JP2023548440A - 新規ポリメラーゼ及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長させることができ、エラー率が少なくとも１：１０００であるポリメラーゼに関する。本開示は更に、組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成方法、テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法、細菌若しくは真核の細胞又は生物のＤＮＡに変異を導入する方法に関する。【選択図】図１

Description

本開示は、分子ツールの分野、具体的には、バイオテクノロジー的手法において有用な遺伝子操作されたＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、それをコードする核酸、それを発現する宿主細胞、及び開示された分子ツールを利用する種々の方法に関する。分子ツールは、ＤＮＡ解析、変異誘発の誘導、及び親和性成熟に応用される。
ゲノムＤＮＡの完全性は、細胞の遺伝情報を保持するための必要条件であり、複製、転写、及び代謝プロセスの副生成物等の天然プロセス、また放射線及び化学物質等の環境因子によって、常に脅威にさらされている。忠実な複製及び損傷修復に失敗すると、発現したタンパク質に変異が生じることがある。変異は、一般に生物にとって有害であるが、稀に、特定の状況下で有益であると判明する特性の変化をもたらすこともある。
ＤＮＡの損傷（一本鎖及び二本鎖の切断、又は塩基の損傷）を検出する方法は、損傷剤の結果を判定するだけでなく、その後の修復にも必要である。個々の細胞あたりのＤＮＡ損傷の程度を評価するための現行の方法の例は、ＤＮＡ断片化の概算を提供するＣＯＭＥＴアッセイ（ＰＭＩＤ：６４７７５８３）及び種々のシーケンシングベースのアッセイ、末端標識を用いて（ＰＭＩＤ：２７６８８７５７）、又はゲノム内の配置を決定するため若しくは損傷の位置にフルオロフォアで標識したヌクレオチドを取り込むことによって細胞内のＤＮＡ損傷を可視化する（ＰＭＩＤ：２９７２３７０８）ために、修飾された塩基におけるポリメラーゼ処理能力のＤＮＡ変化を利用する（ＰＭＩＤ：３１２４７４７０）シーケンシングベースの方法である。
ＤＮＡポリメラーゼは、複製中の変異率を下げるために、高い忠実度が得られるように進化してきた。忠実度が高いことの問題点は、複製に使用されるＤＮＡポリメラーゼが、例えばｃｉｓ－ｓｙｎチミン二量体、脱塩基部位、及び７，８－ジヒドロ－８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）等の損傷塩基をバイパスすることができない点である。そのような位置をバイパスするために原核生物及び真核生物の両方に存在する、そのような損傷塩基に対向するＤＮＡ合成を可能にする損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼが幾つか存在している。損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチドを特定するための要件がより緩いため、損傷を受けていないＤＮＡにおける誤取り込みの頻度が高い。損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼηの１０－２～１０－３という高いエラー率（ＰＭＩＤ：１０６０１２３３）により、高親和性抗体の開発における体細胞超変異の過程でＢ細胞の免疫グロブリン遺伝子（ＰＭＩＤ：１１３７６３４１）において酵素ＡＩＤによって生成される脱塩基部位に変異が導入される。しかし、ポリメラーゼηの処理能力は非常に低く、ＤＮＡ鎖が離れる前に数個のヌクレオチドしか取り込まない（ＰＭＩＤ：１０６０１２３３）。
後天的な変異を利用して親和性の増強された組み換えタンパク質を進化させるという概念が、例えば変異率の高い細菌株を利用して開発されている（ＰＭＩＤ：９３７３３２１、ＰＭＩＤ：８７５７７９９）。これら論文で使用された大腸菌（Ｅ－ｃｏｌｉ）株は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのプルーフリーディング能力に欠陥があり（ＰＭＩＤ：３０５４８８１）、その結果、複製中の変異率が高くなる。
本発明者らは、上述の改善された方法を容易にする、エラープローンＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの必要性を確認した。そのようなＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、以下の基準を満たさなければならない：（１）高度にエラープローンでなければならない、（２）ミスマッチ塩基から伸長できなければならない、（３）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いていなければならない（すなわち、プルーフリーディングなし）、及び（４）新規鎖を合成している間にニックの前の鎖を除去する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していなければならない。
また、収量を増加させ、インプット必要量を減少させ、インビトロにおけるアーティファクトを防ぐため、また、異なるプラットフォームを使用する分析の可能性を提供するために、既存のＤＮＡ損傷検出方法の改善も必要とされている。
また、ＤＮＡの特定領域に対する変異を誘導する誘導性エラープローンＤＮＡポリメラーゼを有する、組み換えタンパク質の親和性成熟のための改善された方法も必要とされている。誘導性プロモーターによって制御される高度にエラープローンなポリメラーゼを保有する原核細胞又は真核細胞の株を作製することができれば、変異が誘導されるタイミングを制御でき、内因性ポリメラーゼのみが発現する条件（すなわち、追加の変異が挿入されない条件）で細菌培養物を増幅させることができるようになる。ＤＮＡニックからＤＮＡ合成を開始するＤＮＡポリメラーゼを有し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってその前の鎖を分解することによって、ＤＮＡニックを有する領域に短い一続きの変異を導入することが可能になる。
本発明の目的は、上述したようなエラープローンＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを提供することである。
本発明の更なる目的は、現行の方法では不可能な、個々の細胞ごとのＤＮＡ損傷の程度だけでなく、ゲノム内のこれらの正確な位置も評価することができる新しいタイプの方法を提供することである。
従って、第１の態様では、本発明は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長させることができ、エラー率が少なくとも１：１０００であるポリメラーゼに関する。
幾つかの実施形態では、組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第１のドメインと、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長させる能力を有する第２のドメインとを含むキメラＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。幾つかの実施形態では、組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ及び損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼηの５’－３’エキソヌクレアーゼドメインを含む。
幾つかの実施形態では、組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸１５～３３７及び３５０～９８１に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のアミノ酸配列を有する。
本発明は、更に、本発明に係る組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子に関する。
幾つかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド４３～１０１１及び１０４８～２９４３に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する。
本発明は、更に、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、一本鎖切断を含むｄｓＤＮＡテンプレート分子並びにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される３種のヌクレオチドを含む反応混合物と接触させることを含み、該反応混合物が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される１種のヌクレオチドを含まない、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成方法に関する。
幾つかの実施形態では、反応混合物は、ｄＵＴＰを更に含む。
幾つかの実施形態では、反応に含まれるヌクレオチドは、親和性リガンドで修飾されるか又は修飾されるように適合される。
幾つかの実施形態では、親和性リガンドは、デスチオビオチンである。
幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドは、ｄＵＴＰである。
本発明は、更に、テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法であって、
－ 請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法に従ってｄｓＤＮＡを合成して、テンプレートｄｓＤＮＡ分子を起源とする第１の鎖と、その一部において反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第２の鎖とを含むハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を得ることと；
－ 該ハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含む制限酵素認識部位を有する制限酵素と接触させて、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第２の鎖の部分外の１つ以上の位置で該ハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を切断してＤＮＡ断片を得ることと；
－ 任意で、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠くＤＮＡ断片を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含むＤＮＡ断片から単離することと；
－ 該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含まないＤＮＡ断片をシーケンシングすることと；
を含み、
それにより、テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法に関する。
幾つかの実施形態では、反応混合物は、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む。
幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうちの１種ではない。
幾つかの実施形態では、上記単離工程は、固体基材に結合した親和性バインダーに親和性リガンドを結合させることによって行われる。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る核酸分子を含み、コードされているＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを発現する原核又は真核の細胞に関する。
更なる態様では、本発明は、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、一本鎖切断を含む１つ以上のｄｓＤＮＡテンプレート分子並びにｄｓＤＮＡテンプレート分子とｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される４種のヌクレオチドとを含む反応混合物と接触させることを含む、１つ以上の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子の合成方法に関する。
更なる態様では、本発明は、細胞においてＤＮＡに変異を導入する方法であって、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを該細胞で発現させることを含む方法に関する。
幾つかの実施形態では、そのような方法は非治療的である。幾つかの実施形態では、方法は、治療目的のためにヒト又は動物の身体に対して実施されるものではない。
幾つかの実施形態では、方法は、本発明に係る宿主細胞においてインビボで実施され、例えば、細胞のＤＮＡに変異を導入するために本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを発現させる。幾つかの実施形態では、方法は、多細胞生物においてインビボで実施される。
幾つかの実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの発現は、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下にある。
本開示は、以下に与える詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明及び具体例では、例示のためだけに本開示の好ましい実施形態を開示する。当業者は、詳細な説明における指針から、本開示の範囲内で変更及び改変がなされ得ることを理解する。
従って、本明細書に開示される開示は、記載される装置の特定の構成部品にも記載される方法の工程にも限定されないことが理解されるべきであるが、その理由は、そのような装置及び方法が変化し得るためである。
上記の目的、並びに本開示の追加の目的、特徴、及び利点は、添付の図面と合わせて考慮した場合、以下の本開示の例示的な実施形態の例示的かつ非限定的な詳細な説明を参照することによって、より十分に理解されるであろう。
図１は、ｓｓＤＮＡ切断を標識する方法の概略図を提供する。 図２Ａ～Ｃは、本発明に係るテンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を分析する方法の工程を示す。図２Ｄは、図に示す通り、異なる時点における４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰ）又は３種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）によるヘアピンの伸長を可視化した変性ＰＡＧＥを示す。図２Ｅは、様々な比のｄＴＴＰ：デスチオビオチン－ｄＵＴＰと共にＳｙｂｒｇｏｌｄ（赤）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷストレプトアビジン（緑）で染色した変性ＰＡＧＥを示す。
定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことが理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」は、特に文脈上明確に指示されていない限り、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することを意図することに留意すべきである。従って、例えば、「あるユニット（ａ ｕｎｉｔ）」又は「そのユニット（ｔｈｅ ｕｎｉｔ）」に対する言及は、複数の装置等を含む場合がある。更に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、及び同様の語句は、他の要素又は工程を除外するものではない。全ての用語には、当業者によって通常与えられる意味が与えられる。明確にするために、幾つかの用語を以下で更に定義する。
エキソヌクレアーゼ活性－ポリヌクレオチド鎖の末端（エキソ）からヌクレオチドを一度に１個又は数個（最大１０個）ずつ切断することによって機能する酵素活性。
エラー率－１複製サイクルあたりの１塩基あたりのエラー数。エラー率は、実施例で説明する通り求めることができる。
配列同一性－２つ以上のヌクレオチド配列間の類似性の程度。また、２つ以上の配列間の配列同一性は、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能なペアワイズ配列アライメント又は多重配列アライメント用の一般に入手可能なソフトウェアを用いたアライメントに基づいていてもよい（Ｍａｄｅｉｒａ Ｆ，Ｐａｒｋ ＹＭ，Ｌｅｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ ＡＰＩｓ ｉｎ ２０１９．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１９ Ｊｕｌ；４７（Ｗ１）：Ｗ６３６－Ｗ６４１）。
ｄｓＤＮＡ－二本鎖ＤＮＡ
ｓｓＤＮＡ－一本鎖ＤＮＡ
親和性リガンド－それに特異的な部分又はそれに対する抗体のいずれかに対して非常に高い親和性で結合することができる分子。
誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーター－例えば生体分子又は化学物質の有無等の特定の条件下で誘導され得る遺伝子プロモーター及び特定の細胞種又は組織でのみ活性のあるプロモーター。
配列
以下の配列は、本開示に関連する。
本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの一実施形態を開示する配列番号１及び配列番号２において、ＴＥＶ認識配列を有する６×Ｈｉｓタグは、下線で強調されている。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの５’－３’エキソドメインは太字で強調されている。４×ＴＧＳスペーサーは、イタリック体で強調されている。酵母損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼη（ＲＡＤ３０）、大腸菌における発現／翻訳に最適化されたコドン使用は、イタリック体の下線で強調されている。
配列番号１
種類：ＤＮＡ
配列番号２
タンパク質
理論上のｐＩ：６．５７
理論上のＭｗ：１０９３４８．１９
発明の詳細な説明
本発明は、分子生物学において有用であり、以下の特徴を示すＤＮＡポリメラーゼを提供することを目的とする：（１）高度にエラープローンである、（２）ミスマッチ塩基から伸長させることができる、（３）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く（すなわち、プルーフリーディングなし）、及び（４）新規鎖を合成している間にニックの前の鎖を除去する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。本発明者らは、数種の市販されているＤＮＡポリメラーゼについて調べ、バッファ条件を変化させることで必要に応じて性能を発揮させることができないかどうか検討したが、所望の特徴を達成することはできなかった。従って、本発明者らは、上記仕様に従って性能を発揮する本発明に係るＤＮＡポリメラーゼを遺伝子操作しようと試みた。
上記に従って、本発明者らは、本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼを遺伝子操作して、エラープローンＤＮＡ損傷乗り越えポリメラーゼを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの５’－３’エキソヌクレアーゼドメインと組み合わせた。このキメラポリメラーゼは、３種のヌクレオチドだけを供給してＤＮＡを複製することができる。エキソヌクレアーゼ活性により、長い一続きのヌクレオチドが確実に置き換えられるようにするために、ＤＮＡニックから複製を開始し、ポリメラーゼの前のＤＮＡ鎖を除去することが可能になる。本発明者らは、本明細書において、そのようなキメラポリメラーゼを利用してｓｓＤＮＡ切断の位置を決定できることを示し、従って、分析用のサンプルを調製する簡便な方法を研究コミュニティに提供する。
必要な特徴を全て備えたＤＮＡポリメラーゼを提供するために、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの５’－３’エキソヌクレアーゼドメインを酵母損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼη（ＲＡＤ３０）と融合させることによってキメラＤＮＡポリメラーゼを遺伝子操作した。このキメラポリメラーゼの構築及び発現については、実施例１に詳細に説明する。
このキメラポリメラーゼは、実施例２で論じる実験を通じて必要な特性を有することが確認された。
従って、第１の態様では、本発明は、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長及び／又は開始させることができ、エラー率が少なくとも１：１０００であるポリメラーゼに関する。
幾つかの実施形態では、組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第１のドメインと、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長させる能力を有する第２のドメインとを含むキメラＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。
幾つかの実施形態では、第１のドメインは、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼγ、ポリメラーゼθ、ポリメラーゼν、エキソヌクレアーゼＩＩ、又はＦｌａｐ構造特異的エンドヌクレアーゼ１の５’－３’エキソヌクレアーゼドメインに由来する。
従って、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする組み換え核酸に、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を既存の酵素に付与するタンパク質ドメインをコードする核酸を含めることを通して、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与され得る。このようなタンパク質ドメイン及びそれをコードする核酸は、当技術分野において公知である。幾つかの実施形態では、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに含まれるタンパク質ドメインは、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼγ、ポリメラーゼθ、ポリメラーゼν、エキソヌクレアーゼＩＩ、又はＦｌａｐ構造特異的エンドヌクレアーゼ１の５’－３’エキソヌクレアーゼドメインに由来する。
幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは、細菌、酵母、真菌、脊椎動物、及び哺乳類等の原核生物又は真核生物を起源とする。幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは、大腸菌、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、又は任意の他のモデル生物を起源とする。
一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩに５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を付与するタンパク質ドメインをコードする核酸を含めることを通じて、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与される。一実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼＩは大腸菌を起源とする。一実施形態では、配列番号１のヌクレオチド４３～１０１１に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する核酸を含めることを通じて、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与される。一実施形態では、配列番号２のアミノ酸１５～３３７に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含めることを通じて、５’－３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与される。
幾つかの実施形態では、第２のドメインは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼに由来する。
本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする組み換え核酸に、好適なＤＮＡポリメラーゼ活性を既存の酵素に付与するタンパク質ドメインをコードする核酸を含めて、得られるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに少なくとも１：１０００のエラー率を付与することを通じて、ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与され得る。このようなタンパク質ドメイン及びそれをコードする核酸は、当技術分野において公知である。幾つかの実施形態では、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに含まれるタンパク質ドメインは、ＤＮＡポリメラーゼι、ＤＮＡポリメラーゼκ、ＤＮＡポリメラーゼη、ＤＮＡポリメラーゼζ、ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、又はＤＮＡポリメラーゼＶに由来する。幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは、大腸菌、出芽酵母、又は任意の他のモデル生物を起源とする。
一実施形態では、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼηをコードする核酸を含めることを通じて、ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与される。一実施形態では、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼηは、出芽酵母を起源とする。一実施形態では、配列番号１のヌクレオチド１０４８～２９４３に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する核酸を含めることを通じて、ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与される。一実施形態では、配列番号２のアミノ酸３５０～９８１に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含めることを通じて、ＤＮＡポリメラーゼ活性がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに付与される。
更なる態様では、本発明は、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、一本鎖切断を含むｄｓＤＮＡテンプレート分子並びにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される３種のヌクレオチドを含む反応混合物と接触させることを含み、該反応混合物が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される１種のヌクレオチドを含まない、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成方法に関する。一実施形態では、反応混合物は、ｄＡＴＰを含まない。一実施形態では、反応混合物は、ｄＧＴＰを含まない。一実施形態では、反応混合物は、ｄＴＴＰを含まない。一実施形態では、反応混合物は、ｄＣＴＰを含まない。一実施形態では、反応混合物は、ｄＵＴＰを含む。方法を実施するための例示的な条件は、実施例２に記載される。
一実施形態では、反応混合物は、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む。親和性リガンドを保有するヌクレオチドを反応混合物に提供することで新たに合成されたＤＮＡ鎖にそれが取り込まれ、例えば親和性クロマトグラフィー又は固体基材への親和性結合によって、反応から新たに合成されたＤＮＡ分子を容易に抽出できるようになる。親和性リガンドは、対応する親和性バインダーと共に、当技術分野において周知である。例としては、ストレプトアビジン又はアビジンと共にビオチン又はデスチオビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）／抗ＤＩＧ抗体及びジニトロフェノール（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ抗体、フルオロフォア（例えば、フルオロセイン）及び抗フルオロフォア抗体（例えば抗フルオロセイン抗体）が挙げられる。また、親和性リガンドで修飾されるように、例えば、その後新たに合成されたＤＮＡ分子に親和性リガンドをカップリングさせるために使用することができる５－エチニル基が取り込まれるように、ヌクレオチドを適合させてもよい。一実施形態では、親和性バインダーは、デスチオビオチンである。一実施形態では、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドは、デスチオビオチン化ｄＵＴＰである。一実施形態では、親和性バインダーは、デスチオビオチンである。一実施形態では、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドは、デスチオビオチン化ｄＡＴＰである。
本発明は更に、エラープローンＤＮＡポリメラーゼ及び３種のみのヌクレオチドを用いて、一本鎖切断を受けたゲノムＤＮＡの位置を特異的に標識する方法を容易にし、提供することを目的とする。反応に添加されるｄＮＴＰから例えばｄＣＴＰを除去する（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのみを提供する）ことによって、新たに合成される鎖から全てのシチジンを枯渇させることができる。これにより、合成された領域にミスマッチが生じるため、制限酵素の認識部位が破壊され、これら領域の外側でしかＤＮＡを切断することができなくなる。
従って、一態様では、本発明は、テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法であって、
－ 上記の方法に従ってｄｓＤＮＡを合成して、テンプレートｄｓＤＮＡ分子を起源とする第１の鎖と、その一部において反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第２の鎖とを含むハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を得ることと；
－ 該ハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含む制限酵素認識部位を有する制限酵素と接触させて、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第２の鎖の部分外の１つ以上の位置で該ハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を切断してＤＮＡ断片を得ることと；
－ 任意で、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠くＤＮＡ断片を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含むＤＮＡ断片から単離することと；
－ 該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含まないＤＮＡ断片をシーケンシングすることと；
を含み、
それにより、テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法に関する。
１種のヌクレオチドが配列から枯渇している点、例えばｄＮＴＰ混合物からｄＡＴＰを除去した場合は全てのアデノシンがグアノシン、チミジン、又はシチジンに置き換えられている配列中の位置を同定することにより、テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置が得られる。損傷の上流の配列は４種のヌクレオチドを全て含有するが、ニックからは、ヌクレオチドのうちの１種が誤ったものに置き換えられる。ヌクレオチドが置き換えられた下流領域における配列は、両鎖のシーケンシングによって又は新たに合成された鎖の配列を参照配列と比較することによって同定することができる。下流領域は上流領域と共に、ゲノムの位置を同定する。
一実施形態では、反応混合物は、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む。これにより、好ましくは固体基材に結合している、親和性リガンドに特異的に結合する親和性バインダーを用いることによって、新たに合成されたＤＮＡ分子の単離が容易になる。親和性リガンドについては、上記で更に説明した。幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうちの１種ではない。幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドは、ｄＵＴＰである。ビオチン等の親和性リガンドを用いて、ＤＮＡポリメラーゼが新たなヌクレオチドを挿入した反応ミックスの画分を抽出することができる。ＤＮＡのごく一部しかＤＮＡニックを含有していない可能性があるため、ビオチン化された分子をストレプトアビジン等を用いてプルダウンする親和性ベースの精製方法では、対象となる分子の画分が増加する。従って、コストが削減される（すなわち、非修飾ＤＮＡのシーケンシングリードが作製されない）。
図１は、ｓｓＤＮＡ切断を標識する方法の概略図を提供する。制限酵素によって作製されたＤＮＡ断片を抽出できるようにするために、合成に使用されるｄＮＴＰ反応ミックスは、プルダウンに使用できる修飾ヌクレオチド、例えば、デスチオビオチン化ｄＵＴＰのプールを含有し得る。
まず（図１Ａ）、自然発生的にｓｓＤＮＡ切断が形成される、又は例えばＵＤＧ、ＦＰＧ：Ｔ４ ＰＤＧ、若しくはＥｎｄｏ ＶＩＩＩによって修飾塩基若しくは脱塩基部位を除去するためにｓｓＤＮＡ切断が作製される。
次いで、本発明に係るエラープローンＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡのニックに結合し、その５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を通して下流領域を分解し、新たなヌクレオチドを取り込む（図１Ｂ）。星印は、取り込まれた修飾ヌクレオチド（例えば、デスチオビオチン－ｄＵＴＰ）を示す。更に、３種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）しか使用しないので、ポリメラーゼは全てのｄＣをｄＴ（又はデスチオビオチン－ｄＵ）で置き換える。
次いで、制限酵素は認識にｄＣを必要とするので、重合領域の外側（縦棒の左右）のＤＮＡを切断する（図１Ｃ）。エラープローンＤＮＡポリメラーゼによって修飾されたＤＮＡ断片を精製するために、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズにデスチオビオチン化ＤＮＡ断片を結合させる（図１Ｄ）。
下流をシーケンシングするためにアダプターをライゲーションする。最初に誤って取り込まれた塩基の位置によって、ＤＮＡ合成の呼び水として使用されたＤＮＡニックの位置が決定される。
一態様では、本発明は、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、他のラクトバチルス属、バチルス属の種等の細菌であってよい。宿主細胞又は生物は、真核生物、例えば出芽酵母、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、若しくは分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、又は例えばコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等の真菌、例えばヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）等の哺乳類細胞、又はアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）等の植物であってもよい。核酸分子は、使用される宿主細胞の特定の種についてコドン最適化されてもよい。特定の成長条件下、刺激時、又は細胞若しくは組織の規定の集団において確実に制御して発現させるために、核酸を構成的、誘導性、又は組織特異的プロモーターに動作可能に連結させてもよい。これにより、規定の細胞集団において規定の期間、変異率の増加を制御することが可能になる。従って、医学研究において幾つかの用途のためのモデル系として、例えば、がんの発症及び進行、標的療法に対する抵抗性の発生のモデルとして、また、悪性細胞における変異負荷が免疫応答にどのように影響するかを調べるためのモデル系として使用することができる。
また、本発明に係るキメラポリメラーゼを使用して、インビボ、例えば上記のような宿主細胞において変異を生じさせるための代替アプローチを提供することができる。従って、本発明に係るキメラポリメラーゼは、インビボにおいて変異を生じさせるための代替アプローチを提供し、任意の細胞型において制御された様式で変異率を高めるために利用することができる。これは、細菌又は真核の細胞で生成された組み換え親和性試薬の親和性を増大させるために応用することができる。増大した親和性の選択は、細胞を誘導して変異させている間に実施することができる、すなわち、細胞は基材上の抗原に対する結合について競合する。このような系は、任意の細胞型において、組み換え親和性試薬の親和性成熟又は対象となるタンパク質を提供する。
本発明に係るキメラポリメラーゼが、上記のｓｓＤＮＡ切断を検出するために使用されるＤＮＡポリメラーゼの要件を全て満たしていることを確認したので、ニックの入ったプラスミドにおいてヌクレオチド配列を修飾できるかどうかを更に分析した。ニックを選択的に導入するために、ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドに６つのニックを生成するニッカーゼＮｔ．ＢｓｍＡＩを利用した。ニックの入ったプラスミドを、３種のヌクレオチドと共に実施例１で得られたキメラポリメラーゼで１５分間処理し、その後、制限酵素ＲｓａＩで消化した。アダプターを末端にライゲーションし、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲアンプリコンをＴＯＰＯ－ベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換した。２０個のシングルコロニーをピックし、シーケンシングしたところ、これらコロニーのうちの３つにおいてニック部位の下流でヌクレオチド交換が検出された（結果を図３に示す）。このデータから、本発明に係るキメラポリメラーゼは、ニックの入ったＤＮＡ分子から複製を開始し、１５分間のインキュベーション中に少なくとも４０個のヌクレオチドを合成できることが確認された。
従って、更なる態様では、本発明は、本発明に係るＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、一本鎖切断を含む１つ以上のｄｓＤＮＡテンプレート分子並びにｄｓＤＮＡテンプレート分子とｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される４種のヌクレオチドとを含む反応混合物と接触させることを含む、１つ以上の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子の合成方法に関する。
一実施形態では、この態様に係る方法は、本発明に係る宿主細胞においてインビボで実施される。
本明細書に記載された発明を実施するにあたり、当業者は、当技術分野における共通の一般知識を利用することができる。そのような知識は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition(1989)(Sambrook,Fritsch,and Maniatis);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th edition(2012)(Green and Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel et al.eds.);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames,and G.R.Taylor eds.):Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(Harlow and Lane,eds.):Antibodies A Laboratory Manual,2nd edition 2013(E.A.Greenfield ed.);Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney,ed.);Benjamin Lewin,Genes IX,published by Jones and Bartlet,2008(ISBN 0763752223);Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0632021829);Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 9780471185710);Singleton e/a/.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994),March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992);及びMarten H.Hofker and Jan van Deursen,Transgenic Mouse Methods and Protocols,2nd edition(2011)において入手可能である。
本明細書に引用した全ての参照文献は、明示的に参照により本明細書に援用される。
本発明を更に説明するために以下の実施例を提供する。例示的であり、情報価値があるが、これらは本発明を限定するものではなく、本発明は上記及び添付の特許請求の範囲に定義される通りである。
実施例１：組み換えキメラポリメラーゼの発現
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩの５’－３’エキソヌクレアーゼドメイン（最初の９６９ヌクレオチド）を酵母ＲＡＤ３０（大腸菌での発現のためにコドン最適化されている）の５’末端に融合させることによって、ポリメラーゼ（配列番号１）を設計した。これらの間に短いスペーサー（４×ＴＧＳ）を含め、ＴＥＶ認識配列と共に６×Ｈｉｓタグをコントラクトの５’に配置して、組み換えタンパク質を精製できるようにした。このコンストラクトをｐＢＡＤベクターに入れた。異なるＤＮＡポリメラーゼのベクターを大腸菌（ＬＭＧ１９４）に形質転換し、３７℃で激しく攪拌しながらアンピシリンを含有するＬＢ培地中において、最初は一晩培養物として増幅させ、その後より大きな生産培養に移した。生産培養では、ＯＤ６００＝０．５に達するまで培養した。その後、最終濃度０．０２％のＬ－アラビノースを添加し、激しく攪拌しながら一晩ＲＴで細菌をインキュベートした。６０００×ｇ及び４℃で１５分間遠心分離することによって細菌を収集し、０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ、及びＥＤＴＡ不含の１×ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（４６９３１５９００１、ｖｗｒ）を補充した結合バッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて４℃で３０分間溶解させた。１３０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによって溶解物を清澄化し、その後、溶解物を０．４５μｍフィルターに通した。Ｈｉｓ ＧｒａｖｉＴｒａｐ（商標）ＴＡＬＯＮ（登録商標）カラム（２９０００５９４、Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、製造者の推奨に従って結合バッファで平衡化し、その後、溶解物を４℃でカラムに適用した。溶解物をカラムに通した後、４℃で５ｍＭイミダゾールを補充した結合バッファ１０ｍＬで２回洗浄した。４℃で５０ｍＭイミダゾールを補充した結合バッファを用いたＨｉｓタグ付きポリメラーゼを溶出した。溶出液を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａスピンフィルタラーを用いて、２×保存バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ及びｐＨ７．４、２５℃）にバッファ交換した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて酵素濃度を測定し、その後、最終濃度５０％のグリセロールを添加した。
実施例２：ポリメラーゼの特性の確認
２つのオリゴ：５’－ＣＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＴＣ（配列番号３）及びリン酸－５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＡＣＧＴＡＣＧＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＧＡＧＡＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣＣＡＣＧＣＴ（配列番号４）（各２０μＭ）を、４℃で一晩、Ｔ４リガーゼ（ＥＬ００１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、リガーゼ反応バッファ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ及びｐＨ７．６、２５℃）中でライゲーションして、５１塩基のオーバーハングを有するヘアピン型ＤＮＡ断片（配列番号５）を形成した（図２Ａ）。オーバーハングを延長し、平滑末端ヘアピンを作製するために、最終濃度０．０２μＭのＤＮＡ断片を、ヘアピンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド５’－ＣＣＧＧＣＣＡＡＧＣ ＴＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＧ（配列番号６）と混合し（図２Ｂ）、０．１ｍＭ ＭｎＣｌ２を補充した１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２（Ｂ７００２Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、及びｐＨ７．９、２５℃）中でインキュベートした。０．０５μＭのＳｌｏｐｐｙｍｅｒａｓｅ並びにそれぞれ最終濃度０．１ｍＭの４種のヌクレオチド、すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、又は３種のヌクレオチド、すなわち、ｄＡＴＰ（０．１ｍＭ）、ｄＧＴＰ（０．１ｍＭ）、及びｄＴＴＰ（０．２ｍＭ）を反応に添加した。ビオチン化ヌクレオチドを導入するために、０．１ｍＭのｄＴＴＰに０．１ｍＭのデスチオビオチン－Ｘ－（５－アミノアリル）－ｄＵＴＰを補充した。次いで、サンプルを３７℃で１２０分間インキュベートした。酵素を７５℃で２０分間熱失活させた。
サンプルを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で流した。ＤＮＡを可視化するために、ゲルを１×ＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（Ｓ１１４９４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。更に、デスチオビオチン化ヌクレオチドの取り込みを可視化するために、最終濃度０．２μｇ／ｍＬのＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷストレプトアビジン（９２６－３２２３０、ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でゲルを染色した。
Ｓｌｏｐｐｙｍｅｒａｓｅ処理したサンプルを、マニュアルに従ってＰｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅した。平滑末端ＰＣＲ産物をエタノール沈殿で精製した。次いで、精製したＰＣＲ産物をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニング（４５０２４５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプラスミドベクターにクローニングした。Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（商標）ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙコンピテント大腸菌（Ｃ４０４０１０）のクローニング及びその後の形質転換については、製造者の推奨に従った。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｋ２１００１１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した後、サンプルをＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓに送ってシーケンシングした。
５’－オーバーハングを有するように設計されたＤＮＡヘアピンを伸長することによって、エラー率を求めた。次いで、４種のヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ）又は３種のヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）のいずれかを用いて、すなわちｄＡＴＰを除外して、本発明に係るＤＮＡポリメラーゼによってヘアピンを伸長した。変性ＰＡＧＥで伸長を確認し、伸長したヘアピンにアダプターをライゲーションした。次いで、増幅及びシーケンシングのためにアダプターにおけるプライマー部位及びヘアピンのループにおけるプライマー部位を利用するＤＮＡシーケンシングのために生成物を送った。リードを解析して、誤って取り込まれたヌクレオチド、欠失、及び挿入の頻度を求めた。ＤＮＡヘアピンの配列はオリゴデザインによって設定されるが、ＤＮＡ合成によって導入されるエラーを制御するために、エラー率の低いプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ）によるヘアピンの伸長を比較として使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼについて求められた頻度を超える誤取り込み、欠失、及び挿入の頻度を真のエラーとみなし、本発明に係るＤＮＡポリメラーゼのエラー率、伸長されたヘアピンで起こるエラーの頻度を求めるために使用した。
３種のヌクレオチドしか提供されない場合にキメラポリメラーゼがＤＮＡを複製できるかどうかを判定するために、５２ヌクレオチドの５’－オーバーハングを有する１４２ヌクレオチドの上述のＤＮＡヘアピン（配列番号５）を設計した（「オリゴ１」図２Ａ）。オーバーハングは、幾つかの制限酵素の認識部位を含む。５’－３’エキソヌクレアーゼ活性をモニタリングするために、ヘアピンに相補的な４９ヌクレオチド（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドにヘアピンをハイブリダイズさせて、３ヌクレオチドのギャップを生じさせた（「オリゴ２」図２Ａ）。プライマーとテンプレートとが互いに連結されたら、変性ＰＡＧＥにおける長さの増加（すなわち、１４２ヌクレオチドから１９４ヌクレオチド）として複製が測定される。４９ヌクレオチドのサイズのバンドが消失することは、キメラポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を示す。４種のｄＮＴＰが全て供給されると、キメラポリメラーゼは正しいヌクレオチドでヘアピンを伸長し、混合物から１種のヌクレオチド、例えばｄＡＴＰが除去されると（図２Ｂ）、幾つかのミスマッチが生じる（図２Ｃ）。このようなミスマッチにより制限酵素の認識部位が破壊されるため、合成された領域の外側の領域だけが切断されることになる。デスチオビオチン化ｄＵＴＰ等の親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを含めると、新たに合成されたｄｓＤＮＡに親和性リガンドが取り込まれるので、親和性分離が容易になる。
キメラポリメラーゼを、３種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）又は４種のヌクレオチドと一緒に、上記のオリゴヌクレオチド系と共にインキュベートし、異なる時点（５分、１５分、３０分、６０分、及び１２０分）で反応を停止させた。次いで、サンプルを変性ＰＡＧＥに流し、ヘアピンのサイズの増加として増幅を判定し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解によってエキソヌクレアーゼ活性を判定した（図２Ｄ）。このデータは、キメラポリメラーゼが重合活性だけでなくエキソヌクレアーゼ活性も有し、また、低速であっても３種のヌクレオチドのみの存在下での重合を可能にするのに十分な程度低い忠実度も有することを明確に示す。伸長したヘアピンのシーケンシングは、反応ミックス中に４種のヌクレオチドが全て存在する場合（表１、ｄＮＴＰ）とは対照的に、反応ミックスからｄＣＴＰを除外すると、Ｃを含まない生成物（表１、－ｄＣＴＰ）が生成されることを示す。誤って取り込まれたヌクレオチドを太字で示し、Ｃが取り込まれるはずであった位置、すなわち相補的ＤＮＡ鎖においてＧが配置されている位置を網掛け列として示した（矢印で示す）。
キメラポリメラーゼがデスチオビオチン－ｄＵＴＰを取り込むことができることを確認するために、ｄＴＴＰに対して様々な比でデスチオビオチン－ｄＵＴＰを添加し、３種又は４種のヌクレオチドいずれかが存在する（すなわち、ｄＣＴＰなし又はあり）実験を実施した。ＰＡＧＥゲルをＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄで染色してＤＮＡを可視化し、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷストレプトアビジンで染色して取り込まれたデスチオビオチン－ｄＵＴＰを可視化したところ、キメラポリメラーゼが修飾されたｄＮＴＰの取り込みにも成功していることが示された（図２Ｅ）。

Claims (20)

  1. ５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長させることができ、エラー率が少なくとも１：１０００である組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
  2. ５’－３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第１のドメインと、ミスマッチ塩基対からＤＮＡ重合を伸長させることができる第２のドメインと、を含むキメラＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
  3. 前記第１のドメインが、ＤＮＡポリメラーゼＩの５’－３’エキソヌクレアーゼドメインであり、前記第２のドメインが、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼηである、請求項２に記載の組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
  4. 配列番号２のアミノ酸１５～３３７及び３５０～９８１に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の組み換えＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子。
  6. 配列番号１のヌクレオチド４３～１０１１及び１０４８～２９４３に対して少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載の核酸分子。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを、一本鎖切断を含むｄｓＤＮＡテンプレート分子並びにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される３種のヌクレオチドを含む反応混合物と接触させることを含み、前記反応混合物が、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＣＴＰから選択される１種のヌクレオチドを含まない、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の合成方法。
  8. 前記反応混合物が、ｄＵＴＰを更に含む、請求項７に記載のｄｓＤＮＡの合成方法。
  9. 前記反応に含まれるヌクレオチドが、親和性リガンドで修飾されるか又は修飾されるように適合される、請求項７又は８のいずれか一項に記載のｄｓＤＮＡの合成方法。
  10. 前記親和性リガンドが、デスチオビオチンである、請求項９に記載のｄｓＤＮＡの合成方法。
  11. 前記親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドが、ｄＵＴＰである、請求項９又は１０に記載のｄｓＤＮＡの合成方法。
  12. テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法であって、
    － 請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法に従ってｄｓＤＮＡを合成して、前記テンプレートｄｓＤＮＡ分子を起源とする第１の鎖と、その一部において反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第２の鎖と、を含むハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を得ることと；
    － 前記ハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を、前記反応混合物に欠けているヌクレオチドを含む制限酵素認識部位を有する制限酵素と接触させて、前記反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第２の鎖の部分外の１つ以上の位置で前記ハイブリッドｄｓＤＮＡ分子を切断してＤＮＡ断片を得ることと；
    － 任意で、前記反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠くＤＮＡ断片を、前記反応混合物に欠けているヌクレオチドを含むＤＮＡ断片から単離することと；
    － 前記反応混合物に欠けているヌクレオチドを含まないＤＮＡ断片をシーケンシングすることと；
    を含み、
    それにより、前記テンプレートｄｓＤＮＡ分子における一本鎖切断の位置を得る方法。
  13. 前記反応混合物が、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのうちの１種ではない、請求項１３に記載の方法。
  15. 請求項１２の単離工程が、固体基材に結合した親和性バインダーに前記親和性リガンドが結合することによって実施される、請求項１３又は１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 請求項５又は６に記載の核酸分子を含み、コードされているＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを発現する、原核又は真核の細胞。
  17. 細胞においてＤＮＡに変異を導入する方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを前記細胞で発現させることを含む方法。
  18. 請求項１６に記載の細胞においてインビボで実施される、請求項１７に記載の方法。
  19. 多細胞生物においてインビボで実施される、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの発現が、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
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