KR20130008930A

KR20130008930A - 타겟 핵산서열의 계층적 제조방법

Info

Publication number: KR20130008930A
Application number: KR1020110069626A
Authority: KR
Inventors: 방두희; 김황범
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2011-07-13
Publication date: 2013-01-23
Also published as: KR101264295B1

Abstract

본 발명은 1 kb 이상의 타겟 핵산서열의 계층적(Hierarchical) 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 다중 층(multiple layers)으로 이루어진 플랭킹 DNA 서열을 포함하는 DNA 마이크로칩(microchip)에서 합성 된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 종래의 방법으로는 불가능하였던 1 kb 이상의 타겟 핵산서열 합성을 효과적으로 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 통한 유전자 합성 비용은 레진-기반된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 종래 방법에 비해 3배 이상 저렴하다. 따라서, 본 발명의 방법은 유전자 합성 비용을 현저하게 감소시킬 수 있는 매우 우수한 수단을 제공한다.

Description

타겟 핵산서열의 계층적 제조방법{Hierarchial Gene Synthesis Methods of a Target Nucleic Acid Sequence}

본 발명은 1 kb 이상의 타겟 핵산서열의 계층적 제조방법에 관한 것이다.

거대한 DNA 스트레치(stretches)(즉, 200 bp부터 전체 게놈 크기의 DNA)를 구축하는 기술은 화학 및 생물학의 많은 분야에 적용될 수 있다(Czar et al ., 2009; Mueller et al ., 2009). 예를 들어, 많은 합성 방법들은 생물학적 시스템을 탐침하기 위해 단백질-인코딩 서열, 그리고 바이러스 및 미생물 게놈의 데 노보(de novo) 구축용으로 개발되어 왔다(Cello et al ., 2002; Gibson et al ., 2008; Gibson et al . 2010; Hutchison et al ., 2005; Kodumal et al ., 2004; Tian et al ., 2009; Tumpey et al ., 2005). 최근에 백신 개발을 위한 약화된 바이러스 게놈의 합성(Coleman et al ., 2008; Mueller et al ., 2010), 그리고 효과적인 생물학적 약물 생산을 위한 코돈-최적화된 항체 서열의 합성(Welch et al ., 2009)은 의약 적용을 위한 DNA 구축의 유용성을 추가적으로 증명해 준다.

긴 DNA 서열은 다중 중첩성(overlapping) 합성 올리고뉴클레오타이드 및 과도한 양의 플랭킹 프라이머 서열을 이용한 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 어셈블리될 수 있다(Stemmer et al ., 1995). 또한, 효과적인 어셈블리는 PCR과 조합된 LCR(ligase chain reaction)에 의해 실시될 수 있다(Smith et al., 2003). 하지만, 올리고뉴클레오타이드의 고-비용(high-cost) 및 높은 합성 오류율(error rates)(Bang and Church, 2008; Smith et al ., 2003)이 저-비용 유전자 합성에 2개의 주요한 장애요인이다. 이로 인해, DNA 합성용 저-비용 기술의 개발이 시급히 요구되고 있다.

현재, 긴 DNA 서열의 합성을 위한 저비용 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 서로 다른 2개의 접근방법이 존재한다. 첫 번째 접근방식으로, Quake 그룹은 16개의 올리고뉴클레오타이드들을 합성하기 위해 전통적으로 조절된 동공 유리 레진(pore glass resin) 및 미세유체장치를 이용하여 200 bp DNA 분자를 어셈블리하였다(Lee et al ., 2010). 상기 접근방식은 미세유체장치로부터 상기 합성 올리고뉴클레오타이드들이 추가적인 증폭 없이 어셈블리를 위해 이용될 수 있다는 장점이 있다. 하지만, 작은 수의 올리고뉴클레오타이드들만이 상기 장치로부터 합성될 수 있기 때문에 상기 접근방식의 확장가능성(scalability)은 여전히 제한적이다.

저-비용 DNA 합성 방법을 개발하기 위한 또 다른 노력으로, Tian 등은 절단될 수 있는 DNA 마이크로칩으로부터 유래된 DNA 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법을 고안하였다(Tian et al., 2004). 수백개의 올리고뉴클레오타이드들이 프로그램될 수 있는(programmable) Atactic 칩(Houston, TX) 상에서 합성되어 절단되고 증폭되었으며, 이후 올리고뉴클레오타이드들은 E. coli 리보좀 단백질을 인코딩하는 21개의 유전자로 어셈블리되었다(Tian et al., 2004). 다중 DNA 분자를 구축하기 위해, 유사한 합성 방법이 DNA 마이크로칩을 이용하여 실시되었다(Richmond et al ., 2004; Zhou et al ., 2004). 보다 최근에, 마이크로어레이 올리고뉴클레오타이드를 이용한 블락-기반된 유전자 어셈블리 방법이 제안되었다(Borovkov et al., 2010). 놀랍게도, 상기 블락-기반된 합성 전략은 올리고뉴클레오타이드 증폭 단계의 필요성을 제거하여 유전자 합성 과정을 단순화시킨다. 하지만, 상술한 모든 마이크로어레이-기반된 유전자 합성 방법들은 작은 크기의 DNA 분자(1 kb 미만)의 구축에 제한되어 왔는데, 이는 마이크로칩-유래된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 긴 DNA 분자를 구축하는 데 어려움이 존재하기 때문이다: 21 DNA 단편들을 이용하여 어셈블리된 14.6 kb DNA의 구축은 매우 예외적인 경우였다(Tian et al ., 2004).

따라서, 보다 긴 DNA 분자를 효과적으로 어셈블리시킬 수 있는 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 보다 경제적이고 효율적으로 합성하는 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다중 공통적 프라이머 서열 및 최소 2개 이상의 제한효소 인지서열을 포함하는 다중 층(multiple layers)으로 이루어진 플랭킹 DNA 서열을 포함하는 DNA 마이크로칩으로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드 풀을 이용하여 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 합성할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 타겟 핵산서열의 계층적(Hierarchical) 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 타겟 핵산서열의 계층적(Hierarchical) 제조방법을 제공한다: (a) 5' to 3' 방향으로 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열(generic priming sequence), 제1차 5'-제한효소 절단 서열, 중첩하는(overlapping) 타겟 일부 서열, 제1차 3'-제한효소 절단 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 풀을 준비하는 단계; 상기 올리고뉴클레오타이드 풀에 있는 상기 중첩하는 타겟 일부 서열들은 서로 중첩하는 경우 타겟 핵산서열 전체를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드의 제1차 5'-제한효소 절단 서열과 제1차 3'-제한효소 절단 서열은 서로 동일하며; 상기 올리고뉴클레오타이드 풀 중에서 제1중간산물의 5'-말단 부위를 생성시키기 위한 제1올리고뉴클레오타이드는 5'-제한효소 절단 서열의 다운스트림에 5' to 3' 방향으로 5'-제2공통적 프라이밍 서열과 제2차 5'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하고, 제1중간산물의 3'-말단 부위를 생성시키기 위한 제2올리고뉴클레오타이드는 3'-제한효소 절단 서열의 업스트림에 3' to 5' 방향으로 3'-제2공통적 프라이밍 서열과 제2차 3'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하며; 제2중간산물의 5-말단 부위를 생성시키기 위한 제3올리고뉴클레오타이드는 5'-제한효소 절단 서열의 다운스트림에 5' to 3' 방향으로 5'-제3공통적 프라이밍 서열과 제3차 5'-제한효소 절단 서열을 포함하고, 제2중간산물의 3'-말단 부위를 생성시키기 위한 제4올리고뉴클레오타이드는 3'-제한효소 절단 서열의 업스트림에 3' to 5' 방향으로 3'-제3공통적 프라이밍 서열과 제3차 3'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하고; (b) 상기 올리고뉴클레오타이드 풀을 상기 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열에 혼성화 되는 제1차 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction) 증폭하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 증폭 결과물을 상기 제1차 5'-제한효소 절단 서열과 제1차 3'-제한효소 절단 서열에 작용하는 제한효소로 절단하는 단계; 상기 절단에 의해 상기 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열이 상기 올리고뉴클레오타이드로 풀로부터 해리(release) 되고; 상기 제1올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 제2공통적 프라이밍 서열이 위치하고, 상기 제2올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 제2공통적 프라이밍 서열이 위치하며, 상기 제3올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 제3공통적 프라이밍 서열이 위치하고, 상기 제4올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 제3공통적 프라이밍 서열이 위치하며; (d) (i) 상기 제1올리고뉴클레오타이드의 제2공통적 프라이밍 서열 및 제2올리고뉴클레오타이드의 제2공통적 프라이밍 서열에 혼성화 되는 프라미어 세트를 포함하는 제1어셈블리 증폭 반응물 1 및 (ii) 상기 제3올리고뉴클레오타이드의 제3공통적 프라이밍 서열 및 제4올리고뉴클레오타이드의 제3공통적 프라이밍 서열에 혼성화 되는 프라이머 세트를 포함하는 제1어셈블리 증폭 반응물 2를 이용하여 제1차어셈블리 PCR을 실시하여 각각 제1중간산물(intermediates) 및 제2중간산물을 생성시키는 단계; (e) 상기 단계 (d)의 제1중간산물 및 제2중간산물을 (i) 상기 제1올리고뉴클레오타이드의 제2차 5'-제한효소 절단 서열과 상기 제2올리고뉴클레오타이드의 제2차 3'-제한효소 절단 서열에 작용하는 제한효소 및 (ii) 상기 제3올리고뉴클레오타이드의 제3차 5'-제한효소 절단 서열과 상기 제4올리고뉴클레오타이드의 제3차 3'-제한효소 절단 서열에 작용하는 제한효소로 절단하는 단계; 및 (f) 상기 단계 (e)의 결과물을 어셈블리 하여 타겟 핵산서열을 수득하는 단계.

본 발명자들은 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 보다 경제적이고 효율적으로 합성하는 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 다중 층(multiple layers)으로 이루어진 플랭킹 DNA 서열을 포함하는 DNA 마이크로칩으로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드 풀을 이용하여 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 합성할 수 있다는 것을 발견하였다.

본 발명은 DNA 마이크로칩-유래된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 타겟 핵산서열을 합성하는 방법으로, 종래기술과 다르게 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 보다 경제적이고 효율적으로 합성할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 보다 큰 유전자(> 1 kb)를 확장 가능하게(scalable) 합성할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 올리고뉴클레오타이드 풀은 DNA 마이크로칩으로부터 유래하며, 상기 올리고뉴클레오타이드들은 다중 층(multiple layers)의 DNA 플랭킹 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드들은 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열, 제1차 5'-제한효소 절단 서열, 중첩하는(overlapping) 타겟 일부 서열, 제1차 3'-제한효소 절단 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열로 이루어져 있다.

상기 올리고뉴클레오타이드의 양 말단에 존재하는 제1공통적 프라이머 서열 쌍은 DNA 칩으로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드의 양을 증폭하기 위한 용도로, 충분한 양의 이중 가닥-올리고뉴클레오타이드(ds-oligonucleotides)들을 생산하기 위한 프라이머 세트의 어닐링 위치로 이용된다.

본 명세서에서 용어 뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 유전자 증폭은 PCR에 의해 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 프라이머는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는 중합제(예컨대, DNA 폴리머라제)의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프라이머는 컴퓨터 프로그램인 Per1 프로그램을 이용하여 제작된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 어닐링 또는 프라이밍은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어어닐링과 혼성화는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

본 발명의 방법에 따르면, 본 발명은 제1공통적 프라이밍 서열에 혼성화되는 프라이머 세트를 이용하여 올리고뉴클레오타이드 풀의 증폭한 후 제한효소 절단을 실시한다. 이후, 상기 올리고뉴클레오타이드 풀 중에서 제1중간산물 및 제2중간산물을 생산하기 위한 어셈블리 PCR을 서로 독립적인 반응물에서 실시하여 합성한다. 최종적으로, 상기 제1중간산물 및 제2중간산물의 어셈블리 PCR을 실시하여 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 제조한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중첩하는(overlapping) 타겟 일부 서열은 서로 중첩하는 경우 타겟 핵산서열 전체를 포함한다.

본 발명은 타겟 핵산서열을 합성하기 위해 중간산물(intermediates)을 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중간산물들은 서로 독립적으로 합성된다.

보다 상세하게는, 본 발명의 제1중간산물은 상기 단계 (a)에서 증폭된 올리고뉴클레오타이드들의 어셈블리 PCR을 통해 제조된다. 상기 올리고뉴클레오타이드들은 서로 중첩하는 서열을 포함한다. 상기 중첩하는 서열은 상기 올리고뉴클레오타이드 서열 중 일부의 상보적인 서열을 의미하고, 이는 상기 제1중간산물을 생산하기 위한 올리고뉴클레오타이드의 순차적인 어셈블리를 가능하도록 디자인된다. 바람직하게는, 제1중간산물의 5'-말단 부위를 생성시키기 위한 제1올리고뉴클레오타이드는 5'-제한효소 절단 서열의 다운스트림에 5' to 3' 방향으로 5'-제2공통적 프라이밍 서열과 제2차 5'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하고, 제1중간산물의 3'-말단 부위를 생성시키기 위한 제2올리고뉴클레오타이드는 3'-제한효소 절단 서열의 업스트림에 3' to 5' 방향으로 3'-제2공통적 프라이밍 서열과 제2차 3'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함한다. 또한, 제1올리고뉴클레오타이드와 제2올리고뉴클레오타이드 사이에 존재하는 제1중간산물을 구성하는 수개의 올리고뉴클레오타이드들은 순차적으로 어셈블리되는 중첩하는 서열을 포함하고 있을 뿐, 제1올리고뉴클레오타이드 및 제2올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 서열들을 포함하지 않는다. 또한, 제2중간산물도 5'-말단 부위를 생성시키기 위한 제3올리고뉴클레오타이드는 5'-제한효소 절단 서열의 다운스트림에 5' to 3' 방향으로 5'-제3공통적 프라이밍 서열과 제3차 5'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하고, 제2중간산물의 3'-말단 부위를 생성시키기 위한 제4올리고뉴클레오타이드는 3'-제한효소 절단 서열의 업스트림에 3' to 5' 방향으로 3'-제3공통적 프라이밍 서열과 제3차 3'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 제1중간산물의 양 말단은 5' to 3' 방향으로 제1올리고뉴클레오타이드 및 제2올리고뉴클레오타이드로 이루어져 있으며, 상기 단계 (a)의 제2중간산물의 양 말단은 5' to 3' 방향으로 제3올리고뉴클레오타이드 및 제4올리고뉴클레오타이드로 이루어져 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 제1중간산물 및 제2중간산물을 형성하는 올리고뉴클레오타이드의 수는 타겟 핵산서열의 길이에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 1 kb 이상의 타겟 핵산서열의 합성에서 이용되는 제1중간산물 및 제2중간산물을 형성하는 올리고뉴클레오타이드의 수는 최소 3개 이상이며, 보다 바람직하게는 최소 4개 이상이고, 보다 더 바람직하게는 최소 5개 이상이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)의 제2차 제한효소 절단 서열과 제3차 제한효소 절단 서열은 동일하거나 또는 서로 다르며, 보다 바람직하게는 서로 다르다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 제1중간산물 및 제2중간산물의 증폭은 서로 다른 튜브에서 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 제1중간산물 및 제2중간산물의 크기는 300-500 bp이고, 보다 바람직하게는 400-500 bp이다.

본 명세서에서 언급되는 용어 상보적(complementary)은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 명세서에 기재된 용어증폭 반응은 타겟 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호) 및 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현 예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명에서 이용될 수 있는 타겟 핵산서열은 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 DNA(gDNA 또는 cDNA) 및 RNA를 포함하며, 보다 바람직하게는 DNA를 포함한다. 또한, 타겟 핵산분자는 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens , Thermus scotoductus, Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 올리고뉴클레오타이드 풀을 이용하여 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 어셈블리할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에서 실시하는 어셈블리 PCR은 높은 어닐링 온도로 실시하며, 보다 바람직하게는 65℃ 이상에서 실시하고, 가장 바람직하게는 65-72℃에서 실시한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 1 kb 이상의 타겟 핵산서열을 보다 경제적이고 효율적으로 합성하는 계층적(hierarchical) 제조방법을 제공한다.

(b) 본 발명의 방법은 다중 층(multiple layers)으로 이루어진 플랭킹 DNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한다.

(c) 본 발명의 방법은 종래의 방법으로는 불가능하였던 1 kb 이상의 타겟 핵산서열 합성을 가능하게 한다.

(d) 또한, 본 발명의 방법을 통한 유전자 합성 비용은 레진-기반된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 종래 방법에 비해 3배 이상 저렴하다.

(e) 따라서, 본 발명의 방법은 유전자 합성 비용을 현저하게 감소시킬 수 있는 매우 우수한 수단을 제공한다.

도 1은 Dpo4 유전자를 서로 다른 2개의 합성 전략으로 합성하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다. (A) 과정은 3개의 단편이 하나의 유전자로 어셈블리 되는 과정을 보여준다. (B) 과정은 타겟 유전자로의 직접적인 어셈블리를 나타낸다.
도 2는 Dpo4 유전자를 구축하는 과정 상의 젤 사진이다. 예상된 산물의 밴드를 빨간색 삼각형으로 표시하고 있다. 도 2a는 플랭킹 프라이머로 PCR-증폭된 Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드의 6% TBE 젤 사진이다. 레인 1, 100 bp DNA 래더; 레인 2, 10 bp DNA 래더; 및 레인 3, Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드. 도 2b는 증폭된 ds-올리고뉴클레오타이드를 EarI 제한효소로 절단하여 6% TBE 젤에 전기영동한 사진이다. 도 2c는 첫 번째 어셈블리 PCR을 실시해 Dpo4 유전자에 대한 3개의 단편을 형성시킨 결과이다. 레인 1, 100 bp DNA 래더; 레인 2, 363 bp의 첫 번째 단편; 레인 3, 429 bp의 두 번째 단편; 및 레인 4, 330 bp의 세 번째 단편. 도 2d는 도 2c에서 나타낸 3개의 DNA 단편들을 이용하여 어셈블리된 Dpo4 유전자의 아가로오스 젤 사진이다. 도 2e는 Dpo4 유전자의 직접 합성을 위한 올리고뉴클레오타이드들이 플랭킹 프라이머를 이용하여 증폭된 결과이다. 도 2f는 증폭된 ds-올리고뉴클레오타이드들이 EarI 제한효소로 절단된 후, 레인 2에 로딩되어 전기영동시킨 결과이다. 도 2g는 Dop4 유전자의 직접적인(one-pot) 합성을 보여주는 젤 사진이다.
도 3은 Dpo4 유전자의 계층적 합성을 보여주는 젤 이미지 결과이다. 도 3a는 플랭킹 프라이머 쌍으로 증폭된 ds-올리고뉴클레오타이드들의 6% TBE 젤 사진이다. 레인 1, 10 bp DNA 래더; 및 레인 2, PCR 산물. 도 3b는 증폭된 ds-올리고뉴클레오타이드들이 EarI 제한효소로 절단된 후 전기영동시킨 결과이다. 레인 1, 100 bp DNA 래더; 및 레인 2, 절단 산물. 도 3c는 Dpo4 유전자에 대한 600 bp 중간산물 단편들을 아가로오스 젤에 로딩한 결과이다. 레인 1, 100 bp DNA 래더; 및 레인 2, 중간산물. 도 3d는 최종적으로 어셈블리된 PCR 산물을 보여주는 결과로, Dpo4 산물이 두 번째 레인에 로딩되었다.
도 4는 계층적 유전자 합성 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다. Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드의 초기 PCR 증폭이 2개의 다른 튜브에서 실시되었다. 복제성 어댑터 서열(generic adopter sequences)을 제거한 후, 상기 ds-올리고뉴클레오타이드들이 400-500 bp DNA 단편의 구축에 이용되었다. 두 세트의 복제성 플랭킹 서열들이 이용되어 one-pot에서 다양한 400-600 bp DNA 단편들이 동시에 구축되었다. 중간산물 단편들에서 두 번째 세트의 플랭킹 서열이 절단되었으며, 이후 중간산물 단편들의 풀이 타겟 유전자의 제작에 이용되었다.
도 5는 계층적 Pfu 유전자를 합성하는 과정 상의 젤 사진이다. (a) Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드들이 2개의 서로 다른 PCR 튜브에서 2쌍의 프라이머들을 이용하여 증폭되었다. 레인 1, 10 bp DNA 래더; 레인 2, EarI 및 BsgI 제한효소 위치를 가지는 ds-올리고뉴클레오타이드; 및 레인 3, EarI 및 BtsI 제한효소 위치를 가지는 ds-올리고뉴클레오타이드. (b) 상기 2개의 ds-올리고뉴클레오타이드들의 플랭킹 서열이 EarI 제한효소로 절단되었다. (c) 두 번째 세트의 플랭킹 프라이머를 이용하여 어셈블리 PCR이 실시되었다. 레인 1, 100 bp DNA 래더; 레인 2, BsgI 제한효소 위치를 가지는 4개의 단편; 및 레인 3, BtsI 제한효소 위치를 가지는 3개의 단편. (d) 2개의 서로 다른 세트의 단편들을 BsgI 또는 BtsI로 절단시킨 후, 최종 어셈블리 PCR을 실시하였다. 2,325 bp의 긴 Pfu 유전자가 성공적으로 제조되었다. 레인 1, 2-로그 DNA 래더; 및 레인 2, 어셈블리된 PCR 산물.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험재료

특별히 언급되지 않은 한, 모든 재료는 하기 나열된 회사(vendors)로부터 구매하였다. DNA 마이크로어레이 올리고뉴클레오타이드는 Agilent 사(Santa Clara, CA, USA)로부터 구매하였다. 다른 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머들은 IDT(Coralville, IA, USA), 바이오니아(한국) 및 마크로젠(한국)으로부터 구매하였다. DNA 정제 키트 및 플라스미드 추출 키트는 Qiagen(Valencia, CA, USA) 및 바이오니아(한국)로부터 구매하였다. 제한 효소 및 리가제는 NEB(New England Biolabs, MA, USA), Fermentas 및 Takara(일본)으로부터 구매하였다. iProof^TM DNA polymerase는 Bio-rad(Hercules, CA, USA)로부터 구매하였다. DNA 시퀀싱 분석 프로그램(Lasergene)은 DNAstar(Madison, WI, USA)로부터 구매하였다.

타겟 DNA 시퀀싱 및 올리고뉴클레오타이드 디자인

코돈-최적화된 Dpo4(1,056 bp; protein sequence from Sulfolobus solfataricus P2 DNA polymerase IV) 및 Pfu DNA 폴리머라제(GenBank 접근번호, P61875)가 합성 모델로 선택되었다. 양성 가닥 및 음성 가닥 올리고뉴클레오타이드를 디자인하기 위해, 본 발명자들은 연구실 내(in-house) Per1 프로그램을 이용하였다. 복제성(generic) 플랭킹 서열을 포함하는 각 Agilent 칩 올리고의 길이는 150 뉴클레오타이드였다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 마이크로어레이 형태로 Agilent 사에서 합성되었다. 올리고뉴클레오타이드 서열은 하기 타겟 서열 정보에서 제공된다.

One-pot Dpo4 합성

플랭킹 프라이머와 마이크로어레이로부터 절단된 Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR 증폭을 통해 150 bp의 이중 가닥 DNA 서열을 제조하였다.

상기 PCR은 제조자의 프로토콜에 따라 iProof^TM DNA 폴리머라제(Bio-rad)를 이용하여 50 반응물로 실시하였으며, 그 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 57℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 25 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 이후, 상기 PCR 산물을 4℃에 보관하였다. 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 농도를 증가시키기 위해 PCR 산물을 재-증폭하였다. 상기 PCR 혼합물은 200 ㎕의 iProof^TM DNA 폴리머라제, 160 ㎕의 물, 8 ㎕의 첫 번째 PCR 산물, 10 ㎕의 정방향 프라이머(20 M) 및 10 ㎕의 역방향 프라이머(20 μM)를 포함하였다. PCR 조건은 10 사이클의 PCR 증폭을 제외하고는 상기 첫 번째 PCR 조건과 동일하였다. 본 발명자들은 PCR 정제 키트를 이용하여 상기 산물을 정제하여 45 ㎕의 물로 용출(탈염 및 완충액 교환 과정)하였다. 상기 정제된 ds-올리고뉴클레오타이드들은 37에서 3시간 동안 EarI 제한효소로 절단되었다. 반응 혼합물은 45 ㎕의 키트-정제된 산물, 10 ㎕의 EarI(20 units/㎕; NEB) 제한효소, 0.5 ㎕의 BSA 및 6 ㎕의 10 NEB 완충액 1을 혼합하여 제조하였다. 그 다음으로, 본 발명자들은 6% TBE 젤에 전기영동하여 ds-올리고뉴클레오타이드가 올바르게 절단되었는 지 여부를 확인하였다. 이후, 본 발명자들은 PCR 정제 키트를 이용하여 산물을 정제하였다. 상기 ds-올리고뉴클레오타이드 풀을 템플레이트로 XbaI 및 PstI 제한효소 위치를 가지는 프라이머를 이용한 어셈블리 PCR을 실시하였다. 총 반응 용량은 20 ㎕였으며, 72℃의 어닐링 온도 및 35 사이클의 PCR 증폭 과정을 제외하고는 상술한 PCR 조건과 동일하였다. 본 발명자들은 최종 어셈블리 산물을 아가로오스-젤 정제를 통해 정제하였다. 상기 정제된 산물은 XbaI(20 units/㎕; NEB) 및 PstI(20 units/㎕; NEB) 제한효소를 이용하여 pUC19 벡터에 클로닝하였다. 본 발명자들은 제한효소 절단을 2시간 동안 실시한 후 효소 활성을 정지시키기 위한 DNA 컬럼 정제를 실시하였고 20 의 물로 산물을 용출하였다. 본 발명자들은 혼합물에 2 ㎕의 T4 DNA 라이게이션 완충액 및 2 ㎕의 T4 DNA 리가제(400 units/㎕; NEB)를 첨가하여 16℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, NEB C2987에서 유래된 컴피턴트 E. coli 세포에 화학적으로 형질전환시켰다. 카르베니실린 항생제를 포함하는 아가 플레이트에서 37℃로 하룻밤 동안 콜로니를 성장시킨 후, 본 발명자들은 콜로니 시퀀싱을 실시하였다. 시퀀싱 데이터는 Lasergene을 이용하여 분석하였다.

세 개의 단편 어셈블리를 통한 Dpo4 합성

One-pot Dpo4 합성에 이용된 전략과는 다르게, 각 Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드는 플랭킹 서열에 EarI 및 BccI 제한효소 위치를 포함하였다. 본 발명자들은 One-pot Dpo4 합성에 이용된 동일한 PCR 조건에 따라 플랭킹 프라이머를 이용하여 올리고뉴클레오타이드의 PCR 증폭을 실시하였다. 올리고뉴클레오타이드 농도를 증가시키기 위해 재-증폭 과정(10 사이클의 PCR)을 실시하였다. 본 발명자들은 PCR 정제 키트를 이용하여 ds-올리고뉴클레오타이드 산물을 정제하였다. 제한효소 절단은 EarI 및 BccI 제한효소를 이용하여 실시하였다.

반응 혼합물은 45 ㎕의 PCR 산물, 5 ㎕의 EarI(20 units/㎕; NEB) 제한효소, 5 ㎕의 BccI(20 units/㎕; NEB) 제한효소, 6 ㎕의 10 NEB 완충액 1 및 0.5 ㎕의 BSA(20×)을 혼합하여 제조하였다. 그 다음으로, 본 발명자들은 6% TBE 젤에 전기영동하여 100 bp의 정확하게-절단된(well-cut) ds-올리고뉴클레오타이드를 확인하였다. 절단된(processed) ds-올리고뉴클레오타이드를 얻기 위해 PCR 정제 키트를 이용하였다. 본 발명자들은 각 반응에 대해 363 bp, 429 bp 및 330 bp의 예상 크기를 가지는 서로 다른 PCR 튜브에서 첫 번째 어셈블리 PCR을 실시하였다. 본 발명자들은 각 튜브에서 3 ㎕의 PCR 산물을 6% TBE 젤에 전기영동하여 산물의 크기를 평가하고 밴드를 절단하여 젤을 잘게 부쉈다. 상기 으깨진 젤을 50 ㎕의 TE 완충액에 녹인 후, DNA 추출을 위해 65℃에서 반응시켰다. XbaI 및 PstI 제한효소 위치를 가지는 프라이머를 이용하여 Dpo4 유전자를 어셈블리시키기 위해, 본 발명자들은 상기 3개의 단편의 어셈블리 PCR을 실시하였다. 본 발명자들은 상기 PCR 산물을 아가로오스 젤에 전기영동하여 1 kb 크기 부위를 절단하여 젤 추출 키트를 이용하여 젤 정제를 실시하고 그 산물을 XbaI 및 PstI 제한효소를 이용하여 pUC19 벡터에 클로닝하였다. 본 발명자들은 제한효소 절단을 2시간 동안 실시한 후 DNA 컬럼 정제를 실시하였고 T4 DNA 라이게이션 완충액 및 T4 DNA 리가제를 첨가하였다. 상기 혼합물을 16℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 컴피턴트 E. coli 세포에 화학적으로 형질전환시켰다. 아가 플레이트에서 37℃로 하룻밤 동안 콜로니를 성장시킨 후, 본 발명자들은 콜로니를 선택하여 콜로니 시퀀싱을 실시하였다.

계층적( Hierarchical ) Dpo4 합성

PCR 증폭이 첫 번째 세트의 플랭킹 프라이머 서열을 포함하는 Agilent 칩으로부터 절단된 올리고뉴클레오타이드를 템플레이트로 이용하여 실시하여 150 bp의 산물을 생산하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 53℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 26 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 이후, 상기 PCR 산물을 4℃에 보관하였으며, 올리고뉴클레오타이드 농도를 증가시키기 위해 53℃의 어닐링 온도를 제외하고는 상술한 PCR 조건과 동일하게 PCR 산물을 재-증폭(10 사이클의 PCR 증폭)하였다. 그 다음으로, 본 발명자들은 6% TBE 젤에 전기영동하였으며, 45 ㎕의 PCR 산물, 10 ㎕의 EarI 제한효소, 6 ㎕의 10 NEB 완충액 1 및 0.5 ㎕의 BSA를 혼합하여 37℃에서 반응시킴으로써 제한효소 절단을 실시하였다. 이후, 두 번째 세트의 플랭킹 프라이머를 이용하여 어셈블리 PCR을 실시하였다. 어셈블리 PCR의 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 72℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 35 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 상기 PCR 산물은 4℃에 보관하였다. 이후, 플랭킹 서열을 절단하기 위해 EarI 제한효소를 이용하여 제한효소 절단을 실시하였다(본 발명자들이 첫 번째 및 두 번째 PCR의 프라이머 서열 모두에 EarI을 이용할 수 있었을 지라도, 프라이머 서열에 직교형 세트의 제IIS형 제한효소 위치를 이용하는 것이 합성 효율을 개선시킬 수 있다: 참고, Pfu DNA 폴리머라제를 인코딩하는 유전자의 계층적 합성을 위한 하기의 방법).

어셈블리 PCR은 XbaI 및 PstI 제한효소 위치를 가지는 프라이머, 링킹(linking) 올리고뉴클레오타이드 및 iProof^TM DNA 폴리머라제를 이용하여 실시하였다. PCR 반응 혼합물은 10 ㎕의 iProof^TM DNA 폴리머라제, 9 ㎕의 물, 1 ㎕의 제한효소 절단된 산물, 0.5 ㎕의 정방향 프라이머, 0.5 ㎕의 역방향 프라이머 및 1 ㎕의 링킹 올리고뉴클레오타이드(0.4 μM)를 포함하였다. PCR은 63℃의 어닐링 온도에서 25 사이클의 PCR 증폭 과정으로 실시하였다.

본 발명자들은 PCR 산물을 아가로오스 젤에 전기영동하여 젤 추출 키트를 이용하여 젤 정제를 실시하고 그 산물을 XbaI 및 PstI 제한효소를 이용하여 pUC19 벡터에 클로닝하였다. 클로닝 및 형질전환 단계는 상술한 바와 같이 실시하였다. 이후, 본 발명자들은 콜로니를 선택하여 콜로니 시퀀싱을 실시하였다.

계층적 Pfu 합성

PCR 증폭이 150 bp의 산물을 생산하는 서로 다른 2개의 튜브에서 두 가지 세트의 플랭킹 프라이머로 Agilent 칩으로부터 절단된 올리고뉴클레오타이드를 템플레이트로 이용하여 실시하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 53℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 26 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 상기 PCR 산물을 4℃에 보관하였다. 이후, 올리고뉴클레오타이드 농도를 증가시키기 위해 53℃의 어닐링 온도를 제외하고는 상술한 PCR 조건과 동일하게 PCR 산물을 재-증폭하였다. 산물을 확인하기 위해 6% TBE 젤에 전기영동하였으며, 90 ㎕의 PCR 산물, 10 ㎕의 EarI 제한효소, 10 ㎕의 10 NEB 완충액 1 및 BSA를 혼합하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켜는 제한효소 절단을 실시하여 플랭킹 서열을 제거하였다. DNA 컬럼 정제(40 ㎕의 물로 용출) 후, 두 번째 세트의 플랭킹 프라이머를 이용한 어셈블리 PCR을 실시하여 2개의 서로 다른 반응 혼합물에서 pfu DNA 폴리머라제 유전자의 단편들을 제조하였다. 어셈블리 PCR 조건은 60℃의 어닐링 온도에서 35 사이클의 PCR 증폭 과정을 실시하는 것을 제외하고는 상술한 PCR 조건과 동일하였다. PCR 반응 혼합물은 10 ㎕의 iProof^TM DNA 폴리머라제, 4 ㎕의 물, 6 ㎕의 플랭킹 서열-절단된 ds-올리고뉴클레오타이드, 0.5 ㎕의 정방향 프라이머 및 0.5 ㎕의 역방향 프라이머를 포함하였다. PCR은 63℃의 어닐링 온도에서 25 사이클의 PCR 증폭 과정으로 실시하였다. 제한효소 절단은 2 ㎕의 BsgI 제한효소(5 units/㎕; NEB), 14 ㎕의 PCR 산물, 2 ㎕의 NEB 완충액 4 및 1× SAM을 포함하는 한 튜브에서 37℃로 1시간 동안 실시하였다. 또한, 두 번째 튜브에서 제한효소 절단은 2 ㎕의 BtsI 제한효소(10 units/㎕; NEB), 14 ㎕의 PCR 산물, 2 ㎕의 NEB 완충액 1 및 1× BSA를 혼합하여 55℃로 2시간 동안 실시하였다. DNA 컬럼 정제 후, 2개의 반응 혼합물을 각각 6 ㎕씩 혼합하여 이를 템플레이트로 XbaI 및 PstI 제한효소 위치를 가지는 프라이머를 이용하여 최종 어셈블리 PCR을 실시하였다. PCR 반응 혼합물은 10 ㎕의 iProof^TM DNA 폴리머라제, 9 ㎕의 물, 12 ㎕의 정제된 pfu 유전자 단편, 0.25 ㎕의 정방향 프라이머 및 0.25 ㎕의 역방향 프라이머를 포함하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같았다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 3분; (b) 95℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 2.5분으로 이루어진 25 사이클의 PCR 단계; 및 (c) 최종 연장 단계, 72℃에서 10분. 상기 PCR 산물을 4℃에 보관하였다. 본 발명자들은 PCR 산물을 아가로오스 젤에 전기영동하여 젤 추출 키트를 이용하여 젤 정제를 실시하고 그 산물을 XbaI 및 PstI 제한효소를 이용하여 pUC19 벡터에 클로닝하였다. 클로닝 및 형질전환 단계는 상술한 바와 같이 실시하였다. 아가 플레이트에서 37℃로 하룻밤 동안 콜로니를 성장시킨 후, 본 발명자들은 콜로니를 선택하여 콜로니 시퀀싱을 실시하였다.

실험결과

올리고뉴클레오타이드들은 55K Agilent 마이크로어레이(하나의 칩 당 55,000개의 독립적인 올리고뉴클레오타이드 스팟을 포함)로부터 절단되었다. 상기 어레이에서, 본 발명자들은 독점적인 잉크-젯 프린팅 기술(LeProust et al.)을 이용하여 10,000개의 독립적인(unique) 올리고뉴클레오타이드(150 bp)를 fmol의 양으로 제조하였다. 55K 칩으로부터 한 커플의 수백개의 스팟들만이 본 발명자들의 실험에 이용되었다: 상기 스팟들은 계층적 Dpo4 합성을 위해 22개의 독립적인 올리고뉴클레오타이드들을 세 쌍으로(triplicate) 이용하고, one-pot Dpo4 합성을 위해 24개의 독립적인 올리고뉴클레오타이드들을 세 쌍으로 이용하며, pfu DNA 폴리머라제 유전자의 제조를 위해 70개의 올리고뉴클레오타이드를 세 쌍으로 이용하였다.

본 발명자들의 이전 연구(Bang and Church, 2008)에 기반하여, 본 발명자들은 1 kb 유전자 합성을 위한 각 올리고뉴클레오타이드의 최소 농도를 0.2 μM로부터 0.025 μM의 범위에서 평가하였다. 전형적인 PCR이 20 ㎕의 반응으로 실시되는 것을 고려할 때, 본 발명자들은 1 kb 유전자 합성을 위해 올리고뉴클레오타이드 당 최소 1 pmol(0.05 M*20 = 1 pmol로 계산)이 필요하였다. 하지만, Agilent 칩으로부터 제공된 총 올리고뉴클레오타이드 양은 10 pmol(각 올리고 당 0.2 fmol)이었다. 이에, 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드 풀을 100 ㎕로 희석하였다. 그 결과, 각 올리고뉴클레오타이드의 농도는 2 pM이었다. 즉, 하나의 DNA 합성 반응을 위해 전체 Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우에도 각 칩 올리고뉴클레오타이드의 양(0.2 fmol)은 하나의 유전자 합성을 위한 최적의 올리고 양(1 pmol)보다 수 천배 적은 것으로 평가된다. 칩 올리고뉴클레오타이드의 농도가 DNA 어셈블리를 실시하기에 너무 적기 때문에, Dpo4 및 pfu DNA 폴리머라제 유전자 어셈블리에 이용하기 전에 본 발명자들은 55K 칩의 올리고뉴클레오타이드 서브-풀을 선택적으로 증폭시키기 위해 복제성 플랭킹 서열을 이용하였다(Tian et al ., 2004).

복제성 서열-절단된 올리고뉴클레오타이드의 충분한 양을 얻는 것이 유전자들의 성공적인 어셈블리에 가장 중요한 요소이다. 플랭킹 서열-절단된 올리고뉴클레오타이드의 농도를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드(ss-oligonucleotides) 대신에 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드(ds-oligonucleotides)를 이용하여 유전자들을 어셈블리하였다. 본 발명의 방법은 ds-올리고뉴클레오타이드로부터 ss-올리고뉴클레오타이드로 추가적으로 프로세싱해야 하는 필요성을 미연에 방지하고, 이러한 ss-올리고뉴클레오타이드 생산 단계의 제거는 올리고뉴클레오타이드의 총 농도를 증가시킨다. 또한, 본 발명자들은 추가적인 PAGE 또는 아가로오스 젤 정제 과정 없이 제IIS형 제한효소 절단 후 ds-올리고뉴클레오타이드를 직접적으로 이용할 수 있는 프로토콜을 최적화하였다. 젤 정제 단계를 제거함으로써, 본 발명자들은 실질적으로 많은 양의 올리고뉴클레오타이드를 얻을 수 있었다.

컬럼-합성된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 단일-스텝(one-step) 폴리머라제 사이클링 어셈블리(PCA)로 1 kb 서열을 어셈블리하는 전형적인 유전자 합성 방법들과는 다르게, DNA 칩 올리고뉴클레오타이드를 이용한 1 kb 유전자를 제조하기 위한 본 발명자들의 초기 시도들은 어셈블리 과정들이 불충분하다는 것을 확인시켜 주었다(결과를 보이지 않음). 500 bp 이상의 DNA 서열로의 어셈블리에 있어서 난점들(Challenges)은 어셈블리 전에 ds-올리고뉴클레오타이드의 플랭킹 부위의 불충분한 제거와 관련이 있다. 또한, 칩-절단된 올리고뉴클레오타이드의 증폭으로부터 유래된 ds-올리고뉴클레오타이드의 균일하지 않은 농도는 효율적이지 않은 유전자 합성에 기여할 수 있다. 따라서, 1 kb 이상의 유전자들의 어셈블리를 위해 본 발명자들은 약 350 bp의 3개의 단편들을 이용하여 1 kb Dpo4 유전자를 어셈블리하는 데 우선적으로 집중하였다. 본 발명자들은 3개의 서로 다른 반응 혼합물에서 3개의 Dpo4 단편들을 어셈블리하기 위해 플랭킹 서열-절단된 올리고뉴클레오타이드를 이용하였다(도 1A 및 도 2a-2c). 상기 타겟 단편들은 중첩하는 부위(overlapping regions)를 포함하도록 디자인되었다. 따라서, 본 발명자들은 한 쌍의 어셈블리 프라이머를 이용하여 두 번째 라운드의 어셈블리 과정 중에 상기 3개의 단편들이 합쳐져서 소망하는 Dpo4 유전자를 형성시켰다(도 1A 및 도 2d).

Dpo4 단편들의 어셈블리를 위해 반복된 실험에서, 본 발명자들은 DNA 어셈블리 동안 높은 어닐링 온도(65-72)가 합성 효율을 증가시킨다는 것을 발견하였다(도 3). 이에, 본 발명자들은 높은 어닐링 온도가 어셈블리 과정에서 불충분하게 절단된 올리고뉴클레오타이드를 제외시킴으로써 어셈블리 효율의 증가에 기여할 수 있을 것이라는 가설을 세웠다. 따라서, 본 발명자들은 다양한 어셈블리 온도에서 어셈블리 실험을 실시하여 1 kb 이상의 DNA 분자를 제조할 수 있는 가능성을 조사하였다(결과를 보이지 않음). 예상한 바와 같이, 본 발명자들은 증가된 어닐링 온도에서 Dpo4 유전자를 어셈블리할 수 있었다(도 1B 및 도 2e-2g). 이후, 본 발명자들은 합성된 컨스트럭트를 클로닝하여 시퀀싱하였다(표 1, one-pot 합성된 Dpo4의 시퀀싱 데이터).

타겟 유전자들의 합성 동안 발생된 서열 오류의 비교.

유전자 이름 (유전자 길이)	방법	오류 ^a	시퀀싱된 총 bp	오류율 (오류/1 kb )
Dpo4 DNA 폴리머라제 (1,056 bp) Dpo4 DNA 폴리머라제 (1,056 bp) Pfu DNA 폴리머라제 (2,325 bp)	One-pot 합성 계층적 합성 계층적 합성	15(11:1:1:2) 13(8:4:1:0) 22(15:2:4:1)	8,448 2,112 4,650	약 1.8 약 6.2 약 4.7

^a오류 [결실:삽입:변화(transition):교차(transversion)]

비록 본 발명자들이 DNA 칩-유래된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 one-pot방법으로 Dpo4 유전자를 성공적으로 합성하였을 지라도, 본 발명자들은 합성 효율이 여전히 낮다는 것을 확인하였다(참고: 도 2g에 보여진 젤 데이터). 또한, 합성 Dpo4 유전자의 증가된 길이가 Agilent 칩에 의해 제공된 올리고뉴클레오타이드의 증가된 길이일 뿐 이라는 논란의 여지가 있을 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 거대 DNA 분자의 제조에 적용될 수 있는 확장 가능하고(scalable) 계층적인 합성 방법을 개발하고자 노력하였다. 본 발명자들의 합성 계획은 도 4에 개략적으로 제시되어 있다. 본 발명의 합성 방법의 독창성은 거대 DNA 컨스트럭트의 어셈블리를 위해 플랭킹 DNA 서열의 다중 층(multiple layers)을 디자인하여 도입한 것이다. 첫 번째 층의 프라이머 서열은 마이크로칩-절단된 ss-올리고뉴클레오타이드를 증폭시켜 ds-올리고뉴클레오타이드를 생산한다. 상기 ds-올리고뉴클레오타이드는 타겟 유전자 합성을 위한 중간산물(intermediates)로 기능할 수 있는 400-500 bp DNA 단편의 제조를 위해 이용되었다. 합성 디자인에 따르면, 본 발명자들은 중간산물인 400-500 bp 단편 서열들에 두 번째 층의 복제성 서열을 추가적으로 도입하였다. 상기 두 번째 층의 프라이머들은 one-pot 방법에서 다중 400-500 bp DNA 단편들을 동시에 제작할 수 있게 하였다. 상기 복제성 플랭킹 서열들은 두 번째 라운드의 어셈블리 과정 전에 절단되는 제IIS형 제한효소 위치를 포함한다. 결국, 본 발명자들은 타겟 유전자들을 제조하기 위해 중간산물 단편들을 이용할 수 있다.

성공적인 계층적 합성을 위해, 본 발명자들은 one-pot 방법으로 다중 합성 타겟 DNA 분자의 어셈블리를 달성해야 했다. 동일한 반응 혼합물에서 단일 일반적인 프라이머 쌍(universal primer pairs)을 이용하여 다중 DNA 단편들(약 500 bp)을 제작할 수 있는 지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 Dpo4 유전자를 중첩하는 부위가 없는 2개의 단편(각각 528 bp)으로 간단히 나누었다. 일반적인 프라이머 쌍을 이용하여, 본 발명자들은 양 단편들을 동일한 반응 혼합물에서 제조하였다(도 3). DNA 시퀀싱을 통한 합성 단편의 확인을 통해, 본 발명자들의 방법이 신뢰할만 하다는 것을 확인하였다(결과를 보이지 않음). 더 나아가, 본 발명자들은 단순히 링킹 올리고뉴클레오타이드(linking oligonucleotide)를 이용함으로써 2개의 단편을 결합시킬 수 있었고, 이를 기반으로 시퀀싱을 실시하였다(도 3 및 표 1의 계층적으로 합성된 Dpo4의 시퀀싱 데이터).

본 발명의 계층적 방법의 유용성 및 일반성(generality)을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 모델 타겟으로서 Pfu DNA 폴리머라제(약 2,325 bp)를 인코딩하는 보다 긴 유전자를 구축할 수 있도록 고안하였다. 본 발명자들은 7개의 서로 다른 400 bp의 단편들의 어셈블리를 위해 올리고뉴클레오타이드 서열을 디자인하였다. 본 발명자들은 중첩하는 400 bp의 단편들의 어셈블리가 단편 어셈블리 과정 동안 방해를 야기할 수 있을 것으로 예상하였다(도 4). 따라서, 본 발명자들은 400 bp의 각 타겟 단편들에 대한 서로 다른 복제성 프라이머 서열을 도입시킴으로써 어셈블리 과정 동안 서로 간에 중첩되지 않는 올리고뉴클레오타이드를 디자인하였다. 본 발명자들은 BsgI 제한효소 위치를 포함하는 한 쌍의 복제성 플랭킹 DNA 서열을 이용하여 4개의 400 bp 단편들을 어셈블리시켰으며, 다른 3개의 400 bp 단편들은 BtsI 제한효소 위치를 포함하는 또 다른 쌍의 복제성 플랭킹 DNA 서열을 이용하여 어셈블리되었다(도 5). 두 개의 분리된 반응 혼합물에서 7개의 타겟 DNA 단편들을 어셈블리시킨 후, 본 발명자들은 상기 반응 혼합물에 각각 BsgI 및 BtsI 제한효소를 이용하여 복제성 플랭킹 서열들을 절단시켰다. 최종적으로, 본 발명자들은 상기 DNA 단편들을 완전한 2,325 bp의 Pfu 유전자로 어셈블리시켰다(도 5). 본 발명자들의 어셈블리 방법을 규명하기 위해, 본 발명자들은 최종 산물을 클로닝하여 시퀀싱하였다. 본 발명의 방법에 따른 Pfu 유전자의 합성으로부터 얻어진 시퀀싱은 컬럼-합성된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Pfu 유전자의 합성과 비교하여 200 bp 당 약 1 bp의 오류율을 나타냈다(참고: 표 1의 계층적으로 합성된 Pfu DNA 폴리머라제의 시퀀싱 데이터).

본 보고에서, 본 발명자들은 신규한 마이크로칩 DNA-기반된 유전자 합성 방법을 제시하였다. 두 개의 층으로 이루어진 복제성 플랭킹 DNA 서열을 적용시킴으로써, 본 발명자들은 프로그램될 수 있는 DNA 마이크로칩으로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드들을 이용하여 1 kb 이상의 유전자들의 계층적 어셈블리 방법을 달성하였다. 본 발명의 계층적 전략은 거대 DNA 분자의 합성을 위해 다중 층의 프라이머 서열로 확장될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명자들은 최적화된 합성 조건에 부합하는 본 발명자들의 계층적 전략은 추가적으로 많은 합성 유전자 서열의 확장 가능하게 구축하도록 적용될 수 있을 것으로 예상한다. 또한, 본 발명자들의 최적화된 어셈블리 과정을 이용하여 본 발명자들이 1 kb 이상의 유전자의 one-pot 합성을 달성하였다는 것이 주목할 만한 것이다. 상술한 바와 같이, 칩 올리고뉴클레오타이드의 매우 작은 양과 관련된 DNA 어셈블리의 어려움으로 인해 1 kb 이상의 DNA 분자의 구축이 크게 어려웠다.

Agilent 칩-올리고뉴클레오타이드를 이용한 유전자 합성에서의 오류율(error rate) 및 비용평가(cost estimate)는 다음과 같다. 하나의 유전자 합성 비용 분석에 있어서, 본 발명자들은 유전자 합성에 소요되는 2개의 주된 비용은 올리고뉴클레오타이드 비용 및 시퀀싱 비용이다. Agilent 55K 칩의 150 bp 올리고뉴클레오타이드에서, 2개의 25 bp 플랭킹 서열이 존재하고 100 bp의 내부 서열(internal sequences)이 타겟 유전자 합성에 이용된다. 각 100 bp의 올리고뉴클레오타이드는 다른 100 bp의 올리고뉴클레오타이드와 완벽하게 중첩되기 때문에, 하나의 올리고뉴클레오타이드는 유전자 어셈블리 과정 동안 50 bp 확장(extension)에 이용된다. 따라서, 본 발명자들은 하나의 55K 칩을 이용하여 2.75 백만 bp(50 bp55,000 올리고뉴클레오타이드)를 합성할 수 있을 것이다. Agilent 칩의 가격이 약 $7,000이기 때문에, 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드의 합성 비용을 1 bp 당 약 $0.0025일 것으로 추정한다. 현재 레진-기반된 올리고뉴클레오타이드 합성 비용이 1 bp 당 약 $0.10이기 때문에, Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드의 비용이 레진-기반된 올리고뉴클레오타이드 합성 비용보다 40배 이상 저렴하다.

시퀀싱 비용은 올리고뉴클레오타이드의 질(original quality)에 의해 주로 결정된다. Agilent 칩 올리고뉴클레오타이드의 질을 평가하기 위해, 본 발명자들은 칩 올리고뉴클레오타이드를 증폭하여 클로닝한 후 DNA 시퀀싱을 실시하였다. 여섯 개의 오류(5개의 결실 및 하나의 삽입)가 1,500 bp의 시퀀싱에서 관찰되었다(즉, 250 bp 당 1 bp의 오류율). 1,056 bp의 Dpo4 유전자의 제조를 위해 0.4%의 오류율의 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 것은 완벽한 타겟 DNA를 포함하는 소망하는 클론을 1.5%만을 생산할 것이다(0.996¹⁰⁵⁶으로부터 산술적으로 계산됨). DNA 어셈블리 과정 동안, 높은 어닐링 온도는 DNA 단편의 확장을 위해 보다 더 순도 높은 올리고뉴클레오타이드를 양성적으로 선택하게 한다. 그 결과, 본 발명자들의 one-pot Dpo4 합성 방법은 500 bp 당 약 1 bp의 오류율을 초래하였다. 일반적으로, 500 bp 당 약 1 bp의 오류율에서 약 10%의 클론들이 평균적으로 오류가 없을 것으로 본 발명자들은 예측하였는데, 본 발명의 Dpo4 유전자 합성에 있어서 단일-스텝 Dpo4 유전자 합성으로 얻어진 약 37%의 클론들(8개 중 3개)에서 오류가 존재하지 않았다. 따라서, DNA 마이크로칩 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Dop4 유전자 합성은 필요한 총 올리고뉴클레오타이드 당 약 $2.5이 소요될 것이고(계산: 1,056 bp$0.0025/bp), 필요한 총 시퀀싱 비용은 약 $100이 소요될 것이다(계산: 10 클론2개의 시퀀싱/클론$5/시퀀싱). 레진-기반된 합성 올리고뉴클레오타이드 비용이 약 $200(계산: 21,056 bp$0.1/bp; 2는 정방향 가닥 및 역방향 가닥을 의미)인 것을 고려할 때, 칩-기반된 DNA 합성은 유전자 합성 비용을 약 $300에서 약 $100까지 감소시킨다.

Pfu DNA 폴리머라제 유전자 합성의 오류율은 one-pot Dpo4 합성보다 2.5배 정도 더 높았다. 이는 계층적 DNA 합성에 필요한 추가적인 스텝으로부터 발생할 것이다. 따라서, 본 발명자들은 현재 유용한 오류 정정 방법들(Carr and Church, 2009)이 DNA 합성의 오류율을 추가적으로 감소시킬 수 있는 본 발명자들의 DNA 합성 방법과 조합되어야만 한다고 제안한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

다음의 단계를 포함하는 타겟 핵산서열의 계층적(Hierarchical) 제조방법:
(a) 5' to 3' 방향으로 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열(generic priming sequence), 제1차 5'-제한효소 절단 서열, 중첩하는(overlapping) 타겟 일부 서열, 제1차 3'-제한효소 절단 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 풀을 준비하는 단계;
상기 올리고뉴클레오타이드 풀에 있는 상기 중첩하는 타겟 일부 서열들은 서로 중첩하는 경우 타겟 핵산서열 전체를 포함하며, 상기 올리고뉴클레오타이드의 제1차 5'-제한효소 절단 서열과 제1차 3'-제한효소 절단 서열은 서로 동일하며;
상기 올리고뉴클레오타이드 풀 중에서 제1중간산물의 5'-말단 부위를 생성시키기 위한 제1올리고뉴클레오타이드는 5'-제한효소 절단 서열의 다운스트림에 5' to 3' 방향으로 5'-제2공통적 프라이밍 서열과 제2차 5'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하고, 제1중간산물의 3'-말단 부위를 생성시키기 위한 제2올리고뉴클레오타이드는 3'-제한효소 절단 서열의 업스트림에 3' to 5' 방향으로 3'-제2공통적 프라이밍 서열과 제2차 3'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하며;
제2중간산물의 5'-말단 부위를 생성시키기 위한 제3올리고뉴클레오타이드는 5'-제한효소 절단 서열의 다운스트림에 5' to 3' 방향으로 5'-제3공통적 프라이밍 서열과 제3차 5'-제한효소 절단 서열을 포함하고, 제2중간산물의 3'-말단 부위를 생성시키기 위한 제4올리고뉴클레오타이드는 3'-제한효소 절단 서열의 업스트림에 3' to 5' 방향으로 3'-제3공통적 프라이밍 서열과 제3차 3'-제한효소 절단 서열을 추가적으로 포함하고;
(b) 상기 올리고뉴클레오타이드 풀을 상기 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열에 혼성화 되는 제1차 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction) 증폭하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 증폭 결과물을 상기 제1차 5'-제한효소 절단 서열과 제1차 3'-제한효소 절단 서열에 작용하는 제한효소로 절단하는 단계;
상기 절단에 의해 상기 5'-말단 제1공통적 프라이밍 서열 및 3'-말단 제1공통적 프라이밍 서열이 상기 올리고뉴클레오타이드로 풀로부터 해리(release) 되고;
상기 제1올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 제2공통적 프라이밍 서열이 위치하고, 상기 제2올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 제2공통적 프라이밍 서열이 위치하며, 상기 제3올리고뉴클레오타이드의 5'-말단에 제3공통적 프라이밍 서열이 위치하고, 상기 제4올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 제3공통적 프라이밍 서열이 위치하며;
(d) (i) 상기 제1올리고뉴클레오타이드의 제2공통적 프라이밍 서열 및 제2올리고뉴클레오타이드의 제2공통적 프라이밍 서열에 혼성화 되는 프라미어 세트를 포함하는 제1어셈블리 증폭 반응물 1 및 (ii) 상기 제3올리고뉴클레오타이드의 제3공통적 프라이밍 서열 및 제4올리고뉴클레오타이드의 제3공통적 프라이밍 서열에 혼성화 되는 프라이머 세트를 포함하는 제1어셈블리 증폭 반응물 2를 이용하여 제1차어셈블리 PCR을 실시하여 각각 제1중간산물(intermediates) 및 제2중간산물을 생성시키는 단계;
(e) 상기 단계 (d)의 제1중간산물 및 제2중간산물을 (i) 상기 제1올리고뉴클레오타이드의 제2차 5'-제한효소 절단 서열과 상기 제2올리고뉴클레오타이드의 제2차 3'-제한효소 절단 서열에 작용하는 제한효소 및 (ii) 상기 제3올리고뉴클레오타이드의 제3차 5'-제한효소 절단 서열과 상기 제4올리고뉴클레오타이드의 제3차 3'-제한효소 절단 서열에 작용하는 제한효소로 절단하는 단계; 및,
(f) 상기 단계 (e)의 결과물을 어셈블리 하여 타겟 핵산서열을 수득하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 올리고뉴클레오타이드 풀은 DNA 마이크로칩으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 제1중간산물 및 제2중간산물을 형성하는 올리고뉴클레오타이드의 수는 최소 3개 이상인 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드의 수는 최소 4개 이상인 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 제2차 제한효소 절단 서열과 제3차 제한효소 절단 서열은 서로 다른 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 제1중간산물 및 제2중간산물의 증폭은 서로 다른 튜브에서 실시하는 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 제1중간산물 및 제2중간산물의 크기는 300-500 bp인 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 방법에서 실시하는 어셈블리 PCR은 높은 어닐링 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 높은 어닐링 온도는 65℃ 이상인 것을 특징으로 하는 계층적 제조방법.