JP4180511B2 - 原料核酸の確率論的に組み合わせられた部分よりなる核酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は原料核酸の確率論的に組み合わせられた部分よりなる核酸の製造方法並びに該方法を実施するためのキットに関する。

本質的に、核酸は蛋白の構造および機能を決定する生物学的情報をもたらし、これにより、最も単純な細菌細胞から極めて複雑な多細胞の生物まで、生命体の全機能を制御する。技術的または医療目的のために利用することのできる新規または変更された性質を有するように蛋白を操作できることは知られている。このような操作は、対応する蛋白をコードする核酸配列を修飾すること、発現系を用いて蛋白を発現させること、十分に強力なスクリーニング方法により蛋白の性質を試験すること、および、最もよい性能を示すものを選択することにより行なうことができる。当然ながら、核酸が機能分子そのものとして作用する場合は、この操作法を同様に使用できる。操作法を反復して行なう場合は、その方法は、新しい機能を発生させ、既存のものを変更する天然の方法と同様に、指向的進化と称される。

核酸の修飾は指向的進化における固有の工程である。規則的な突然変異の導入のほかに、配列部分の組み換えは、核酸の修飾のために、並びに、後にスクリーニングおよび選択の操作法に付すことのできる広範なライブラリの作製のために、極めて有効な方法である。配列部分はゲノムのフラグメント、遺伝子クラスター、遺伝子クラスター内の遺伝子変異体、遺伝子の一部、例えばエクソン、または蛋白内のドメインをコードする配列であることができるが、数塩基または１塩基までの極めて短い核酸フラグメントであることもできる。

核酸の部分の組み換えは好ましくは相同組み換えにより行なう。相同組み換えは、方向と読み枠を維持しながら種々の原料核酸由来の対応する配列部分の組み合わせである。相同組み換えの主な利点は、非特異的組み換えに伴う非関連配列のバックグラウンドノイズの防止である。

実験的には、相同組み換えは、好ましくは個々の酵素機能または定義の混合物または一連の酵素的処理工程を用いてインビトロで行なわれる。

ＷＯ９５／２２６２５に記載された最初のインビトロの方法はＰＣＲに基づいている（Stemmer,Nature 370（１９９４）３８９参照）。ここではオーバーラップする遺伝子フラグメントを準備し、その後、別のプライマーを用いることなくＰＣＲにおいて初めのの長さの産物まで組み立てる。即ち、各ＰＣＲサイクルにおけるフラグメントの相互のプライミングにより、異なる起源のフラグメントを偶発的に連結して生成分子とすることができる。理論的には、この方法により導入される組み換え事象は得られる核酸配列全体に渡り確率論的に分布する。核酸分子当たりの組み換え事象の数、即ち、組み換え頻度、および、組み換え部位間の平均の距離はフラグメントの長さにより決定される。一方、十分な比率で相互プライミングを可能とするための最小フラグメントサイズは数百塩基対のオーダーである。フラグメントが短くなるほど、フラグメントの効率的なアニーリングの確率が低下する。従って、遺伝子当たりの組み換え事象の数は限定され、そして更に、組み換え部位の最小平均距離が制限される。これらの要因を制御するための手段は無い。

別のＰＣＲに基づく方法はＷＯ９８／４２７２８（シャオ（Ｓｈａｏ）ら．，Nucl.Acids Res.26（１９９８），６８１）に記載されている。ここでは、無作為化配列を有するプライマーが用いられており、これによりポリヌクレオチド内の無作為の位置における重合の開始が可能となる。即ち、ＷＯ９５／２２６２５と同様、相互プライミングにより相互に組み換えることができる短いポリヌクレオチドフラグメントが形成される。この方法では組み換えの頻度と距離を制御することは極めて困難である。更にまた、非特異的なプライマーにより比較的高い固有誤差率が生じ、これが感受性の配列部分および／または長い遺伝子で問題となる。

ＷＯ９８／４２７２８に記載されている別の方法はＰＣＲにおけるプライマー伸長の間に鎖交換を誘発するための変更されたＰＣＲプロトコルを用いている（Ｚｈａｏら．，Nat.Biotechnol.16（１９９８），２５８）。方法はプライマーを用いた鋳型配列のプライミング、次いで変性と極めて省略されたアニーリングの反復サイクルおよびポリメラーゼ触媒鎖伸長よりなる。各サイクルにおいて、成長中のフラグメントは配列の相補性に基づいて種々の鋳型にアニーリングし、更に伸長することができる。これが完全長配列が形成されるまで反復される。鋳型の交換のために、得られるポリヌクレオチドは異なる親配列に由来する配列情報を含む場合がある。従って、組み換え頻度はＰＣＲサイクルの数により制御され、組み換え部位間の平均距離は重合時間の実際の設定により決定される。速い温度変化を利用することが技術的に制限されているため、組み換え部位間の最小平均距離は１００核酸塩基程度になる。

ＷＯ０１／３４８３５はＰＣＲに基づかない相同組み換えのための方法を記載している。この方法は位置選択的な組み換えの可能性に組み換え頻度の制御性を組み合わせている。方法は原料核酸の融解とアニーリングにより形成される２重鎖ヘテロ２本鎖の部分的エキソ核酸分解的１重鎖分解および鋳型指向性１重鎖合成を用いている。分解と再合成の工程を反復の方法で繰り返すことにより、複数の組み換えが行なわれる。従って、サイクル数が組み換え頻度を決定する。方法は、エキソ核酸分解活性を制御することにより位置選択的組み換えを可能にする。組み換え部位間の極めて短い距離は、実際には、原料核酸分子内の百の核酸塩基の範囲内の特定の領域に着目した場合にのみ起こる。原料核酸配列全体に渡って短い平均距離とすることは困難である。

ＰＣＲに基づかない相同組み換えの別の方法は、ＷＯ０１／２９２１１に記載されている。その方法は一過性のポリヌクレオチドスカフォールドにアニーリングされた無作為に切断された親ＤＮＡのオーダーリング、トリミングおよびジョイニングによる。ＷＯ９５／２２６２５によれば、発生したフラグメントの最小長さは鋳型への効率的なアニーリングの必要性により制限される。従って、組み換え部位間の最小距離は数百核酸塩基以上になる。

即ち、本発明の基礎となる技術的課題は原料核酸の確率論的に組み合わせられた部分よりなる核酸の製造のための方法を提供することである。特に、技術的課題は組み換え部位のターゲティングされた明確な位置決めを可能とするインビトロの相同組み換え方法を提供することである。幾つかの指向性進化実験によれば、制御された状態で相同組み換えを行なうことが必要であることが分かっている。例えば、蛋白モジュールの組み換えはポリヌクレオチド配列の狭い領域への組み換え部位の配置を必要とする。抗体内のＣＤＲの組み換えにはコードされたポリヌクレオチドの特定の部分のターゲティングが必要とされる。現在の組み換え方法にはこれらの要因に関する十分な制御性が無い。従って、ターゲティングおよび指向は、組み換えられる鎖、配列内の位置および組み換え部位間の平均距離に関して可能であるはずである。これを利用して、相同インビトロ組み換えは、現在利用できる方法では達成できない方法で、多くの指向性進化の課題のために必要とされる程度に厳密に機能すると考えられる。

技術的課題は請求項に特徴付けられた実施形態を提供することにより解決される。即ち本発明は、
（Ａ）修飾された性質を有するポリヌクレオチド分子の製造方法であって、以下の工程：
（１）原料核酸分子の集団を準備すること、ここで該集団の個々の核酸分子は相同および異種のセグメントを有し、その核酸配列内に取りこまれたマーカーヌクレオチドの少なくとも１種を有するものであり、
（２）異種セグメントによる２重鎖を含む工程（１）により準備された原料核酸分子の集団の２重鎖ポリヌクレオチド分子を形成すること（ヘテロ２本鎖）、
（３）工程（２）により生成された２重鎖ヘテロ２本鎖の取りこまれたマーカーヌクレオチドにおいて１重鎖ブレイクを形成すること、；並びに、
（４）工程（３）により形成された１重鎖ブレイクから出発してマーカーヌクレオチドの取りこみを行ないながら、または行なうことなく、鋳型指向性１重鎖合成を行なうこと、
を包含する方法；および、
（Ｂ）上記（Ａ）に記載した方法を実施するためのキットであって、該キットは好ましくは、下記の構成要素：
（ｉ）ポリヌクレオチド分子内への取りこみのためのマーカーヌクレオチド；
（ｉｉ）取りこまれたマーカーヌクレオチドにおける１重鎖ブレイクを可能にする薬剤；および、
（ｉｉｉ）マーカーヌクレオチドの取りこみを行なうため、および、これらの部位において１重鎖ブレイクを形成するための緩衝液、
の少なくとも１つを含むキット、を提供する。

本発明の実施形態（Ａ）の方法において、工程（１）で原料核酸分子が２重鎖である場合は、鎖は相補または部分相補であってよい。更に工程（３）から（４）は逐次的または同時に行なってよい。後に示す図面は本発明の実施形態を更に説明するものである。しかしながら図は本発明を限定するものではない。

上記したとおり、本発明の実施形態（Ａ）は修飾された特性を有する核酸、即ち原料核酸の確率論的に組み合わせられた部分よりなるポリヌクレオチドの製造のための方法に関する。該実施形態は本発明の方法の可能な変法を概略的に示している図１を参照することにより更に詳細に説明される。

条件に応じて、本発明の方法は異種配列セグメントの偶発的および制御下の双方の新しい組み合わせを可能にする。マーカーヌクレオチドの取りこみの確率を調節することにより、組み換え部位間の平均距離を制御できる。１ヌクレオチドまでの距離が適切な比率のヌクレオチドおよびマーカーヌクレオチドの使用により可能である。これは以前に報告されている方法の何れでも達成困難である。更にまた、サイクル数およびサイクル当たりの平均組み換え距離を調節することにより、組み換え頻度も広範に制御できる。このような組み換え頻度の制御はＷＯ０１／３４８３５に記載の方法および鎖交換によるＰＣＲを利用したＷＯ９８／４２７２８に記載の方法によっても達成できる。少なくとも部分的にはＷＯ９５／２２６２５およびＷＯ０１／２９２１１に記載の方法によっても達成される。無作為プライミングを利用しているＷＯ９８／４２７２８に記載されている方法は組み換え頻度の調節のための方法は提示していない。

相同組み換えのための方法の別の局面は、組み換えるべき原料核酸間の相同性の特定の水準を必要とする点である。ＷＯ９５／２２６２５、ＷＯ９８／４２７２８およびＷＯ０１／２９２１１に記載された方法は全て、組み換え部位間の短い配列セグメントのアニーリングを利用している。組み換え事象が核酸配列の全体に渡り均一に分布する場合、これは、短い核酸セグメントのアニーリングを可能にするためには原料核酸配列全体が重分な相同性を示す必要があることを意味する。より低い相同性の核酸配列内の領域がこのようなアニーリングを可能とし、従って組み換え反応を妨害する。これとは対照的に、ＷＯ０１／３４８３５に記載された方法並びに本発明の方法は組み換え過程に付されるヘテロ２本鎖を生成するために完全長核酸配列のアニーリングを用いている。これにより、核酸配列内のむしろ低い相同性の領域も組み換えを妨害せず、全体的により低い相同性も上記方法と比較して忍容される。

従って、本発明の方法はこれまで開示された如何なる方法でも達成できなかった利点の組み合わせを特徴とする。

本発明の方法による個々のサイクルの結果として得られる産物は半保存性の１重鎖の核酸分子であるが、その理由は、実施形態によるが、より長い、または短い配列のセグメントがマーカーヌクレオチド取りこみ部位の一方において維持されつつ、マーカーヌクレオチド取りこみ部位の他方の配列のセグメントは鋳型鎖の情報とともに新たに合成されているためである。

本発明によれば、「マーカーヌクレオチド」という用語はポリヌクレオチドへの取りこみに適し、鋳型指向性重合反応のための分子内開始点を与えるために対応する位置に１重鎖ブレイクを導入するためのマーカーとして使用することのできる如何なる核酸単量体をも指すものとする。好ましくは、マーカーヌクレオチドは化学反応または酵素的処理により特異的に認識されることのできる標準ヌクレオチドの類縁体である。

好ましい実施形態においては、上記した工程（１）から（４）を含む１以上のサイクル、即ち少なくとも２、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、最も好ましくは少なくとも５０サイクルで終了する。本実施形態において、工程（４）の鋳型指向性１重鎖合成はマーカーヌクレオチドの取りこみとともに行なわれ、これにより各サイクルにおいて次のサイクルのためのマーカーヌクレオチドが取りこまれる。次に、好ましくは、最終サイクルは、それ以上プロセシングされ得るマーカーヌクレオチドを含まない２重鎖を生成するために、マーカーヌクレオチドの取りこみを行なうことなく実施する。

本発明の方法のサイクル適用により、種々の原料核酸由来の複数の組み換えられた配列セグメントを含む核酸分子を生成することが可能になる。特に、サイクル適用により数個の異種の配列セグメントを相互に組み合わせることが可能となる。更にまた、サイクルの数により各ポリヌクレオチド鎖の組み換え頻度を制御できる。サイクル適用により、新しい組み合わせの間の平均の距離が各サイクにおけるマーカーヌクレオチドの取りこみの確率により制御可能になる。

特に、２連続サイクルの各々における工程（４）による鋳型指向性合成の出発点の間の平均距離が、２連続サイクルの初回の工程（４）におけるマーカーヌクレオチドの取りこみの確率を調節することにより制御される。マーカーヌクレオチドの取りこみの確率は標準ヌクレオチドに対するマーカーヌクレオチドの濃度の比を調節することにより制御することができる。好ましくは、マーカーヌクレオチドの取りこみの確率は、１未満、そして、塩基対内の原料核酸長の逆数より高値であるように選択される。注目すべき点は、ポリヌクレオチド鎖当たりマーカーヌクレオチド１個より多くが取りこまれる場合は常時、鋳型指向性重合の開始点の次に取りこまれるマーカーヌクレオチドのみが組み換え部位間の距離を決定する点である。全ての他のマーカーヌクレオチドは結果に影響せず取り除かれる（図１参照）。

好ましい実施形態において、工程（１）により準備される原料核酸分子の集団中の核酸分子は２重鎖であり、マーカーヌクレオチドは両方の鎖における核酸配列内に取りこまれる。ここで、両方の鎖は工程（３）による１重鎖ブレイクの生成のために使用でき、従って、両方の鎖とも、組み換えに付され、同時に、鋳型鎖としても機能する。

別の好ましい実施形態においては、工程（１）により準備される原料核酸分子の集団中の核酸分子は２重鎖であり、マーカーヌクレオチドは両方の鎖の一方のみ（マーカー鎖またはセンス鎖）における核酸配列内に取りこまれる。従って、両方の鎖の一方のみが工程（３）による１重鎖ブレイクの生成のために使用可能であり、従って、両方の鎖の一方のみが組み換えに付される。他方の鎖は全工程の間、鋳型としてのみ機能する（鋳型鎖またはアンチセンス鎖）。

特に好ましい実施形態においては、マーカー鎖および鋳型鎖よりなる該２重鎖は、取りこまれたマーカーヌクレオチド少なくとも１種を有する１つのプライマー、および、取りこまれたマーカーヌクレオチドを保有しない第２のプライマーを用いてＰＣＲにより生成される。

別の特定の好ましい実施形態においては、マーカー鎖および鋳型鎖よりなる該２重鎖は、プライマー１個のみを使用する非対称ＰＣＲにより各々が生成される１重鎖２個のアニーリングにより生成され、その際、マーカー鎖は重合工程の間マーカーヌクレオチドの取り込みを伴って生成されるのに対し、鋳型鎖は重合工程の間マーカーヌクレオチドの取りこみを伴うことなく生成される。

別の好ましい実施形態においては、工程（１）により準備される原料核酸分子の集団における取りこまれたマーカーヌクレオチドは、５’末端の次に取りこまれ、そして、マーカーヌクレオチドの取りこみ部位および工程（３）による、対応する１重鎖ブレイクにより定義される組み換え部位はサイクル数の増加に従ってポリヌクレオチド分子の３’末端に近づく。

別の好ましい実施形態においては、１回より多いサイクルを終了した時点で、マーカーヌクレオチドの取りこみの確率がサイクル毎に変化される。例えば、これは、マーカーヌクレオチドと対応する標準ヌクレオチドの濃度の比を変化させることにより行なうことができる。この様にして、組み換え部位間の距離を位置選択的に制御できるのである。

本発明の方法の工程（１）により準備される原料核酸分子の集団は、相同および異種のセグメントよりなるポリヌクレオチド少なくとも２種を含む核酸分子の如何なる集団であることもできる。好ましくは、これらのポリヌクレオチドの２つは各々、相互に比較した場合に、少なくとも相同配列セグメント１つ、および異種配列セグメント２種を有する。「核酸分子の集団」という用語は如何なる種類の核酸、例えば１重鎖ＤＮＡ、２重鎖ＤＮＡ、１重鎖ＲＮＡ、２重鎖ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの２重鎖ハイブリッド、またはこれらの混合物も意味する。原則として、方法はまた同様に構築された人工の重合体に対しても使用してよい。「相同セグメント」という用語は核酸分子２種以上に対し、同一または相補的である、即ち、対応する位置に同じ情報を有するセグメントを指す。「異種セグメント」という用語は、核酸分子２種以上に対し、同一でも相補的でもない、即ち、対応する位置に異なる情報を有するセグメントを指す。核酸分子の「情報」または「遺伝子型」という用語は、核酸分子内の種々の単量体の順序である。異種配列セグメントは好ましくは少なくとも１ヌクレオチドの長さを有するが、より長くてもよい。例えば、異種配列セグメントは２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチド、例えばコドンの長さを有してもよい。原則として、異種セグメントの長さに関しては上限はない。しかしなお、異種セグメントの長さは１０００ヌクレオチドを越えてはならず、好ましくは５００ヌクレオチドより長くなく、更に好ましくは２００ヌクレオチドより長くなく、最も好ましくは１００ヌクレオチドより長くない。このような長い配列セグメントは例えば、抗体をコードする配列の高頻度可変領域、蛋白のドメイン、遺伝子クラスターの遺伝子、ゲノムの領域などであってよい。好ましくは、異種配列は核酸分子が１塩基で異なる配列セグメントである。しかしながら異種セグメントはまた核酸分子に欠失、重複、挿入、逆位、付加等が存在するか、起こっている事実によるものでもよい。

本発明によれば、実施形態（Ａ）の工程（１）により準備される核酸分子は好ましくは少なくとも１個の相同配列セグメントおよび少なくとも２個の異種配列セグメントを有する。しかしながら、より好ましくはそれらは複数の相同および異種セグメントを有する。原則として、相同および異種のセグメントの数には上限は無い。本発明による原料核酸分子の集団は（ｉ）種々の位置に点突然変異１個以上を各々が有する遺伝子変異体、または、（ｉｉ）少なくとも部分的にはヘテロ２本鎖を形成するために十分な相同性を与える異なる種から得られる遺伝子相同体、または（ｉｉｉ）抗体遺伝子ライブラリのような無作為化されたカセット１個以上を各々が有する遺伝子変異体よりなってよい。しかしながら、これら列挙したものに本発明は限定されない。

方法の工程（１）により準備される核酸分子の集団における異種セグメントは各々相同セグメントによる介入を受けている。相同セグメントは好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、そして最も好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さを有する。異種セグメントの場合と同様、相同セグメントもまた遥かに長くてもよく、そして、原則として、その長さには上限は無い。好ましくは、その長さは５０００ヌクレオチド以下、より好ましくは２０００ヌクレオチド以下、最も好ましくは１０００ヌクレオチド以下である。

本発明の方法の特に好ましい実施形態において、関連の核酸配列は工程（１）により原料核酸分子の集団を準備するために用いられる。この点に関し、「関連の」という用語は相互において相同および異種のセグメントの両方を有するポリヌクレオチドを意味する。関連の核酸分子は原料核酸配列に無作為に点突然変異を導入するための操作法から生じるものであってよい。この点突然変異の導入は固有の誤複写過程のみによって行なうこともできるが、使用するポリメラーゼの非正確さの意図的に増大（例えば単量体の明確な非均衡付加、塩基類縁体の付加、誤りの生じやすいＰＣＲ、極めて高いエラー率を有するポリメラーゼによる等）によるか、合成後のポリヌクレオチドの化学的修飾によるか、単量体混合物および／またはヌクレオチド類縁体の少なくとも部分的な適用下のポリヌクレオチドの完全な合成によるか、インビボの誤りの生じやすい修復（例えば高いエラー率を有するウィルス、細菌突然変異株、ＵＶ照射下の細菌による等）によるか、上記方法の２種以上の組み合わせにより行なうこともできる。関連の核酸分子はまた別の核酸変異操作、例えば配列セグメントの無作為トランケーション、挿入、欠失または逆位、または、無作為化された配列セグメントの導入に付されている核酸分子であってもよい。関連の核酸分子はまた擬似種の突然変異株の分布の核酸配列であってよい。「擬似種」とは誤った複製およびその後の選択により形成される関連分子の変異体（突然変異株）の動的集団である（ＷＯ９２／１８６４５）。或いは、関連核酸分子は方法の工程（２）によるヘテロ２本鎖を形成するのに十分な程度の相同性を有する天然の原料から単離された核酸配列であってよい。例えば、進化的に関連する種のゲノムから単離された類似の遺伝子または遺伝子フラグメントを用いることができる。これらの関連核酸分子のいずれも、直接使用してよいか、または、組み換え操作の適用前のスクリーニングおよび／または選択操作、特定の表現型を有する核酸分子を選択する選択および／またはスクリーニング操作に付してよい。「核酸分子の表現型」という用語は核酸分子と核酸分子によりコードされる転写または翻訳の産物の機能および性質の総和を指す。

工程（１）による、そして適宜、工程（４）によるマーカーヌクレオチドの取りこみは鋳型指向性ポリメラーゼ反応を用いるか、または、オリゴヌクレオチドの化学合成により行なう。好ましくは、工程（４）によるマーカーヌクレオチドの取りこみは鋳型指向性ポリメラーゼ反応を用いて行なう。

方法の工程（４）による該鋳型指向性ポリメラーゼ反応のためには、３’末端から出発してポリヌクレオチド鎖を重合することのできる鋳型指向性ポリヌクレオチド重合活性を有する如何なる酵素も使用できる。最も変異の大きい生物に由来し種々の機能を有する多数のポリメラーゼが既に単離され、報告されている。鋳型および合成されるポリヌクレオチドの種類の点から、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）で区別されている。温度安定性の点から、非温度安定性（３７℃）および安定性ポリメラーゼ（７５〜９５℃）で区別されている。更にまた、ポリメラーゼは５’−３’−および３’−５’−エキソ核酸分解活性の存在の点で異なっている。

鋳型鎖およびマーカー鎖の両方がＤＮＡよりなる場合は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく使用される。特に、厳密に、或いは概ね３７℃の旨適温度を有するＤＮＡポリメラーゼが用いられる。これらには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ７由来のＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、および、バクテリオファージＴ４由来のＴ４ＤＮＡポリメラーゼが包含され、これらは多数の製造元より供給されている。Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼＩ（ホロ酵素）は５’−３’ポリメラーゼ活性、３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有している。酵素はニック翻訳法によるＤＮＡのインビトロ標識のために使用される（J.Mol.Biol.113（１９７７），２３７−２５１）。ホロ酵素とは対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ(klenow)断片はＴ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼのように５’−エキソヌクレアーゼ活性を有していない。従ってこれらの酵素はいわゆるフィリングイン(filling-in)反応のため、または、長鎖の合成のために使用される（Biochemistry 31（１９９２），８６７５−８６９０，Methods Enzymol.29（１９７４），４６−５３）。Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の３’−エキソ（−）変異体は３’−エキソヌクレアーゼ活性を有していない。この酵素はしばしば、ＳａｎｇｅｒのＤＮＡ配列決定のために用いられる（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74（１９７７），５４６３−５４６７）。これらの酵素の外に、本発明の方法で使用できる種々の性質を有する他の３７℃ＤＮＡポリメラーゼが複数存在する。

更にまた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。好ましくは旨適温度７５℃であり９５℃で十分安定である最も広範に使用されている熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであるＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用できる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは種々の製造元より市販されている。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは３’−エキソヌクレアーゼ活性を有さない高度にプロセシング可能なＤＮＡポリメラーゼである。これは標準的なＰＣＲのため、配列決定反応のため、および、突然変異誘発ＰＣＲのため頻繁に使用されている（PCR Methods Appl.3（１９９４），１３６−１４０，Methods Mol.Biol.23（１９９３），１０９−１１４）。しかしながら、幾つかの他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼも使用できる。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来のＴｆｌＤＮＡポリメラーゼは同様の特性を有している。ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼは更に、マンガンイオン存在下で内因性逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する（Biotechniques 17（１９９４），１０３４−１０３６）。５’−エキソヌクレアーゼ活性は有さないが、３’−エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのうち、多くのものが市販されており、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ由来のＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＴｌｉ、ＶｅｎｔまたはＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｘまたはＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ由来のＴｕｂＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＴｍａまたはＵＩＴｍａＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。３’−プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼは可能な限り欠損の無いＰＣＲ産物の増幅のために使用される。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＳｔｏｆｆｅｌフラグメントを用いて、Ｖｅｎｔ−（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼおよびＴｓｐＤＮＡポリメラーゼを用いて、５’−および３’−エキソヌクレアーゼ活性のいずれも有さない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用できる。

ＲＮＡを鋳型鎖の核酸として、そして、ＤＮＡをマーカー鎖の核酸として使用する場合は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を使用できる。逆転写酵素のうち、好ましくはトリ骨髄芽球症ウィルス由来のＡＭＶ逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウィルス由来のＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、または、ヒト免疫不全ウィルス由来のＨＩＶ逆転写酵素を使用する。これらの酵素は全て、種々の製造元より入手できる。ＨＩＶ逆転写酵素と同様、ＡＭＶ逆転写酵素も関連のＲＮａｓｅ−Ｈ活性を有する。この活性はＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素では顕著に低減している。Ｍ−ＭｕＬＶおよびＡＭＶの逆転写酵素の両方とも３’−エキソヌクレアーゼ活性を有していない。更にまた、熱安定性逆転写酵素も使用できる。そして、内因性逆転写酵素活性を有するＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＴｔｈ-ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。

ＤＮＡを鋳型鎖の核酸として、そして、ＲＮＡをマーカー鎖の核酸として使用する場合は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してよい。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌ由来のＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＳＰ６を感染させたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２由来のＳＰ６−ＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３由来のＴ３−ＲＮＡポリメラーゼ、または、バクテリオファージＴ７由来のＴ７−ＲＮＡポリメラーゼＴ７が使用される。

方法の好ましい実施形態においては、ＤＮＡを核酸として使用し、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）をマーカーヌクレオチドとして使用する。ここで、工程（１）による、そして適宜工程（４）によるマーカーヌクレオチドの取りこみは、鋳型指向性ポリメラーゼ反応において４種の標準的なデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ；デオキシアデノシントリホスフェート、ｄＡＴＰ；デオキシグアノシントリホスフェート、ｄＧＴＰ；デオキシチミジントリホスフェート、ｄＴＴＰ；デオキシシチジントリホスフェート、ｄＣＴＰ；）と組み合わせてｄＵＴＰを使用することにより行なわれる。この反応におけるｄＴＴＰ濃度に対するｄＵＴＰの比はマーカーヌクレオチドの取りこみ確率を制御し、これにより組み換え距離を制御するために、広範な範囲から選択できる。厳密な比は、鋳型指向性ポリメラーゼ反応において使用されるポリメラーゼのｄＴＴＰとｄＵＴＰの識別率、並びに組み換え部位間の所望の平均距離に適合するものでなければならない。上記したポリメラーゼのうちのいくつかに関するｄＴＴＰとｄＵＴＰの識別率は以下のとおり、即ち、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ｄＴＴＰ取りこみのＶｍａｘ／Ｋｍ）／（ｄＵＴＰ取りこみのＶｍａｘ／Ｋｍ）＝１．２；クレノウＤＮＡポリメラーゼ＝１．６；ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ＝１．４；ＭＭＬＶ逆転写酵素＝６．３である（J.Biol.Chem.275（２０００）４０２６６）。一例として、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用し、２０〜６０塩基の範囲の平均距離を望む場合は、ｄＵＴＰに対するｄＴＴＰの濃度の比は、好ましくは、１００，０００未満、０．００１超である。より好ましくは、比は１，０００未満、０．１超である。最も好ましくはｄＵＴＰに対するｄＴＴＰの濃度の比は１０の範囲である。

別の好ましい実施形態において、使用される核酸はＤＮＡであり、８−オキソ−デオキシグアノシントリホスフェート（８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ）をマーカーヌクレオチドとして４種の標準ｄＮＴＰと組み合わせて鋳型指向性ポリメラーゼ反応に用いる。マーカー取りこみの確率、および、ひいては、組み換え部位間の距離は、８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰとｄＧＴＰの適切な濃度比の選択により制御することができる。一例として、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用し、２０〜６０塩基の範囲の平均距離が望まれる場合は、この反応における８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰのｄＧＴＰに対する濃度の比は、好ましくは１００，０００〜１０の範囲で選択される。より好ましくは、濃度の比は１０，０００〜１００の範囲で選択される。最も好ましくは、濃度の比は１０００の範囲である。

別の好ましい実施形態においては、以下に示す修飾塩基、即ち、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、７−ヒドロキシエチルグアニン、７−クロロエチルグアニン、Ｏ２−アルキルチミン、Ｏ２−アルキルシトシン、５−フルオロウラシル、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５，６−ジヒドロチミン、５−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン、チミングリコール、ウラシルグリコール、イソジアル尿酸、アロキサン、５，６−ジヒドロウラシル、５−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５−ホルミルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニンまたは３，Ｎ４−エテノシトシンの１つを有するマーカーヌクレオチドを鋳型指向性ポリメラーゼ反応において４種の標準ｄＮＴＰと組み合わせて使用する。ポリメラーゼ反応のためには、これらのマーカーヌクレオチドを取りこむことのできる鋳型指向性ポリヌクレオチド重合活性を有する如何なる酵素も使用できる。

別の好ましい実施形態においては、マーカー鎖核酸はＤＮＡであり、４種のリボヌクレオシドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）の１個、２個、３個または４個全てを鋳型指向性ポリメラーゼ反応において４種の標準的なｄＮＴＰと組み合わせて使用する。この反応におけるｒＮＴＰの対応するｄＮＴＰに対する濃度の比を用いてマーカー取りこみの確率、そしてこれにより組み換え部位間の距離も制御できる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼに関する識別比ｄＮＴＰ取りこみのＶｍａｘ／Ｋｍ）／（ｒＮＴＰ取りこみのＶｍａｘ／Ｋｍ）は、ｄＵＴＰ／ｒＵＴＰ＝１，５００，０００、ｄＣＴＰ／ｒＣＴＰ＝２４，０００であり；クレノウＤＮＡポリメラーゼについては、ｄＵＴＰ／ｒＵＴＰ＝１３０，０００、ｄＣＴＰ／ｒＣＴＰ＝３，１００であり；ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼについてはｄＵＴＰ／ｒＵＴＰ＝１０，０００、ｄＣＴＰ／ｒＣＴＰ＝２，０００であり；そして、ＭＭＬＶ逆転写酵素については、ｄＵＴＰ／ｒＵＴＰ＝２１，０００、ｄＣＴＰ／ｒＣＴＰ＝１，１００である（J.Biol.Chem.275,（２０００）４０２６６）。一例として、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼをマーカーヌクレオチドとしてのｒＣＴＰと組み合わせて使用し、２０〜６０核酸塩基の範囲の平均距離を望む場合は、ｄＣＴＰに対するｒＣＴＰの濃度の比は、好ましくは、１０，０００未満、１超である。より好ましくは、比は１，０００未満、１０超である。最も好ましくは比は１００の範囲である。

本発明の方法の工程（２）による２重鎖ヘテロ２本鎖の形成は好ましくは原料核酸分子の相同セグメントのハイブリダイゼーションにより行なわれる。「ヘテロ２本鎖」という用語は相同セグメント少なくとも１つおよび異種セグメント少なくとも２つを有する２重鎖を意味する。異種セグメントを有する核酸配列の集団を使用することにより、集団の配列変異体の相対的頻度に相応する統計学的確率でヘテロ２本鎖が形成される。例えば異種セグメント２個を有する変異体２種の等モル混合物から出発する場合、２つ毎の２重鎖核酸でヘテロ２本鎖が統計学的に生じる。変異体の数が個々の変異体の相対的頻度より遥かに大きい場合は、ヘテロ２本鎖がほぼ排他的に形成される。

ヘテロ２本鎖を形成するための原料核酸の相同セグメントのハイブリダイゼーションは、当業者の知る方法に従って行なわれる。好ましい実施形態においては、原料核酸分子は１重鎖であり、ハイブリダイゼーションは該１重鎖を組み合わせ、例えば温度を低下させるか、塩濃度を調節することにより、相同核酸のアニーリングを促進するように反応条件を調節することにより行なわれる。別の好ましい実施形態においては、原料核酸分子は２重鎖であり、ハイブリダイゼーションは適切な条件下、例えば２重鎖の融点より高温で２重鎖を融解することにより行なわれ、そして、例えば２重鎖の融点より低温まで温度を低下させることにより鎖をリアニーリングする。

本発明の工程（３）による取りこまれたマーカーヌクレオチドの位置における１重鎖ブレイクの生成は、好ましくは、化学または酵素反応により行なわれる。「ブレイク」という用語は鋳型指向性ポリメラーゼ反応の開始点として機能することのできる核酸鎖におけるニックまたはギャップを意味する。

好ましい実施形態においては、１重鎖ブレイクは、１塩基ギャップおよび該ギャップの５’側に遊離の３’−ＯＨ残基をもたらす酵素１種以上の作用によりマーカーヌクレオチドを除去することにより行なわれ、その際、遊離の３’−ＯＨは方法の工程（４）に従ってポリメラーゼにより伸長可能となる。

特に好ましい実施形態においては、ＤＮＡが核酸であり、ｄＵＴＰをマーカーヌクレオチドとして使用する場合は、取りこまれたマーカーウリジン残基のウラシル塩基をウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、図２〜４）の作用によりリボースから分離する。種々の種から単離されている種々のＵＤＧが多数報告されている（Rev.Biochem.Tox.9（１９８８）６９；Mutat.Res.460（２０００）１６５）。ＵＤＧはウラシルをもたらすＤＮＡ塩基シトシンの脱アミノ化により、または、ＤＮＡ複製の間のウリジンの過った取りこみにより生じる塩基除去経路に関与している。ＰＣＲキャリーオーバ防止におけるＵＤＧの使用は報告されている（Gene 93（１９９０）１２５）。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＵＤＧは種々の製造元から、操作型および未操作型で市販されている。Ｅ．ｃｏｌｉＵＤＧは１重鎖または２重鎖のＤＮＡからウラシルを効率的に加水分解するが、ｄＵＴＰからは加水分解しない。ＵＤＧの最小基質はｐｄ（ＵＮ）ｐであることが解かっている（Biochemistry 30（１９９１）４０５５）。反応は例えば緩衝液の条件または温度を変化させるか、または、ＵＤＧを添加することにより開始され、例えば緩衝液の条件または温度を変化させるか、またはＵＤＧ阻害剤を添加することにより停止できる。ウリジン残基を含むＤＮＡからのウラシル塩基の分離により、アピリミジン部位（ＡＰ部位）が生じる。

別の特に好ましい実施形態においては、ＤＮＡが核酸であり、８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰをマーカーヌクレオチドとして使用する場合は、ホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）を用いてリボースから８−ｏｘｏ−グアニジン塩基を分離する（ＥＭＢＯ Ｊ．６（１９８７）３１７７）。反応は例えば緩衝液の条件または温度を変化させるか、または、酵素を添加することにより開始でき、そして、例えば緩衝液の条件または温度を変化させるか、または、阻害剤を添加することにより停止することができる。そのホルムアミドピリミジン−グリコシラーゼ活性のほかに、この蛋白はまた、ＡＰ部位において５’−および３’−ホスホジエステル結合の両方をα，β−除去を介して切断するニック形成活性を有している（Biochem.J.262（１９８９）５８１）。即ち、８−ｏｘｏ−ＧＭＰ残基を有するポリヌクレオチド分子の処理は５’−および３’−末端の両方においてホスフェート基を有する１ヌクレオチドのギャップをもたらす。

別の特に好ましい実施形態においては、上記した修飾塩基の１つを検出する如何なる別のＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼも使用される。Ｅ．ｃｏｌｉアルキル塩基−ＤＮＡグリコシラーゼ（ａｌｋＡ遺伝子産物、Mol.Gen.Genet.197（１９８４）３６８）は、例えば３−メチルアデノシン、７−メチルアデノシン、３−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、７−ヒドロキシエチルグアノシン、７−クロロエチルグアノシン、Ｏ２−アルキルチミジン、Ｏ２−アルキルシチジン、ヒポキサントシン、１，Ｎ６−エテノアデノシンまたは３，Ｎ４−エテノシチジンから塩基を分離する。代替品としてのＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ（Biochem.J.242（１９８７）５６５）は５−ヒドロキシシチジン、５，６−ジヒドロチミジン、５−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミジン、チミジングリコール、ウリジングリコール、アロキサン、５，６−ジヒドロウリジン、５−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロウリジンまたは５−ヒドロキシウリジンから塩基を分離する。エンドヌクレアーゼＩＩＩはそのＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ活性の外にβ−除去を介してＡＰ部位の結合を３’−末端で分離するＡＰリアーゼ活性を有している（Nucl.Acid.Res.16（１９８８）１１３５）。即ち、エンドヌクレアーゼＩＩＩに対する上記した基質残基を含む核酸分子の処理は、３’−末端がα，β−不飽和アルデヒド（トランス−４−ヒドロキシ−２−ペンタナール(pentenal)−５−ホスフェート）および５’−末端がホスフェート基となるニックをもたらす。

別の好ましい実施形態においては、ＤＮＡが核酸であり、ｒＮＴＰの１つ以上をマーカーヌクレオチドとして使用する場合は、ＤＮＡ２重鎖に取りこまれているｒＮＭＰ残基はリボヌクレアーゼＨにより認識されることができる（ＲＮａｓｅＨ、図５）。好ましくは、リボヌクレオチド残基１個以上よりなるＤＮＡ鎖中のＲＮＡセグメントの５’−部位で切断するＫ５６２ヒト赤白血病細胞由来のＲＮａｓｅＨ１を用いる（J.Biol.Chem.266（１９９１）６４７２）。この反応により一方で５’−ｐ−ｒＮＭＰ残基、他方で遊離の３’−ＯＨ基となるニックが形成される。或いは、他のＲＮａｓｅＨ、例えばＥ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅＨまたは逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性を用いることができる。反応は例えば緩衝液の条件または温度を変化させるか、または、酵素を添加することにより開始でき、そして、例えば緩衝液の条件または温度を変化させるか、または、阻害剤を添加することにより停止することができる。

好ましい実施形態においては、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼの作用により生じるＡＰ部位をクラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼにより切断する（図２）。特にエンドヌクレアーゼＩＶ（J.Biol.Chem.252（１９７７）２８０８）またはエキソヌクレアーゼＩＩＩ（J.Biol.Chem.239（１９６４）２４２）をこの反応のために使用できる。これらの酵素とともにＡＰ部位を有するポリヌクレオチド分子をインキュベートすることにより、加水分解を介して、一方が５’−デオキシリボースホスフェート（ｄＲｐ）、他方が遊離の３’−ＯＨ基となるニックが形成される（Nucl.Acid.Res.18（１９９０）５０６９）。

特に好ましい実施形態においては、クラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼの作用により生じる５’−ｄＲｐをデオキシリボースホスファターゼ活性（ｄＲｐａｓｅｎ）を示す酵素により切断する。この反応のためには、複数の酵素を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ（Nucl.Acid.Res.20（１９９２）４６９９）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲｅｃＪ蛋白（Nucl.Acid.Res.22，１９９４，９９３）；Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ（Nucl.Acid.Res.17，１９８９，６２６９）；Ｅ．ｃｏｌｉホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Fpg,J.Biol.Chem.267，１９９２，１４４２９）；Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（J.Biol.Chem.272，１９９７，３２２３０）；Ｔ４エンドヌクレアーゼＶ（Biochemistry 32，１９９３，８２８４）；Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（J.Biol.Chem.273，１９９８，７８８８）；Ｔ７ＤＮＡリガーゼ（J.Biol.Chem.273，１９９８，７８８８）またはＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＭＭＬＶ逆転写酵素（J.Biol.Chem.275，２０００，１２５０９）が挙げられる。

別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼの作用により生じるＡＰ部位は、クラスＩＡＰエンドヌクレアーゼにより切断される（図３）。この反応のためには、Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩ（Biochem.J.242，１９８７，５６５−５７３）またはＴ４エンドヌクレアーゼＶ（Mutat.Res.459，２０００，４３−５３）を使用することができる。これらの酵素とともにＡＰ部位を含むポリヌクレオチド分子をインキュベートすることにより、β−除去を介して、３’−末端がα，β−不飽和アルデヒド（トランス−４−ヒドロキシ−２−ペンタナール(pentenal)−５−ホスフェート）および５’−末端がホスフェート基となるニックがもたらされる（FEBS Lett.178，１９８４，２２３；Nucl.Acid.Res.16，１９８８，１１３５）。３’−アルデヒドはエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶのようなクラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼにより除去し（Biochem.J.242，１９８７，５６５）、遊離の３’−ＯＨ基としなければならない。

好ましい実施形態においては、ＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼの作用により生じるＡＰ部位は、α，β−除去を介してＡＰ部位で切断するＡＰリアーゼにより切断される（図４）。Ｅ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（J.Biol.Chem.272，１９９７，３２２３０）およびＥ．ｃｏｌｉホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼ（Fpg,J.Biol.Chem.267，１９９２，１４４２９）をこの目的のために使用できる。これらの酵素とともにＡＰ部位を有するＤＮＡ２重鎖をインキュベートすることによりギャップの一端が３’−ホスフェート残基であり、ギャップの他端が５’−ホスフェート残基となる１ヌクレオチドのギャップがもたらされる。その後、３’−ホスフェート基をクラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶ（J.Biol.Chem.258，１９８３，１５１９８）によるか、またはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Biochemistry 16，１９７７，５１２０）により除去することにより、遊離の３’−ＯＨ基とする。

別の好ましい実施形態においては、ＤＮＡよりなりｒＮＭＰ残基を含むマーカー鎖をアルカリ加水分解により切断する。この反応は３’−末端が２’−または３’−ｒＮＭＰ、そして５’−末端がＯＨ基となるニックを形成する。反応はｐＨを変化させることにより開始および停止することができる。

別の好ましい実施形態においては、ｒＮＭＰを含むＤＮＡポリヌクレオチドのアルカリ加水分解で生じるニックの３’−末端の２’−または３’−ｒＮＭＰをクラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼにより除去する。好ましくは、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶを使用し、遊離の３’−ＯＨ基を得る。

工程（４）によれば、上記した反応の１つ以上の結果生じるニックまたはギャップの遊離の３’−ＯＨ基を、別のマーカーヌクレオチドの取りこみを伴うか、または伴うことなく、鋳型指向性ポリメラーゼ反応により伸長する。

好ましい実施形態においては、１重鎖ブレイクのマーカー鎖３’の残りの部分、特にクラスＩＩＡＰエンドヌクレアーゼの作用により生じる５’−ｄＲｐを含む鎖を、対応する相補鎖の余剰部に結合させ、これにより鋳型鎖から除去する。次に、何らかの種類のポリメラーゼを用いて鋳型指向性重合により３’−ＯＨ基を伸長させることができる。

別の好ましい実施形態においては、１重鎖ブレイクのマーカー鎖３’の残りの部分を、強力な鎖置換特性を示すポリメラーゼを用いて鋳型鎖から除去する。好ましくは、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼまたはクレノウＤＮＡポリメラーゼをこの目的のために使用する。

別の好ましい実施形態においては、１重鎖ブレイクのマーカー鎖３’の残りの部分を、５’−エキソヌクレアーゼ活性により鋳型鎖から除去する。この目的のためには、５’−エキソヌクレアーゼ活性を示す如何なるポリメラーゼも使用することができる。好ましくは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを使用する。或いは、５’−３’エキソヌクレアーゼをいずれかのポリメラーゼと組み合わせて使用することができる。そして、好ましくはラムダエキソヌクレアーゼ（Gene Amplification and Analysis 2，１９８１，１３５）またはＴ７エキソヌクレアーゼ（Nucl.Acid.Res.5，１９７８，４２４５）を使用する。

本発明の実施形態（Ｂ）は本発明の方法の実施形態（Ａ）を実施するための取扱説明書を含むキットに関する。好ましくは、該キットは下記構成要素：
（ｉ）ポリヌクレオチド分子内への取りこみのためのマーカーヌクレオチド；
（ｉｉ）取りこまれたマーカーヌクレオチドにおける１重鎖ブレイクを可能にする薬剤；および、
（ｉｉｉ）マーカーヌクレオチドの取りこみを行なうため、および１重鎖ブレイクを形成するための緩衝液、
を含む。

キットは更に別の構成要素、例えば下記要素：
（ｉｖ）２重鎖ポリヌクレオチドを生成するための緩衝液；
（ｖ）１重鎖ブレイクから出発するポリヌクレオチド鎖の鋳型指向性重合を可能にする薬剤；および、
（ｖｉ）重合反応を行なうための緩衝液、
の１つ以上を含んでいてよい。

本発明を以下の実施例により更に説明するが、これにより本発明は限定されない。

無作為に分布した遺伝子当りの１組み換え事象の生成
１．組み換えるべき部分相同および異種の遺伝子を準備する。一端でＥｃｏＲＩ制限部位および他端でＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入するＰＣＲにより遺伝子を増幅する。

２．ＰＣＲ産物１μｇおよびｐＵＣ１８ベクター１μｇをＥｃｏＲＩ反応緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０２５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）中１ＵのＥｃｏＲＩ（例えばＮＥＢ）および１ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（例えばＮＥＢ）とともに２時間３７℃でインキュベートする。６５℃で２０分間酵素を熱不活性化する。分解産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製する。

３．２００ｆｍｏｌベクター、６００ｆｍｏｌインサート、１μｌの１０Ｘライゲーション緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１００ｍＭＤＴＴ；１０ｍＭＡＴＰ，２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（例えばＮＥＢ）を水で１０μｌとしたものを用いてｐＵＣ１８ベクターにＰＣＲ産物を連結する。室温で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間酵素を熱不活性化する。Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅを例えばエレクトロポレーションにより連結されたベクターで形質転換する。例えばＱｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐキットを用いて陽性クローンからプラスミドを調製する。

４．下記プライマー：
ｐＵＣ−ｌｅｆｔ：５’−ＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧ−３’（配列番号１）；
ｐＵＣ−ｒｉｇｈｔ：５’−ＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２）
を用いたＰＣＲによる挿入遺伝子の増幅は、１０μｌ １０ＸＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｐｈ８．７５；１００ｍＭ ＫＣｌ；１００ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００；１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）、１０ｆｍｏｌ鋳型ベクター、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｌｅｆｔ、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｒｉｇｈｔ、２００μＭｄＮＴＰｓ、２Ｕ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）を混合して水で１００μｌとし、そして次のサイクルプロトコル、即ち１’９４℃；１’９４℃、１’５０℃、１．５’７２℃よりなる３０サイクル；２’７２℃を用いて行う。ＰＣＲ産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）で精製する。

５．１０μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；５００ｍＭ ＫＣｌ；１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０１％（ｗ／ｖ）ゲランチン(gelantin)）、１ｐｍｏｌ鋳型ＤＮＡ、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｌｅｆｔ、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｒｉｇｈｔ（３’−ＮＨ₂修飾）、２００μＭｄＮＴＰ、上記したｄＵＴＰ濃度のいずれか、２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を混合して水で１００μｌとし、そして次のサイクルプロトコル、即ち１’９４℃；１’９４℃、１’５０℃、１．５’７２℃よりなる３０サイクルを用いることにより、添加するｄＵＴＰの濃度を変化（例えば０．２μＭ；１μＭ；５μＭ；２５μＭ；１００μＭ ｄＵＴＰ）させながら鋳型として混合ＰＣＲ産物を用いて一連の非対称ＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、マーカー鎖としてＰＣＲ産物をプールする。

１０μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；５００ｍＭ ＫＣｌ；１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０１％（ｗ／ｖ）ゲランチン(gelantin)）、１ｐｍｏｌ鋳型ＤＮＡ、１００ｐｍｏｌブロックｐＵＣ−ｌｅｆｔ（３’−ＮＨ₂修飾）、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｒｉｇｈｔ、２００μＭｄＮＴＰ、２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を混合して水で１００μｌとし、そして次のサイクルプロトコル、即ち１’９４℃；１’９４℃、１’５０℃、１．５’７２℃よりなる３０サイクルを用いることにより、鋳型（アンチセンス鎖）として混合ＰＣＲ産物を用いて非対称ＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、鋳型鎖としてＰＣＲ産物をプールする。

６．１００ｍＭＮａＣｌ中でセンス鎖２ｐｍｏｌ（取りこまれたｄＵ’を有する）およびアンチセンス鎖２ｐｍｏｌをアニーリングする（２’９５℃、９５℃→５０℃、０．０４℃／ｓ）。アニーリングされた２重鎖ＤＮＡを例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）キットを用いて精製する。

７．２０μｌＵＤＧ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）中３７℃で１時間１Ｕ ＵＤＧ（例えばＮＥＢ）および２ＵエンドヌクレアーゼＩＶ（例えばＥｐｉｃｅｎｔｒｅ）とともにアニーリングされた２重鎖ＤＮＡ２ｐｍｏｌをインキュベートする。Ｖｅｎｔ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；１０ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２ｍＭ ＭｇＳＯ₄；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）８０μｌ、２００μＭ ｄＮＴＰおよび２Ｕ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を添加する。７２℃で５分間インキュベートする。ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製する。

８．３７℃で２時間、ＥｃｏＲＩ反応緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０２５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）中、１Ｕ ＥｃｏＲＩ（例えばＮＥＢ）および１Ｕ ＨｉｎｄＩＩＩ（例えばＮＥＢ）と共に生成物とｐＵＣ１８ベクター１μｇをインキュベートする。６５℃で２０分間酵素を熱不活性化する。切断産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）−キットを用いて精製する。

９．２００ｆｍｏｌベクター、６００ｆｍｏｌインサート、１μＬの１０Ｘ ライゲーション緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１００ｍＭＤＴＴ；１０ｍＭＡＴＰ，２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（例えばＮＥＢ）を水で１０μｌとしたものを用いてｐＵＣ１８ベクターに産物を連結する。室温で１時間インキュベートし、６５℃で１０分間酵素を熱不活性化する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅを連結したベクターで形質転換する。

遺伝子当たり１組み換え事象超の生成
工程１〜４は実施例１参照。

５．１０μｌの１０ＸＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；５００ｍＭ ＫＣｌ；１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０１％（ｗ／ｖ）ゲランチン(gelantin)）、１ｐｍｏｌ鋳型ＤＮＡ、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｌｅｆｔ、１００ｐｍｏｌロックｐＵＣ−ｒｉｇｈｔ（３’−ＮＨ₂修飾）、２００μＭｄＮＴＰ、２μＭｄＵＴＰ、２Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を混合して水で１００μｌとし、そして次のサイクルプロトコル、即ち１’９４℃；１’９４℃、１’５０℃、１．５’７２℃よりなる３０サイクルを用いることにより、鋳型として混合ＰＣＲ産物を用いて非対称ＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）によりマーカー鎖として精製する。

１０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３；５００ｍＭ ＫＣｌ；１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０１％（ｗ／ｖ）ゲランチン(gelantin)）、１ｐｍｏｌ鋳型ＤＮＡ、１００ｐｍｏｌブッロクｐＵＣ−ｌｅｆｔ（３’−ＮＨ₂修飾）、１００ｐｍｏｌｐＵＣ−ｒｉｇｈｔ、２００μＭｄＮＴＰ、２Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を混合して水で１００μｌとし、そして次のサイクルプロトコル、即ち１’９４℃；１’９４℃、１’５０℃、１．５’７２℃よりなる３０サイクルを用いることにより、鋳型として混合ＰＣＲ産物を用いて非対称ＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）により鋳型鎖として精製する。

６．１００ｍＭＮａＣｌ中マーカー鎖（組みこまれたｄＵ’を有する）２ｐｍｏｌおよび鋳型鎖２ｐｍｏｌをアニーリングする（２’９５℃、９５℃→５０℃、０．０４℃／ｓ）。アニーリングされた２重鎖ＤＮＡを例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）−キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。

７．２０μｌＵＤＧ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）中３７℃で１時間１Ｕ ＵＤＧ（例えばＮＥＢ）および２ＵエンドヌクレアーゼＩＶ（例えばＥｐｉｃｅｎｔｒｅ）とともにアニーリングされた２重鎖ＤＮＡ２ｐｍｏｌをインキュベートする。ＵＧＩ（ウラシルグリコシラーゼ阻害剤、例えばＮＥＢ）２Ｕを添加する。Ｖｅｎｔ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；１０ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２ｍＭ ＭｇＳＯ₄；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）８０μｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、２μＭ ｄＵＴＰおよび２Ｕ Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を添加する。７２℃で５分間インキュベートする。ＤＮＡを精製する（例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）を用いる）。

８．１００ｍＭＮａＣｌ中種々の鎖をリアニーリングする（２’９５℃、９５℃→５０℃、０．０４℃／ｓ）。

９．工程７および８を数回反復する（サイクル数はｂｐ／１００において遺伝子長と等しくなければならない）。

１０．産物およびｐＵＣ１８ベクター１μｇをＥｃｏＲＩ反応緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．０２５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）中１ＵのＥｃｏＲＩ（例えばＮＥＢ）および１ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（例えばＮＥＢ）とともに２時間３７℃でインキュベートする。６５℃で２０分間酵素を熱不活性化する。分解産物を例えばＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）−キットで精製する。

１１．２００ｆｍｏｌベクター、６００ｆｍｏｌインサート、１μｌの１０Ｘライゲーション緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１００ｍＭＤＴＴ；１０ｍＭＡＴＰ，２５０μｇ／ｍｌＢＳＡ）、５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（例えばＮＥＢ）を水で１０μｌとしたものを用いてｐＵＣ１８ベクターに産物を連結する。室温で１時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を熱不活性化する。Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅを連結されたベクターで形質転換する。

無作為に組み換えられたサブチリシン遺伝子の発生
４種の部分相同および部分異種のサブチリシン遺伝子を以下に記載する本発明の方法に従って組み換えた。４種の遺伝子は野生型および３種の突然変異株である変異体１５、変異体２１および変異体２２であり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のサブチリシンＥをコードする遺伝子ａｐｒＥに由来する（図７およびａｐｒＥコードサブチリシンＥ蛋白アミノ酸配列を示す配列番号５を参照）。

１．４種の部分相同および部分異種の遺伝子の各々を以下のプライマー：
プライマーＨＬ：５’−ＣＧＴＴＧＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号３）
プライマーＨＲ：５’−ＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＣ−３’（配列番号４）
を用いてＰＣＲ増幅した。

ＰＣＲは、１０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８；１００ｍＭ ＫＣｌ；１００ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２５ｍＭ ＭｇＳＯ₄；１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００；１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）、１０ｆｍｏｌ鋳型、１００ｐｍｏｌプライマーＨＬ、１００ｐｍｏｌプライマーＨＲ、２００μＭｄＮＴＰ、２．５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を混合して水で１００μｌとし、そして次の熱サイクルプロトコル、即ち１’９４℃；１’９４℃、１’５５℃、１．５’７２℃よりなる３０サイクル；２’７２℃を用いることにより、行なった。ＰＣＲ産物はＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）により精製した。

２．第２のＰＣＲにおいては、４種の遺伝子の各々を工程１と同じプライマーを用いてマーカーヌクレオチドの取りこみ下にＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ｄＴＴＰが減量されｄＵＴＰで補充されｄＵＴＰ／ｄＴＴＰの比が１：４０となっているｄＮＴＰ混合物２００μＭを１０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（７５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８；２００ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）；２．５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）と混合し、水で１００μＬとし、そして以下の熱サイクルプロトコル、即ち、１’９４℃；１’９４℃、１’５２℃、１．５’７２℃よりなる２５サイクルを用いることにより行なった。ＰＣＲ産物はＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）により精製した。

３．工程２のＰＣＲ産物（マーカー取りこみ）の各々０．５μｇ（約１ｐｍｏｌ）および工程１のＰＣＲ産物（マーカー非含有）の各々０．５μｇ（約１ｐｍｏｌ）を１００ｍＭＮａＣｌ中で混合することによりマーカー取りこみポリヌクレオチドのマーカー非含有ポリヌクレオチドに対する比率１：１の混合物を調製した。９４℃で２分間加熱し０．０４℃／ｓの速度で５０℃まで冷却することによりヘテロ２本鎖分子を形成した。同様にして、工程２および１のＰＣＲ産物の対応する量を混合してマーカー取りこみポリヌクレオチドのマーカー非含有ポリヌクレオチドに対する比率が１：３および１：９の混合物を調製し、同じプロトコルでヘテロ２本鎖分子を形成した。

４．各ヘテロ２本鎖分子混合物２μｇ（約３．８ｐｍｏｌ）を２０μｌの１ｘＵＤＧ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１ｍＭ ＤＴＴ）中、１Ｕ ＵＤＧ（ＮＥＢ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。２ＵエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を添加し、反応容量を１ｘＵＤＧ緩衝液で２０μｌまで増加し、混合物を３７℃で更に３０分間インキュベートした。次に８０μＬＴａｑ緩衝液（７５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８；２００ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）、２００μＭｄＮＴＰおよび２．５Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を添加し、混合物を７２℃で更に５分間インキュベートした。産物をＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）により精製した。

５．ポリヌクレオチドを１００ｍＭＮａＣｌに再懸濁し、再度、９４℃で２分間加熱を通じて鎖を溶解し、０．０４℃／ｓの速度で５０℃まで冷却することによりヘテロ２本鎖分子を形成した。

６．工程４および５を２回反復した。

７．最後に、ヘテロ２本鎖を分離するために、２０ｐｍｏｌのプライマーＭＬおよびプライマーＭＲを各混合物に添加し、サイクルプロトコル１’９４℃、１’５２℃、１．５’７２℃を用いた３サイクルのＰＣＲを行なった。組み換えられたポリヌクレオチドはＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）を用いて精製した。

８．次に、組み換えられたポリヌクレオチドをベクターｐＢＶＰ４３（図７参照）に、ｐ４３プロモーターの後方で連結し、その際、ベクターは以下のとおり構築した。即ち、ｐＵＣ１９（ＡＴＣＣ３７２５４）由来のｐＭＢ１オリジン(origin)をＰＣＲ増幅（位置７６３−１６０１）し、ｐＵＢ１１０（ＡＴＣＣ３７０１５）のＰｖｕＩＩ部位に導入した。このベクターからＳａｐＩおよびＢｇｌＩＩの間のフラグメントを除去した。次に、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｃｄｄ遺伝子由来のＰ４３プロモーターを含むインサート、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのサブチリシンＥ遺伝子由来のシグナル配列およびターミネーター、ならびに、シグナル配列およびターミネーターとの間の短いマルチクローニングサイトをユニークなＳｐｈＩ部位に導入することにより、ベクターｐＢＶＰ４３エンプティーを形成した。シグナル配列を有さない野生型のサブチリシンＥ遺伝子（配列番号５の蛋白をコードし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株１６８（ＤＳＭ＃４０２）のゲノムより誘導される）並びに他のサブチリシン変異体をマルチクローニングサイトにシグナル配列とともにインフレームに導入し、ベクターｐＢＶＰ４３を形成した。

９．次に、組み換えられたポリヌクレオチドをベクターｐＢＶＰ４３（図７参照）に、ｐ４３プロモーターの後方で連結した。ライゲーションは、３００ｆｍｏｌベクター、１５００ｆｍｏｌインサート、２μｌの１０Ｘライゲーション緩衝液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５；１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１００ｍＭＤＴＴ；１０ｍＭＡＴＰ，２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、５Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を水で２０μｌとしたものを用い、室温で２時間インキュベートし、その後６５℃で１０分間熱不活性化し、エタノール沈殿することにより行なった。次にライゲーション混合物でエレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した。

１０．単離したクローンを配列決定することにより、組み換え体の数と組み換え事象の頻度を調べた。

代表的なセットのクローンの配列決定分析の結果は図８に示すとおりであり、これは、野生型サブチリシンとその３種の突然変異体の出発原料のアミノ酸残基と本発明の方法を使用することにより得られた組み換え体のものを比較したものである。アミノ酸は以下の表Ｉに示すとおり略記される。

全体として、２６クローン中１７が組み換えられ、組み換え体６５％に相当した。遺伝子当たりの組み換え事象の平均数はクローン全体で約１．２であった。

図９に示すとおり、マーカー非含有ＰＣＲ産物のマーカー取りこみＰＣＲ産物に対する比が１：１および１：３のものは、約７５％の組み換え体を示し（図９Ｂ）；１：３混合物の組み換え体は、１：１混合物と比較して平均で１．５０の組み換え事象を有していた（図９Ａ）。

表Ｉ：アミノ酸の略記法

図１は本発明の方法の概略図である。 図２はマーカーヌクレオチドとしてｄＵＭＰを使用し、マーカーヌクレオチドにおける１重鎖ブレイクの導入のためにＵＤＧ、クラスＩＩ ＡＰエンドヌクレアーゼおよびｄＲＰａｓｅを用いる方法の原理を説明するものである。 図３はマーカーヌクレオチドとしてｄＵＭＰを使用し、マーカーヌクレオチドにおける１重鎖ブレイクの導入のためにＵＤＧ、クラスＩ ＡＰエンドヌクレアーゼおよびクラスＩＩ ＡＰエンドヌクレアーゼを用いる方法の原理を説明するものである。 図４はマーカーヌクレオチドとしてｄＵＭＰを使用し、マーカーヌクレオチドにおける１重鎖ブレイクの導入のためにＵＤＧ、ＥｎｄｏＶＩＩＩまたはＦｐｇ、およびクラスＩＩ ＡＰエンドヌクレアーゼまたはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いる方法の原理を説明するものである。 図５はマーカーヌクレオチドとしてｒＮＭＰを使用し、マーカーヌクレオチドにおける１重鎖ブレイクの導入のためにＲＮａｓｅＨを用いる方法の原理を説明するものである。 図６は３サイクルを用いる本発明の方法の概略図である。 図７はＰ４３プロモーターの後方に挿入されたサブチリシン遺伝子を有する実験部の実施例３において使用したシャトルベクターｐＢＶ４３のプラスミドマップを示す。 図８は実施例３に記載した本発明の方法により得られた組み換え体の代表的セットにおいて観察される突然変異を示す。突然変異はサブチリシンの野生型アミノ酸配列（配列番号５）を有する変異体と比較した場合のアミノ酸配列の相違として定義する。アミノ酸は表１に示す１文字コードに従って略記する。例えば「Ｅ１６０Ｄ」とは野生型アミノ酸配列の１６０位のグルタミン酸（Ｅと略記）がアスパラギン酸（Ｄと略記）により置きかえられていることを示す。 図９は実施例３に記載したバチルス・サブチルス由来のサブチリシン遺伝子の４種の変異体を用いて３ラウンドの本発明の方法を実施した場合の結果を示す。（Ａ）遺伝子当たりの組み換え事象の平均数；（Ｂ）得られた集団内の組み換え体の割合。Ｎは配列分析により調べた各実験におけるクローンの数である。１：１、１：３および１：９とは、方法において使用した、ｄＵＴＰ含有鎖の濃度に対する非ｄＵＴＰ含有鎖の濃度の種々の比を示す。

Claims (13)

1. 修飾された性質を有するポリヌクレオチド分子の製造方法であって、以下の工程：
   （１）原料核酸分子の集団を準備すること、ここで該集団の個々の核酸分子は相同および異種のセグメントを有し、その核酸配列内に取りこまれたマーカーヌクレオチドの少なくとも１種を有するものであり、
   （２）異種セグメントによる２重鎖を含む工程（１）により準備された原料核酸分子の集団の２重鎖ポリヌクレオチド分子を形成すること（ヘテロ２本鎖）、
   （３）工程（２）により生成された２重鎖ヘテロ２本鎖の取りこまれたマーカーヌクレオチドにおいて１重鎖ブレイクを形成すること；並びに、
   （４）工程（３）により形成された１重鎖ブレイクから出発してマーカーヌクレオチドの取りこみを行ないながら、または行なうことなく、鋳型指向性１重鎖合成を行なうこと、
   を包含する、製造方法。
2. （ｉ）上記した工程（２）から（４）を含む１サイクル以上、好ましくは少なくとも２サイクル、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも２０サイクル行ない；および／または、
   （ｉｉ）最終サイクルを除く全サイクルにおいて、新しいマーカーヌクレオチドの取りこみを行ないながら工程（４）を行ない；および／または、
   （ｉｉｉ）工程（３）および（４）を逐次的または同時に行う、請求項１に記載の方法。
3. （ｉ）相同セグメントが少なくとも５、好ましくは少なくとも１０そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、および／または、５０００ヌクレオチド以下、好ましくは２０００ヌクレオチド以下、より好ましくは１０００ヌクレオチド以下の長さを有し；および／または、
   （ｉｉ）相同セグメントが異種セグメントによりフランキングされている（flanked）、請求項１または２に記載の方法。
4. （ｉ）工程（１）による核酸分子へのマーカーヌクレオチドの取りこみが鋳型指向性ポリメラーゼ反応の使用によるか、または、オリゴヌクレオチドの化学合成により行なわれ；および／または、
   （ｉｉ）工程（２）による２重鎖ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドの生成が相補ポリヌクレオチドの相同セグメントのハイブリダイゼーションにより行なわれ；および／または、
   （ｉｉｉ）工程（３）において取りこまれたマーカーヌクレオチドの位置における１重鎖ブレイクが酵素的反応の使用により得られるニックまたはギャップであり；および／または、
   （ｉｖ）工程（４）の鋳型指向性１重鎖合成がポリメラーゼを利用する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 工程（２）から（４）を含む１以上のサイクルが行なわれ、２連続サイクルの各々における工程（４）による鋳型指向性合成の出発点の間の平均距離が、２連続サイクルの初回の工程（４）におけるマーカーヌクレオチドの取りこみの確率を調節することにより制御される、請求項１から４に記載の方法。
6. マーカーヌクレオチドの取りこみの確率がマーカーヌクレオチドの標準ヌクレオチドに対する濃度の比を調節することにより制御され；および／または、マーカーヌクレオチドの取りこみの確率が好ましくは１未満であり、そして塩基対内の原料核酸長の逆数より高値であり；および／または、マーカーヌクレオチドの取りこみの確率がサイクルごとに変わる、請求項５に記載の方法。
7. 核酸分子がＤＮＡ分子であり、鋳型指向性ポリメラーゼ反応においてデオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）をマーカーヌクレオチドとして４種の標準デオキシヌクレオシドトリホスフェートと組み合わせて使用し；および／または取りこまれたマーカーウリジン残基のウラシル塩基がウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼを用いてリボースから分離される、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 核酸分子がＤＮＡ分子であり、鋳型指向性ポリメラーゼ反応において８−オキソ−デオキシグアノシン(doxyguanosine)トリホスフェート（８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ）をマーカーヌクレオチドとして４種の標準デオキシヌクレオシドトリホスフェートと組み合わせて使用し；および／または取りこまれた８−ｏｘｏ−ＧＭＰ残基の８−ｏｘｏ−グアニン塩基がホルムアミドピリミジン−ＤＮＡグリコシラーゼを用いてリボースから分離される、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
9. 核酸分子がＤＮＡ分子であり、鋳型指向性ポリメラーゼ反応において以下の修飾された塩基：即ち、３−メチルアデニン、７−メチルアデニン、３−メチルグアニン、７−メチルグアニン、７−ヒドロキシエチルグアニン、７−クロロエチルグアニン、Ｏ２−アルキルチミン、Ｏ２−アルキルシトシン、５−フルオロウラシル、２，５−アミノ−５−ホルムアミドピリミジン、４，６−ジアミノ−５−ホルムアミドピリミジン、２，６−ジアミノ−４−ヒドロキシ−５−ホルムアミドピリミジン、５−ヒドロキシシトシン、５，６−ジヒドロチミン、５−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン、チミングリコール、ウラシルグリコール、イソジアル尿酸、アロキサン、５，６−ジヒドロウラシル、５−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロウラシル、５−ヒドロキシウラシル、５−ホルミルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、ヒポキサンチン、１，Ｎ６−エテノアデニンまたは３，Ｎ４−エテノシトシンを有するマーカーヌクレオチドを４つの標準ｄＮＴＰと組み合わせて使用し；および／または、上記した修飾塩基の１つを検出するＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼ、好ましくはＥ．ｃｏｌｉエンドヌクレアーゼＩＩＩまたはアルキル塩基ＤＮＡグリコシラーゼを使用する、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
10. 核酸分子がＤＮＡ分子であり、鋳型指向性ポリメラーゼ反応において４種の標準ｄＮＴＰと組み合わせてマーカーヌクレオチドとしてリボヌクレオシドトリホスフェート（ｒＮＴＰ）１、２、３種または４種全てを鋳型指向性ポリメラーゼ反応において使用し；および／またはＤＮＡポリヌクレオチド内に取りこまれたｒＮＭＰ残基が特異的リボヌクレアーゼＨ、好ましくはヒトＲＮａｓｅＨ１により認識される、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
11. 核酸分子がＤＮＡ分子であり、リボヌクレオシドモノホスフェート（ｒＮＭＰ）のいずれかまたは４つのすべてをマーカーヌクレオチドとして使用し、そして、マーカー鎖がｒＮＭＰ残基においてアルカリ加水分解により切断され、および／または、アルカリ加水分解により生じるニックの３'−末端における２'−または３'−ｒＮＭＰがクラスＩＩ ＡＰエンドヌクレアーゼにより、好ましくは、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはエンドヌクレアーゼＩＶにより除去される、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
12. 工程（４）において、酵素反応の結果として生じるニックまたはギャップにおける３'ＯＨ−基が、さらなるマーカーヌクレオチドの取りこみを行ないながら、または行なうことなく、鋳型指向性ポリメラーゼ反応により伸長され、好ましくは、
    （ｉ）クラスＩＩ ＡＰエンドヌクレアーゼの作用の結果として生じる５'−ｄＲｐ基を含む鎖が対応する鋳型鎖の余剰部に結合し、３'−基が鋳型指向性ポリメラーゼにより伸長され；および／または、
    （ｉｉ）ニックの３'ＯＨ−基が強力な鎖置換特性を示すポリメラーゼを用いて鋳型指向性に伸張され；および／または、
    （ｉｉｉ）ニックまたはギャップの３'ＯＨ−基が５'３'−エキソヌクレアーゼ活性を示す鋳型指向性ポリメラーゼにより、または、別の５'３'−エキソヌクレアーゼと共同して他の鋳型指向性ポリメラーゼを用いて伸長される、請求項４から１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 鋳型指向性１重鎖合成が行なわれる工程（４）における鋳型鎖がＲＮＡ分子であり、これによりＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはトリ骨髄芽球症ウィルス由来のＡＭＶ逆転写酵素、ヒト免疫不全ウィルス由来のＨＩＶ逆転写酵素、または、モロニーマウス白血病ウィルス由来のＭＭＬＶ逆転写酵素を鋳型指向性１重鎖合成のために用いる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

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