｉVIの認識配列
（ｇｔａｔｃｃ）を含有している。また、ＤＮＡの３’
末端用のアンカー（図３の上〜２段目）は３’−ＮＨ２
−ＮＮ・・・Ｎで示される標的ＤＮＡの末端塩基配列と
ハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列、及び
制限酵素ＢｃｉVIの認識配列（ｇｔａｔｃｃ）を含有し
ている。
制限酵素の認識配列として制限酵素ＢｃｉVIの認識配列
（ｇｔａｔｃｃ）を、挿入される塩基配列として４塩基
のｃｇｇｔを用いた場合の具体例により、詳細に説明す
る。図３はこの具体例によりステップＶ〜ステップVII
を説明するためのものである。図３の太線は、ランダム
に切断されたＤＮＡを示す。ＤＮＡの５’−末端に５’
−末端用のアンカーを連結させる。図３の５’−末端用
のアンカーのＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨは、標的ＤＮ
Ａの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補
的な塩基配列を示している。このアンカーは挿入される
塩基配列ｃｇｇｔ、及び，制限酵素ＢｃｉVIの認識配列
（ｇｔａｔｃｃ）を含有している。また、ＤＮＡの３’
末端用のアンカー（図３の上〜２段目）は３’−ＮＨ２
−ＮＮ・・・Ｎで示される標的ＤＮＡの末端塩基配列と
ハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列、及び
制限酵素ＢｃｉVIの認識配列（ｇｔａｔｃｃ）を含有し
ている。
【００１４】両末端にアンカーが連結されたＤＮＡをＰ
ＣＲにより増幅し（ステップVI）、次いで制限酵素Ｂｃ
ｉVIで切断する。制限酵素ＢｃｉVIは、認識配列の外側
でＤＮＡを切断する制限酵素であり、認識配列（ｇｔａ
ｔｃｃ）の６塩基外側、即ちこの例では挿入される塩基
配列ｃｇｇｔの直前で切断される。切断面は平滑端では
ないので、後でこれを平滑化する。また、３’−末端用
のアンカーは３塩基のダミー配列を有しているから、標
的ＤＮＡに３塩基分くい込んで切断されることになる。
この切断面を平滑化すると、元のＤＮＡから３塩基分が
削除されたことになる。３塩基はコドンを形成するもの
である。したがって、この結果元のＤＮＡの５’−末端
側に４塩基が付加され、３’−末端側からコドンの３塩
基分が削除されることになる。つまり、この例では、天
然のアミノ酸のコドンが削除され、当該コドンが存在し
ていた一に非天然アミノ酸のコドンである４塩基が挿入
されることになる。
ＣＲにより増幅し（ステップVI）、次いで制限酵素Ｂｃ
ｉVIで切断する。制限酵素ＢｃｉVIは、認識配列の外側
でＤＮＡを切断する制限酵素であり、認識配列（ｇｔａ
ｔｃｃ）の６塩基外側、即ちこの例では挿入される塩基
配列ｃｇｇｔの直前で切断される。切断面は平滑端では
ないので、後でこれを平滑化する。また、３’−末端用
のアンカーは３塩基のダミー配列を有しているから、標
的ＤＮＡに３塩基分くい込んで切断されることになる。
この切断面を平滑化すると、元のＤＮＡから３塩基分が
削除されたことになる。３塩基はコドンを形成するもの
である。したがって、この結果元のＤＮＡの５’−末端
側に４塩基が付加され、３’−末端側からコドンの３塩
基分が削除されることになる。つまり、この例では、天
然のアミノ酸のコドンが削除され、当該コドンが存在し
ていた一に非天然アミノ酸のコドンである４塩基が挿入
されることになる。
【００１５】次に、配列が未知な１本鎖ＤＮＡへのアン
カー連結法について説明する。ｍＲＮＡを逆転写して得
られるｃＤＮＡの３’末端の配列が未知な場合、そのｃ
ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅するためには、３’末端に
プライマーとなる配列既知のオリゴＤＮＡ（アンカー）
を付加する必要がある。これまでは、主に次の２種の方
法が使用されてきた。（１）鋳型なしでＤＮＡ鎖を延長
する酵素（ターミナルデオキシリボトランスフェラー
ゼ）を用いて、ｃＤＮＡの３’末端に単一塩基からなる
オリゴＤＮＡ（アンカー）を付加する。この場合は特定
の配列を付加することはできない。（２）ＲＮＡリガー
ゼを用いて、一本鎖オリゴＤＮＡ（アンカー）を連結す
る。この場合、ＲＮＡリガーゼのＤＮＡに対する活性が
低いことが欠点である。
カー連結法について説明する。ｍＲＮＡを逆転写して得
られるｃＤＮＡの３’末端の配列が未知な場合、そのｃ
ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅するためには、３’末端に
プライマーとなる配列既知のオリゴＤＮＡ（アンカー）
を付加する必要がある。これまでは、主に次の２種の方
法が使用されてきた。（１）鋳型なしでＤＮＡ鎖を延長
する酵素（ターミナルデオキシリボトランスフェラー
ゼ）を用いて、ｃＤＮＡの３’末端に単一塩基からなる
オリゴＤＮＡ（アンカー）を付加する。この場合は特定
の配列を付加することはできない。（２）ＲＮＡリガー
ゼを用いて、一本鎖オリゴＤＮＡ（アンカー）を連結す
る。この場合、ＲＮＡリガーゼのＤＮＡに対する活性が
低いことが欠点である。
【００１６】このような従来法による欠点を解消し、末
端が未知な一本鎖ＤＮＡへの効率的かつ、簡便な連結法
を提供することも本発明の目的のひとつである。本発明
は、片方の３’−末端に約１０塩基のランダム配列を突
出させた二本鎖オリゴＤＮＡ（アンカー）により、この
突出したランダム塩基配列と、配列が未知な一本鎖ＤＮ
Ａの３’−末端とが相補鎖を形成して、リガーゼによる
連結反応が行われる。この時、アンカー同士の連結反応
を避けるために、３’末端を保護しておく（図４参
照）。また、同様の原理により、アンカーの片方の５’
−端にランダム塩基配列を突出させることで、５’末端
配列が未知の一本鎖ＤＮＡへの連結も可能となる。この
時もアンカー同士の連結反応を避けるために、突出させ
た５’−末端をリン酸化しないなどして保護しておく
（図５参照）。
端が未知な一本鎖ＤＮＡへの効率的かつ、簡便な連結法
を提供することも本発明の目的のひとつである。本発明
は、片方の３’−末端に約１０塩基のランダム配列を突
出させた二本鎖オリゴＤＮＡ（アンカー）により、この
突出したランダム塩基配列と、配列が未知な一本鎖ＤＮ
Ａの３’−末端とが相補鎖を形成して、リガーゼによる
連結反応が行われる。この時、アンカー同士の連結反応
を避けるために、３’末端を保護しておく（図４参
照）。また、同様の原理により、アンカーの片方の５’
−端にランダム塩基配列を突出させることで、５’末端
配列が未知の一本鎖ＤＮＡへの連結も可能となる。この
時もアンカー同士の連結反応を避けるために、突出させ
た５’−末端をリン酸化しないなどして保護しておく
（図５参照）。
【００１７】図４にＤＮＡの３’末端の塩基配列が未知
の場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要を
示す。まず、アンカーの２本鎖部分（この塩基配列はわ
かっている。図４では太線で示している。）に、標的Ｄ
ＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相
補的な塩基配列（図４ではＮＮＮＮ・・・で示してい
る。）を結合するのであるが、標的ＤＮＡの３’−末端
の塩基配列が未知であるためにこの塩基配列を決定する
ことができない。そこで、標的ＤＮＡの末端塩基配列と
ハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列とし
て、ランダムな配列を有する混合物を用意する。ランダ
ムな配列を有するアンカーの混合物を標的ＤＮＡと接触
させると、その混合物中のアンカーのうち標的ＤＮＡと
相補的な配列を有するアンカーのみがハイブリダイズ
し、次のＰＣＲを適用することができるようになる。
の場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要を
示す。まず、アンカーの２本鎖部分（この塩基配列はわ
かっている。図４では太線で示している。）に、標的Ｄ
ＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相
補的な塩基配列（図４ではＮＮＮＮ・・・で示してい
る。）を結合するのであるが、標的ＤＮＡの３’−末端
の塩基配列が未知であるためにこの塩基配列を決定する
ことができない。そこで、標的ＤＮＡの末端塩基配列と
ハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列とし
て、ランダムな配列を有する混合物を用意する。ランダ
ムな配列を有するアンカーの混合物を標的ＤＮＡと接触
させると、その混合物中のアンカーのうち標的ＤＮＡと
相補的な配列を有するアンカーのみがハイブリダイズ
し、次のＰＣＲを適用することができるようになる。
【００１８】図５は、ＤＮＡの５’末端の塩基配列が未
知の場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要
を示す。その手法は基本的には前記した３’−末端の場
合と同様である。そして、ここで重要なことは、アンカ
ー同士の連結反応を避けるために、３’−末端用のアン
カーのランダム配列の３’−末端をアミノ化などにより
保護しておき、また、５’−末端用のアンカーのランダ
ム配列の５’−末端をリン酸化しないなどの方法により
保護しておくことである。
知の場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要
を示す。その手法は基本的には前記した３’−末端の場
合と同様である。そして、ここで重要なことは、アンカ
ー同士の連結反応を避けるために、３’−末端用のアン
カーのランダム配列の３’−末端をアミノ化などにより
保護しておき、また、５’−末端用のアンカーのランダ
ム配列の５’−末端をリン酸化しないなどの方法により
保護しておくことである。
【００１９】本発明の配列が未知な１本鎖ＤＮＡへのア
ンカーの連結法は、これをＰＣＲのために単独で使用す
ることもできるが、アンカーとして本発明の前記した変
異法に使用するアンカーに用いることにより、変異させ
ようとする標的ＤＮＡの末端塩基が未知のものであって
も、本発明の変異法を適用することが可能となる。
ンカーの連結法は、これをＰＣＲのために単独で使用す
ることもできるが、アンカーとして本発明の前記した変
異法に使用するアンカーに用いることにより、変異させ
ようとする標的ＤＮＡの末端塩基が未知のものであって
も、本発明の変異法を適用することが可能となる。
【００２０】次に、変異を導入する蛋白質として緑色蛍
光蛋白質（ＧＦＰ）を用いた例により本発明をさらに詳
細に説明する。この遺伝子に４塩基変異が導入される
と、そのままではコドンの読み枠がずれ蛍光が消失す
る。そこで作成した遺伝子を大腸菌に導入し、コロニー
の蛍光を観察することにより、変異体の作成を確認する
ことができる。このＧＦＰ遺伝子を前記したプライマー
を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡ（図
２の（１）及び（２）のタイプのもの）を、９４℃で熱
変性し、７４℃で再アニーリングした。この処理により
図２の（１）、（２）、（３）、及び（４）のタイプの
ＤＮＡが生成する。ヘテロハイブリッドの（３）及び
（４）は、２本鎖の５’末端側に１３塩基が突出してい
る。この相補鎖の突出に基づいて、低温でのアニーリン
グ及びセンス鎖におけるＴａｑＤＮＡリガーゼ処理によ
り環状２本鎖ＤＮＡが生成する。この環状２本鎖ＤＮＡ
（３’）及び（４’）は、アンチセンス鎖において非結
合部（nick）を含有している。環状２本鎖ＤＮＡ
（３’）及び（４’）の収率を向上させるために、この
処理を４サイクル行った。その結果を図６に図面に代わ
る写真で示す。図６のレーンＭはＤＮＡマーカーであ
り、レーン１は反応前の２本鎖の鎖状ＤＮＡであり、レ
ーン２はＴａｑＤＮＡリガーゼ処理なしで４サイクルを
行った後のものであり、レーン３はＴａｑＤＮＡリガー
ゼの存在下で４サイクルを行った後のものである。いず
れも、４Ｍ尿素中で５０℃で３０秒加熱し、８Ｍ／４％
ＰＡＧＥで分析した結果である。レーン３の上部に２本
鎖環状ＤＮＡのバンドを観察することができた。環状２
本鎖ＤＮＡの多量の生成はＴａｑＤＮＡリガーゼを添加
した場合であった（図６のレーン３参照）。
光蛋白質（ＧＦＰ）を用いた例により本発明をさらに詳
細に説明する。この遺伝子に４塩基変異が導入される
と、そのままではコドンの読み枠がずれ蛍光が消失す
る。そこで作成した遺伝子を大腸菌に導入し、コロニー
の蛍光を観察することにより、変異体の作成を確認する
ことができる。このＧＦＰ遺伝子を前記したプライマー
を用いてＰＣＲにより増幅した。増幅されたＤＮＡ（図
２の（１）及び（２）のタイプのもの）を、９４℃で熱
変性し、７４℃で再アニーリングした。この処理により
図２の（１）、（２）、（３）、及び（４）のタイプの
ＤＮＡが生成する。ヘテロハイブリッドの（３）及び
（４）は、２本鎖の５’末端側に１３塩基が突出してい
る。この相補鎖の突出に基づいて、低温でのアニーリン
グ及びセンス鎖におけるＴａｑＤＮＡリガーゼ処理によ
り環状２本鎖ＤＮＡが生成する。この環状２本鎖ＤＮＡ
（３’）及び（４’）は、アンチセンス鎖において非結
合部（nick）を含有している。環状２本鎖ＤＮＡ
（３’）及び（４’）の収率を向上させるために、この
処理を４サイクル行った。その結果を図６に図面に代わ
る写真で示す。図６のレーンＭはＤＮＡマーカーであ
り、レーン１は反応前の２本鎖の鎖状ＤＮＡであり、レ
ーン２はＴａｑＤＮＡリガーゼ処理なしで４サイクルを
行った後のものであり、レーン３はＴａｑＤＮＡリガー
ゼの存在下で４サイクルを行った後のものである。いず
れも、４Ｍ尿素中で５０℃で３０秒加熱し、８Ｍ／４％
ＰＡＧＥで分析した結果である。レーン３の上部に２本
鎖環状ＤＮＡのバンドを観察することができた。環状２
本鎖ＤＮＡの多量の生成はＴａｑＤＮＡリガーゼを添加
した場合であった（図６のレーン３参照）。
【００２１】環状１本鎖ＤＮＡの製造には、Ｔ４ ＤＮ
Ａ ポリメラーゼを用いた。Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼ
は、３’から５’方向へのエキソヌクレアーゼ活性を有
することが知られている。このヌクレアーゼ活性を環状
２本鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖の分解に利用した。結果
を図７及び図８に図面に代わる写真で示す。図７は４％
ＰＡＧＥでの分析であり、図８は８Ｍ尿素４％ＰＡＧＥ
での分析結果である。各々、レーンＭ１はＤＮＡマーカ
ーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７８５
ｍｅｒ）であり、レーンＭ３は２本鎖ＤＮＡマーカー
（７５９ｂｐ）である。レーン１は反応前の環状２本鎖
ＤＮＡであり、レーン２はｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後の反応生成物であ
る。図７の最も上に見えるバンドが環状２本鎖ＤＮＡの
ものであり、その下に見えるのが環状１本鎖ＤＮＡのも
のであり、中ほどのものが鎖状の２本鎖ＤＮＡのバンド
である。図８では、最も上に見えるのが環状１本鎖ＤＮ
Ａであり、その下に見えるのが鎖状１本鎖ＤＮＡのバン
ドである。
Ａ ポリメラーゼを用いた。Ｔ４ＤＮＡ ポリメラーゼ
は、３’から５’方向へのエキソヌクレアーゼ活性を有
することが知られている。このヌクレアーゼ活性を環状
２本鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖の分解に利用した。結果
を図７及び図８に図面に代わる写真で示す。図７は４％
ＰＡＧＥでの分析であり、図８は８Ｍ尿素４％ＰＡＧＥ
での分析結果である。各々、レーンＭ１はＤＮＡマーカ
ーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７８５
ｍｅｒ）であり、レーンＭ３は２本鎖ＤＮＡマーカー
（７５９ｂｐ）である。レーン１は反応前の環状２本鎖
ＤＮＡであり、レーン２はｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後の反応生成物であ
る。図７の最も上に見えるバンドが環状２本鎖ＤＮＡの
ものであり、その下に見えるのが環状１本鎖ＤＮＡのも
のであり、中ほどのものが鎖状の２本鎖ＤＮＡのバンド
である。図８では、最も上に見えるのが環状１本鎖ＤＮ
Ａであり、その下に見えるのが鎖状１本鎖ＤＮＡのバン
ドである。
【００２２】ｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼでの処理により環状２本鎖ＤＮＡのバンド
は消失し、環状１本鎖ＤＮＡのバンドが出現している
（図７レーン２参照）。図８では、レーン１では、環状
の１本鎖ＤＮＡが観察されているが、ｄＮＴＰｓの不存
在下でのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後（レー
ン２）では鎖状のものが消失し、環状のものだけになっ
ている。このＰＡＧＥ分析の結果、センス鎖の環状１本
鎖ＤＮＡの調製に成功していることがわかった。
ポリメラーゼでの処理により環状２本鎖ＤＮＡのバンド
は消失し、環状１本鎖ＤＮＡのバンドが出現している
（図７レーン２参照）。図８では、レーン１では、環状
の１本鎖ＤＮＡが観察されているが、ｄＮＴＰｓの不存
在下でのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後（レー
ン２）では鎖状のものが消失し、環状のものだけになっ
ている。このＰＡＧＥ分析の結果、センス鎖の環状１本
鎖ＤＮＡの調製に成功していることがわかった。
【００２３】ランダムな位置で切断された１本鎖ＤＮＡ
のステップ５以降の概要を図９に示す。この例で用いた
５’−アンカーを次式で示す。
のステップ５以降の概要を図９に示す。この例で用いた
５’−アンカーを次式で示す。
【００２４】
【化１】
【００２５】（式中、Ｎは任意の塩基を示し、ｎは塩基
がｎ個続くことを示し、好ましくはｎは７、１０、１４
である。） この例で用いた３’−アンカーを次式で示す。
がｎ個続くことを示し、好ましくはｎは７、１０、１４
である。） この例で用いた３’−アンカーを次式で示す。
【００２６】
【化２】
【００２７】（式中、Ｎは任意の塩基を示し、ｎは塩基
がｎ個続くことを示し、好ましくはｎは７、１０、１４
である。） また、この実験のために使用したビオチン化配列を次式
がｎ個続くことを示し、好ましくはｎは７、１０、１４
である。） また、この実験のために使用したビオチン化配列を次式
【００２８】
【化３】
【００２９】（式中、Ｂｉｏｔｉｎはビオチンを示
す。） で示す。まず、ステップ５では、１本鎖ＤＮＡへのアン
カーの連結を行う。次に、これをＰＡＧＥにより精製し
てアンカーが連結された１本鎖ＤＮＡにする。これをス
テップ６でＰＣＲで増幅して、次いで、ステップ７で制
限酵素ＢｃｉVIで切断する。切断面をＴ４ ＤＮＡ ポ
リメラーゼを用いて平滑化すると、元の１本鎖ＤＮＡの
３’末端の３塩基が削除され、５’末端側にあらたに４
塩基が挿入されたＤＮＡがえられることになる。
す。） で示す。まず、ステップ５では、１本鎖ＤＮＡへのアン
カーの連結を行う。次に、これをＰＡＧＥにより精製し
てアンカーが連結された１本鎖ＤＮＡにする。これをス
テップ６でＰＣＲで増幅して、次いで、ステップ７で制
限酵素ＢｃｉVIで切断する。切断面をＴ４ ＤＮＡ ポ
リメラーゼを用いて平滑化すると、元の１本鎖ＤＮＡの
３’末端の３塩基が削除され、５’末端側にあらたに４
塩基が挿入されたＤＮＡがえられることになる。
【００３０】次に、ステップ５における、ランダムに切
断された環状１本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端へ
の、アンカーＤＮＡの連結についてモデル実験を行っ
た。配列が未知の１本鎖ＤＮＡの３’末端へのリンカー
ＤＮＡの連結については、アンカーＰＣＲ法、ＣＲＴＣ
（controlled ribonucleotide tailing of cDNA ends）
法、及びＳＬＩＣ（single strand ligation to ss-cDN
A）法などが知られている。しかし、アンカーＰＣＲ法
やＣＲＴＣ法では、ＤＮＡフラグメントの３’末端での
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
によるｄＧＴＰテイリングが必要である。ＳＬＩＣ法で
はしばしば反応が充分進行しない。そこで、本発明者ら
は、新規な方法を開発した。このモデル反応の概要を図
１０に示す。まず、最初の反応はＴＥＳＴアンカーを用
いた。ＴＥＳＴアンカーは、図１０の（ａ）に示される
ように、ＴＥＳＴＣＯと５’末端がリン酸化された又は
遊離のＯＨ基であるＴＥＳＴＮ７（ランダムなテイル部
分の塩基が７個ある。）からなっている。即ち、ＴＥＳ
ＴＮ７は、５’末端に７ｍｅｒのランダム配列からなる
テイルを有するものである。
断された環状１本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端へ
の、アンカーＤＮＡの連結についてモデル実験を行っ
た。配列が未知の１本鎖ＤＮＡの３’末端へのリンカー
ＤＮＡの連結については、アンカーＰＣＲ法、ＣＲＴＣ
（controlled ribonucleotide tailing of cDNA ends）
法、及びＳＬＩＣ（single strand ligation to ss-cDN
A）法などが知られている。しかし、アンカーＰＣＲ法
やＣＲＴＣ法では、ＤＮＡフラグメントの３’末端での
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
によるｄＧＴＰテイリングが必要である。ＳＬＩＣ法で
はしばしば反応が充分進行しない。そこで、本発明者ら
は、新規な方法を開発した。このモデル反応の概要を図
１０に示す。まず、最初の反応はＴＥＳＴアンカーを用
いた。ＴＥＳＴアンカーは、図１０の（ａ）に示される
ように、ＴＥＳＴＣＯと５’末端がリン酸化された又は
遊離のＯＨ基であるＴＥＳＴＮ７（ランダムなテイル部
分の塩基が７個ある。）からなっている。即ち、ＴＥＳ
ＴＮ７は、５’末端に７ｍｅｒのランダム配列からなる
テイルを有するものである。
【００３１】このアンカーは、アンカーのテイル部分の
ランダム配列と、ＴＥＳＴＮｎの１本鎖ＤＮＡ部分の
５’末端のランダム配列とが、相補的なペアーを形成し
てハイブリダイズする可能性がある。その可能性はきわ
めて低いと思われるが、可能性はある。そこで、まず、
これらの自己連結について実験した。Ｔ４ ＤＮＡ リ
ガーゼの存在下に５’−リン酸化アンカーを図１０の
（ａ）に示すように反応させた。結果を図１１の図面に
代わる写真で示す。図１１は、２０％ＰＡＧＥによる分
析結果である。レーンＭ１はＴ４ ＤＮＡ リガーゼの
不存在下（−Ｌｉｇ）での１μＭの５’−リン酸化ＴＥ
ＳＴアンカーの場合であり、レーンＭ２はＴ４ ＤＮＡ
リガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’−リ
ン酸化ＴＥＳＴアンカーの場合である。リガーゼの存在
下では、アンカー同士の自己連結が生じていることがわ
かった。
ランダム配列と、ＴＥＳＴＮｎの１本鎖ＤＮＡ部分の
５’末端のランダム配列とが、相補的なペアーを形成し
てハイブリダイズする可能性がある。その可能性はきわ
めて低いと思われるが、可能性はある。そこで、まず、
これらの自己連結について実験した。Ｔ４ ＤＮＡ リ
ガーゼの存在下に５’−リン酸化アンカーを図１０の
（ａ）に示すように反応させた。結果を図１１の図面に
代わる写真で示す。図１１は、２０％ＰＡＧＥによる分
析結果である。レーンＭ１はＴ４ ＤＮＡ リガーゼの
不存在下（−Ｌｉｇ）での１μＭの５’−リン酸化ＴＥ
ＳＴアンカーの場合であり、レーンＭ２はＴ４ ＤＮＡ
リガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’−リ
ン酸化ＴＥＳＴアンカーの場合である。リガーゼの存在
下では、アンカー同士の自己連結が生じていることがわ
かった。
【００３２】次に、図１０の（ｂ）に示されるように、
５’末端がＯＨ基であるＴＥＳＴアンカーを、５’末端
がリン酸化された種々の数のヌクレオチドからなるラン
ダム配列の１本鎖ＤＮＡと連結させる実験を行った。結
果を図１１に図面に代わる写真で示す。レーン１はリガ
ーゼの不存在下（−Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯ
Ｈ基のＴＥＳＴアンカーの場合であり、レーン２はリガ
ーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ
基のＴＥＳＴアンカーの場合であり、レーン３はリガー
ゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基
のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴ
Ｎ７の場合であり、レーン４はリガーゼの存在下（＋Ｌ
ｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカ
ーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ５の場合であ
り、レーン５はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μ
Ｍの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの
５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ９の場合であり、レーン６は
リガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端が
ＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化Ｒ
Ｖの場合である。上段のバンドは連結生成物を示し、下
段はアンカーのバンドを示す。
５’末端がＯＨ基であるＴＥＳＴアンカーを、５’末端
がリン酸化された種々の数のヌクレオチドからなるラン
ダム配列の１本鎖ＤＮＡと連結させる実験を行った。結
果を図１１に図面に代わる写真で示す。レーン１はリガ
ーゼの不存在下（−Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯ
Ｈ基のＴＥＳＴアンカーの場合であり、レーン２はリガ
ーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ
基のＴＥＳＴアンカーの場合であり、レーン３はリガー
ゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基
のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴ
Ｎ７の場合であり、レーン４はリガーゼの存在下（＋Ｌ
ｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカ
ーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ５の場合であ
り、レーン５はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μ
Ｍの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの
５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ９の場合であり、レーン６は
リガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端が
ＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化Ｒ
Ｖの場合である。上段のバンドは連結生成物を示し、下
段はアンカーのバンドを示す。
【００３３】５’末端をＯＨ基にしたアンカーは自己連
結しなかった（図１１のレーン２参照）。５’末端にラ
ンダムテイルを有する１本鎖ＤＮＡが添加された場合に
は、連結が生起した（図１１レーン３−５参照）。連結
はＴＥＳＴＮ７ＤＮＡの場合が最も効果的であった。こ
れは、このもののランダムテイルの長さが、アンカーの
テイルの長さと同じであったからであろう。しかし、連
結の有効性はＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳＴＮ５においても
顕著な低下はみられなかった。ＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳ
ＴＮ５における充分な連結は、部分的なハイブリダイズ
で連結には充分であり、完全なハイブリダイズは必要無
いことを示している。しかしながら、アンカーが５’末
端にランダムテイルを持っていないＲＶと連結しないと
いう事実は、連結にはハイブリダイズが必要であること
を示している。このモデル実験の結果は、アンカーＤＮ
Ａと５’及び３’末端にランダム配列を有する１本鎖Ｄ
ＮＡとの連結は、相補鎖を見出す可能性は低いが、各々
充分に効果的に生起することを示している。そして、こ
の方法は、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥによるクロー
ニング技術にも効果的に応用することができる。
結しなかった（図１１のレーン２参照）。５’末端にラ
ンダムテイルを有する１本鎖ＤＮＡが添加された場合に
は、連結が生起した（図１１レーン３−５参照）。連結
はＴＥＳＴＮ７ＤＮＡの場合が最も効果的であった。こ
れは、このもののランダムテイルの長さが、アンカーの
テイルの長さと同じであったからであろう。しかし、連
結の有効性はＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳＴＮ５においても
顕著な低下はみられなかった。ＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳ
ＴＮ５における充分な連結は、部分的なハイブリダイズ
で連結には充分であり、完全なハイブリダイズは必要無
いことを示している。しかしながら、アンカーが５’末
端にランダムテイルを持っていないＲＶと連結しないと
いう事実は、連結にはハイブリダイズが必要であること
を示している。このモデル実験の結果は、アンカーＤＮ
Ａと５’及び３’末端にランダム配列を有する１本鎖Ｄ
ＮＡとの連結は、相補鎖を見出す可能性は低いが、各々
充分に効果的に生起することを示している。そして、こ
の方法は、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥによるクロー
ニング技術にも効果的に応用することができる。
【００３４】次に、１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での
切断（ステップ４）、アンカーの連結（ステップ５）、
及びＰＣＲによる増幅（ステップ６）について述べる。
１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での切断は、ＤＮａｓｅ
Ｉを用いて２５℃で行った。結果を図１２の図面に代わ
る写真で示す。図１２のレーンＭ１はＤＮＡマーカーで
あり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７５９ｍｅ
ｒ）であり、レーン１は切断反応前の環状１本鎖ＤＮＡ
であり、レーン２はＤＮａｓｅＩによる切断反応の生成
物であり、レーン３はＮ７テイルを有するアンカーと鎖
状１本鎖ＤＮＡとの連結反応の生成物であり、レーン４
はＮ１０テイルを有するものとの反応生成物であり、レ
ーン５はＮ１４テイルを有するものとの反応生成物であ
る。全ての試料は、４Ｍ尿素中で３０秒、９５℃に加熱
され、８Ｍ尿素／４％ＰＡＧＥで分析された。ランダム
な位置での切断の結果は、未反応の環状１本鎖ＤＮＡを
伴うが鎖状の１本鎖ＤＮＡの生成が確認された（図１２
のレーン２参照）。このバンドは複数箇所で切断された
ものが検出されないことを示しており、このことは切断
が１箇所のみで生起していることを示した。
切断（ステップ４）、アンカーの連結（ステップ５）、
及びＰＣＲによる増幅（ステップ６）について述べる。
１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での切断は、ＤＮａｓｅ
Ｉを用いて２５℃で行った。結果を図１２の図面に代わ
る写真で示す。図１２のレーンＭ１はＤＮＡマーカーで
あり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７５９ｍｅ
ｒ）であり、レーン１は切断反応前の環状１本鎖ＤＮＡ
であり、レーン２はＤＮａｓｅＩによる切断反応の生成
物であり、レーン３はＮ７テイルを有するアンカーと鎖
状１本鎖ＤＮＡとの連結反応の生成物であり、レーン４
はＮ１０テイルを有するものとの反応生成物であり、レ
ーン５はＮ１４テイルを有するものとの反応生成物であ
る。全ての試料は、４Ｍ尿素中で３０秒、９５℃に加熱
され、８Ｍ尿素／４％ＰＡＧＥで分析された。ランダム
な位置での切断の結果は、未反応の環状１本鎖ＤＮＡを
伴うが鎖状の１本鎖ＤＮＡの生成が確認された（図１２
のレーン２参照）。このバンドは複数箇所で切断された
ものが検出されないことを示しており、このことは切断
が１箇所のみで生起していることを示した。
【００３５】アンカーの連結は、５’アンカー及び３’
アンカーのペアーを用いて行われた。ランダムテイルと
して、異なる長さのものを用いた（ｎ＝７、１０、１
４）。３’テイルの３’末端は自己連結を防止するため
にアミノ基でブロックされた。連結反応の結果を前記図
１２のレーン３−５に示す。いずれのアンカーを使用し
た場合も鎖状の１本鎖ＤＮＡのバンドが次第に弱くなっ
て来た。これはアンカーとの連結が生起したためであ
る。アンカーが連結した１本鎖ＤＮＡを回収し、５’ビ
オチン化３ＣＯプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
増幅した結果を図１３に図面に代わる写真で示す。図１
３は４％ＰＡＧＥ上での分析結果である。図１３の、レ
ーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖
ＤＮＡマーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切
断反応前の環状１本鎖ＤＮＡであり、各々レーン１は１
５サイクルのものであり、レーン２は１８サイクルであ
り、レーン３は２１サイクルのものであり、レーン４は
２４サイクルである。図１３の左側はＮ７テイルを有す
るアンカーの場合であり、中央はＮ１０テイルを有する
アンカーの場合であり、右側はＮ１４テイルを有するア
ンカーの場合である。Ｎ１０テイルを有するアンカー
が、Ｎ７やＮ１４テイルのものよりも早く反応した。こ
の結果はＮ１０テイルがもっとも好ましいことを示して
いる。
アンカーのペアーを用いて行われた。ランダムテイルと
して、異なる長さのものを用いた（ｎ＝７、１０、１
４）。３’テイルの３’末端は自己連結を防止するため
にアミノ基でブロックされた。連結反応の結果を前記図
１２のレーン３−５に示す。いずれのアンカーを使用し
た場合も鎖状の１本鎖ＤＮＡのバンドが次第に弱くなっ
て来た。これはアンカーとの連結が生起したためであ
る。アンカーが連結した１本鎖ＤＮＡを回収し、５’ビ
オチン化３ＣＯプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
増幅した結果を図１３に図面に代わる写真で示す。図１
３は４％ＰＡＧＥ上での分析結果である。図１３の、レ
ーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖
ＤＮＡマーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切
断反応前の環状１本鎖ＤＮＡであり、各々レーン１は１
５サイクルのものであり、レーン２は１８サイクルであ
り、レーン３は２１サイクルのものであり、レーン４は
２４サイクルである。図１３の左側はＮ７テイルを有す
るアンカーの場合であり、中央はＮ１０テイルを有する
アンカーの場合であり、右側はＮ１４テイルを有するア
ンカーの場合である。Ｎ１０テイルを有するアンカー
が、Ｎ７やＮ１４テイルのものよりも早く反応した。こ
の結果はＮ１０テイルがもっとも好ましいことを示して
いる。
【００３６】次に制限酵素ＢｃｉVIでの切断（ステップ
７）及び環化（ステップ８）について説明する。ＰＣＲ
産物をＢｃｉVIで切断した。この酵素は、認識配列の外
側を切断する。この例では図３に示される箇所で切断さ
れ、元の１本鎖ＤＮＡの５’末端に４塩基を挿入し、
３’末端から３塩基を削除する。生成物を精製して、Ｔ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて切断面を平滑化し
た。次いで、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼで処理して環化さ
せた。
７）及び環化（ステップ８）について説明する。ＰＣＲ
産物をＢｃｉVIで切断した。この酵素は、認識配列の外
側を切断する。この例では図３に示される箇所で切断さ
れ、元の１本鎖ＤＮＡの５’末端に４塩基を挿入し、
３’末端から３塩基を削除する。生成物を精製して、Ｔ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて切断面を平滑化し
た。次いで、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼで処理して環化さ
せた。
【００３７】以上の操作により、ランダムに選択された
連続する３塩基が、４塩基で置換された変異ＧＦＰ遺伝
子を得た。
連続する３塩基が、４塩基で置換された変異ＧＦＰ遺伝
子を得た。
【００３８】得られた変異ＧＦＰ遺伝子をＰＣＲで増幅
し、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII
サイトにクローニングした。約５０，０００のコロニー
が得られ、その約９０％が蛍光を示さなかった。蛍光を
失ったのはコドンの変異が生起しているからである。蛍
光を示さないコロニーを採取し、２つのコロニーからプ
ラスミドを精製し、配列を決定した。この変異ＤＮＡか
ら、連続した３塩基からなるコドンがｇｇｇの３塩基で
置換されていることが見出された。４塩基中の最初の塩
基ｃが脱落しており、これは、ステップ７における平滑
化にためのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性のためであると考えられる。したがって、Ｔ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼの使用量を最適化することに
より塩基ｃの脱落を防止することができると考えられ
る。このように、本発明の方法は、コドンを置換した変
異体を製造する方法として極めて有用であることがわか
った。
し、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII
サイトにクローニングした。約５０，０００のコロニー
が得られ、その約９０％が蛍光を示さなかった。蛍光を
失ったのはコドンの変異が生起しているからである。蛍
光を示さないコロニーを採取し、２つのコロニーからプ
ラスミドを精製し、配列を決定した。この変異ＤＮＡか
ら、連続した３塩基からなるコドンがｇｇｇの３塩基で
置換されていることが見出された。４塩基中の最初の塩
基ｃが脱落しており、これは、ステップ７における平滑
化にためのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼのエキソヌクレ
アーゼ活性のためであると考えられる。したがって、Ｔ
４ ＤＮＡ ポリメラーゼの使用量を最適化することに
より塩基ｃの脱落を防止することができると考えられ
る。このように、本発明の方法は、コドンを置換した変
異体を製造する方法として極めて有用であることがわか
った。
【００３９】つぎに環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダム
に行われたか否かを検証した。ＤＮａｓｅＩは、１本鎖
ＤＮＡをランダムな位置で切断する酵素であることが知
られている。切断のランダムさを図１４の（ａ）に示す
方法で検証した。実験に使用した遺伝子はＥｃｏＲＩに
よる切断位置を１箇所のみ有するので、これらのＤＮＡ
をＥｃｏＲＩで切断した。もし、ランダムに切断されて
いたならば、ＥｃｏＲＩによる切断で種々の長さのＤＮ
Ａフラグメントが生じるはずである（図１４（ａ）参
照）。結果を図１４の（ｂ）に図面に代わる写真で示
す。図１４の（ｂ）のレーンＭ１はＤＮＡマーカーであ
り、レーン１及びレーン３はステップ６におけるＰＣＲ
産物であり、レーン２及び４はそのＰＣＲ産物をＥｃｏ
ＲＩで切断したものである。レーン１及び２は１μＬの
場合であり、レーン３及び４は４０μＬの場合である。
その結果、ＥｃｏＲＩによる消化で、ＰＣＲ産物のシン
グルバンドが消失し、多数のバンドが生じていることが
わかった。
に行われたか否かを検証した。ＤＮａｓｅＩは、１本鎖
ＤＮＡをランダムな位置で切断する酵素であることが知
られている。切断のランダムさを図１４の（ａ）に示す
方法で検証した。実験に使用した遺伝子はＥｃｏＲＩに
よる切断位置を１箇所のみ有するので、これらのＤＮＡ
をＥｃｏＲＩで切断した。もし、ランダムに切断されて
いたならば、ＥｃｏＲＩによる切断で種々の長さのＤＮ
Ａフラグメントが生じるはずである（図１４（ａ）参
照）。結果を図１４の（ｂ）に図面に代わる写真で示
す。図１４の（ｂ）のレーンＭ１はＤＮＡマーカーであ
り、レーン１及びレーン３はステップ６におけるＰＣＲ
産物であり、レーン２及び４はそのＰＣＲ産物をＥｃｏ
ＲＩで切断したものである。レーン１及び２は１μＬの
場合であり、レーン３及び４は４０μＬの場合である。
その結果、ＥｃｏＲＩによる消化で、ＰＣＲ産物のシン
グルバンドが消失し、多数のバンドが生じていることが
わかった。
【００４０】緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を用いた同様な
実験を行った。この遺伝子に４塩基変異が導入される
と、そのままではコドンの読み枠がずれ蛍光が消失す
る。そこで作成した遺伝子を大腸菌に導入し、コロニー
の蛍光を観察した。その結果、約８０％のコロニーの蛍
光が消失していることから、効率よく変異が導入できた
ことがわかった。次に蛍光の消失した４個のコロニーか
らプラスミドを抽出し、変異ＧＦＰ遺伝子の塩基配列を
決定したところ、２／４の効率でＣＧＧＴ変異が導入さ
れていた。この結果を図１５に示す。この新規変異法を
用いることで、非天然アミノ酸を導入した蛋白質ライブ
ラリーを作成するためのＤＮＡライブラリーが作成でき
た。さらに本変異法は、削除する塩基の数、挿入する塩
基の数及び配列を任意に設定できるため、ＤＮＡ組換え
法における新手法として、様々な分野での応用が期待さ
れる。
実験を行った。この遺伝子に４塩基変異が導入される
と、そのままではコドンの読み枠がずれ蛍光が消失す
る。そこで作成した遺伝子を大腸菌に導入し、コロニー
の蛍光を観察した。その結果、約８０％のコロニーの蛍
光が消失していることから、効率よく変異が導入できた
ことがわかった。次に蛍光の消失した４個のコロニーか
らプラスミドを抽出し、変異ＧＦＰ遺伝子の塩基配列を
決定したところ、２／４の効率でＣＧＧＴ変異が導入さ
れていた。この結果を図１５に示す。この新規変異法を
用いることで、非天然アミノ酸を導入した蛋白質ライブ
ラリーを作成するためのＤＮＡライブラリーが作成でき
た。さらに本変異法は、削除する塩基の数、挿入する塩
基の数及び配列を任意に設定できるため、ＤＮＡ組換え
法における新手法として、様々な分野での応用が期待さ
れる。
【００４１】
【発明の実施の形態】本発明のアンカーとしては、少な
くとも制限酵素の認識配列、挿入される塩基配列、及び
標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本
鎖の相補的な塩基配列（テイル）を含有しているもので
あり、これと対をなすアンカーは少なくとも制限酵素の
認識配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダ
イズし得る１本鎖の相補的な塩基配列（テイル）を含有
していればよい。本発明はこのようなアンカーの対（ア
ンカーセット）を提供するものでもある。そして、アン
カーは、さらにＰＣＲ用のプライマー領域を含有するも
のであるが、このプライマー領域は他の塩基配列と重複
して使用することができる。制限酵素の認識配列として
は６塩基でも４塩基でもよいが、認識配列の外側でＤＮ
Ａを切断することが必要である。認識配列の中で切断さ
れる場合には挿入される塩基が認識配列の中の塩基とな
り、任意の塩基配列を選択することができなくなるから
である。認識配列の中の塩基配列を挿入しようとする場
合には、認識配列の中でＤＮＡを切断する制限酵素を使
用することも可能ではある。
くとも制限酵素の認識配列、挿入される塩基配列、及び
標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本
鎖の相補的な塩基配列（テイル）を含有しているもので
あり、これと対をなすアンカーは少なくとも制限酵素の
認識配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダ
イズし得る１本鎖の相補的な塩基配列（テイル）を含有
していればよい。本発明はこのようなアンカーの対（ア
ンカーセット）を提供するものでもある。そして、アン
カーは、さらにＰＣＲ用のプライマー領域を含有するも
のであるが、このプライマー領域は他の塩基配列と重複
して使用することができる。制限酵素の認識配列として
は６塩基でも４塩基でもよいが、認識配列の外側でＤＮ
Ａを切断することが必要である。認識配列の中で切断さ
れる場合には挿入される塩基が認識配列の中の塩基とな
り、任意の塩基配列を選択することができなくなるから
である。認識配列の中の塩基配列を挿入しようとする場
合には、認識配列の中でＤＮＡを切断する制限酵素を使
用することも可能ではある。
【００４２】挿入される塩基配列は、理論的には１塩基
以上であればよいが、コドン単位での変異を望む場合に
は、３塩基または４塩基からなるものが好ましい。天然
のアミノ酸による置換の場合には３塩基を非天然のアミ
ノ酸での置換の場合には４塩基にするのがよい。また、
標的となるＤＮＡには、特に制限波ないが、蛋白質をコ
ードしているＤＮＡが好ましい。これによりアミノ酸が
置換された変異蛋白質のライブリーを作成することがで
きる。
以上であればよいが、コドン単位での変異を望む場合に
は、３塩基または４塩基からなるものが好ましい。天然
のアミノ酸による置換の場合には３塩基を非天然のアミ
ノ酸での置換の場合には４塩基にするのがよい。また、
標的となるＤＮＡには、特に制限波ないが、蛋白質をコ
ードしているＤＮＡが好ましい。これによりアミノ酸が
置換された変異蛋白質のライブリーを作成することがで
きる。
【００４３】標的となるＤＮＡの末端にそのＤＮＡ中で
唯一の制限酵素切断配列を持っていない場合には、当該
ＤＮＡの末端に、当該ＤＮＡ中には無い塩基配列であっ
て、制限酵素により切断できる塩基配列を付加すること
が好ましい。本発明の方法で得られた変異ＤＮＡを用い
て常法によりアミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換され
た蛋白質を発現させることができる。この方法により天
然の蛋白質の１個又は一部のアミノ酸が他のアミノ酸又
は非天然のアミノ酸に置換された蛋白質を製造すること
ができる。最初に得られる変異ＤＮＡはランダムに置換
されているので、ランダムにアミノ酸が、他のアミノ酸
に置換された蛋白質のらいぶらりーを製造することがで
きる。また、その中の特定のＤＮＡを選択することによ
り、特定の蛋白質を特異的に製造することもできる。
唯一の制限酵素切断配列を持っていない場合には、当該
ＤＮＡの末端に、当該ＤＮＡ中には無い塩基配列であっ
て、制限酵素により切断できる塩基配列を付加すること
が好ましい。本発明の方法で得られた変異ＤＮＡを用い
て常法によりアミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換され
た蛋白質を発現させることができる。この方法により天
然の蛋白質の１個又は一部のアミノ酸が他のアミノ酸又
は非天然のアミノ酸に置換された蛋白質を製造すること
ができる。最初に得られる変異ＤＮＡはランダムに置換
されているので、ランダムにアミノ酸が、他のアミノ酸
に置換された蛋白質のらいぶらりーを製造することがで
きる。また、その中の特定のＤＮＡを選択することによ
り、特定の蛋白質を特異的に製造することもできる。
【００４４】このように本発明の方法は、特定のコドン
配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置の
塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン配
列に置き換えることを可能とする。また、２０種のアミ
ノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用いる
ことにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のアミ
ノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドン類の３塩基コドンを使用すること
による、蛋白質のアラニンスキャン、（ｄ）挿入配列と
して新しい制限酵素認識配列を導入することによる、蛋
白質のハイブリッド化やサーキュラー変異、（ｅ）ラン
ダムな任意の長さの挿入配列を用いることによる、蛋白
質のランダム挿入変異、（ｆ）欠失の長さを制御するこ
とによる、蛋白質のランダム欠失変異、などがあげられ
る。本方法はＤＮＡ組換え法における新手法として広い
範囲の研究や産業あるいは創薬の分野で応用できるもの
である。
配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置の
塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン配
列に置き換えることを可能とする。また、２０種のアミ
ノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用いる
ことにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のアミ
ノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドン類の３塩基コドンを使用すること
による、蛋白質のアラニンスキャン、（ｄ）挿入配列と
して新しい制限酵素認識配列を導入することによる、蛋
白質のハイブリッド化やサーキュラー変異、（ｅ）ラン
ダムな任意の長さの挿入配列を用いることによる、蛋白
質のランダム挿入変異、（ｆ）欠失の長さを制御するこ
とによる、蛋白質のランダム欠失変異、などがあげられ
る。本方法はＤＮＡ組換え法における新手法として広い
範囲の研究や産業あるいは創薬の分野で応用できるもの
である。
【００４５】
【実施例】次に実施例により本発明をより詳細に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
【００４６】実施例１ （プラスミドｐＵＧＦＰａの構
築） ＧＦＰ遺伝子を、プライマーとしてＧＦＰＥｃｏＧ及び
ＧＦＰＨｉｎを用いてＰｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼの
存在下、プラスミドｐＧＦＰＵＶからＰＣＲで増幅し
た。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで切断
して、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
Iサイトにクローン化した。
築） ＧＦＰ遺伝子を、プライマーとしてＧＦＰＥｃｏＧ及び
ＧＦＰＨｉｎを用いてＰｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼの
存在下、プラスミドｐＧＦＰＵＶからＰＣＲで増幅し
た。ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで切断
して、プラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄII
Iサイトにクローン化した。
【００４７】実施例２ （環状２本鎖ＤＮＡの調製（ス
テップII）） プライマーＧＦＦＷ３（attcgaaccgtgacc-tggacgacgtag
c-5'-OH）及び５’−リン酸化したプライマーＧＦＲＶ
２、並びにプライマーＧＦＦＷ２（5'P-acctgctgcatcg-
ccatgattacgaattcg）及び５’−リン酸化したプライマ
ーＧＦＲＶ３のプライマーの組みを用いて、Ｐｆｘ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の４ＵのＰｆｘ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．３μＭのプ
ライマー、及び８０ｎｇのｐＵＧＦＰａを含有する反応
混合液８００μＬ中でパラレルＰＣＲを行った。ＰＣＲ
の温度サイクルは、（１）９４℃で１分間の変性（dena
turation）、（２）９４℃で１２秒、５０℃で３０秒、
及び６８℃で３０秒の２０サイクル、（３）６８℃で２
分間、であった。生成物をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キ
ットを用いて精製し、ＰＣＲ反応混合物４００μＬ毎に
水１００μＬで溶出した。溶出溶液のＤＮＡ濃度は吸光
度で決定した（２本鎖ＤＮＡの５０μｇ／ｍＬでＡ
２６０=１）。環化を、Ｔａｑ ＤＮＡ リガーゼ緩衝
液中の４００ＵＴａｑ ＤＮＡ リガーゼに各４．２μ
のＰＣＲ産物を含有する５００μＬの反応混合物中で行
った。温度サイクルは、（１）９４℃で１分間の変性
（denaturation）、（２）９４℃で１５秒、７０℃で２
分、及び４０℃で２分、及び４５℃で３０分の４サイク
ル、であった。結果を図６に示す。図６は、本発明のス
テップIIの環状２本鎖ＤＮＡの生成を確認する結果を示
す図面に代わる写真である。図６のレーンＭはＤＮＡマ
ーカーであり、レーン１は反応前の２本鎖の鎖状ＤＮＡ
であり、レーン２はＴａｑＤＮＡリガーゼ処理なしで４
サイクルを行った後のものであり、レーン３はＴａｑＤ
ＮＡリガーゼの存在下で４サイクルを行った後のもので
ある。いずれも、４Ｍ尿素中で５０℃で３０秒加熱し、
８Ｍ／４％ＰＡＧＥで分析した結果である。
テップII）） プライマーＧＦＦＷ３（attcgaaccgtgacc-tggacgacgtag
c-5'-OH）及び５’−リン酸化したプライマーＧＦＲＶ
２、並びにプライマーＧＦＦＷ２（5'P-acctgctgcatcg-
ccatgattacgaattcg）及び５’−リン酸化したプライマ
ーＧＦＲＶ３のプライマーの組みを用いて、Ｐｆｘ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の４ＵのＰｆｘ ＤＮＡ
ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．３μＭのプ
ライマー、及び８０ｎｇのｐＵＧＦＰａを含有する反応
混合液８００μＬ中でパラレルＰＣＲを行った。ＰＣＲ
の温度サイクルは、（１）９４℃で１分間の変性（dena
turation）、（２）９４℃で１２秒、５０℃で３０秒、
及び６８℃で３０秒の２０サイクル、（３）６８℃で２
分間、であった。生成物をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キ
ットを用いて精製し、ＰＣＲ反応混合物４００μＬ毎に
水１００μＬで溶出した。溶出溶液のＤＮＡ濃度は吸光
度で決定した（２本鎖ＤＮＡの５０μｇ／ｍＬでＡ
２６０=１）。環化を、Ｔａｑ ＤＮＡ リガーゼ緩衝
液中の４００ＵＴａｑ ＤＮＡ リガーゼに各４．２μ
のＰＣＲ産物を含有する５００μＬの反応混合物中で行
った。温度サイクルは、（１）９４℃で１分間の変性
（denaturation）、（２）９４℃で１５秒、７０℃で２
分、及び４０℃で２分、及び４５℃で３０分の４サイク
ル、であった。結果を図６に示す。図６は、本発明のス
テップIIの環状２本鎖ＤＮＡの生成を確認する結果を示
す図面に代わる写真である。図６のレーンＭはＤＮＡマ
ーカーであり、レーン１は反応前の２本鎖の鎖状ＤＮＡ
であり、レーン２はＴａｑＤＮＡリガーゼ処理なしで４
サイクルを行った後のものであり、レーン３はＴａｑＤ
ＮＡリガーゼの存在下で４サイクルを行った後のもので
ある。いずれも、４Ｍ尿素中で５０℃で３０秒加熱し、
８Ｍ／４％ＰＡＧＥで分析した結果である。
【００４８】実施例３ （環状１本鎖ＤＮＡの調製（ス
テップIII）） エタノールで沈殿させた後、５０ｍＭ酢酸カリウム、２
０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（dithiothreito
l）、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、及び１８０ＵのＴ４
ＤＮＡ ポリメラーゼに、前記ライゲーション産物７．
２μｇを入れ、反応混合物を１２０μＬにした。この反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、エタノー
ルで沈殿させた。結果を図７及び図８に示す。図７は、
本発明のステップIIIの環状１本鎖ＤＮＡの製造の結果
を示す図面に代わる写真である。４％ＰＡＧＥでの分析
であり、レーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ
２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７８５ｍｅｒ）であり、レ
ーンＭ３は２本鎖ＤＮＡマーカー（７５９ｂｐ）であ
る。レーン１は反応前の環状２本鎖ＤＮＡであり、レー
ン２はｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ４ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼでの処理後の反応生成物である。図８は、８Ｍ尿
素４％ＰＡＧＥでの分析結果である。
テップIII）） エタノールで沈殿させた後、５０ｍＭ酢酸カリウム、２
０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム、１ｍＭジチオスレイトール（dithiothreito
l）、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、及び１８０ＵのＴ４
ＤＮＡ ポリメラーゼに、前記ライゲーション産物７．
２μｇを入れ、反応混合物を１２０μＬにした。この反
応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、エタノー
ルで沈殿させた。結果を図７及び図８に示す。図７は、
本発明のステップIIIの環状１本鎖ＤＮＡの製造の結果
を示す図面に代わる写真である。４％ＰＡＧＥでの分析
であり、レーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ
２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７８５ｍｅｒ）であり、レ
ーンＭ３は２本鎖ＤＮＡマーカー（７５９ｂｐ）であ
る。レーン１は反応前の環状２本鎖ＤＮＡであり、レー
ン２はｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ４ ＤＮＡ ポリメ
ラーゼでの処理後の反応生成物である。図８は、８Ｍ尿
素４％ＰＡＧＥでの分析結果である。
【００４９】実施例４ （１本鎖環状ＤＮＡのランダム
な切断（ステップIV）） １本鎖環状ＤＮＡのランダムな切断は、５０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７．９）、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ、及び０．０１２ＵのＤＮａｓｅ
Ｉに、前記の１本鎖環状ＤＮＡ０．２４μｇを入れた反
応混合物８０μＬ中で行った。反応混合物を２５℃で３
分間インキュベートし、エタノールで沈殿させた。結果
を図１２に示す。図１２は、本発明の変異法のステップ
IVにおける、１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での切断の
結果を示す図面に代わる写真である。図１２のレーンＭ
１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡ
マーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切断反応
前の環状１本鎖ＤＮＡであり、レーン２はＤＮａｓｅＩ
による切断反応の生成物であり、レーン３はＮ７テイル
を有するアンカーと鎖状１本鎖ＤＮＡとの連結反応の生
成物であり、レーン４はＮ１０テイルを有するものとの
反応生成物であり、レーン５はＮ１４テイルを有するも
のとの反応生成物である。全ての試料は、４Ｍ尿素中で
３０秒、９５℃に加熱され、８Ｍ尿素／４％ＰＡＧＥで
分析された。
な切断（ステップIV）） １本鎖環状ＤＮＡのランダムな切断は、５０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ７．９）、２０ｍＭ塩化マグネシウム、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ、及び０．０１２ＵのＤＮａｓｅ
Ｉに、前記の１本鎖環状ＤＮＡ０．２４μｇを入れた反
応混合物８０μＬ中で行った。反応混合物を２５℃で３
分間インキュベートし、エタノールで沈殿させた。結果
を図１２に示す。図１２は、本発明の変異法のステップ
IVにおける、１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での切断の
結果を示す図面に代わる写真である。図１２のレーンＭ
１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡ
マーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切断反応
前の環状１本鎖ＤＮＡであり、レーン２はＤＮａｓｅＩ
による切断反応の生成物であり、レーン３はＮ７テイル
を有するアンカーと鎖状１本鎖ＤＮＡとの連結反応の生
成物であり、レーン４はＮ１０テイルを有するものとの
反応生成物であり、レーン５はＮ１４テイルを有するも
のとの反応生成物である。全ての試料は、４Ｍ尿素中で
３０秒、９５℃に加熱され、８Ｍ尿素／４％ＰＡＧＥで
分析された。
【００５０】実施例５ （アンカーの１本鎖部分（テイ
ル）の長さの最適化） ランダムに切断された１本鎖ＤＮＡ（３０ｎｇ）を、１
０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール
（dithiothreitol）、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢ
ＳＡ、１０％ＰＥＧ８０００、及び１５０ｍＭＮａＣｌ
を含有する５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に溶解
させた。この溶液を９５℃で１５秒、５０℃で１０秒イ
ンキュベートした。その後、１本鎖部分（テイル）が７
塩基、１０塩基、及び１４塩基の長さを有する各種の
５’−アンカー及び３’−アンカーを各々の最終濃度が
１μＭになるように添加した。この溶液を３０℃で１０
秒、インキュベートして、４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを加えた。温度サイクルは、１０℃で３０及び３０
℃で３０秒を毎時１２サイクルの速度で１０時間行っ
た。エタノールで沈殿させた後、ライゲーション産物を
４％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルで精製した。次い
で、Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の０．１Ｕ
のＰｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μ
Ｍ、０．３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び３ｎｇのライゲー
ション産物を含有する２０μＬの反応混合物中で、ＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、（１）９４℃で
１分間の変性（denaturation）、（２）９４℃で１２
秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒の、１５、１
８、 ２１、又は２４サイクル、であった。各サイ
クルで、４μＬアリコート反応混合物中から除いた。生
成物を４％ＰＡＧＥで分析した。
ル）の長さの最適化） ランダムに切断された１本鎖ＤＮＡ（３０ｎｇ）を、１
０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール
（dithiothreitol）、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢ
ＳＡ、１０％ＰＥＧ８０００、及び１５０ｍＭＮａＣｌ
を含有する５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）に溶解
させた。この溶液を９５℃で１５秒、５０℃で１０秒イ
ンキュベートした。その後、１本鎖部分（テイル）が７
塩基、１０塩基、及び１４塩基の長さを有する各種の
５’−アンカー及び３’−アンカーを各々の最終濃度が
１μＭになるように添加した。この溶液を３０℃で１０
秒、インキュベートして、４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを加えた。温度サイクルは、１０℃で３０及び３０
℃で３０秒を毎時１２サイクルの速度で１０時間行っ
た。エタノールで沈殿させた後、ライゲーション産物を
４％アクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルで精製した。次い
で、Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の０．１Ｕ
のＰｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μ
Ｍ、０．３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び３ｎｇのライゲー
ション産物を含有する２０μＬの反応混合物中で、ＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、（１）９４℃で
１分間の変性（denaturation）、（２）９４℃で１２
秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒の、１５、１
８、 ２１、又は２４サイクル、であった。各サイ
クルで、４μＬアリコート反応混合物中から除いた。生
成物を４％ＰＡＧＥで分析した。
【００５１】実施例６ （連続する３塩基をｃｇｇｔ４
塩基への置換（ステップＶ−VII）） Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の０．５ＵのＰ
ｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、
０．３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び１０ｎｇのライゲーシ
ョン産物を含有する１００μＬの反応混合物中で、ＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、（１）９４℃で
１分間の変性（denaturation）、（２）９４℃で１２
秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒の、２３サイ
クル、（３）さらに、６８℃で２分、であった。生成物
をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キットを用いて精製し、Ｐ
ＣＲ反応混合物１００μＬ毎に水５０μＬで溶出した。
結果を図１３に示す。図１３は、本発明の変異法のステ
ップVIにおける、ＰＣＲで増幅した結果を示す図面に代
わる写真である。４％ＰＡＧＥ上での分析結果であり、
レーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本
鎖ＤＮＡマーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は
切断反応前の環状１本鎖ＤＮＡであり、各々レーン１は
１５サイクルのものであり、レーン２は１８サイクルで
あり、レーン３は２１サイクルのものであり、レーン４
は２４サイクルである。図１３の左側はＮ７テイルを有
するアンカーの場合であり、中央はＮ１０テイルを有す
るアンカーの場合であり、右側はＮ１４テイルを有する
アンカーの場合である。次に、１．２μｇのＰＣＲ産物
を、４０μＬの反応混合物中の３０ＵのＢｃｉVIで、３
７℃で２時間インキュベートした。エタノール沈殿の
後、１ｎｇのストレプトアビジンを含む４％ＰＡＧＥ上
で精製し、２５μＬの反応混合物中の１５ＵのＴ４ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼで１２℃で１５分インキュベートし
た。エタノール沈殿の後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオ
スレイトール（dithiothreitol）、１ｍＭＡＴＰ、及び
４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む２５μｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含有する反応混合物２０μＬ中で環化を行っ
た。反応混合物を３０度で１０時間インキュベートし、
エタノールで沈殿させた。次いで、Ｐｆｘ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ緩衝液中の０．５ＵのＰｆｘ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．３μＭのＧＦＲＶ
３、０．３μＭのＧＦＦＷ３、及び前記のライゲーショ
ン産物を含有する反応混合物１００μＬ中で、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲの温度サイクルは、（１）９４℃で２分
間の変性（denaturation）、（２）９４℃で１２秒、６
５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒の、１３サイクル、
（３）さらに、６８℃で２分、であった。ＰＣＲ産物
を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで切断して、その産物
を１．５％アガロースゲル電気泳動で精製し、プラスミ
ドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにクロ
ーン化した。大腸菌ＤＨ１０Ｂを、ライゲーション混合
物を含有する１０％グリセロール中のエレクトロポーレ
ーションにより形質転換した。
塩基への置換（ステップＶ−VII）） Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の０．５ＵのＰ
ｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、
０．３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び１０ｎｇのライゲーシ
ョン産物を含有する１００μＬの反応混合物中で、ＰＣ
Ｒを行った。ＰＣＲの温度サイクルは、（１）９４℃で
１分間の変性（denaturation）、（２）９４℃で１２
秒、５５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒の、２３サイ
クル、（３）さらに、６８℃で２分、であった。生成物
をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キットを用いて精製し、Ｐ
ＣＲ反応混合物１００μＬ毎に水５０μＬで溶出した。
結果を図１３に示す。図１３は、本発明の変異法のステ
ップVIにおける、ＰＣＲで増幅した結果を示す図面に代
わる写真である。４％ＰＡＧＥ上での分析結果であり、
レーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本
鎖ＤＮＡマーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は
切断反応前の環状１本鎖ＤＮＡであり、各々レーン１は
１５サイクルのものであり、レーン２は１８サイクルで
あり、レーン３は２１サイクルのものであり、レーン４
は２４サイクルである。図１３の左側はＮ７テイルを有
するアンカーの場合であり、中央はＮ１０テイルを有す
るアンカーの場合であり、右側はＮ１４テイルを有する
アンカーの場合である。次に、１．２μｇのＰＣＲ産物
を、４０μＬの反応混合物中の３０ＵのＢｃｉVIで、３
７℃で２時間インキュベートした。エタノール沈殿の
後、１ｎｇのストレプトアビジンを含む４％ＰＡＧＥ上
で精製し、２５μＬの反応混合物中の１５ＵのＴ４ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼで１２℃で１５分インキュベートし
た。エタノール沈殿の後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ
７．５）、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオ
スレイトール（dithiothreitol）、１ｍＭＡＴＰ、及び
４００ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む２５μｇ／ｍｌ
ＢＳＡを含有する反応混合物２０μＬ中で環化を行っ
た。反応混合物を３０度で１０時間インキュベートし、
エタノールで沈殿させた。次いで、Ｐｆｘ ＤＮＡ ポ
リメラーゼ緩衝液中の０．５ＵのＰｆｘ ＤＮＡポリメ
ラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．３μＭのＧＦＲＶ
３、０．３μＭのＧＦＦＷ３、及び前記のライゲーショ
ン産物を含有する反応混合物１００μＬ中で、ＰＣＲを
行った。ＰＣＲの温度サイクルは、（１）９４℃で２分
間の変性（denaturation）、（２）９４℃で１２秒、６
５℃で３０秒、及び６８℃で３０秒の、１３サイクル、
（３）さらに、６８℃で２分、であった。ＰＣＲ産物
を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIIIで切断して、その産物
を１．５％アガロースゲル電気泳動で精製し、プラスミ
ドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにクロ
ーン化した。大腸菌ＤＨ１０Ｂを、ライゲーション混合
物を含有する１０％グリセロール中のエレクトロポーレ
ーションにより形質転換した。
【００５２】実施例７ （１本鎖ＤＮＡにアンカーＤＮ
Ａを連結するモデル実験例） １μＭのＴＥＳＴリンカー、４μＭの５’−リン酸化Ｔ
ＥＳＴＮ５、ＴＥＳＴＮ７、ＴＥＳＴＮ９、又はＲＶ、
５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール（dithiothre
itol）、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、１０％
ＰＥＧ８０００、及び１００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを
含む１５０ｍＭＮａＣｌを含有する５μＬの反応混合物
中で反応を行った。対照の反応を、１μＭのＴＥＳＴリ
ンカー及び５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ７を含有する５μ
Ｌの反応混合物中で行った。反応混合物を１６度で６時
間インキュベートした。反応後の溶液を２０％ＰＡＧＥ
で分析した。結果を図１１に示す。図１１は、アンカー
と１本鎖ＤＮＡとの連結法についてのモデル反応の結果
を示す図面に代わる写真である。レーン１はリガーゼの
不存在下（−Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基の
ＴＥＳＴアンカーの場合であり、レーン２はリガーゼの
存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴ
ＥＳＴアンカーの場合であり、レーン３はリガーゼの存
在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥ
ＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ７の
場合であり、レーン４はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）
での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４
μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ５の場合であり、レー
ン５はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’
末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン
酸化ＴＥＳＴＮ９の場合であり、レーン６はリガーゼの
存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴ
ＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化ＲＶの場合で
ある。上段のバンドは連結生成物を示し、下段はアンカ
ーのバンドを示す。
Ａを連結するモデル実験例） １μＭのＴＥＳＴリンカー、４μＭの５’−リン酸化Ｔ
ＥＳＴＮ５、ＴＥＳＴＮ７、ＴＥＳＴＮ９、又はＲＶ、
５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ塩化マ
グネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール（dithiothre
itol）、１ｍＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、１０％
ＰＥＧ８０００、及び１００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを
含む１５０ｍＭＮａＣｌを含有する５μＬの反応混合物
中で反応を行った。対照の反応を、１μＭのＴＥＳＴリ
ンカー及び５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ７を含有する５μ
Ｌの反応混合物中で行った。反応混合物を１６度で６時
間インキュベートした。反応後の溶液を２０％ＰＡＧＥ
で分析した。結果を図１１に示す。図１１は、アンカー
と１本鎖ＤＮＡとの連結法についてのモデル反応の結果
を示す図面に代わる写真である。レーン１はリガーゼの
不存在下（−Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基の
ＴＥＳＴアンカーの場合であり、レーン２はリガーゼの
存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴ
ＥＳＴアンカーの場合であり、レーン３はリガーゼの存
在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥ
ＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ７の
場合であり、レーン４はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）
での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４
μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ５の場合であり、レー
ン５はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’
末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン
酸化ＴＥＳＴＮ９の場合であり、レーン６はリガーゼの
存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴ
ＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化ＲＶの場合で
ある。上段のバンドは連結生成物を示し、下段はアンカ
ーのバンドを示す。
【００５３】実施例８ （ランダムに切断したＤＮＡの
コンフォメーション） Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の１ＵのＰｆｘ
ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．
３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び４０ｎｇのステップ５の最
初のＰＣＲ産物のゲル精製物を含有する反応混合物２０
０μＬ中で、ＰＣＲを行った。第２回目のＰＣＲの温度
サイクルは、第１回目のＰＣＲと同じであった。エタノ
ールで沈殿した後、生成物を２０μＬの１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．０）に溶解させた。２０ＵのＥｃｏＲ
Ｉを含むＥｃｏＲＩ緩衝液中に第２回目のＰＣＲ産物５
μＬを含有する５０μＬの反応混合物中で、ＥｃｏＲＩ
による切断を行った。反応混合物を３７℃で１時間イン
キュベートし、エタノールで沈殿させた。生成物を６％
ＰＡＧＥで分析した。結果を図１４に示す。図１４は、
環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダムに行われたか否かを
検証する方法の概要示す（図１４の（ａ））、またを図
１４の（ｂ）は切断のランダムさを検証した結果を示す
図面に代わる写真である。図１４の（ｂ）のレーンＭ１
はＤＮＡマーカーであり、レーン１及びレーン３はステ
ップ６におけるＰＣＲ産物であり、レーン２及び４はそ
のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切断したものである。レー
ン１及び２は１μＬの場合であり、レーン３及び４は４
０μＬの場合である。
コンフォメーション） Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の１ＵのＰｆｘ
ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．
３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び４０ｎｇのステップ５の最
初のＰＣＲ産物のゲル精製物を含有する反応混合物２０
０μＬ中で、ＰＣＲを行った。第２回目のＰＣＲの温度
サイクルは、第１回目のＰＣＲと同じであった。エタノ
ールで沈殿した後、生成物を２０μＬの１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．０）に溶解させた。２０ＵのＥｃｏＲ
Ｉを含むＥｃｏＲＩ緩衝液中に第２回目のＰＣＲ産物５
μＬを含有する５０μＬの反応混合物中で、ＥｃｏＲＩ
による切断を行った。反応混合物を３７℃で１時間イン
キュベートし、エタノールで沈殿させた。生成物を６％
ＰＡＧＥで分析した。結果を図１４に示す。図１４は、
環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダムに行われたか否かを
検証する方法の概要示す（図１４の（ａ））、またを図
１４の（ｂ）は切断のランダムさを検証した結果を示す
図面に代わる写真である。図１４の（ｂ）のレーンＭ１
はＤＮＡマーカーであり、レーン１及びレーン３はステ
ップ６におけるＰＣＲ産物であり、レーン２及び４はそ
のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切断したものである。レー
ン１及び２は１μＬの場合であり、レーン３及び４は４
０μＬの場合である。
【００５４】
【発明の効果】このように本発明の方法は、特定のコド
ン配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置
の塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン
配列に置き換えることを可能とする。また、２０種のア
ミノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用い
ることにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のア
ミノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドン類の３塩基コドンを使用すること
による、蛋白質のアラニンスキャン、（ｄ）挿入配列と
して新しい制限酵素認識配列を導入することによる、蛋
白質のハイブリッド化やサーキュラー変異、（ｅ）ラン
ダムな任意の長さの挿入配列を用いることによる、蛋白
質のランダム挿入変異、（ｆ）欠失の長さを制御するこ
とによる、蛋白質のランダム欠失変異、などがあげられ
る。本方法はＤＮＡ組換え法における新手法として広い
範囲の研究や産業あるいは創薬の分野で応用できるもの
である。
ン配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置
の塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン
配列に置き換えることを可能とする。また、２０種のア
ミノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用い
ることにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のア
ミノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドン類の３塩基コドンを使用すること
による、蛋白質のアラニンスキャン、（ｄ）挿入配列と
して新しい制限酵素認識配列を導入することによる、蛋
白質のハイブリッド化やサーキュラー変異、（ｅ）ラン
ダムな任意の長さの挿入配列を用いることによる、蛋白
質のランダム挿入変異、（ｆ）欠失の長さを制御するこ
とによる、蛋白質のランダム欠失変異、などがあげられ
る。本方法はＤＮＡ組換え法における新手法として広い
範囲の研究や産業あるいは創薬の分野で応用できるもの
である。
【図１】図１は、本発明の変異法の概要を示したもので
ある。ステップＩからステップVIIIまでの概略を模式的
に示したものである。
ある。ステップＩからステップVIIIまでの概略を模式的
に示したものである。
【図２】図２は、本発明の変異法のステップＩ及びステ
ップIIをより具体的に例示したものである。
ップIIをより具体的に例示したものである。
【図３】図３は、本発明の変異法のステップＶ〜ステッ
プVIIをより具体的に説明するためのものである。図３
の太線は、ランダムに切断されたＤＮＡを示す。
プVIIをより具体的に説明するためのものである。図３
の太線は、ランダムに切断されたＤＮＡを示す。
【図４】図４は、ＤＮＡの３’末端の塩基配列が未知の
場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要を示
す。
場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要を示
す。
【図５】図５は、ＤＮＡの５’末端の塩基配列が未知の
場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要を示
す。
場合の１本鎖ＤＮＡへのアンカーの連結方法の概要を示
す。
【図６】図６は、本発明のステップIIの環状２本鎖ＤＮ
Ａの生成を確認する結果を示す図面に代わる写真であ
る。図６のレーンＭはＤＮＡマーカーであり、レーン１
は反応前の２本鎖の鎖状ＤＮＡであり、レーン２はＴａ
ｑＤＮＡリガーゼ処理なしで４サイクルを行った後のも
のであり、レーン３はＴａｑＤＮＡリガーゼの存在下で
４サイクルを行った後のものである。いずれも、４Ｍ尿
素中で５０℃で３０秒加熱し、８Ｍ／４％ＰＡＧＥで分
析した結果である。
Ａの生成を確認する結果を示す図面に代わる写真であ
る。図６のレーンＭはＤＮＡマーカーであり、レーン１
は反応前の２本鎖の鎖状ＤＮＡであり、レーン２はＴａ
ｑＤＮＡリガーゼ処理なしで４サイクルを行った後のも
のであり、レーン３はＴａｑＤＮＡリガーゼの存在下で
４サイクルを行った後のものである。いずれも、４Ｍ尿
素中で５０℃で３０秒加熱し、８Ｍ／４％ＰＡＧＥで分
析した結果である。
【図７】図７は、本発明のステップIIIの環状１本鎖Ｄ
ＮＡの製造の結果を示す図面に代わる写真である。４％
ＰＡＧＥでの分析であり、レーンＭ１はＤＮＡマーカー
であり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７８５ｍ
ｅｒ）であり、レーンＭ３は２本鎖ＤＮＡマーカー（７
５９ｂｐ）である。レーン１は反応前の環状２本鎖ＤＮ
Ａであり、レーン２はｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ４
ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後の反応生成物である。
ＮＡの製造の結果を示す図面に代わる写真である。４％
ＰＡＧＥでの分析であり、レーンＭ１はＤＮＡマーカー
であり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカー（７８５ｍ
ｅｒ）であり、レーンＭ３は２本鎖ＤＮＡマーカー（７
５９ｂｐ）である。レーン１は反応前の環状２本鎖ＤＮ
Ａであり、レーン２はｄＮＴＰｓの不存在下でのＴ４
ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後の反応生成物である。
【図８】図８は、本発明のステップIIIの環状１本鎖Ｄ
ＮＡの製造の結果を示す図面に代わる写真である。８Ｍ
尿素４％ＰＡＧＥでの分析結果であり、レーンＭ１はＤ
ＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカ
ー（７８５ｍｅｒ）であり、レーンＭ３は２本鎖ＤＮＡ
マーカー（７５９ｂｐ）である。レーン１は反応前の環
状２本鎖ＤＮＡであり、レーン２はｄＮＴＰｓの不存在
下でのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後の反応生
成物である。
ＮＡの製造の結果を示す図面に代わる写真である。８Ｍ
尿素４％ＰＡＧＥでの分析結果であり、レーンＭ１はＤ
ＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカ
ー（７８５ｍｅｒ）であり、レーンＭ３は２本鎖ＤＮＡ
マーカー（７５９ｂｐ）である。レーン１は反応前の環
状２本鎖ＤＮＡであり、レーン２はｄＮＴＰｓの不存在
下でのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼでの処理後の反応生
成物である。
【図９】図９は、本発明の変異法のステップＶ以降のラ
ンダムな位置で切断された１本鎖ＤＮＡの処理の概要を
より具体的に示す。
ンダムな位置で切断された１本鎖ＤＮＡの処理の概要を
より具体的に示す。
【図１０】図１０は、アンカーと１本鎖ＤＮＡとの連結
法についてのモデル反応の概要を示す。図１０の（ａ）
は、ＴＥＳＴＣＯと５’末端がリン酸化された又は遊離
のＯＨ基であるＴＥＳＴＮ７からなっている。図１０の
（ｂ）は、５’末端がＯＨ基であるＴＥＳＴアンカー
を、５’末端がリン酸化された種々の数のヌクレオチド
からなるランダム配列の１本鎖ＤＮＡとの連結の概要を
示す。
法についてのモデル反応の概要を示す。図１０の（ａ）
は、ＴＥＳＴＣＯと５’末端がリン酸化された又は遊離
のＯＨ基であるＴＥＳＴＮ７からなっている。図１０の
（ｂ）は、５’末端がＯＨ基であるＴＥＳＴアンカー
を、５’末端がリン酸化された種々の数のヌクレオチド
からなるランダム配列の１本鎖ＤＮＡとの連結の概要を
示す。
【図１１】図１１は、アンカーと１本鎖ＤＮＡとの連結
法についてのモデル反応の結果を示す図面に代わる写真
である。レーン１はリガーゼの不存在下（−Ｌｉｇ）で
の１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーの場合
であり、レーン２はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での
１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーの場合で
あり、レーン３はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１
μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの
５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ７の場合であり、レーン４は
リガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端が
ＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化Ｔ
ＥＳＴＮ５の場合であり、レーン５はリガーゼの存在下
（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴ
アンカーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ９の場合
であり、レーン６はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での
１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭ
の５’−リン酸化ＲＶの場合である。上段のバンドは連
結生成物を示し、下段はアンカーのバンドを示す。
法についてのモデル反応の結果を示す図面に代わる写真
である。レーン１はリガーゼの不存在下（−Ｌｉｇ）で
の１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーの場合
であり、レーン２はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での
１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーの場合で
あり、レーン３はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１
μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの
５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ７の場合であり、レーン４は
リガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端が
ＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭの５’−リン酸化Ｔ
ＥＳＴＮ５の場合であり、レーン５はリガーゼの存在下
（＋Ｌｉｇ）での１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴ
アンカーと４μＭの５’−リン酸化ＴＥＳＴＮ９の場合
であり、レーン６はリガーゼの存在下（＋Ｌｉｇ）での
１μＭの５’末端がＯＨ基のＴＥＳＴアンカーと４μＭ
の５’−リン酸化ＲＶの場合である。上段のバンドは連
結生成物を示し、下段はアンカーのバンドを示す。
【図１２】図１２は、本発明の変異法のステップIVにお
ける、１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での切断の結果を
示す図面に代わる写真である。図１２のレーンＭ１はＤ
ＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカ
ー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切断反応前の環
状１本鎖ＤＮＡであり、レーン２はＤＮａｓｅＩによる
切断反応の生成物であり、レーン３はＮ７テイルを有す
るアンカーと鎖状１本鎖ＤＮＡとの連結反応の生成物で
あり、レーン４はＮ１０テイルを有するものとの反応生
成物であり、レーン５はＮ１４テイルを有するものとの
反応生成物である。全ての試料は、４Ｍ尿素中で３０
秒、９５℃に加熱され、８Ｍ尿素／４％ＰＡＧＥで分析
された。
ける、１本鎖ＤＮＡのランダムな位置での切断の結果を
示す図面に代わる写真である。図１２のレーンＭ１はＤ
ＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマーカ
ー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切断反応前の環
状１本鎖ＤＮＡであり、レーン２はＤＮａｓｅＩによる
切断反応の生成物であり、レーン３はＮ７テイルを有す
るアンカーと鎖状１本鎖ＤＮＡとの連結反応の生成物で
あり、レーン４はＮ１０テイルを有するものとの反応生
成物であり、レーン５はＮ１４テイルを有するものとの
反応生成物である。全ての試料は、４Ｍ尿素中で３０
秒、９５℃に加熱され、８Ｍ尿素／４％ＰＡＧＥで分析
された。
【図１３】図１３は、本発明の変異法のステップVIにお
ける、ＰＣＲで増幅した結果を示す図面に代わる写真で
ある。４％ＰＡＧＥ上での分析結果であり、レーンＭ１
はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマ
ーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切断反応前
の環状１本鎖ＤＮＡであり、各々レーン１は１５サイク
ルのものであり、レーン２は１８サイクルであり、レー
ン３は２１サイクルのものであり、レーン４は２４サイ
クルである。図１３の左側はＮ７テイルを有するアンカ
ーの場合であり、中央はＮ１０テイルを有するアンカー
の場合であり、右側はＮ１４テイルを有するアンカーの
場合である。
ける、ＰＣＲで増幅した結果を示す図面に代わる写真で
ある。４％ＰＡＧＥ上での分析結果であり、レーンＭ１
はＤＮＡマーカーであり、レーンＭ２は１本鎖ＤＮＡマ
ーカー（７５９ｍｅｒ）であり、レーン１は切断反応前
の環状１本鎖ＤＮＡであり、各々レーン１は１５サイク
ルのものであり、レーン２は１８サイクルであり、レー
ン３は２１サイクルのものであり、レーン４は２４サイ
クルである。図１３の左側はＮ７テイルを有するアンカ
ーの場合であり、中央はＮ１０テイルを有するアンカー
の場合であり、右側はＮ１４テイルを有するアンカーの
場合である。
【図１４】図１４は、環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダ
ムに行われたか否かを検証する方法の概要示す（図１４
の（ａ））、またを図１４の（ｂ）は切断のランダムさ
を検証した結果を示す図面に代わる写真である。図１４
の（ｂ）のレーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーン
１及びレーン３はステップ６におけるＰＣＲ産物であ
り、レーン２及び４はそのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切
断したものである。レーン１及び２は１μＬの場合であ
り、レーン３及び４は４０μＬの場合である。
ムに行われたか否かを検証する方法の概要示す（図１４
の（ａ））、またを図１４の（ｂ）は切断のランダムさ
を検証した結果を示す図面に代わる写真である。図１４
の（ｂ）のレーンＭ１はＤＮＡマーカーであり、レーン
１及びレーン３はステップ６におけるＰＣＲ産物であ
り、レーン２及び４はそのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切
断したものである。レーン１及び２は１μＬの場合であ
り、レーン３及び４は４０μＬの場合である。
【図１５】図１５は、本発明の変異法により変異ＧＦＰ
遺伝子の塩基配列を決定した結果を示すものである。
遺伝子の塩基配列を決定した結果を示すものである。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年３月２８日（２００１．３．２
８）
８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】追加
【補正内容】
【発明の名称】 ランダム挿入削除ＤＮＡ変異法 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月２日（２００１．７．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記した
従来の変異法の問題点（１）〜（３）を改善するため
に、（１）については、各アミノ酸に対応する３塩基コ
ドンをほぼ同じ確率でＤＮＡ中に導入できるので置換さ
れるアミノ酸の種類に偏りが生じない。（２）について
はランダムな位置の塩基配列を、指定した塩基配列に置
換できることを可能にする、（３）については、変異率
がほぼ一定のＤＮＡを作成することを可能にすることに
より解決するために、鋭意研究した結果、一方のアンカ
ーが、認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素の認
識配列、挿入される塩基配列、及び標的ＤＮＡの末端塩
基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配
列を含有しており、他方のアンカーが、認識配列の外側
でＤＮＡを切断する制限酵素の認識配列、及び標的ＤＮ
Ａの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補
的な塩基配列を含有しているアンカーを用いることによ
り、これらの目的を達成できることを見出した。
従来の変異法の問題点（１）〜（３）を改善するため
に、（１）については、各アミノ酸に対応する３塩基コ
ドンをほぼ同じ確率でＤＮＡ中に導入できるので置換さ
れるアミノ酸の種類に偏りが生じない。（２）について
はランダムな位置の塩基配列を、指定した塩基配列に置
換できることを可能にする、（３）については、変異率
がほぼ一定のＤＮＡを作成することを可能にすることに
より解決するために、鋭意研究した結果、一方のアンカ
ーが、認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限酵素の認
識配列、挿入される塩基配列、及び標的ＤＮＡの末端塩
基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配
列を含有しており、他方のアンカーが、認識配列の外側
でＤＮＡを切断する制限酵素の認識配列、及び標的ＤＮ
Ａの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補
的な塩基配列を含有しているアンカーを用いることによ
り、これらの目的を達成できることを見出した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】まず、本発明の変異法について説明する。
本発明の変異法では、ＤＮＡのランダムな位置の塩基を
任意の数だけ切り取り、その位置に任意の数の塩基を挿
入することができる。本発明者らは、本発明の変異法を
ランダム挿入削除変異法（random insertion deletion
mutation（ＲＩＤＭ））と命名したので、以下、本発明
の変異法をＲＩＤＭと略称することがある。図１は、本
発明の変異法の概要を示したものである。図１の上段に
変異しようとするＤＮＡが示されている。まず、目的Ｄ
ＮＡをＰＣＲ法により増幅する（ステップＩ）。このと
き、センス鎖のプライマーの５’末端をリン酸化してお
く。次に増幅したＤＮＡを環化し（ステップII）、Ｔ４
ＤＮＡ合成酵素を用いてアンチセンス鎖のみを分解す
る（ステップIII）。続いて生成物である環状１本鎖セ
ンス鎖ＤＮＡをランダムな１箇所で切断する（ステップ
IV）。これにより、ランダムな位置で切断された１本鎖
のＤＮＡとなる。切断は酵素や物理的な手段によって行
うことができるので、特定の位置で切断されるのではな
く、いろんな位置で切断された１本鎖のＤＮＡの混合物
が得られることになる。また、切断は、原則的には１個
のＤＮＡについて１箇所が切断される条件にすることが
好ましい。
本発明の変異法では、ＤＮＡのランダムな位置の塩基を
任意の数だけ切り取り、その位置に任意の数の塩基を挿
入することができる。本発明者らは、本発明の変異法を
ランダム挿入削除変異法（random insertion deletion
mutation（ＲＩＤＭ））と命名したので、以下、本発明
の変異法をＲＩＤＭと略称することがある。図１は、本
発明の変異法の概要を示したものである。図１の上段に
変異しようとするＤＮＡが示されている。まず、目的Ｄ
ＮＡをＰＣＲ法により増幅する（ステップＩ）。このと
き、センス鎖のプライマーの５’末端をリン酸化してお
く。次に増幅したＤＮＡを環化し（ステップII）、Ｔ４
ＤＮＡ合成酵素を用いてアンチセンス鎖のみを分解す
る（ステップIII）。続いて生成物である環状１本鎖セ
ンス鎖ＤＮＡをランダムな１箇所で切断する（ステップ
IV）。これにより、ランダムな位置で切断された１本鎖
のＤＮＡとなる。切断は酵素や物理的な手段によって行
うことができるので、特定の位置で切断されるのではな
く、いろんな位置で切断された１本鎖のＤＮＡの混合物
が得られることになる。また、切断は、原則的には１個
のＤＮＡについて１箇所が切断される条件にすることが
好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】次に元のＤＮＡの全長の長さを有する１本
鎖ＤＮＡを集め、１本鎖のＤＮＡの両端にアンカーＤＮ
Ａを連結させる（ステップＶ）。アンカーの２本鎖部分
の塩基配列はわかっているので、この配列に基づいてＰ
ＣＲにより増幅する（ステップVI）。そして、認識配列
の外側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてＤＮＡを切
断（ステップVII）することで、片側の末端に特定の配
列を挿入し、もう一方は指定した数の塩基を削除する。
ここで挿入配列と削除塩基数は、ステップＶのアンカー
の種類によって任意に決めることができる。最後に、末
端を平滑化したのち再び環化し（ステップVIII）、変異
ＤＮＡを得る。図１の灰色部分は新たに挿入された塩基
配列部分を示している。この方法により、ランダムな位
置に指定した塩基配列が置換された（図１の灰色部分）
変異ＤＮＡのライブラリーが作成される。この変異ＤＮ
Ａのライブラリーを用いて、通常の方法により蛋白質を
発現させると、変異蛋白質のライブラリーを得ることが
できる。 （削除）
鎖ＤＮＡを集め、１本鎖のＤＮＡの両端にアンカーＤＮ
Ａを連結させる（ステップＶ）。アンカーの２本鎖部分
の塩基配列はわかっているので、この配列に基づいてＰ
ＣＲにより増幅する（ステップVI）。そして、認識配列
の外側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてＤＮＡを切
断（ステップVII）することで、片側の末端に特定の配
列を挿入し、もう一方は指定した数の塩基を削除する。
ここで挿入配列と削除塩基数は、ステップＶのアンカー
の種類によって任意に決めることができる。最後に、末
端を平滑化したのち再び環化し（ステップVIII）、変異
ＤＮＡを得る。図１の灰色部分は新たに挿入された塩基
配列部分を示している。この方法により、ランダムな位
置に指定した塩基配列が置換された（図１の灰色部分）
変異ＤＮＡのライブラリーが作成される。この変異ＤＮ
Ａのライブラリーを用いて、通常の方法により蛋白質を
発現させると、変異蛋白質のライブラリーを得ることが
できる。 （削除）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】両末端にアンカーが連結されたＤＮＡをＰ
ＣＲにより増幅し（ステップVI）、次いで制限酵素Ｂｃ
ｉVIで切断する。制限酵素ＢｃｉVIは、認識配列の外側
でＤＮＡを切断する制限酵素であり、認識配列（ｇｔａ
ｔｃｃ）の６塩基外側、即ちこの例では挿入される塩基
配列ｃｇｇｔの直前で切断される。切断面は平滑端では
ないので、後でこれを平滑化する。また、３’−末端用
のアンカーは３塩基のダミー配列を有しているから、標
的ＤＮＡに３塩基分くい込んで切断されることになる。
この切断面を平滑化すると、元のＤＮＡから３塩基分が
削除されたことになる。３塩基はコドンを形成するもの
である。したがって、この結果元のＤＮＡの５’−末端
側に４塩基が付加され、３’−末端側からコドンの３塩
基分が削除されることになる。つまり、この例では、天
然のアミノ酸のコドンが削除され、当該コドンが存在し
ていた位置に非天然アミノ酸のコドンである４塩基が挿
入されることになる。
ＣＲにより増幅し（ステップVI）、次いで制限酵素Ｂｃ
ｉVIで切断する。制限酵素ＢｃｉVIは、認識配列の外側
でＤＮＡを切断する制限酵素であり、認識配列（ｇｔａ
ｔｃｃ）の６塩基外側、即ちこの例では挿入される塩基
配列ｃｇｇｔの直前で切断される。切断面は平滑端では
ないので、後でこれを平滑化する。また、３’−末端用
のアンカーは３塩基のダミー配列を有しているから、標
的ＤＮＡに３塩基分くい込んで切断されることになる。
この切断面を平滑化すると、元のＤＮＡから３塩基分が
削除されたことになる。３塩基はコドンを形成するもの
である。したがって、この結果元のＤＮＡの５’−末端
側に４塩基が付加され、３’−末端側からコドンの３塩
基分が削除されることになる。つまり、この例では、天
然のアミノ酸のコドンが削除され、当該コドンが存在し
ていた位置に非天然アミノ酸のコドンである４塩基が挿
入されることになる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】
【化１】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】（式中、Ｎは任意の塩基を示し、ｎは塩基
がｎ個続くことを示し、ｎとしては７〜１４が可能であ
るが、好ましくはｎ＝１０である。） この例で用いた３’−アンカーを次式で示す。
がｎ個続くことを示し、ｎとしては７〜１４が可能であ
るが、好ましくはｎ＝１０である。） この例で用いた３’−アンカーを次式で示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】５’末端をＯＨ基にしたアンカーは自己連
結しなかった（図１１のレーン２参照）。５’末端にラ
ンダムテイルを有する１本鎖ＤＮＡが添加された場合に
は、連結が生起した（図１１レーン３−５参照）。連結
はＴＥＳＴＮ７ＤＮＡの場合が最も効果的であった。こ
れは、このもののランダムテイルの長さが、アンカーの
テイルの長さと同じであったからであろう。しかし、連
結の有効性はＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳＴＮ５においても
顕著な低下はみられなかった。ＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳ
ＴＮ５における充分な連結は、部分的なハイブリダイズ
で連結には充分であり、完全なハイブリダイズは必要無
いことを示している。しかしながら、アンカーが５’末
端にランダムテイルを持っていないＲＶと連結しないと
いう事実は、連結にはハイブリダイズが必要であること
を示している。このモデル実験の結果は、アンカーＤＮ
Ａと５’及び３’末端にランダム配列を有する１本鎖Ｄ
ＮＡとの連結は、相補鎖を見出す可能性は低いものの、
各々充分に効果的に生起することを示している。そし
て、この方法は今まで比較的困難であった。５’ＲＡＣ
Ｅによるクローニング技術にも効果的に応用することが
できる。
結しなかった（図１１のレーン２参照）。５’末端にラ
ンダムテイルを有する１本鎖ＤＮＡが添加された場合に
は、連結が生起した（図１１レーン３−５参照）。連結
はＴＥＳＴＮ７ＤＮＡの場合が最も効果的であった。こ
れは、このもののランダムテイルの長さが、アンカーの
テイルの長さと同じであったからであろう。しかし、連
結の有効性はＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳＴＮ５においても
顕著な低下はみられなかった。ＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳ
ＴＮ５における充分な連結は、部分的なハイブリダイズ
で連結には充分であり、完全なハイブリダイズは必要無
いことを示している。しかしながら、アンカーが５’末
端にランダムテイルを持っていないＲＶと連結しないと
いう事実は、連結にはハイブリダイズが必要であること
を示している。このモデル実験の結果は、アンカーＤＮ
Ａと５’及び３’末端にランダム配列を有する１本鎖Ｄ
ＮＡとの連結は、相補鎖を見出す可能性は低いものの、
各々充分に効果的に生起することを示している。そし
て、この方法は今まで比較的困難であった。５’ＲＡＣ
Ｅによるクローニング技術にも効果的に応用することが
できる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】５’末端をＯＨ基にしたアンカーは自己連
結しなかった（図１１のレーン２参照）。５’末端にラ
ンダムテイルを有する１本鎖ＤＮＡが添加された場合に
は、連結が生起した（図１１レーン３−５参照）。連結
はＴＥＳＴＮ７ＤＮＡの場合が最も効果的であった。こ
れは、このもののランダムテイルの長さが、アンカーの
テイルの長さと同じであったからであろう。しかし、連
結の有効性はＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳＴＮ５においても
顕著な低下はみられなかった。ＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳ
ＴＮ５における充分な連結は、部分的なハイブリダイズ
で連結には充分であり、完全なハイブリダイズは必要無
いことを示している。しかしながら、アンカーが５’末
端にランダムテイルを持っていないＲＶと連結しないと
いう事実は、連結にはハイブリダイズが必要であること
を示している。このモデル実験の結果は、アンカーＤＮ
Ａと５’及び３’末端にランダム配列を有する１本鎖Ｄ
ＮＡとの連結は、相補鎖を見出す可能性は低いものの、
各々充分に効果的に生起することを示している。そし
て、この方法は今まで比較的困難であった。５’ＲＡＣ
Ｅによるクローニング技術にも効果的に応用することが
できる。
結しなかった（図１１のレーン２参照）。５’末端にラ
ンダムテイルを有する１本鎖ＤＮＡが添加された場合に
は、連結が生起した（図１１レーン３−５参照）。連結
はＴＥＳＴＮ７ＤＮＡの場合が最も効果的であった。こ
れは、このもののランダムテイルの長さが、アンカーの
テイルの長さと同じであったからであろう。しかし、連
結の有効性はＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳＴＮ５においても
顕著な低下はみられなかった。ＴＥＳＴＮ９及びＴＥＳ
ＴＮ５における充分な連結は、部分的なハイブリダイズ
で連結には充分であり、完全なハイブリダイズは必要無
いことを示している。しかしながら、アンカーが５’末
端にランダムテイルを持っていないＲＶと連結しないと
いう事実は、連結にはハイブリダイズが必要であること
を示している。このモデル実験の結果は、アンカーＤＮ
Ａと５’及び３’末端にランダム配列を有する１本鎖Ｄ
ＮＡとの連結は、相補鎖を見出す可能性は低いものの、
各々充分に効果的に生起することを示している。そし
て、この方法は今まで比較的困難であった。５’ＲＡＣ
Ｅによるクローニング技術にも効果的に応用することが
できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】本発明のアンカーとしては、少なくとも制
限酵素の認識配列、挿入される塩基配列、及び標的ＤＮ
Ａの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補
的な塩基配列（テイル）を含有しているものであり、こ
れと対をなすアンカーは少なくとも制限酵素の認識配
列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし
得る１本鎖の相補的な塩基配列（テイル）を含有してい
ればよい。本発明はこのようなアンカーの対（アンカー
セット）を提供するものでもある。そして、アンカー
は、さらにＰＣＲ用のプライマー領域を含有するもので
あるが、このプライマー領域は他の塩基配列と重複して
使用することができる。制限酵素は６塩基の認識配列を
持ち、認識配列の外側でＤＮＡを切断することが必要で
ある。認識配列の中で切断される場合には挿入される塩
基が認識配列の中の塩基となり、任意の塩基配列を選択
することができなくなるからである。認識配列の中の塩
基配列を挿入しようとする場合には、認識配列の中でＤ
ＮＡを切断する制限酵素を使用することも可能ではあ
る。
限酵素の認識配列、挿入される塩基配列、及び標的ＤＮ
Ａの末端塩基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補
的な塩基配列（テイル）を含有しているものであり、こ
れと対をなすアンカーは少なくとも制限酵素の認識配
列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし
得る１本鎖の相補的な塩基配列（テイル）を含有してい
ればよい。本発明はこのようなアンカーの対（アンカー
セット）を提供するものでもある。そして、アンカー
は、さらにＰＣＲ用のプライマー領域を含有するもので
あるが、このプライマー領域は他の塩基配列と重複して
使用することができる。制限酵素は６塩基の認識配列を
持ち、認識配列の外側でＤＮＡを切断することが必要で
ある。認識配列の中で切断される場合には挿入される塩
基が認識配列の中の塩基となり、任意の塩基配列を選択
することができなくなるからである。認識配列の中の塩
基配列を挿入しようとする場合には、認識配列の中でＤ
ＮＡを切断する制限酵素を使用することも可能ではあ
る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】挿入される塩基配列は、理論的には１塩基
以上であればよいが、コドン単位での変異を望む場合に
は、３塩基または４塩基からなるものが好ましい。天然
のアミノ酸による置換の場合には３塩基を非天然のアミ
ノ酸での置換の場合には４塩基にするのがよい。また、
標的となるＤＮＡには、特に制限はないが、蛋白質をコ
ードしているＤＮＡが好ましい。これによりアミノ酸が
置換された変異蛋白質のライブリーを作成することがで
きる。
以上であればよいが、コドン単位での変異を望む場合に
は、３塩基または４塩基からなるものが好ましい。天然
のアミノ酸による置換の場合には３塩基を非天然のアミ
ノ酸での置換の場合には４塩基にするのがよい。また、
標的となるＤＮＡには、特に制限はないが、蛋白質をコ
ードしているＤＮＡが好ましい。これによりアミノ酸が
置換された変異蛋白質のライブリーを作成することがで
きる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】標的となるＤＮＡの末端にそのＤＮＡ中で
唯一の制限酵素切断配列を持っていない場合には、当該
ＤＮＡの末端に、当該ＤＮＡ中には無い塩基配列であっ
て、制限酵素により切断できる塩基配列を付加すること
が好ましい。本発明の方法で得られた変異ＤＮＡを用い
て常法によりアミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換され
た蛋白質を発現させることができる。この方法により天
然の蛋白質の１個又は一部のアミノ酸が他のアミノ酸又
は非天然のアミノ酸に置換された蛋白質を製造すること
ができる。最初に得られる変異ＤＮＡはランダムに置換
されているので、ランダムにアミノ酸が、他のアミノ酸
に置換された蛋白質のライブラリーを製造することがで
きる。また、その中の特定のＤＮＡを選択することによ
り、特定の蛋白質を特異的に製造することもできる。
唯一の制限酵素切断配列を持っていない場合には、当該
ＤＮＡの末端に、当該ＤＮＡ中には無い塩基配列であっ
て、制限酵素により切断できる塩基配列を付加すること
が好ましい。本発明の方法で得られた変異ＤＮＡを用い
て常法によりアミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換され
た蛋白質を発現させることができる。この方法により天
然の蛋白質の１個又は一部のアミノ酸が他のアミノ酸又
は非天然のアミノ酸に置換された蛋白質を製造すること
ができる。最初に得られる変異ＤＮＡはランダムに置換
されているので、ランダムにアミノ酸が、他のアミノ酸
に置換された蛋白質のライブラリーを製造することがで
きる。また、その中の特定のＤＮＡを選択することによ
り、特定の蛋白質を特異的に製造することもできる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】このように本発明の方法は、特定のコドン
配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置の
塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン配
列に置き換えることを可能とする。また、２０種のアミ
ノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用いる
ことにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のアミ
ノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドン類を使用することによる非天然ア
ミノ酸をランダムな位置に導入した蛋白質ライブラリー
の作成、（ｃ）アラニンを指定する３塩基コドンを使用
することによる、蛋白質のアラニンスキャン、（ｄ）挿
入配列として新しい制限酵素認識配列を導入することに
よる、蛋白質のハイブリッド化やサーキュラー変異、
（ｅ）ランダムな任意の長さの挿入配列を用いることに
よる、蛋白質のランダム挿入変異、（ｆ）欠失の長さを
制御することによる、蛋白質のランダム欠失変異、など
があげられる。本方法はＤＮＡ組換え法における新手法
として広い範囲の研究や産業あるいは創薬の分野で応用
できるものである。
配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置の
塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン配
列に置き換えることを可能とする。また、２０種のアミ
ノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用いる
ことにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のアミ
ノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドン類を使用することによる非天然ア
ミノ酸をランダムな位置に導入した蛋白質ライブラリー
の作成、（ｃ）アラニンを指定する３塩基コドンを使用
することによる、蛋白質のアラニンスキャン、（ｄ）挿
入配列として新しい制限酵素認識配列を導入することに
よる、蛋白質のハイブリッド化やサーキュラー変異、
（ｅ）ランダムな任意の長さの挿入配列を用いることに
よる、蛋白質のランダム挿入変異、（ｆ）欠失の長さを
制御することによる、蛋白質のランダム欠失変異、など
があげられる。本方法はＤＮＡ組換え法における新手法
として広い範囲の研究や産業あるいは創薬の分野で応用
できるものである。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】実施例８ （ＤＮＡ切断位置のランダム性
の検証） Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の１ＵのＰｆｘ
ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．
３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び４０ｎｇのステップ５の最
初のＰＣＲ産物のゲル精製物を含有する反応混合物２０
０μＬ中で、ＰＣＲを行った。第２回目のＰＣＲの温度
サイクルは、第１回目のＰＣＲと同じであった。エタノ
ールで沈殿した後、生成物を２０μＬの１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．０）に溶解させた。２０ＵのＥｃｏＲ
Ｉを含むＥｃｏＲＩ緩衝液中に第２回目のＰＣＲ産物５
μＬを含有する５０μＬの反応混合物中で、ＥｃｏＲＩ
による切断を行った。反応混合物を３７℃で１時間イン
キュベートし、エタノールで沈殿させた。生成物を６％
ＰＡＧＥで分析した。結果を図１４に示す。図１４は、
環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダムに行われたか否かを
検証する方法の概要示す（図１４の（ａ））、またを図
１４の（ｂ）は切断のランダムさを検証した結果を示す
図面に代わる写真である。図１４の（ｂ）のレーンＭ１
はＤＮＡマーカーであり、レーン１及びレーン３はステ
ップ６におけるＰＣＲ産物であり、レーン２及び４はそ
のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切断したものである。レー
ン１及び２は１μＬの場合であり、レーン３及び４は４
０μＬの場合である。
の検証） Ｐｆｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ緩衝液中の１ＵのＰｆｘ
ＤＮＡ ポリメラーゼ、各ｄＮＴＰ３００μＭ、０．
３μＭのＰＣＲ３ＣＯ、及び４０ｎｇのステップ５の最
初のＰＣＲ産物のゲル精製物を含有する反応混合物２０
０μＬ中で、ＰＣＲを行った。第２回目のＰＣＲの温度
サイクルは、第１回目のＰＣＲと同じであった。エタノ
ールで沈殿した後、生成物を２０μＬの１０ｍＭトリス
−塩酸（ｐＨ８．０）に溶解させた。２０ＵのＥｃｏＲ
Ｉを含むＥｃｏＲＩ緩衝液中に第２回目のＰＣＲ産物５
μＬを含有する５０μＬの反応混合物中で、ＥｃｏＲＩ
による切断を行った。反応混合物を３７℃で１時間イン
キュベートし、エタノールで沈殿させた。生成物を６％
ＰＡＧＥで分析した。結果を図１４に示す。図１４は、
環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダムに行われたか否かを
検証する方法の概要示す（図１４の（ａ））、またを図
１４の（ｂ）は切断のランダムさを検証した結果を示す
図面に代わる写真である。図１４の（ｂ）のレーンＭ１
はＤＮＡマーカーであり、レーン１及びレーン３はステ
ップ６におけるＰＣＲ産物であり、レーン２及び４はそ
のＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで切断したものである。レー
ン１及び２は１μＬの場合であり、レーン３及び４は４
０μＬの場合である。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５４】
【発明の効果】このように本発明の方法は、特定のコド
ン配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置
の塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン
配列に置き換えることを可能とする。また、２０種のア
ミノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用い
ることにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のア
ミノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドンを導入することによる非天然アミ
ノ酸含有蛋白質ライブラリーの作成、（ｃ）アラニンに
対応する３塩基コドンを使用することによる、蛋白質の
アラニンスキャン、（ｄ）挿入配列として新しい制限酵
素認識配列を導入することによる、蛋白質のハイブリッ
ド化やサーキュラー変異、（ｅ）ランダムな任意の長さ
の挿入配列を用いることによる、蛋白質のランダム挿入
変異、（ｆ）欠失の長さを制御することによる、蛋白質
のランダム欠失変異、などがあげられる。本方法はＤＮ
Ａ組換え法における新手法として広い範囲の研究や産業
あるいは創薬の分野で応用できるものである。
ン配列を持つアンカーを用いることで、ランダムな位置
の塩基配列を特定のアミノ酸をコードする特定のコドン
配列に置き換えることを可能とする。また、２０種のア
ミノ酸に対応するコドン類を含むアンカー混合物を用い
ることにより、ランダムな位置の塩基配列を２０種のア
ミノ酸のコドン類に置換ですることができるようになっ
た。さらに、４塩基コドンを挿入することによりランダ
ムな位置のアミノ酸を特定の非天然アミノ酸に置き換え
ることが可能となった。そして、１個の蛋白質あたり正
確に１個の変異を導入できるようになった。本発明の変
異法は、削除する塩基の数、挿入する塩基の数及び配列
を任意に設定できるため、非常に汎用性の高いＤＮＡラ
イブラリーの作成ができる。その応用としては、（ａ）
指定したコドンとして、２０種類のアミノ酸のコドンの
混合物を用いることによる、ランダムな位置のアミノ酸
をランダムなアミノ酸に置換した蛋白質ライブラリーの
作成、（ｂ）指定したコドンとして、非天然アミノ酸に
対応する４塩基コドンを導入することによる非天然アミ
ノ酸含有蛋白質ライブラリーの作成、（ｃ）アラニンに
対応する３塩基コドンを使用することによる、蛋白質の
アラニンスキャン、（ｄ）挿入配列として新しい制限酵
素認識配列を導入することによる、蛋白質のハイブリッ
ド化やサーキュラー変異、（ｅ）ランダムな任意の長さ
の挿入配列を用いることによる、蛋白質のランダム挿入
変異、（ｆ）欠失の長さを制御することによる、蛋白質
のランダム欠失変異、などがあげられる。本方法はＤＮ
Ａ組換え法における新手法として広い範囲の研究や産業
あるいは創薬の分野で応用できるものである。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】図１４は、環状１本鎖ＤＮＡの切断がランダ
ムに行われたか否かを検証する方法の概要示す（図１４
の（ａ））、またを図１４の（ｂ）は切断のランダムさ
を検証した結果を示す図面に代わる写真である。
（削除）
ムに行われたか否かを検証する方法の概要示す（図１４
の（ａ））、またを図１４の（ｂ）は切断のランダムさ
を検証した結果を示す図面に代わる写真である。
（削除）
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】削除
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正内容】
【図９】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 HA01 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR55 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 DA13
Claims (30)
- 【請求項１】 ＤＮＡを環化して、環状の１本鎖ＤＮＡ
を作成し、この環状のＤＮＡの任意の１カ所を切断し、
得られた鎖状の１本鎖ＤＮＡの両端にアンカーを結合さ
せ、これをＰＣＲ法により増幅させ、次に認識配列の外
側でＤＮＡを切断する制限酵素を用いてアンカー中の認
識配列の外側を切断し、片側の末端にアンカー中に調製
しておいた特定の塩基配列が挿入されるようにしてお
き、もう一端は他端に挿入された塩基数と同数の塩基配
列が削除されるようにしておくことを特徴とするＤＮＡ
の変異方法。 - 【請求項２】 一方のアンカーが、制限酵素の認識配
列、挿入される塩基配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配
列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列を
含有している請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 他方のアンカーが、制限酵素の認識配
列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリダイズし
得る１本鎖の相補的な塩基配列を含有している請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 アンカーが、さらにＰＣＲ用のプライマ
ー領域を含有してなる請求項２又は３に記載の方法。 - 【請求項５】 ＰＣＲ用のプライマー領域が、他の塩基
配列と重複して使用される請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 アンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列と
ハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列が、ラ
ンダム配列である請求項２〜５のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項７】 挿入される塩基配列が、３塩基または４
塩基からなるものである請求項１〜６のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項８】 ４塩基の配列が、非天然アミノ酸に対応
するＣＧＧＴである請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 認識配列の外側でＤＮＡを切断する制限
酵素が、６塩基からなる配列を認識する酵素である請求
項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 認識配列の外側でＤＮＡを切断する制
限酵素が、ＢｃｉVIである請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 環状の１本鎖ＤＮＡが、センス鎖であ
る請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡが、蛋白質をコードしているＤ
ＮＡである請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡが、当該ＤＮＡの末端に、当該
ＤＮＡ中に無い塩基配列であって、制限酵素により切断
できる塩基配列を付加されたものである請求項１〜１２
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項１２又は１３に記載の方法によ
り得られた変異させたＤＮＡを用いて、アミノ酸の一部
が他のアミノ酸に置換された蛋白質を発現させることを
特徴とする変異した蛋白質の製造方法。 - 【請求項１５】 アミノ酸が、非天然のアミノ酸に置換
されたものである請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項１４又は１５に記載の方法によ
り、アミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換された変異し
た蛋白質の蛋白質ライブラリーを製造する方法。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法で得ることが
できる、アミノ酸の一部が他のアミノ酸に置換された変
異した蛋白質ライブラリー。 - 【請求項１８】 少なくとも認識配列の外側でＤＮＡを
切断する制限酵素の認識配列、及び標的ＤＮＡの末端塩
基配列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配
列を含有してなるオリゴヌクレオチドからなるアンカ
ー。 - 【請求項１９】 アンカーが、さらに挿入される塩基配
列を含有している請求項１８に記載のアンカー。 - 【請求項２０】 一方のアンカーが、制限酵素の認識配
列、挿入される塩基配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配
列とハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列を
含有するアンカーであり、他方のアンカーが、制限酵素
の認識配列、及び標的ＤＮＡの末端塩基配列とハイブリ
ダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列を含有するアン
カーである２種のアンカーからなるアンカーセット。 - 【請求項２１】 アンカーが、さらにＰＣＲ用のプライ
マー領域を含有してなる請求項１８〜２０のいずれかに
記載のアンカー。 - 【請求項２２】 ＰＣＲ用のプライマー領域が、他の塩
基配列と重複して使用される請求項２１に記載のアンカ
ー。 - 【請求項２３】 アンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列
とハイブリダイズし得る１本鎖の相補的な塩基配列が、
ランダム配列である請求項１８〜２２のいずれかに記載
のアンカー。 - 【請求項２４】 挿入される塩基配列が、３塩基または
４塩基からなるものである請求項１８〜２３のいずれか
に記載のアンカー。 - 【請求項２５】 ４塩基の配列が、非天然アミノ酸に対
応するＣＧＧＴである請求項２４に記載のアンカー。 - 【請求項２６】 認識配列の外側でＤＮＡを切断する制
限酵素が、６塩基からなる配列を認識する酵素である請
求項１８〜２５のいずれかに記載のアンカー。 - 【請求項２７】 認識配列の外側でＤＮＡを切断する制
限酵素が、ＢｃｉVIである請求項２６に記載のアンカ
ー。 - 【請求項２８】 末端の塩基配列が未知な１本鎖ＤＮＡ
にアンカーを連結させる方法であって、塩基配列のわか
っている２本鎖の領域と標的ＤＮＡの末端塩基配列とハ
イブリダイズするための１本鎖の塩基配列の部分とを有
するアンカーを用いて、当該アンカーの標的ＤＮＡの末
端塩基配列とハイブリダイズするための１本鎖の塩基配
列がランダムな種々の塩基配列を有するアンカー群と１
本鎖ＤＮＡとを接触させることからなる末端の塩基配列
が未知な１本鎖ＤＮＡにアンカーを連結させる方法。 - 【請求項２９】 アンカーの標的ＤＮＡの末端塩基配列
とハイブリダイズするための１本鎖の塩基配列部分の
３’末端及び／又は５’末端が保護されているアンカー
である請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 ３’末端の保護がアミノ化であり、
５’末端の保護がリン酸化しない状態のままである請求
項２９に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001057478A JP2002253255A (ja) | 2001-03-01 | 2001-03-01 | ランダム挿入削除ｄｎａ変異法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001057478A JP2002253255A (ja) | 2001-03-01 | 2001-03-01 | ランダム挿入削除ｄｎａ変異法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002253255A true JP2002253255A (ja) | 2002-09-10 |
Family
ID=18917346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001057478A Pending JP2002253255A (ja) | 2001-03-01 | 2001-03-01 | ランダム挿入削除ｄｎａ変異法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002253255A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002068634A3 (de) * | 2001-02-28 | 2003-10-30 | Volker Sieber | Verfahren zur herstellung von genbibliotheken |
| JP2008527987A (ja) * | 2005-01-20 | 2008-07-31 | ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド | ポリペプチド突然変異導入法 |
-
2001
- 2001-03-01 JP JP2001057478A patent/JP2002253255A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002068634A3 (de) * | 2001-02-28 | 2003-10-30 | Volker Sieber | Verfahren zur herstellung von genbibliotheken |
| JP2008527987A (ja) * | 2005-01-20 | 2008-07-31 | ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド | ポリペプチド突然変異導入法 |
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