KR100482530B1 - 부위특이적 변이 도입방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 부위특이적변이를 위한 표적 DNA 단편을 삽입하여 수득한, 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한 2본쇄 DNA 벡터, 및 2종 이상의 선별 프라이머를 사용한 PCR을 시행하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 부위특이적변이도입 시행방법; 및 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 포함함을 특징으로 하는, 상기 방법에 사용되는 부위특이적변이도입을 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따라서, 부위특이적변이도입 시행방법 및 키트가 제공될 수 있으며, 이는 유전공학 및 단백질 공학에서 보다 간단하고 신속한 유용성을 주는 것이다. 본 발명의 방법과 키트를 사용함에 따라 PCR에 의해 수득한 PCR 산물을 숙주에 간편하게 형질전환하여 목적 부위에 변이 도입된 유전자를 효율적으로 수득할 수 있다.

Description

부위특이적변이도입방법 {METHOD FOR EFFECTING SITE-DIRECTED MUTAGENESIS}

본 발명은 유전 공학적 기법에 사용되는 부위특이적변이도입 (site-directed mutagenesis) 을 보다 용이하고 효율적으로 수행하는 방법, 및 상기 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.

최근, 유전공학 분야에서는, 발현 유전자를 클로닝하는 기술에만 의존하고 있기 때문에 유전자산물을 대량으로 수득하는 것은 곤란하며, 성공한 예가 거의 없다. 이러한 이유로, 클로닝된 유전자의 발현수준을 증가시키기 위해서, 프레임을 일치시키는 기술 및 아미노산 서열의 변화 없이 개시 코돈 근처의 염기서열을 바꾸는 기술 (사일런트 변이)은 최소적으로 필요한 기술이다. 또한, 상기 단백질이 효소인 경우, 유전자의 클로닝을 수행하고 발현된 단백질로서 보다 유용한 단백질을 제조하기 위해서는, 해당 코돈의 염기서열을 변화시켜 아미노산을 삭제하거나 치환시킴으로써, 단백질의 특이성, 예를 들어, 최적 pH, 안정성, 기질 특이성, Km 수치 등을 변화시키는 기술이 중요하며 필수적이다.

상기 기재된 바와 같이, 클로닝된 유전자 내에서 특정 염기서열을 원하는 대로 변화시키는 방법, 즉 부위특이적변이도입방법은 RNA 를 포함한 유전자상의 다양한 조절영역의 구조 및 기능의 해석, 및 재조합 DNA 기술을 이용한 단백질 공학 응용의 수행에 필수적이다. 또한, 단백질 공학의 연구분야에서, 부위특이적변이도입 시행방법은 DNA 수준에서 변이의 도입 및 삭제에 의한 보다 신속하고 정확한 연구의 관점에서 보다 중요하다.

통상적으로, 부위특이적변이도입 시행방법은, 예를 들어, 하기의 공정을 포함한다:

(1) 먼저, 변이가 도입될 목적 DNA 를 벡터에 삽입시킨다. 이후, 2본쇄 플라스미드 DNA 를 사용하는 경우, 열변성에 의해 목적 DNA 의 상보쇄를 해리 시키거나, M13 파지 벡터를 사용하여 1본쇄 DNA 를 제조한다;

(2) 목적 변이를 도입하기 위하여 고안된 올리고뉴클레오티드 (변이도입용 프라이머) 를 상기 1본쇄 DNA 와 접합 (annealing) 시킨다. 이후, DNA 폴리머라제 및 DNA 리가아제를 반응시켜 인 비트로 (in vitro) 시스템에서 상보쇄 DNA 를 합성한다;

(3) 상기 (2)항에서 얻은 DNA 로 대장균 (Escherichia coli)을 형질전환시킨 후, 변이가 도입된 클론을 선별한다.

그러나, 상기 공정들만을 실시할 경우, 모계 DNA (parent DNA) 에 대한 변이체의 비율이 극히 낮으므로, 변이도입용 프라이머에 접합시켜 생성된 클론을 효과적으로 선별할 필요가 있다. 따라서, 상기 (3)항의 공정에서는, 모계 DNA 를 갖고 있는 클론이 자라지 않도록 선별적인 제거 시스템을 사용한다.

상기 시스템의 예로는 앰버 변이 (앰버 코돈) 를 이용하는 방법 [Nucleic Acids Research, 12, No. 24, pp.9441-9456 (1984)]; 제한효소 부위를 이용하는 방법 [Analytical Biochemistry, 200, pp.81-88 (1992); Gene, 102, pp.67-70 (1991)]; 및 dut (dUTPase) 변이 및 ung (우라실 DNA 글리코실라제) 변이를 이용하는 방법 [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82, pp.488-492 (1985)] 등이 있다. 그러나, 상기 변이도입방법에서는, 이들의 공정이 복잡하고 많은 시간이 소요된다. 또한, 상기 방법에서는, 변이가 도입된 목적 클론의 수득율이 낮다.

한편, 일본 특개평 7-289262 에 기재되어 있는 부위특이적변이도입방법은 DNA 폴리머라제 및 DNA 리가아제를 사용한 앰버 변이를 이용하는 방법이다. 상기 방법과 비교하여, 일본 특개평 7-289262 에 기재되어 있는 방법에서 변이체를 높은 효율로 제조할 수 있다 하더라도, 대장균 내로의 2-단계 형질전환이 필요하며, 따라서 실제적인 목적을 위한 간단한 조작이 방해 받고있다.

최근, 사용이 보편화된 PCR 기술을 바탕으로 하는 부위특이적변이도입방법이 개발되어 왔다.

예를 들어, 변이도입용 프라이머를 포함하는 3종 이상의 프라이머를 사용하여 변이가 도입될 DNA 쇄를 합성하는 단계; 이후 변이가 도입된 것으로 예상되는 DNA 쇄를 제한효소로 절단한 후, 다른 벡터에 결찰시키는 단계; 및 수득된 벡터로 숙주 대장균을 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법이 알려져 있다. 또한, 변이가 도입될 2본쇄 DNA 와 회합 (hybridize)할 수 있는 2종의 상보적인 변이도입용 올리고뉴클레오티드 (변이도입용 프라이머) 를 사용하여 PCR 또는 피로코커스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 의 DNA 폴리머라제로 쇄를 합성하고, 이후, 변이가 없이 생성된 쇄를 제한효소 DpnI 으로 절단하고, 이후 DpnI 으로 처리된 생성물로 숙주 대장균을 형질전환시킴으로써, 변이가 도입된 DNA 를 수득하기 위하여 상표명이 퀵 체인지 (Quik Change^TM) 인 부위특이적변이도입 키트 (Stratagene 사 제조) 를 사용할 수 있다. 또한, 2종의 변이도입용 올리고뉴클레오티드 (변이도입용 프라이머) 각각의 5'-말단측에 클래스 IIS 제한효소 인식부위를 첨가하고, PCR 에 의해 쇄를 합성한 후, 클래스 IIS 제한효소로 변이가 도입된 DNA 를 절단하고, 결찰시킨 후 숙주 대장균을 형질전환시킴을 포함하는 변이가 도입된 DNA 를 수득할 수 있는 방법이 알려져 있다 (미국특허 제 5,512,463 호).

상기 기재한 바와 같이, DNA 폴리머라제 및 DNA 리가아제를 사용하는 통상의 방법은 상기의 효소 반응 및 변이 부위를 고정시키기 위한 다수의 형질전환 단계를필요로 하며, 시간이 너무 많이 소요됨으로써, 효율을 증진시키기 곤란하다. 또한, 앰버 변이 또는 "dut" 및 "ung" 변이를 사용하는 방법에서는, 1본쇄 DNA를 분리하여야만 한다. 제한효소 부위를 제거하는 방법은 사용 가능한 제한효소가 한정되어있는 것을 포함하는 것과 같은 문제점을 가진다.

이상의 관점에서, 최근 널리 보편화한 PCR 기술을 이용한 부위특이적변이도입 시행방법이 개발되어 실제 응용되고 있다. 그러나, 변이도입용 프라이머와, 2종 이상의 변이도입용 프라이머를 포함하는 프라이머가 포함되는, 3종 이상의 프라이머가 필요하고, 또한 조작 중 제한효소 반응이 필요하고, 또한 기타면에 있어서 그의 조작이 복잡하다. 기타 다양한 문제점으로는 불완전 제한효소 반응에 기인하는 지극히 제한된 변이 효율 등이 있다.

따라서 본 발명의 목적은 간편하고도 실용적인, PCR 방법을 이용한 부위특이적변이도입 시행방법과 부위특이적변이도입 시행방법을 실시하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

효율적이고도 간편한 부위특이적변이도입 시행방법을 개발하기 위한 강도 높은 연구의 결과로, 본 발명자들은 PCR 수행이후 단 한번만 대장균을 형질전환시켜 목적 변이가 도입된 클론을 얻는데 성공하였다. 본 발명은 이러한 사실을 기초로 완성되었다.

도 1 은 플라스미드 pKF19k의 구조를 나타내는 개략도이다.

도 2 는 플라스미드 pKF19kM의 구조를 나타내는 개략도이다.

따라서, 본 발명의 요지는 하기와 같다:

[1] 부위특이적변이도입을 위한 표적 DNA 단편의 도입에 의해 수득한, 하나 이상의 앰버 코돈을 가지는 2본쇄 DNA 벡터, 및 2종 이상의 선별 프라이머를 이용한 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 방법임을 특징으로 하는 부위특이적변이도입 시행방법;

[2] 상기 [1]항에 따른 부위특이적변이도입 시행방법으로 선별 프라이머가 변이도입용 프라이머 및 앰버 코돈 복귀용 프라이머임을 특징으로 하는 방법;

[3] 상기 [1]항 또는 [2]항에 따른 부위특이적변이도입 시행방법으로 하나 이상의 앰버 코돈을 포함하는 약물 내성유전자를 가지는 벡터임을 특징으로 하는 방법;

[4] 상기 [1]항에서 [3]항 중 어느 한 항에 따른 부위특이적변이도입 시행방법으로 PCR 산물로 서프레서-프리 (suppressor-free; Sup ^o ) 숙주를 형질전환하는 단계를 더 포함하는 방법;

[5] 상기 [4]항에 따른 부위특이적변이도입 시행방법으로 서프레서-프리 (Sup ^o ) 숙주가 대장균임을 특징으로 하는 방법;

[6] 상기 [1]항 에서 [5]항 중 어느 한 항에 따른 부위특이적변이도입 시행방법에 사용되는 부위특이적변이도입을 위한 키트로, 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 포함함을 특징으로 하는 키트;

[7] 상기 [6]항에 따른 부위특이적변이도입을 위한 키트로, 하나 이상의 앰버 코돈을 가지는 벡터를 포함함을 특징으로 하는 키트;

[8] 상기 [6]항 또는 [7]항에 따른 부위특이적변이도입을 위한 키트로, 서프레서-프리 (Sup ^o ) 숙주를 포함함을 특징으로 하는 키트; 및

[9] 상기 [8]항에 따른 부위특이적변이도입을 위한 키트로, 서프레서-프리 (Sup ^o ) 숙주가 대장균임을 특징으로 하는 키트.

본 발명을 이하에서 상세히 설명한다.

본 발명은 부위특이적변이도입 시행방법으로, 부위특이적변이도입을 위한 표적 DNA 단편을 삽입하여 수득한, 하나 이상의 앰버 코돈을 가지는 2본쇄 DNA 벡터, 및 2종 이상의 선별 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법이다. 본 발명에서 사용된 선별 프라이머는, 변이될 유전자 상에 목적하는 위치에 변이를 유도하기 위한 변이도입용 프라이머로 구성되는 2종 이상의 프라이머를 사용할 수 있고; 또한 앰버 코돈 복귀를 위한 앰버 코돈 복귀용 프라이머로서, 변이도입용 프라이머의 반대편 쇄에 배열된 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 사용할 수 있다. 본문에서 사용된 "2종 이상의 프라이머"라는 용어는 변이도입용 프라이머와 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 말하며, 상기 두 종의 선별 프라이머가 포함되는 한 어떠한 선별 프라이머의 세트라도 본 발명에 기재된 2종 이상의 선별 프라이머에 포함된다.

본 발명에서 사용된 하나 이상의 앰버 코돈을 가지는 2본쇄 DNA 벡터는, 본 벡터가 하나 이상의 앰버 코돈을 가지고, 본 발명의 부위특이적변이도입 시행방법에 제한이 없는 한 어떤 벡터도 가능할 수 있다. 이러한 경우에는, 약물 내성유전자 상에 앰버 코돈(들)을 가지는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 약물 내성유전자는 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들어, 카나마이신 (kanamycin) 내성유전자, 클로르암페니콜 (chloramphenicol) 내성유전자 등이 바람직하다. 달리 표현하면, 예를 들어 카나마이신 또는 클로르암페니콜 내성유전자와 같은 약물 내성유전자 상에 하나 이상의 앰버 코돈들을 가지는 벡터가 바람직하게 사용된다. 일례로, pKF19k (다까라 슈조사 제조)를 사용할 수 있다. 앰버 코돈을 포함하는 카세트를 제조하여 카세트를 벡터에 도입할 수 있다. 이러한 벡터를 사용함으로써, 단순히 대장균과 같은 서프레서-프리 숙주에 PCR 산물을 도입하고, 수득한 숙주를 예를 들어, 카나마이신, 클로르암페니콜 등의 약물을 함유하는 아가배지에서 배양하여 약물 내성유전자 상의 앰버 코돈의 복귀를 용이하게 확인할 수 있다.

본 발명의 부위특이적변이도입 시행방법에 의해 도입할 수 있는 변이의 종류는 특별히 한정되지는 않는다. 이의 예는 염기 치환, 삭제와 삽입을 포함한다. 변이 크기가 한정된 것은 아니나, 변이도입용 프라이머의 길이를 변이 크기에 따라 변화시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 변이 크기가 약 1 내지 3 염기일 때, 변이도입용 프라이머의 길이는 약 20 염기가 바람직하다. 변이 크기가 4 염기 이상일 경우, 변이도입용 프라이머는 목적 변이 부위에 대해 5'-측 및 3'-측의 각각에 약 15 염기 쌍을 포함하여, 약 30 염기정도 까지인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 변이도입용 프라이머 3'-말단은 G 또는 C인 것이 또한 바람직한데, 이는 3'-말단이 폴리머라제 반응의 출발점으로 작용하기 때문이다. 이러한 조건들을 고려하여 변이도입용 프라이머를 제조한다. 또한 전기영동 등의 방법에 의해서 프라이머를 사용한 PCR로 목적 단편이 확실히 증폭 되었는지의 여부를 확인함으로써 프라이머의 디자인과 순도를 평가할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 변이도입용 프라이머의 개수와 관련하여, 한 종류의 변이도입용 프라이머로서 목적 변이를 도입할 수 있다. 그러나 한 부위에 다른 변이를 도입할 때는, 목적에 따라서, 일회의 조작에 의해 각 목적 변이를 도입하는 유전자를 수득하기 위해 혼합물 내에 복수의 변이도입용 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 위치에서 G 에서 A, T, 또는 C로 각각 염기 변환하는 염기-치환 부위특이적변이도입을 수행하면 G 에서 A, T, 또는 C 각각으로의 변이를 도입하여 얻은 유전자는 각 3 종의 변이도입용 프라이머를 제조하고, 이후 혼합물에서 변이도입용 프라이머를 사용하는 일회 조작에 의하여 수득할 수 있다.

또한, 앰버 코돈 복귀용 프라이머는 특별히 제한되지 않으면서 앰버 코돈 부분을 야생형 등으로 복귀시킬 수 있는 프라이머이다. 예를 들어, 앰버 코돈이 TAG이면, TAG를 TCG 또는 CTG로 전환하도록 제조한 프라이머를 이용하여 앰버 코돈을 복귀시킬 수 있다. 앰버 코돈 복귀용 프라이머의 길이는 앰버 코돈의 개수, PCR 효율 등에 따라서 변화시키는 것이 바람직하다. 앰버 코돈 복귀용 프라이머의 길이는 특별히 한정되지는 않는다. 바람직하게는 약 20 염기 내지 약 30 염기의 길이이다. 또한 앰버 코돈의 3'-말단이 변이 프라이머에서와 같이 G 또는 C인 것이 바람직한데 그 이유는 3'-말단이 폴리머라제 반응의 출발점으로 작용하기 때문이다. 또한 전기영동 등의 방법에 의해서 프라이머를 사용한 PCR로 목적 단편이 확실히 증폭 되었는지의 여부를 확인함으로써 프라이머의 디자인과 순도를 평가할 수 있다. 또한, 한 종류의 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다. 2 이상의 앰버 코돈이 존재할 때, 앰버 코돈이 한 종류의 프라이머에 의해 복귀될 수 있도록 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 제조하는 것이 바람직하다.

PCR에서 각 변이도입용 프라이머 및 앰버 코돈 복귀용 프라이머의 농도는 특별히 한정되지는 않는다. 반응중의 각 최적 농도를 연구하는 것이 필요한데, 이는 각 프라이머의 농도가 매우 낮을 때는 증폭량을 감소되고, 그 농도가 매우 높을 때는 비-특이적 반응이 촉진되어 결과적으로 어떤 경우에는 특이적 증폭 반응의 시작을 방해할 수 있기 때문이다. 일반적으로 PCR은 각 프라이머의 최종 농도 범위를 0.1 내지 1.0 μM 로 하여 시행하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 언급한 서프레서-프리 숙주는 대장균, 예를 들어, 대장균 MV1184 (다까라 슈조 사 제조)를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 서프레션 능력을 갖지 않는 한, 어떠한 숙주도 사용될 수 있으며, 또한 그러한 모든 숙주는 본 명세서 내에서 서프레서-프리 숙주로 언급된 범위 내에 포함된다.

본 발명의 방법에 의한 부위특이적변이도입은, 예를 들어, 하기의 단계들로 수행할 수 있다:

(1) 표적 DNA를 하나 이상의 앰버 코돈을 가지는 2본쇄 DNA 벡터에 삽입한다.

(2) 위 (1) 항에서 제조한 DNA-삽입 벡터, 변이시킬 유전자의 목적 부위에 변이를 도입할 변이도입용 프라이머, 및 상기 변이도입용 프라이머의 반대쇄에 배열된 앰버 코돈의 복귀를 위한 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 혼합하여 이후 PCR을 수행한다.

(3) 이 PCR 산물을 서프레서-프리 (Sup ^o ) 숙주에 도입하고, 목적 변이를 가지는 클론을 선별한다.

상기 단계를 수행함으로써, 목적 부위에 변이가 도입된 유전자를 효율적으로 수득할 수 있다.

본 발명에서는, PCR 증폭에 의한 PCR 산물이 긴-사슬 프라이머로 작용하기 때문에, PCR 산물은 PCR 과정 중의 완전-길이 DNA 합성을 촉진한다. 또한, 숙주로서의 대장균 (in vivo)에 직접 도입 될 때, PCR 산물은 고리화한다. 또한, 목적 부위에 변이가 도입된 유전자를 포함하는 클론을 선별하는 경우, 서프레션 시스템 방법을 이용하면 선별이 단순화된다. 정확히 표현하면, PCR 산물을 숙주, 예를 들어, 서프레서-프리 대장균에 도입하고, 상기 약물 내성유전자 중의 하나에 대한 약물을 함유하는 배지 내에서 숙주를 배양하여, 그의 성장을 확인함으로써 앰버 코돈 복귀를 간단히 확인할 수 있다. 다시 말하면, 단지 앰버 코돈-복귀된 클론만이 선별되기 때문에, 성장한 균주는 목적 부위에 변이가 도입된 유전자를 가지는 클론인 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 변이시킬 유전자 상의 어느 부위에도 변이를 도입할 수 있다.

본 발명의 방법에 의한 PCR을 시행하기 위해 통상의 방법을 사용할 수 있지만, 이하에 기술한 사항을 고려하여 3'-말단에 아데닌 (A)가 첨가되는 등의 PCR에 의한 잘못된 염기의 도입을 피하는 것이 바람직하다.

(I) 변이되어 벡터에 삽입될 유전자는 바람직하게는 2 kbp 이하이다.

(II) PCR 사이클의 횟수는 바람직하게는 20 내지 30 사이클이다.

(III) PCR에 쓰이는 열안정성 DNA 폴리머라제는 바람직하게는 고 증폭 효율 및 저 오류도를 가지는 것이다. 예를 들어, TaKaRa LA PCR 키트 (다까라 슈조사 제조)를 PCR 키트로 사용할 수 있다. 또한, 열안정성 DNA 폴리머라제로는 TaKaRa Ex Taq (다까라 슈조사 제조)를 이용하여 PCR을 수행함으로써 고 증폭 효율 및 저 오류도를 이룰 수 있다.

PCR 산물로, 대장균과 같은 숙주 및 다른 숙주를 형질 전환하는 방법으로는, 염화칼슘법 [Journal of Molecular Biology, 166, pp. 557-580 (1983)] 및 엘렉트로포레이션 법 (electroporation method) [Nucleic Acids Research, 16, pp. 6127-6145 (1988)]을 포함한다. 수득한 형질전환체의 스크리닝에 관해서는, 고 확률 앰버 코돈 복귀를 가지는 유전자를 함유한 클론, 즉, 목적부위에 고 변이 확률을 가지는 유전자를 상기 약물 내성유전자 중의 하나에 해당하는 약물을 함유하는 배지 내에서 형질전환체를 배양하여, 그의 성장을 확인함으로써 선별할 수 있다.

본 발명에 의해서 앰버 코돈을 이용한 간단한 부위특이적변이도입 시행방법이 제공되므로, 당업자가 앰버 코돈 이외의 종결 코돈, 예를 들어 오커 코돈 또는 오팔 코돈을 본 발명의 앰버 코돈 대신에 적용할 수 있음은 자명하다. 따라서, 본 발명의 앰버 코돈의 위치 대신에 오커 코돈 또는 오팔 코돈을 사용하는 부위특이적변이도입 시행방법도, 당연히 본 발명의 범위 내에 포함된다.

이하에서 본 발명을 하기된 실시예에 의해 보다 자세히 설명하지만, 이 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

단일 염기-치환 부위특이적변이도입

1. pKF19kM의 제조

pKF19kM (도 2)를 이하의 실시예에서 사용할 플라스미드로 제조하였다. 이는 pKF19k (다까라 슈조사 제조, 도 1)의 lacZ' 유전자 내의 다중클로닝 위치에서 하류 (downstream)로 30 번째 위치의 G를 A로 전환하여 수득한 것으로, 앰버 코돈 두 개를 포함하는 카나마이신 내성유전자를 가지는 것이다.

lacZ' 유전자는 lacZ' 유전자가 lacZΔM15 유전자형을 가지는 숙주 세포에 도입될 때 β-갈락토시다제 활성을 나타낸다. 따라서, 염기 치환이 없는 lacZ' 유전자의 경우에는 수득한 성장 콜로니가 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG, 다까라 슈조사 제조) 존재하에 기질로서 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드 (X-Gal, 다까라 슈조사 제조)와 반응하여 푸른색을 띤다. 반면에, 염기 치환이 있는 변이체 lacZ' 유전자는 고유의 활성을 나타낼 수 없으므로, 수득한 성장 콜로니가 흰색을 띤다.

이러한 현상을 이용하여, 부위특이적변이도입에 의한 pKF19kM 변이체 lacZ' 유전자 내 염기 치환의, 활성 유전자로의 복귀 효율을 푸른 콜로니 및 흰 콜로니의 개수로부터 계산한다.

2. 변이도입용 올리고뉴클레오티드 (변이도입용 프라이머) 및 카나마이신 내성유전자 내의 이중 앰버 코돈 복귀를 위한 올리고뉴클레오티드 (앰버 코돈 복귀용 프라이머)의 합성

서열 목록 내의 서열번호: 1로 나타낸 5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드 (mut1)를 변이체 lacZ' 유전자 내의 염기 치환 위치의 복귀 (A에서 G로의 복귀)에 사용되는 변이도입용 올리고뉴클레오티드로서 합성한다. 달리 말하면, mut1은 열 번째 C의 염기 치환을 복귀하여 활성 lacZ' 유전자를 수득하도록 디자인한다.

또한, 서열 목록 내의 서열번호: 2로 나타낸 5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드는 카나마이신 내성유전자 내의 이중 앰버 코돈 (두개의 앰버 코돈)의 복귀를 위한 프라이머 (KQ2)로서 제조한다. 정확하게는, pKF19kM 내에서, 앰버 코돈 (TAG)을 KQ2 의 3번째에서 5번째 위치의 TTG와, 9번째에서 11번째 위치의 CTG로 복귀시키도록 프라이머를 디자인한다.

3. PCR

반응 혼합물의 조성을 표 1에 나타내었다. PCR은 써멀 사이클러 (thermal cycler; 다까라 슈조사 제조)를 이용하여 실행한다. 반응 결과 혼합물을 에탄올 침전시켜 탈염하고 농축한다. 이후, 결과 혼합물을 5 ㎕의 멸균수에 현탁한다.

pKF19kM	5 ng
프라이머 (mut1 및 KQ2)	각 최종 농도 5 pmol
TaKaRa Ex Taq (다까라 슈조사 제조)	5U
dNTP 혼합물	최종 농도 200 μM
TAPS 완충액 (pH 9.3, 25℃)	25 mM
KCl	50 mM
MgCl2	2 mM
2-머캅토에탄올	1 mM
총 부피 50 ㎕ (미네랄 오일을 부가)
주의: TAPS = N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설포네이트

사이클은 94℃에서 30 초간, 55℃에서 2 분간, 및 72℃에서 2 분간의 조건하에서 실행한다. 상기 조건을 사이클 I 에 대해서는 20 사이클, 및 Cycle II에 대해서는 24 사이클을 반복한다. 부가적으로, PCR의 종결 후에는, 사이클 I 및 II의 각 산물을 전기영동에 걸어 목적하는 크기의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인한다.

4. 형질 전환

서프레서-프리 대장균 MV1184 (다까라 슈조사 제조)를 에탄올 침전 후의 PCR 산물 각 2 ㎕를 이용하여 엘렉트로포레이션 법에 의해 형질전환한다. 이후에, 결과의 형질 전환 세포를 카나마이신 (50 ㎍/ml), X-Gal (40 ㎍/ml) 및 IPTG (0.2 mM)을 함유하는 LB 아가 배양액 [박토트립톤 (10 g), 박토이스트 추출물 (5 g), NaCl (5 g), 증류수 (1 리터), pH (7.0)]에 분산시키고 수득한 클론에서 부위특이적변이도입의 효율을 계산한다. 부수적으로는 변이체 lacZ' 유전자 내의 변이 부분이 활성 lacZ' 유전자로 복귀되면, 결과의 콜로니는 푸른색을, 변이 부분이 복귀되지 않았으면 흰색을 보임에 주의해야한다. 결과는 표 2에 기재되어 있다.

푸른색 흰색 합계 (푸른색/합계)X100 [%]

사이클 I 586 314 900 65 사이클 II 2655 891 3546 75

달리 말하자면, 부위특이적변이도입에 의해 활성 유전자로 복귀된 클론을 사이클 II에 의해 75% 효율로 수득하였다.

5. 부위특이적변이 부위의 분석

플라스미드 DNA를 실시예 1의 4항에서 수득한 4개의 각 푸른색 콜로니에 대한 알칼리 라이시스 (alkali lysis)법으로 제조한다. 각 플라스미드 DNA의 염기서열은 디데옥시 법으로 결정하고, 이후 변이 부위를 분석한다. 그 결과로, lacZ' 유전자 내의 다중클로닝 부위 하류 30번째 위치에서 A에서 복귀된 G가 관측되었고, 이는 부위특이적 변이가 유도되는 것을 명백히 시사하고 있다.

실시예 2

3 염기- 또는 6 염기- 삭제 부위특이적변이도입

3 염기 또는 6 염기를 삭제하기 위하여, 두 개의 앰버 코돈을 가지는 카나마이신 내성유전자와 야생형 lacZ' 유전자를 가지는 pKF19k를 사용하였다.

1. 변이도입용 올리고뉴클레오티드의 합성

5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드를 pKF19k의 다중클로닝 부위에서 각각 3 염기- 또는 6 염기- 삭제에 의해 BamHI부위 및 BamHI-EcoRI 부위가 결핍되도록 합성한다. 3-염기 삭제에 사용하는 올리고뉴클레오티드 (del1) 를 서열 목록 내의 서열번호: 3 으로 나타내었다. 6-염기 삭제에 사용하는 올리고뉴클레오티드 (del2) 를 서열 목록 내의 서열번호: 4 로 나타내었다. 정확하게는, del1은 서열 목록 내의 서열번호: 3 의 12번째 G와 13번째 C 사이 위치의 염기를 삭제하기 위해 디자인 된 것이고, del2는 서열 목록 내의 서열번호: 4 의 12번째 G와 13번째 T 사이 위치의 염기를 삭제하기 위해 디자인 된 것이다.

2. PCR 및 형질 전환

표 1 의 조성물 (표에서, pKF19k가 pKF19kM 대신 사용되었음)에 따라, 실시예 1에서 사용된 KQ2 프라이머와 실시예 2의 1항에서 제조한 프라이머 del1 및 del2 각각을 사용하여 94℃에서 30 초간, 55℃에서 2 분간, 및 72℃에서 2 분간의 조건으로 구성된 각 사이클로서, 30 사이클의 PCR을 실행한다. 결과의 PCR 산물을 실시예 1에서와 같은 방법으로 에탄올 침전시킨다. 이후에 침전한 PCR 산물을 5 ㎕의 멸균수에 현탁하고, 대장균 MV1184를 2 ㎕의 수득한 현탁액으로 형질전환한다. 다음에는, 수득한 형질전환체를 50 ㎕/ml 카나마이신을 함유한 LB 아가배지에 분산시키고, 각 10개의 균주를 성장 콜로니에서 선별한다. 이후, 플라스미드 DNA를 실시예 1의 5항과 동일한 방법으로 제조한다. 변이의 확인은 상기 플라스미드 DNA 각각을 제한효소 BamHI으로 소화시킴으로써 시행한다. 달리 말하면, 변이가 도입된 플라스미드는 소화되지 않는다. 결과는 표 3에 나타내었다.

비-소화 클론 개수 검정 균주수 변이 효율 (%)

del1 9 10 90 del2 9 10 90

프라이머 del1 및 del2를 이용한 PCR 산물 각각에 도입된 변이는 90%의 변이 효율을 가지고, 시퀀싱 (sequencing) 결과, 3 염기 또는 6 염기가 각 PCR 산물에서 삭제된 것으로 확인되었다.

실시예 3

60 염기-삭제 부위특이적변이도입

1. 변이도입용 올리고뉴클레오티드의 합성

삭제에 의해 pKF19k (다까라 슈조사 제조)의 전체 다중클로닝 부위 (60 염기)가 결핍되도록한 5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 (del3)는 서열 목록 내의 서열번호: 5로 나타내었다. 달리 말하면, del3은 서열 목록 내의 서열번호: 5 의 10번째 T와 11번째 G 사이 위치의 전체 다중클로닝 부위 (60 염기)를 삭제하기 위해 디자인 된 것이다.

2. PCR 및 형질전환

표 1 의 조성물 (표에서, pKF19k가 pKF19kM 대신 사용되었음)에 따라, 실시예 1에서 사용된 KQ2 프라이머와 실시예 3의 1항에서 제조한 프라이머 del3 를 사용하여 94℃에서 30 초간, 50℃에서 2 분간, 및 72℃에서 2 분간의 조건으로 구성된 각 사이클로서, 30 사이클의 PCR을 실행한다. 결과의 PCR 산물을 실시예 1에서와 같은 방법으로 에탄올 침전시킨다. 이후에 침전한 PCR 산물을 5 ㎕의 멸균수에 현탁하고, 대장균 MV1184를 2 ㎕의 수득한 현탁액으로 형질전환한다. 다음에는, 수득한 형질전환체를 50 ㎕/ml 카나마이신을 함유한 LB 아가배지에 분산시키고, 각 20개의 균주를 성장 콜로니에서 선별한다. 이후, 플라스미드 DNA를 실시예 1의 5항과 동일한 방법으로 제조한다. 변이의 확인은 상기 플라스미드 DNA 각각을 제한효소 EcoRI 및 HindIII으로 소화시킴으로써 시행한다. 달리 말하면, 변이가 도입된 플라스미드는 소화되지 않는다. 결과는 표 4에 나타내었다.

비-소화 클론 개수 검정 균주수 변이 효율 (%)

del3 20 20 100

프라이머 del3 를 이용한 PCR에 의해 도입된 변이는 100%의 변이 효율을 가지고, 시퀀싱 결과, 전체 다중클로닝 부위 (60 염기)가 삭제된 것으로 확인되었다.

이러한 결과는, 상대적으로 긴 영역의 염기의 삭제도 쉽게 실시될 수 있음을 보여주고 있다.

실시예 4

삭제 및 삽입 부위특이적변이도입

1. 변이도입용 올리고뉴클레오티드의 합성

5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드를 pKF19k의 다중클로닝 위치 내의 EcoRI 부위에서 하류로 100 번째 위치에서 부가의 EcoRI 부위가 도입되도록 합성한다. 올리고뉴클레오티드 eco1은 서열 목록 내의 서열번호: 6 으로 나타내었다. 달리 말하면, eco1은 9번째 G와 14번째 C 사이 위치의 염기에 해당하는 원 서열의 AAT 염기를 삭제하고 EcoRI 부위인 GAATTC를 삽입하도록 디자인된다.

2. PCR 및 형질전환

표 1 의 조성물 (표에서, pKF19k가 pKF19M 대신 사용되었음)에 따라, 실시예 1에서 사용된 KQ2 프라이머와 실시예 4의 1항에서 제조한 프라이머 eco1을 사용하여 94℃에서 30 초간, 55℃에서 2 분간, 및 72℃에서 2 분간의 조건으로 구성된 각 사이클로서, 24 사이클의 PCR을 실행한다. 수득한 PCR 산물을 실시예 1에서와 같은 방법으로 에탄올 침전시킨다. 이후에 침전한 PCR 산물을 5 ㎕의 멸균수에 현탁하고, 대장균 MV1184를 2 ㎕의 수득한 현탁액으로 형질전환한다. 다음에는, 수득한 형질전환체를 50 ㎕/ml 카나마이신을 함유한 LB 아가배지에 분산시키고, 각 12개의 균주를 성장 콜로니에서 선별한다. 이후, 플라스미드 DNA를 실시예 1의 5항과 동일한 방법으로 제조한다. 변이의 확인은 상기 플라스미드 DNA 각각을 제한효소 EcoRI 로 소화시킴으로써 시행한 후, 전기영동에 의해 100 염기의 DNA 단편을 확인한다. 달리 말하면, 변이가 도입된 플라스미드는 100 개의 염기 간격으로 두 개의 EcoRI 부위를 가지며, 상기 100 개 염기 단편은 제한효소 EcoRI 로 소화시킴으로써 확인할 수 있다. 결과는 표 5에 나타내었다.

확인된 100염기 단편 개수 검정 균주수 변이 효율 (%)

eco1 12 12 100

목적 변이 플라스미드는 100%의 변이 효율로서 프라이머 eco1 을 이용하여 도입된 변이가 수득됨을 확인하였고, 시퀀싱 결과, 목적 부위에 EcoRI 부위가 도입되었음이 확인되었다.

실시예 5

pKF19k에 결찰된 DNA 단편으로의 변이 도입

1. 대장균 플라스미드 벡터 pBR322와 pKF19k의 결찰

pKF19k를 제한효소 BamHI으로 소화시킨 벡터를 제조하고, 4361 염기 길이를 가지는 대장균 플라스미드 pBR322 [다까라 슈조사 제조; Gene, 22, pp.277-280 (1983)]를 상기의 소화시킨 pKF19k의 BamHI 부위에 도입한다. 수득한 벡터는 pKB101로 명명했다. 삽입 단편에 대한 부위특이적변이도입은 상기한 벡터를 이용하여 제조한다.

2. 변이도입용 올리고뉴클레오티드의 합성

5'-말단 인산화 올리고뉴클레오티드를 pBR322의 BamHI 부위에서 하류로 400 번째 위치에서 부가의 BamHI 부위가 도입되도록 합성한다. 올리고뉴클레오티드 (bam1)는 서열 목록 내의 서열번호: 7 로 나타내었다. 달리 말하면, bam1은 서열 목록 내의 서열번호: 7의 16번째 G와 21번째 C 사이 위치에서 원 서열의 AGCGCT가 BamHI 부위 GGATCC로 치환되도록 디자인된 것이다.

3. PCR 및 형질 전환

표 1 의 조성물 (표에서, pKB101이 pKF19M 대신 사용되었음)에 따라, 실시예 1에서 사용된 KQ2 프라이머와 실시예 5의 2항에서 제조한 프라이머 bam1을 사용하여 94℃에서 30 초간, 55℃에서 30 초간, 및 72℃에서 6 분간의 조건으로 구성된 각 사이클로서, 25 사이클의 PCR을 실행한다. 수득한 PCR 산물을 실시예 1에서와 같은 방법으로 에탄올 침전시킨다. 이후에 침전한 PCR 산물을 5 ㎕의 멸균수에 현탁하고, 대장균 MV1184를 2 ㎕의 수득한 현탁액으로 형질전환한다. 다음에는, 결과의 형질전환체를 50 ㎕/ml 카나마이신을 함유한 LB 아가배지에 분산시키고, 각 6 개의 균주를 성장 콜로니에서 선별한다. 이후, 플라스미드 DNA를 실시예 1의 5항과 동일한 방법으로 제조한다. 변이의 확인은 상기 플라스미드 DNA 각각을 제한효소 BamHI 로 소화시킴으로써 시행한 후, 전기영동에 의해 400 염기의 DNA 단편을 확인한다. 달리 말하면, 변이가 도입된 플라스미드는 400 개의 염기 간격으로 두 개의 BamHI 부위를 가지며, 상기 400 개 염기 단편은 제한효소 BamHI 로 소화시킴으로써 확인할 수 있다. 결과는 표 6에 나타내었다.

확인된 400염기 단편 개수 검정 균주수 변이 효율 (%)

bam1 5 6 83

pKF19k에 결찰된 DNA 단편을 이용한 목적 변이 플라스미드는 80% 또는 이상의 효율로서 수득됨을 확인하였고, 시퀀싱 결과, 목적 부위에 BamHI 부위가 도입되었음이 확인되었다.

실시예 6

부위특이적변이도입을 위한 키트의 제조

부위특이적변이도입 시행 (20 회분)을 위한 키트를 숙주 대장균, 대조군으로 사용된 벡터 및 올리고뉴클레오티드의 세트로서 구성하였다 (표 7).

㎕

KQ2 프라이머 (앰버코돈의 복귀를 위한 것; 5 pmol/㎕) 20 mut1 프라이머 (변이도입용 프라이머; 5 pmol/㎕) 5 pKF19kM (5 ng/㎕) 5 pKF18k 및 pKF19k (10 OD/ml) 각 10 대장균 MV1184 (10% 글리세롤 용액에 저장된 것) 100 주의; pKF18k 및 pKF19k 는 다까라 슈조사 제조품이다.

부가적으로, 표 7의 키트는 판매중인 PCR 키트와 조합할 수 있다.

또한, 부위특이적변이도입 시행 (20 회분)을 위한 키트를 구성할 때, 키트는 PCR을 수행하기 위한 한 세트의 반응 혼합물, dNTP 혼합물, 열안정성 DNA 폴리머라제를 포함한다 (표 8).

㎕

TaKaRa Ex Taq (5 U/㎕; 다까라 슈조사 제조) 20 10X Ex Taq 완충액 (다까라 슈조사 제조) 200 dNTP 혼합물 (각 2.5 mM) 240 KQ2 프라이머 (앰버코돈의 복귀를 위한 것; 5 pmol/㎕) 20 mut1 프라이머 (변이도입용 프라이머; 5 pmol/㎕) 5 pKF19kM (5 ng/㎕) 5 pKF18k 및 pKF19k (10 OD/ml) 각 10 대장균 MV1184 (10% 글리세롤 용액에 저장된 것) 100 주의; pKF18k 및 pKF19k 는 다까라 슈조사 제조품이다.

본 발명에 따라서, 부위특이적변이도입 시행방법 및 키트가 제공되며, 이는 유전공학 및 단백질 공학에서 보다 간단하고 신속한 유용성을 주는 것이다. 본 발명의 방법과 키트를 사용함에 따라 PCR에 의해 수득한 PCR 산물을 숙주에 간편하게 형질전환하여 목적 부위에 변이 도입된 유전자를 효율적으로 수득할 수 있다.

[서열목록]

서열번호: 1

서열 길이: 20

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 1]

GGGTTTTCCC AGTCACGACG

서열번호: 2

서열 길이: 20

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 2]

GATTGCGCCT GAGCGAGACG

서열번호: 3

서열 길이: 23

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 3]

CGGTACCCGG GGCTCTAGAG TCG

서열번호: 4

서열 길이: 23

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 4]

CGGTACCCGG GGTAGAGTCG ACC

서열번호: 5

서열 길이: 20

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 5]

GACGGCCAGT GTAATCATGG

서열번호: 6

서열 길이: 24

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 6]

GCTGGCGTGA ATTCAGCGAA GAGG

서열번호: 7

서열 길이: 30

서열 형: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 직쇄

분자 형: 다른 핵산 (합성 DNA)

[서열 7]

CCGAAAATGA CCCAGGGATC CGCCGGCACC

Claims (5)

1. 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 부위특이적변이도입 시행방법:

   (1) 부위특이적변이도입을 위한 표적 DNA 단편을 삽입하여 수득한, 하나 이상의 앰버 코돈을 가지는 2본쇄 DNA 벡터, 및 2종 이상의 선별 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;

   (2) 상기의 단계 (1) 에서 수득한 PCR 산물 또는 그의 농축액을 서프레서-프리 (Sup ^o) 숙주에 도입함으로써, 상기 숙주의 형질전환을 수행하고, 목적하는 돌연변이를 갖는 클론을 선별하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기의 선별 프라이머가 변이도입용 프라이머 및 앰버 코돈 복귀용 프라이머임을 특징으로 하는 부위특이적변이도입 시행방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기의 벡터가 하나 이상의 앰버 코돈을 포함하는 약물 내성유전자를 가짐을 특징으로 하는 부위특이적변이도입 시행방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기의 서프레서-프리 (Sup ^o) 숙주가 대장균 (Escherichia coli) 임을 특징으로 하는 부위특이적변이도입 시행방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 부위특이적변이도입 시행방법에 사용되는 부위특이적변이도입 키트로서, 앰버 코돈 복귀용 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.