JP2023548440A - 新規ポリメラーゼ及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本開示は、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長させることができ、エラー率が少なくとも1:1000であるポリメラーゼに関する。本開示は更に、組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼをコードする核酸分子、二本鎖DNA(dsDNA)の合成方法、テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法、細菌若しくは真核の細胞又は生物のDNAに変異を導入する方法に関する。【選択図】図1

Description

本開示は、分子ツールの分野、具体的には、バイオテクノロジー的手法において有用な遺伝子操作されたDNA依存性ポリメラーゼ、それをコードする核酸、それを発現する宿主細胞、及び開示された分子ツールを利用する種々の方法に関する。分子ツールは、DNA解析、変異誘発の誘導、及び親和性成熟に応用される。
ゲノムDNAの完全性は、細胞の遺伝情報を保持するための必要条件であり、複製、転写、及び代謝プロセスの副生成物等の天然プロセス、また放射線及び化学物質等の環境因子によって、常に脅威にさらされている。忠実な複製及び損傷修復に失敗すると、発現したタンパク質に変異が生じることがある。変異は、一般に生物にとって有害であるが、稀に、特定の状況下で有益であると判明する特性の変化をもたらすこともある。
DNAの損傷(一本鎖及び二本鎖の切断、又は塩基の損傷)を検出する方法は、損傷剤の結果を判定するだけでなく、その後の修復にも必要である。個々の細胞あたりのDNA損傷の程度を評価するための現行の方法の例は、DNA断片化の概算を提供するCOMETアッセイ(PMID:6477583)及び種々のシーケンシングベースのアッセイ、末端標識を用いて(PMID:27688757)、又はゲノム内の配置を決定するため若しくは損傷の位置にフルオロフォアで標識したヌクレオチドを取り込むことによって細胞内のDNA損傷を可視化する(PMID:29723708)ために、修飾された塩基におけるポリメラーゼ処理能力のDNA変化を利用する(PMID:31247470)シーケンシングベースの方法である。
DNAポリメラーゼは、複製中の変異率を下げるために、高い忠実度が得られるように進化してきた。忠実度が高いことの問題点は、複製に使用されるDNAポリメラーゼが、例えばcis-synチミン二量体、脱塩基部位、及び7,8-ジヒドロ-8-オキソグアニン(8-oxoG)等の損傷塩基をバイパスすることができない点である。そのような位置をバイパスするために原核生物及び真核生物の両方に存在する、そのような損傷塩基に対向するDNA合成を可能にする損傷乗り越えDNAポリメラーゼが幾つか存在している。損傷乗り越えDNAポリメラーゼは、ヌクレオチドを特定するための要件がより緩いため、損傷を受けていないDNAにおける誤取り込みの頻度が高い。損傷乗り越えDNAポリメラーゼηの10-2~10-3という高いエラー率(PMID:10601233)により、高親和性抗体の開発における体細胞超変異の過程でB細胞の免疫グロブリン遺伝子(PMID:11376341)において酵素AIDによって生成される脱塩基部位に変異が導入される。しかし、ポリメラーゼηの処理能力は非常に低く、DNA鎖が離れる前に数個のヌクレオチドしか取り込まない(PMID:10601233)。
後天的な変異を利用して親和性の増強された組み換えタンパク質を進化させるという概念が、例えば変異率の高い細菌株を利用して開発されている(PMID:9373321、PMID:8757799)。これら論文で使用された大腸菌(E-coli)株は、DNAポリメラーゼIIIのプルーフリーディング能力に欠陥があり(PMID:3054881)、その結果、複製中の変異率が高くなる。
本発明者らは、上述の改善された方法を容易にする、エラープローンDNA依存性DNAポリメラーゼの必要性を確認した。そのようなDNA依存性DNAポリメラーゼは、以下の基準を満たさなければならない:(1)高度にエラープローンでなければならない、(2)ミスマッチ塩基から伸長できなければならない、(3)3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠いていなければならない(すなわち、プルーフリーディングなし)、及び(4)新規鎖を合成している間にニックの前の鎖を除去する5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有していなければならない。
また、収量を増加させ、インプット必要量を減少させ、インビトロにおけるアーティファクトを防ぐため、また、異なるプラットフォームを使用する分析の可能性を提供するために、既存のDNA損傷検出方法の改善も必要とされている。
また、DNAの特定領域に対する変異を誘導する誘導性エラープローンDNAポリメラーゼを有する、組み換えタンパク質の親和性成熟のための改善された方法も必要とされている。誘導性プロモーターによって制御される高度にエラープローンなポリメラーゼを保有する原核細胞又は真核細胞の株を作製することができれば、変異が誘導されるタイミングを制御でき、内因性ポリメラーゼのみが発現する条件(すなわち、追加の変異が挿入されない条件)で細菌培養物を増幅させることができるようになる。DNAニックからDNA合成を開始するDNAポリメラーゼを有し、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によってその前の鎖を分解することによって、DNAニックを有する領域に短い一続きの変異を導入することが可能になる。
本発明の目的は、上述したようなエラープローンDNA依存性DNAポリメラーゼを提供することである。
本発明の更なる目的は、現行の方法では不可能な、個々の細胞ごとのDNA損傷の程度だけでなく、ゲノム内のこれらの正確な位置も評価することができる新しいタイプの方法を提供することである。
従って、第1の態様では、本発明は、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長させることができ、エラー率が少なくとも1:1000であるポリメラーゼに関する。
幾つかの実施形態では、組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼは、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第1のドメインと、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長させる能力を有する第2のドメインとを含むキメラDNA依存性DNAポリメラーゼである。幾つかの実施形態では、組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼI及び損傷乗り越えDNAポリメラーゼηの5’-3’エキソヌクレアーゼドメインを含む。
幾つかの実施形態では、組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼは、配列番号2のアミノ酸15~337及び350~981に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性のアミノ酸配列を有する。
本発明は、更に、本発明に係る組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼをコードする核酸分子に関する。
幾つかの実施形態では、核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド43~1011及び1048~2943に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性のヌクレオチド配列を有する。
本発明は、更に、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼを、一本鎖切断を含むdsDNAテンプレート分子並びにdATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される3種のヌクレオチドを含む反応混合物と接触させることを含み、該反応混合物が、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される1種のヌクレオチドを含まない、二本鎖DNA(dsDNA)の合成方法に関する。
幾つかの実施形態では、反応混合物は、dUTPを更に含む。
幾つかの実施形態では、反応に含まれるヌクレオチドは、親和性リガンドで修飾されるか又は修飾されるように適合される。
幾つかの実施形態では、親和性リガンドは、デスチオビオチンである。
幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドは、dUTPである。
本発明は、更に、テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法であって、
- 請求項7~10のいずれか一項に記載の方法に従ってdsDNAを合成して、テンプレートdsDNA分子を起源とする第1の鎖と、その一部において反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第2の鎖とを含むハイブリッドdsDNA分子を得ることと;
- 該ハイブリッドdsDNA分子を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含む制限酵素認識部位を有する制限酵素と接触させて、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第2の鎖の部分外の1つ以上の位置で該ハイブリッドdsDNA分子を切断してDNA断片を得ることと;
- 任意で、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠くDNA断片を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含むDNA断片から単離することと;
- 該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含まないDNA断片をシーケンシングすることと;
を含み、
それにより、テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法に関する。
幾つかの実施形態では、反応混合物は、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む。
幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドは、dATP、dCTP、dGTP、dTTPのうちの1種ではない。
幾つかの実施形態では、上記単離工程は、固体基材に結合した親和性バインダーに親和性リガンドを結合させることによって行われる。
更なる態様では、本発明は、本発明に係る核酸分子を含み、コードされているDNA依存性DNAポリメラーゼを発現する原核又は真核の細胞に関する。
更なる態様では、本発明は、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼを、一本鎖切断を含む1つ以上のdsDNAテンプレート分子並びにdsDNAテンプレート分子とdATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される4種のヌクレオチドとを含む反応混合物と接触させることを含む、1つ以上の二本鎖DNA(dsDNA)分子の合成方法に関する。
更なる態様では、本発明は、細胞においてDNAに変異を導入する方法であって、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼを該細胞で発現させることを含む方法に関する。
幾つかの実施形態では、そのような方法は非治療的である。幾つかの実施形態では、方法は、治療目的のためにヒト又は動物の身体に対して実施されるものではない。
幾つかの実施形態では、方法は、本発明に係る宿主細胞においてインビボで実施され、例えば、細胞のDNAに変異を導入するために本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼを発現させる。幾つかの実施形態では、方法は、多細胞生物においてインビボで実施される。
幾つかの実施形態では、DNA依存性DNAポリメラーゼの発現は、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下にある。
本開示は、以下に与える詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明及び具体例では、例示のためだけに本開示の好ましい実施形態を開示する。当業者は、詳細な説明における指針から、本開示の範囲内で変更及び改変がなされ得ることを理解する。
従って、本明細書に開示される開示は、記載される装置の特定の構成部品にも記載される方法の工程にも限定されないことが理解されるべきであるが、その理由は、そのような装置及び方法が変化し得るためである。
上記の目的、並びに本開示の追加の目的、特徴、及び利点は、添付の図面と合わせて考慮した場合、以下の本開示の例示的な実施形態の例示的かつ非限定的な詳細な説明を参照することによって、より十分に理解されるであろう。
図1は、ssDNA切断を標識する方法の概略図を提供する。 図2A~Cは、本発明に係るテンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を分析する方法の工程を示す。図2Dは、図に示す通り、異なる時点における4種のヌクレオチド(dATP、dGTP、dTTP、及びdCTP)又は3種のヌクレオチド(dATP、dGTP、及びdTTP)によるヘアピンの伸長を可視化した変性PAGEを示す。図2Eは、様々な比のdTTP:デスチオビオチン-dUTPと共にSybrgold(赤)及びIRDye(登録商標)800CWストレプトアビジン(緑)で染色した変性PAGEを示す。
定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことが理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、冠詞「a」、「an」、「the」、及び「said」は、特に文脈上明確に指示されていない限り、要素のうちの1つ以上が存在することを意味することを意図することに留意すべきである。従って、例えば、「あるユニット(a unit)」又は「そのユニット(the unit)」に対する言及は、複数の装置等を含む場合がある。更に、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含有する(containing)」、及び同様の語句は、他の要素又は工程を除外するものではない。全ての用語には、当業者によって通常与えられる意味が与えられる。明確にするために、幾つかの用語を以下で更に定義する。
エキソヌクレアーゼ活性-ポリヌクレオチド鎖の末端(エキソ)からヌクレオチドを一度に1個又は数個(最大10個)ずつ切断することによって機能する酵素活性。
エラー率-1複製サイクルあたりの1塩基あたりのエラー数。エラー率は、実施例で説明する通り求めることができる。
配列同一性-2つ以上のヌクレオチド配列間の類似性の程度。また、2つ以上の配列間の配列同一性は、例えば、European Bioinformatics Instituteから入手可能なペアワイズ配列アライメント又は多重配列アライメント用の一般に入手可能なソフトウェアを用いたアライメントに基づいていてもよい(Madeira F,Park YM,Lee J,et al.The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.Nucleic Acids Research.2019 Jul;47(W1):W636-W641)。
dsDNA-二本鎖DNA
ssDNA-一本鎖DNA
親和性リガンド-それに特異的な部分又はそれに対する抗体のいずれかに対して非常に高い親和性で結合することができる分子。
誘導性プロモーター及び組織特異的プロモーター-例えば生体分子又は化学物質の有無等の特定の条件下で誘導され得る遺伝子プロモーター及び特定の細胞種又は組織でのみ活性のあるプロモーター。
配列
以下の配列は、本開示に関連する。
本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼの一実施形態を開示する配列番号1及び配列番号2において、TEV認識配列を有する6×Hisタグは、下線で強調されている。大腸菌DNAポリメラーゼIの5’-3’エキソドメインは太字で強調されている。4×TGSスペーサーは、イタリック体で強調されている。酵母損傷乗り越えDNAポリメラーゼη(RAD30)、大腸菌における発現/翻訳に最適化されたコドン使用は、イタリック体の下線で強調されている。
配列番号1
種類:DNA
配列番号2
タンパク質
理論上のpI:6.57
理論上のMw:109348.19
発明の詳細な説明
本発明は、分子生物学において有用であり、以下の特徴を示すDNAポリメラーゼを提供することを目的とする:(1)高度にエラープローンである、(2)ミスマッチ塩基から伸長させることができる、(3)3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く(すなわち、プルーフリーディングなし)、及び(4)新規鎖を合成している間にニックの前の鎖を除去する5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有する。本発明者らは、数種の市販されているDNAポリメラーゼについて調べ、バッファ条件を変化させることで必要に応じて性能を発揮させることができないかどうか検討したが、所望の特徴を達成することはできなかった。従って、本発明者らは、上記仕様に従って性能を発揮する本発明に係るDNAポリメラーゼを遺伝子操作しようと試みた。
上記に従って、本発明者らは、本明細書において、DNAポリメラーゼを遺伝子操作して、エラープローンDNA損傷乗り越えポリメラーゼを大腸菌DNAポリメラーゼIの5’-3’エキソヌクレアーゼドメインと組み合わせた。このキメラポリメラーゼは、3種のヌクレオチドだけを供給してDNAを複製することができる。エキソヌクレアーゼ活性により、長い一続きのヌクレオチドが確実に置き換えられるようにするために、DNAニックから複製を開始し、ポリメラーゼの前のDNA鎖を除去することが可能になる。本発明者らは、本明細書において、そのようなキメラポリメラーゼを利用してssDNA切断の位置を決定できることを示し、従って、分析用のサンプルを調製する簡便な方法を研究コミュニティに提供する。
必要な特徴を全て備えたDNAポリメラーゼを提供するために、大腸菌DNAポリメラーゼIの5’-3’エキソヌクレアーゼドメインを酵母損傷乗り越えDNAポリメラーゼη(RAD30)と融合させることによってキメラDNAポリメラーゼを遺伝子操作した。このキメラポリメラーゼの構築及び発現については、実施例1に詳細に説明する。
このキメラポリメラーゼは、実施例2で論じる実験を通じて必要な特性を有することが確認された。
従って、第1の態様では、本発明は、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長及び/又は開始させることができ、エラー率が少なくとも1:1000であるポリメラーゼに関する。
幾つかの実施形態では、組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼは、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第1のドメインと、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長させる能力を有する第2のドメインとを含むキメラDNA依存性DNAポリメラーゼである。
幾つかの実施形態では、第1のドメインは、例えばDNAポリメラーゼI、T7 DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼγ、ポリメラーゼθ、ポリメラーゼν、エキソヌクレアーゼII、又はFlap構造特異的エンドヌクレアーゼ1の5’-3’エキソヌクレアーゼドメインに由来する。
従って、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼをコードする組み換え核酸に、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を既存の酵素に付与するタンパク質ドメインをコードする核酸を含めることを通して、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与され得る。このようなタンパク質ドメイン及びそれをコードする核酸は、当技術分野において公知である。幾つかの実施形態では、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼに含まれるタンパク質ドメインは、例えばDNAポリメラーゼI、T7 DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼγ、ポリメラーゼθ、ポリメラーゼν、エキソヌクレアーゼII、又はFlap構造特異的エンドヌクレアーゼ1の5’-3’エキソヌクレアーゼドメインに由来する。
幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは、細菌、酵母、真菌、脊椎動物、及び哺乳類等の原核生物又は真核生物を起源とする。幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは、大腸菌、出芽酵母(S.cervisiae)、又は任意の他のモデル生物を起源とする。
一実施形態では、DNAポリメラーゼIに5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を付与するタンパク質ドメインをコードする核酸を含めることを通じて、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与される。一実施形態では、DNAポリメラーゼIは大腸菌を起源とする。一実施形態では、配列番号1のヌクレオチド43~1011に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性のヌクレオチド配列を有する核酸を含めることを通じて、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与される。一実施形態では、配列番号2のアミノ酸15~337に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含めることを通じて、5’-3’エキソヌクレアーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与される。
幾つかの実施形態では、第2のドメインは、損傷乗り越えDNAポリメラーゼに由来する。
本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼをコードする組み換え核酸に、好適なDNAポリメラーゼ活性を既存の酵素に付与するタンパク質ドメインをコードする核酸を含めて、得られるDNA依存性DNAポリメラーゼに少なくとも1:1000のエラー率を付与することを通じて、DNAポリメラーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与され得る。このようなタンパク質ドメイン及びそれをコードする核酸は、当技術分野において公知である。幾つかの実施形態では、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼに含まれるタンパク質ドメインは、DNAポリメラーゼι、DNAポリメラーゼκ、DNAポリメラーゼη、DNAポリメラーゼζ、DNAポリメラーゼIV、又はDNAポリメラーゼVに由来する。幾つかの実施形態では、ポリメラーゼは、大腸菌、出芽酵母、又は任意の他のモデル生物を起源とする。
一実施形態では、損傷乗り越えDNAポリメラーゼηをコードする核酸を含めることを通じて、DNAポリメラーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与される。一実施形態では、損傷乗り越えDNAポリメラーゼηは、出芽酵母を起源とする。一実施形態では、配列番号1のヌクレオチド1048~2943に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性のヌクレオチド配列を有する核酸を含めることを通じて、DNAポリメラーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与される。一実施形態では、配列番号2のアミノ酸350~981に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を含めることを通じて、DNAポリメラーゼ活性がDNA依存性DNAポリメラーゼに付与される。
更なる態様では、本発明は、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼを、一本鎖切断を含むdsDNAテンプレート分子並びにdATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される3種のヌクレオチドを含む反応混合物と接触させることを含み、該反応混合物が、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される1種のヌクレオチドを含まない、二本鎖DNA(dsDNA)の合成方法に関する。一実施形態では、反応混合物は、dATPを含まない。一実施形態では、反応混合物は、dGTPを含まない。一実施形態では、反応混合物は、dTTPを含まない。一実施形態では、反応混合物は、dCTPを含まない。一実施形態では、反応混合物は、dUTPを含む。方法を実施するための例示的な条件は、実施例2に記載される。
一実施形態では、反応混合物は、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む。親和性リガンドを保有するヌクレオチドを反応混合物に提供することで新たに合成されたDNA鎖にそれが取り込まれ、例えば親和性クロマトグラフィー又は固体基材への親和性結合によって、反応から新たに合成されたDNA分子を容易に抽出できるようになる。親和性リガンドは、対応する親和性バインダーと共に、当技術分野において周知である。例としては、ストレプトアビジン又はアビジンと共にビオチン又はデスチオビオチン、ジゴキシゲニン(DIG)/抗DIG抗体及びジニトロフェノール(DNP)/抗DNP抗体、フルオロフォア(例えば、フルオロセイン)及び抗フルオロフォア抗体(例えば抗フルオロセイン抗体)が挙げられる。また、親和性リガンドで修飾されるように、例えば、その後新たに合成されたDNA分子に親和性リガンドをカップリングさせるために使用することができる5-エチニル基が取り込まれるように、ヌクレオチドを適合させてもよい。一実施形態では、親和性バインダーは、デスチオビオチンである。一実施形態では、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドは、デスチオビオチン化dUTPである。一実施形態では、親和性バインダーは、デスチオビオチンである。一実施形態では、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドは、デスチオビオチン化dATPである。
本発明は更に、エラープローンDNAポリメラーゼ及び3種のみのヌクレオチドを用いて、一本鎖切断を受けたゲノムDNAの位置を特異的に標識する方法を容易にし、提供することを目的とする。反応に添加されるdNTPから例えばdCTPを除去する(すなわち、dATP、dGTP、dTTPのみを提供する)ことによって、新たに合成される鎖から全てのシチジンを枯渇させることができる。これにより、合成された領域にミスマッチが生じるため、制限酵素の認識部位が破壊され、これら領域の外側でしかDNAを切断することができなくなる。
従って、一態様では、本発明は、テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法であって、
- 上記の方法に従ってdsDNAを合成して、テンプレートdsDNA分子を起源とする第1の鎖と、その一部において反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第2の鎖とを含むハイブリッドdsDNA分子を得ることと;
- 該ハイブリッドdsDNA分子を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含む制限酵素認識部位を有する制限酵素と接触させて、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第2の鎖の部分外の1つ以上の位置で該ハイブリッドdsDNA分子を切断してDNA断片を得ることと;
- 任意で、該反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠くDNA断片を、該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含むDNA断片から単離することと;
- 該反応混合物に欠けているヌクレオチドを含まないDNA断片をシーケンシングすることと;
を含み、
それにより、テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法に関する。
1種のヌクレオチドが配列から枯渇している点、例えばdNTP混合物からdATPを除去した場合は全てのアデノシンがグアノシン、チミジン、又はシチジンに置き換えられている配列中の位置を同定することにより、テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置が得られる。損傷の上流の配列は4種のヌクレオチドを全て含有するが、ニックからは、ヌクレオチドのうちの1種が誤ったものに置き換えられる。ヌクレオチドが置き換えられた下流領域における配列は、両鎖のシーケンシングによって又は新たに合成された鎖の配列を参照配列と比較することによって同定することができる。下流領域は上流領域と共に、ゲノムの位置を同定する。
一実施形態では、反応混合物は、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む。これにより、好ましくは固体基材に結合している、親和性リガンドに特異的に結合する親和性バインダーを用いることによって、新たに合成されたDNA分子の単離が容易になる。親和性リガンドについては、上記で更に説明した。幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドは、dATP、dCTP、dGTP、dTTPのうちの1種ではない。幾つかの実施形態では、親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドは、dUTPである。ビオチン等の親和性リガンドを用いて、DNAポリメラーゼが新たなヌクレオチドを挿入した反応ミックスの画分を抽出することができる。DNAのごく一部しかDNAニックを含有していない可能性があるため、ビオチン化された分子をストレプトアビジン等を用いてプルダウンする親和性ベースの精製方法では、対象となる分子の画分が増加する。従って、コストが削減される(すなわち、非修飾DNAのシーケンシングリードが作製されない)。
図1は、ssDNA切断を標識する方法の概略図を提供する。制限酵素によって作製されたDNA断片を抽出できるようにするために、合成に使用されるdNTP反応ミックスは、プルダウンに使用できる修飾ヌクレオチド、例えば、デスチオビオチン化dUTPのプールを含有し得る。
まず(図1A)、自然発生的にssDNA切断が形成される、又は例えばUDG、FPG:T4 PDG、若しくはEndo VIIIによって修飾塩基若しくは脱塩基部位を除去するためにssDNA切断が作製される。
次いで、本発明に係るエラープローンDNAポリメラーゼがDNAのニックに結合し、その5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を通して下流領域を分解し、新たなヌクレオチドを取り込む(図1B)。星印は、取り込まれた修飾ヌクレオチド(例えば、デスチオビオチン-dUTP)を示す。更に、3種のヌクレオチド(dATP、dGTP、dTTP)しか使用しないので、ポリメラーゼは全てのdCをdT(又はデスチオビオチン-dU)で置き換える。
次いで、制限酵素は認識にdCを必要とするので、重合領域の外側(縦棒の左右)のDNAを切断する(図1C)。エラープローンDNAポリメラーゼによって修飾されたDNA断片を精製するために、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズにデスチオビオチン化DNA断片を結合させる(図1D)。
下流をシーケンシングするためにアダプターをライゲーションする。最初に誤って取り込まれた塩基の位置によって、DNA合成の呼び水として使用されたDNAニックの位置が決定される。
一態様では、本発明は、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼをコードする核酸分子を含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、他のラクトバチルス属、バチルス属の種等の細菌であってよい。宿主細胞又は生物は、真核生物、例えば出芽酵母、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、若しくは分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、又は例えばコウジカビ(Aspergillus oryzae)等の真菌、例えばヒト(Homo sapiens)、マウス(Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)等の哺乳類細胞、又はアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)等の植物であってもよい。核酸分子は、使用される宿主細胞の特定の種についてコドン最適化されてもよい。特定の成長条件下、刺激時、又は細胞若しくは組織の規定の集団において確実に制御して発現させるために、核酸を構成的、誘導性、又は組織特異的プロモーターに動作可能に連結させてもよい。これにより、規定の細胞集団において規定の期間、変異率の増加を制御することが可能になる。従って、医学研究において幾つかの用途のためのモデル系として、例えば、がんの発症及び進行、標的療法に対する抵抗性の発生のモデルとして、また、悪性細胞における変異負荷が免疫応答にどのように影響するかを調べるためのモデル系として使用することができる。
また、本発明に係るキメラポリメラーゼを使用して、インビボ、例えば上記のような宿主細胞において変異を生じさせるための代替アプローチを提供することができる。従って、本発明に係るキメラポリメラーゼは、インビボにおいて変異を生じさせるための代替アプローチを提供し、任意の細胞型において制御された様式で変異率を高めるために利用することができる。これは、細菌又は真核の細胞で生成された組み換え親和性試薬の親和性を増大させるために応用することができる。増大した親和性の選択は、細胞を誘導して変異させている間に実施することができる、すなわち、細胞は基材上の抗原に対する結合について競合する。このような系は、任意の細胞型において、組み換え親和性試薬の親和性成熟又は対象となるタンパク質を提供する。
本発明に係るキメラポリメラーゼが、上記のssDNA切断を検出するために使用されるDNAポリメラーゼの要件を全て満たしていることを確認したので、ニックの入ったプラスミドにおいてヌクレオチド配列を修飾できるかどうかを更に分析した。ニックを選択的に導入するために、pcDNA3.1プラスミドに6つのニックを生成するニッカーゼNt.BsmAIを利用した。ニックの入ったプラスミドを、3種のヌクレオチドと共に実施例1で得られたキメラポリメラーゼで15分間処理し、その後、制限酵素RsaIで消化した。アダプターを末端にライゲーションし、PCRによって増幅した。PCRアンプリコンをTOPO-ベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換した。20個のシングルコロニーをピックし、シーケンシングしたところ、これらコロニーのうちの3つにおいてニック部位の下流でヌクレオチド交換が検出された(結果を図3に示す)。このデータから、本発明に係るキメラポリメラーゼは、ニックの入ったDNA分子から複製を開始し、15分間のインキュベーション中に少なくとも40個のヌクレオチドを合成できることが確認された。
従って、更なる態様では、本発明は、本発明に係るDNA依存性DNAポリメラーゼを、一本鎖切断を含む1つ以上のdsDNAテンプレート分子並びにdsDNAテンプレート分子とdATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される4種のヌクレオチドとを含む反応混合物と接触させることを含む、1つ以上の二本鎖DNA(dsDNA)分子の合成方法に関する。
一実施形態では、この態様に係る方法は、本発明に係る宿主細胞においてインビボで実施される。
本明細書に記載された発明を実施するにあたり、当業者は、当技術分野における共通の一般知識を利用することができる。そのような知識は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition(1989)(Sambrook,Fritsch,and Maniatis);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th edition(2012)(Green and Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel et al.eds.);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames,and G.R.Taylor eds.):Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(Harlow and Lane,eds.):Antibodies A Laboratory Manual,2nd edition 2013(E.A.Greenfield ed.);Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney,ed.);Benjamin Lewin,Genes IX,published by Jones and Bartlet,2008(ISBN 0763752223);Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0632021829);Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 9780471185710);Singleton e/a/.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley & Sons(New York,N.Y.1994),March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley & Sons(New York,N.Y.1992);及びMarten H.Hofker and Jan van Deursen,Transgenic Mouse Methods and Protocols,2nd edition(2011)において入手可能である。
本明細書に引用した全ての参照文献は、明示的に参照により本明細書に援用される。
本発明を更に説明するために以下の実施例を提供する。例示的であり、情報価値があるが、これらは本発明を限定するものではなく、本発明は上記及び添付の特許請求の範囲に定義される通りである。
実施例1:組み換えキメラポリメラーゼの発現
大腸菌DNAポリメラーゼIの5’-3’エキソヌクレアーゼドメイン(最初の969ヌクレオチド)を酵母RAD30(大腸菌での発現のためにコドン最適化されている)の5’末端に融合させることによって、ポリメラーゼ(配列番号1)を設計した。これらの間に短いスペーサー(4×TGS)を含め、TEV認識配列と共に6×Hisタグをコントラクトの5’に配置して、組み換えタンパク質を精製できるようにした。このコンストラクトをpBADベクターに入れた。異なるDNAポリメラーゼのベクターを大腸菌(LMG194)に形質転換し、37℃で激しく攪拌しながらアンピシリンを含有するLB培地中において、最初は一晩培養物として増幅させ、その後より大きな生産培養に移した。生産培養では、OD600=0.5に達するまで培養した。その後、最終濃度0.02%のL-アラビノースを添加し、激しく攪拌しながら一晩RTで細菌をインキュベートした。6000×g及び4℃で15分間遠心分離することによって細菌を収集し、0.2mg/mLリゾチーム、1mM MgCl、0.25%Triton-x、及びEDTA不含の1×cOmplete(商標)プロテアーゼ阻害剤(4693159001、vwr)を補充した結合バッファ(50mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、pH7.4)を用いて4℃で30分間溶解させた。13000×g、4℃で15分間遠心分離することによって溶解物を清澄化し、その後、溶解物を0.45μmフィルターに通した。His GraviTrap(商標)TALON(登録商標)カラム(29000594、Fisher scientific)を、製造者の推奨に従って結合バッファで平衡化し、その後、溶解物を4℃でカラムに適用した。溶解物をカラムに通した後、4℃で5mMイミダゾールを補充した結合バッファ10mLで2回洗浄した。4℃で50mMイミダゾールを補充した結合バッファを用いたHisタグ付きポリメラーゼを溶出した。溶出液を濃縮し、Amicon 10kDaスピンフィルタラーを用いて、2×保存バッファ(50mM Tris.HCl、2mM DTT、0.2mM EDTA及びpH7.4、25℃)にバッファ交換した。Nanodropを用いて酵素濃度を測定し、その後、最終濃度50%のグリセロールを添加した。
実施例2:ポリメラーゼの特性の確認
2つのオリゴ:5’-CCCAAACCCAATTAATGTACTGCAGAATTCAGCTCGAAGCTTGGCCGGATCCAGCGTGGGACTGAGTC(配列番号3)及びリン酸-5’-GTCTCGTGTCTGTAAAAACGTACGTAGATGCCATTTCTAAAAAAACAGACACGAGACGACTCAGTCCCACGCT(配列番号4)(各20μM)を、4℃で一晩、T4リガーゼ(EL0011、Thermo Scientific)を用いて、リガーゼ反応バッファ(50mM Tris-HCl、10mM MgCl、1mM DTT、1mM ATP及びpH7.6、25℃)中でライゲーションして、51塩基のオーバーハングを有するヘアピン型DNA断片(配列番号5)を形成した(図2A)。オーバーハングを延長し、平滑末端ヘアピンを作製するために、最終濃度0.02μMのDNA断片を、ヘアピンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド5’-CCGGCCAAGC TTCGAGCTGAATTCTGCAGTACATTAATTGGGTTTGGG(配列番号6)と混合し(図2B)、0.1mM MnClを補充した1×NEBuffer(商標)2(B7002S、New England Biolabs、50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl、1mM DTT、及びpH7.9、25℃)中でインキュベートした。0.05μMのSloppymerase並びにそれぞれ最終濃度0.1mMの4種のヌクレオチド、すなわち、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTP、又は3種のヌクレオチド、すなわち、dATP(0.1mM)、dGTP(0.1mM)、及びdTTP(0.2mM)を反応に添加した。ビオチン化ヌクレオチドを導入するために、0.1mMのdTTPに0.1mMのデスチオビオチン-X-(5-アミノアリル)-dUTPを補充した。次いで、サンプルを37℃で120分間インキュベートした。酵素を75℃で20分間熱失活させた。
サンプルを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で流した。DNAを可視化するために、ゲルを1×SYBR(商標)Gold Nucleic Acid Gel Stain(S11494、Thermo Fisher Scientific)で染色した。更に、デスチオビオチン化ヌクレオチドの取り込みを可視化するために、最終濃度0.2μg/mLのIRDye(登録商標)800CWストレプトアビジン(926-32230、LI-COR Biosciences)でゲルを染色した。
Sloppymerase処理したサンプルを、マニュアルに従ってPhusion(商標)High-Fidelity DNAポリメラーゼを用いてPCRで増幅した。平滑末端PCR産物をエタノール沈殿で精製した。次いで、精製したPCR産物をZero Blunt(登録商標)TOPO(登録商標)PCRクローニング(450245、Thermo Fisher Scientific)を用いてプラスミドベクターにクローニングした。One Shot(商標)TOP10 Chemicallyコンピテント大腸菌(C404010)のクローニング及びその後の形質転換については、製造者の推奨に従った。PureLink(登録商標)Quick Plasmid Miniprep Kit(K210011、Thermo Fisher Scientific)を用いてプラスミドDNAを単離した後、サンプルをEurofins Genomicsに送ってシーケンシングした。
5’-オーバーハングを有するように設計されたDNAヘアピンを伸長することによって、エラー率を求めた。次いで、4種のヌクレオチド(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)又は3種のヌクレオチド(dCTP、dGTP、dTTP)のいずれかを用いて、すなわちdATPを除外して、本発明に係るDNAポリメラーゼによってヘアピンを伸長した。変性PAGEで伸長を確認し、伸長したヘアピンにアダプターをライゲーションした。次いで、増幅及びシーケンシングのためにアダプターにおけるプライマー部位及びヘアピンのループにおけるプライマー部位を利用するDNAシーケンシングのために生成物を送った。リードを解析して、誤って取り込まれたヌクレオチド、欠失、及び挿入の頻度を求めた。DNAヘアピンの配列はオリゴデザインによって設定されるが、DNA合成によって導入されるエラーを制御するために、エラー率の低いプルーフリーディングDNAポリメラーゼ(Phusion DNAポリメラーゼ)によるヘアピンの伸長を比較として使用した。Phusion DNAポリメラーゼについて求められた頻度を超える誤取り込み、欠失、及び挿入の頻度を真のエラーとみなし、本発明に係るDNAポリメラーゼのエラー率、伸長されたヘアピンで起こるエラーの頻度を求めるために使用した。
3種のヌクレオチドしか提供されない場合にキメラポリメラーゼがDNAを複製できるかどうかを判定するために、52ヌクレオチドの5’-オーバーハングを有する142ヌクレオチドの上述のDNAヘアピン(配列番号5)を設計した(「オリゴ1」図2A)。オーバーハングは、幾つかの制限酵素の認識部位を含む。5’-3’エキソヌクレアーゼ活性をモニタリングするために、ヘアピンに相補的な49ヌクレオチド(配列番号6)を有するオリゴヌクレオチドにヘアピンをハイブリダイズさせて、3ヌクレオチドのギャップを生じさせた(「オリゴ2」図2A)。プライマーとテンプレートとが互いに連結されたら、変性PAGEにおける長さの増加(すなわち、142ヌクレオチドから194ヌクレオチド)として複製が測定される。49ヌクレオチドのサイズのバンドが消失することは、キメラポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を示す。4種のdNTPが全て供給されると、キメラポリメラーゼは正しいヌクレオチドでヘアピンを伸長し、混合物から1種のヌクレオチド、例えばdATPが除去されると(図2B)、幾つかのミスマッチが生じる(図2C)。このようなミスマッチにより制限酵素の認識部位が破壊されるため、合成された領域の外側の領域だけが切断されることになる。デスチオビオチン化dUTP等の親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを含めると、新たに合成されたdsDNAに親和性リガンドが取り込まれるので、親和性分離が容易になる。
キメラポリメラーゼを、3種のヌクレオチド(dATP、dGTP、及びdTTP)又は4種のヌクレオチドと一緒に、上記のオリゴヌクレオチド系と共にインキュベートし、異なる時点(5分、15分、30分、60分、及び120分)で反応を停止させた。次いで、サンプルを変性PAGEに流し、ヘアピンのサイズの増加として増幅を判定し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解によってエキソヌクレアーゼ活性を判定した(図2D)。このデータは、キメラポリメラーゼが重合活性だけでなくエキソヌクレアーゼ活性も有し、また、低速であっても3種のヌクレオチドのみの存在下での重合を可能にするのに十分な程度低い忠実度も有することを明確に示す。伸長したヘアピンのシーケンシングは、反応ミックス中に4種のヌクレオチドが全て存在する場合(表1、dNTP)とは対照的に、反応ミックスからdCTPを除外すると、Cを含まない生成物(表1、-dCTP)が生成されることを示す。誤って取り込まれたヌクレオチドを太字で示し、Cが取り込まれるはずであった位置、すなわち相補的DNA鎖においてGが配置されている位置を網掛け列として示した(矢印で示す)。
キメラポリメラーゼがデスチオビオチン-dUTPを取り込むことができることを確認するために、dTTPに対して様々な比でデスチオビオチン-dUTPを添加し、3種又は4種のヌクレオチドいずれかが存在する(すなわち、dCTPなし又はあり)実験を実施した。PAGEゲルをSYBR(商標)Goldで染色してDNAを可視化し、IRDye(登録商標)800CWストレプトアビジンで染色して取り込まれたデスチオビオチン-dUTPを可視化したところ、キメラポリメラーゼが修飾されたdNTPの取り込みにも成功していることが示された(図2E)。

Claims (20)

  1. 5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼであって、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長させることができ、エラー率が少なくとも1:1000である組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼ。
  2. 5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を有し、3’-5’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第1のドメインと、ミスマッチ塩基対からDNA重合を伸長させることができる第2のドメインと、を含むキメラDNA依存性DNAポリメラーゼである、請求項1に記載の組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼ。
  3. 前記第1のドメインが、DNAポリメラーゼIの5’-3’エキソヌクレアーゼドメインであり、前記第2のドメインが、損傷乗り越えDNAポリメラーゼηである、請求項2に記載の組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼ。
  4. 配列番号2のアミノ酸15~337及び350~981に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性のアミノ酸配列を有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼ。
  5. 請求項1~4のいずれか一項に記載の組み換えDNA依存性DNAポリメラーゼをコードする核酸分子。
  6. 配列番号1のヌクレオチド43~1011及び1048~2943に対して少なくとも50%、例えば60%、70%、80%、90%、95%、又は100%の配列同一性のヌクレオチド配列を有する、請求項5に記載の核酸分子。
  7. 請求項1~5のいずれか一項に記載のDNA依存性DNAポリメラーゼを、一本鎖切断を含むdsDNAテンプレート分子並びにdATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される3種のヌクレオチドを含む反応混合物と接触させることを含み、前記反応混合物が、dATP、dGTP、dTTP、及びdCTPから選択される1種のヌクレオチドを含まない、二本鎖DNA(dsDNA)の合成方法。
  8. 前記反応混合物が、dUTPを更に含む、請求項7に記載のdsDNAの合成方法。
  9. 前記反応に含まれるヌクレオチドが、親和性リガンドで修飾されるか又は修飾されるように適合される、請求項7又は8のいずれか一項に記載のdsDNAの合成方法。
  10. 前記親和性リガンドが、デスチオビオチンである、請求項9に記載のdsDNAの合成方法。
  11. 前記親和性リガンドで修飾されるヌクレオチドが、dUTPである、請求項9又は10に記載のdsDNAの合成方法。
  12. テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法であって、
    - 請求項7~11のいずれか一項に記載の方法に従ってdsDNAを合成して、前記テンプレートdsDNA分子を起源とする第1の鎖と、その一部において反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第2の鎖と、を含むハイブリッドdsDNA分子を得ることと;
    - 前記ハイブリッドdsDNA分子を、前記反応混合物に欠けているヌクレオチドを含む制限酵素認識部位を有する制限酵素と接触させて、前記反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠く第2の鎖の部分外の1つ以上の位置で前記ハイブリッドdsDNA分子を切断してDNA断片を得ることと;
    - 任意で、前記反応混合物に含まれないヌクレオチドを欠くDNA断片を、前記反応混合物に欠けているヌクレオチドを含むDNA断片から単離することと;
    - 前記反応混合物に欠けているヌクレオチドを含まないDNA断片をシーケンシングすることと;
    を含み、
    それにより、前記テンプレートdsDNA分子における一本鎖切断の位置を得る方法。
  13. 前記反応混合物が、親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項12に記載の方法。
  14. 前記親和性リガンドで修飾されたヌクレオチドが、dATP、dCTP、dGTP、dTTPのうちの1種ではない、請求項13に記載の方法。
  15. 請求項12の単離工程が、固体基材に結合した親和性バインダーに前記親和性リガンドが結合することによって実施される、請求項13又は14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 請求項5又は6に記載の核酸分子を含み、コードされているDNA依存性DNAポリメラーゼを発現する、原核又は真核の細胞。
  17. 細胞においてDNAに変異を導入する方法であって、請求項1~4のいずれか一項に記載のDNA依存性DNAポリメラーゼを前記細胞で発現させることを含む方法。
  18. 請求項16に記載の細胞においてインビボで実施される、請求項17に記載の方法。
  19. 多細胞生物においてインビボで実施される、請求項18に記載の方法。
  20. 前記DNA依存性DNAポリメラーゼの発現が、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項17~19のいずれか一項に記載の方法。
JP2023551645A 2020-10-30 2021-10-19 新規ポリメラーゼ及びその使用 Pending JP2023548440A (ja)

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