CN116254258A - 一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用。该方法需两种寡核苷酸,即定制的标签引物和可用于所有文库构建的通用引物。标签引物的中间是标签信序列,两侧是退火序列。通用引物的两侧是与标签引物退火序列互补的序列,中间为可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基。将标签引物文库与等量的通用引物通过退火,获取引物二聚体。引物二聚体两侧为碱基配对的DNA双链,且为粘性末端。引物二聚体的中间为不配对的Ω环结构,Ω环的双链分别含有标签引物所携带的标签信息和通用引物携带的修饰碱基。引物二聚体与线性化载体连接,再转化大肠杆菌,通过细胞内源的碱基切除修复机制将Ω环的修饰碱基所在区域替换为标签序列。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体涉一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法及应用。
背景技术
Cas蛋白结合目标DNA依赖gRNA的碱基互补,仅需简单地改变转录得到的gRNA序列就可以定制新的靶点。利用CRISPR/Cas基因编辑技术,定制靶向基因家族或信号通路的每个成员的gRNA文库,高通量、大规模地定向创制突变体库,是功能基因组学和生物育种的重要手段。通过对Cas蛋白的修饰、宿主DNA损伤方式和修复途径的改变,高通量CRISPR技术还能实现碱基编辑、转录激活和转录抑制等突变体库的创制。实现这一技术的根本前提,是能够简单、高效和低成本地定制gRNA载体文库。
DNA条形码是指DNA上的短核苷酸序列,能给区分不同样品来源。DNA条形码可以用于高通量混合测序,在降低测序成本的同时保证了不同分子间不会相互干扰。利用DNA条形码标记不同细胞,可以追踪细胞谱系,用于发育生物学研究。
现有技术中,将标签序列引入载体中,首先需要合成较长的单链寡核苷酸(~100nt),标签序列位于中间,两端为保守序列。再利用PCR技术,利用设计于保守序列的通用引物扩增得到双链的DNA片段。最后通过酶切/连接或同源重组技术,将双链DNA片段插入到载体中。需要合成的单链寡核苷酸的长度与成本和错误率呈正相关,且当前60nt以上(含60nt)的寡核苷酸的每个碱基的商业合成成本比59nt(含59nt)以下的高数倍。有些技术可以使用较短的引物,但仍然需要PCR获取双链DNA片段。PCR技术可能引入突变,且短片段扩增产物的回收率较低。现有技术也有使用正、负引物退火的方式得到双链的DNA片段,但是不同标签的正、负引物需要独立地退火,构建标签载体文库的操作繁琐,而且无法使用低成本的简并引物作为标签引物。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种新的构建含标签序列载体文库的方法及应用,该方法中标签序列可以用作gRNA文库的靶点,因此本发明可以用于高通量基因编辑载体文库的创制。标签序列可以用作载体DNA的条形码,因此本发明可以用于带条形码载体文库的创制,并可为利用该载体文库获得的基因工程细胞赋予条形码。若标签序列位于蛋白质编码区,即可获得对蛋白质进行定点饱和突变的载体文库。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:
一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,包括:
1)预备可用于所有文库构建的通用引物;即在载体骨架和线性化方式固定的前提下,预备可用于任何类型载体文库(相同的线性化载体)的单链寡核苷酸。
2)定制中间含预设标签序列(~20nt)的标签引物;
其中,标签引物为长度60nt以下的单链寡核苷酸,其中间是欲引入载体的标签序列,其两侧是退火序列(~15nt);
通用引物为单链寡核苷酸(~40nt),其中间为一个/多个尿嘧啶或其他可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基,其两侧为标签引物退火序列的同源序列;标签引物及通用引物的两侧序列能互补配对,因此能够形成引物二聚体,即双链DNA短片段。
3)将标签引物与等量的通用引物通过同源序列间的退火,获取引物二聚体;
所述引物二聚体的两侧为碱基配对的DNA双链,且引物二聚体两端为粘性末端;引物二聚体的中间为不配对的环状结构,呈“Ω”状;“Ω”环状结构的双链分别含有标签引物所携带的标签序列和通用引物携带的修饰碱基;
4)制备两粘性末端与引物二聚体粘性末端相兼容的线性化载体;
5)将引物二聚体和线性化载体骨架通过T4 DNA连接酶连接成重组分子;其中,通过粘性末端的匹配,引物二聚体可以与线性化载体连接。
6)转化大肠杆菌,通过细胞内源的碱基切除修复机制将Ω环的修饰碱基所在区域替换为标签序列。
7)挑选单克隆,摇菌提质粒,测序验证。
进一步的,所述引物二聚体两端的粘性末端不相兼容;通过对标签引物和通用引物的设计,引物二聚体的两端将形成不相兼容的粘性末端(若粘性末端兼容,效率会大大降低)。
优选的,所述标签引物的标签序列为生物体基因组DNA的靶向序列;可用于构建a:在细胞基因组DNA指定位点造成成双链断裂的载体文库;b:在细胞基因组DNA指定位点造成单链断裂的载体文库;c:在细胞基因组DNA指定位点造成碱基损伤的载体文库;d:在细胞基因组DNA指定位点募集转录调控因子(包括激活因子、抑制因子)的载体文库。
优选的,所述标签引物的标签序列为含有简并碱基的简并引物;标签序列位于蛋白质编码区,利用简并引物在蛋白质特定位点引入变异,可用于定点饱和突变文库和噬菌体展示文库等蛋白/肽文库的构建。
进一步的,所述线性化载体通常由环状质粒被Type II限制性内切酶的双酶切或被Type IIS型限制性内切酶的单酶切而获得,其两端为互不兼容(若粘性末端兼容,效率会大大降低)且与引物二聚体的粘性末端相兼容的粘性末端。
本发明还提供一种鉴定转基因生物身份的方法,包括:由上述方法获得的载体文库,通过标签序列鉴定文库中的每个成员。
进一步的,具体步骤为:将上述方法获得的载体文库稳定转化细胞后,提取转化子的DNA,利用测序鉴定整合在其基因组上的标签序列,从而为每个独立转化子赋予独一无二的身份,并获取转基因拷贝数等信息。
发明的有益效果在于:
与需要定制100nt以上的大部分现有技术相比,针对每个标签序列,本发明只需要定制长度很短(<60nt)的单链的标签引物,能显著降低引物合成成本。与需要PCR的大部分现有技术相比,本发明使用引物退火获取携带标签序列信息的双链DNA,保真性更强,且不会因为小片段难以回收而影响建库效率。与需要单独对每对引物进行退火的现有技术相比,本发明使用了含修饰碱基的通用引物,简化了操作方法,还实现了使用简并引物低成本编制条形码的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的原理图。
图2为实施例中引物二聚体的二级结构;
其中,简并碱基和修饰碱基用下划线标出;小写字母代表退火序列,在本实施例中分别为水稻U3启动子的下游部分序列和sgRNA支架上游部分序列,以实现标签序列的无缝插入,针对不同的线性化载体,退火序列需要重新设计;粗体字代表粘性末端。
图3为实施例中质粒pGN-Cas9-U3’=Amp-SacB=scaffold’的载体图谱;
其中,白色字体代表保证质粒在大肠杆菌和农杆菌中扩繁的必需元件,黑色字体代表双元载体的T-DNA区。LB和RB分别为双元载体的左边界和右边界,Pe35S、HygR和T35S为赋予植物对潮霉素抗性的元件,PZmUbi、Cas9和TNOS为赋予植物细胞基因编辑功能的元件,POsU3’和Scaffold’为分别缺失了下游部分序列和上游部分序列的水稻U3启动子和sgRNA支架,缺失的序列将由引物二聚体在后续补齐。AmpR和SacB分别为正筛选标记和负筛选标记,分别用于降低载体扩繁的突变率和提高后续分子克隆的阳性率。BsaI酶切位点是将该质粒线性化的位置。
图4为实施例中线性化载体pGN-Cas9-U3’=Amp-SacB=scaffold’粘性末端区域的DNA序列;
其中,BsaI酶切识别位点位于被替换片段上。
图5为实施例中转化入载体文库的大肠杆菌菌落在卡那霉素LB平板上的生长情况;
该结果表明,本发明的效率很高,具备使用价值。
图6为实施例中使用混合标签引物构建的CRISPR/Cas9基因组编辑载体文库的每个成员的载体图谱;
其中,通过引物二聚体引入的序列,水稻U3启动子和sgRNA均恢复完整。
图7为实施例中随机挑选的7个克隆的测序验证结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
参照附图1所示,本发明一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,包括以下步骤:
1)预先备好通用引物。通用引物的中间含有可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基(如dU)。通用引物的两侧为各~15nt的退火序列。退火序列的长度无固定要求,但过长会提高成本,过短可能影响后续退火,进而影响效率。经实验测定,各端的退火序列的Tm值在45℃以上即可保证本方法的效率。尽量保证两端的退火序列的Tm值接近。退火序列的具体序列由载体序列和选定的将载体环化的限制性内切酶决定。当线性化载体一定时,通用引物可以重复使用。将通用引物用无菌双蒸水稀释至浓度为100μM。
2)针对不同载体文库的不同需求,定制中间含预设标签序列(~20nt)的单链寡核苷酸(<60nt),命名为标签引物。标签引物的两端为能够与通用引物退火的退火序列,因此两种引物上的退火序列互为反向互补。将所有的标签引物等量混合,获得标签引物混合物。标签引物混合物的浓度也需要稀释至100μM。
3)配置10μL反应体系,包含1μL标签引物(100μM)、1μL通用引物、1μL 10×T4 DNA连接酶Buffer(含浓度为10mM的ATP,或改用10mM的ATP溶液)和0.5μL T4多聚核苷酸激酶(NEB,M0201),最后5.5μL无菌双蒸水补齐;在PCR仪上设置反应程序,即37℃30min(T4多聚核苷酸激酶将ATP的磷酸基团转移至引物的5’端),65℃20min(失活T4多聚核苷酸激酶),4℃1min,95℃5min,缓降温至25℃(5℃/min),最后用无菌双蒸水稀释200倍,此时产物为0.05μM的5’端磷酸化的引物二聚体。常规商业化寡核苷酸的5’和3’均为羟基,直接退火形成的5’羟基的引物二聚体与线性载体连接后会在两条DNA单链上各引入1个切刻(Nick),影响后续预期的碱基切除修复。因此,本步骤必须使用T4多聚核苷酸激酶以获得5’端磷酸化的引物二聚体,进而提高后续的连接效率和将标签引物携带的信息引入载体的效率。引物二聚体的中间为不配对的环状结构,呈“Ω”状;“Ω”环状结构的双链分别含有标签引物所携带的标签序列和通用引物携带的修饰碱基;引物二聚体的两端形成不相兼容的粘性末端。
4)制备线性化载体。推荐使用Type II限制性内切酶的双酶切或Type IIS型限制性内切酶的单酶切,其两端为互不兼容(若粘性末端兼容,效率会大大降低)且与引物二聚体的粘性末端相兼容的粘性末端。以BsaI酶切反应为例,配置50μL反应体系:包含1μg载体DNA、5μL rCutSmart Buffer和1μL(NEB,R3733),最后用无菌双蒸水补齐。37℃反应15min至过夜。推荐酶切后回收线性化载体。若不回收,需要选择Type IIS型限制性内切酶或载体上被替换片段为致死序列,否则将因自连率过高影响阳性率;且酶切反应完成后,需要通过高温或蛋白酶K将限制酶失活,避免影响后续连接。线性化载体一定时,通用引物是固定且可重复使用的,标签引物的退火序列是固定的。
5)连接反应。配置20μL反应体系:包含1μL线性化载体(~20ng/μL)、1μL引物二聚体(0.05μM)、1μL 10×T4 DNA连接酶Buffer和1μL T4 DNA连接酶,最后用无菌双蒸水补齐。25℃反应1h或16℃过夜。
6)将连接产物转化大肠杆菌感受态。大肠杆菌感受态细胞冰浴融化后,加入反应液(不超过1/10比例)轻轻混匀,冰浴30min;42℃水浴热激60s,迅速放回冰中并静置2min,此步骤不可晃动离心管;向离心管中加入500~900μL LB培养基混匀,37℃、180rpm条件下复苏菌种45~60min;取100~200μL菌液涂于带有相应抗性的固体LB平板上;待平板已干,将其封口,倒置于37℃培养箱,过夜培养(~15h)。
7)挑选单克隆,摇菌提质粒,测序验证。
实施例1
分别合成标签引物(Tag-f)和通用引物(Uni-r)。本实施例的标签引物为简并引物,其中W代表A/T,K代表T/G,Y代表T/C,D代表A/T/G,R代表A/G,S代表G/C,N代表A/T/G/C,V代表A/G/C,H代表A/T/C,M代表A/C,B代表T/G/C。引物序列如表1所示。因此,标签引物Tag-f实际上是含20736个成员的寡核苷酸文库。本实施例的通用引物选择了U作为修饰碱基,其可被大肠杆菌宿主识别为碱基C的脱氨损伤,以下划线表示。
表1.构建载体文库所用引物的序列
名称 | 序列 |
Tag-f | TGTGCAGATGATCCGTGGCAGWCKYGDARTSNVAHAMCBTGTTTCAGAGCTAGAAATA |
Uni-r | TTGCTATTTCTAGCTCTGAAACUTGCCACGGATCATCTG |
配置10μL反应体系,包含1μL Tag-f(100μM)、1μL Uni-r(100μM)、1μL 10×T4 DNA连接酶Buffer和0.5μL T4多聚核苷酸激酶(NEB,M0201),最后5.5μL无菌双蒸水补齐;在PCR仪上设置反应程序:37℃30min,65℃20min,4℃1min,95℃5min,缓降温至25℃(5℃/min)。最后用无菌双蒸水稀释200倍,此时产物为0.05μM的5’端磷酸化的引物二聚体(图2)。
使用Type IIS限制酶BsaI酶切质粒pGN-Cas9-U3’=Amp-SacB=scaffold’(图3),配置50μL反应体系:包含1μg pGN-Cas9-U3’=Amp-SacB=scaffold’、5μL rCutSmartBuffer和1μL(NEB,R3733),最后用无菌双蒸水补齐。设置PCR仪37℃1h,无需回收,即可获得浓度为20ng/μL的线性化载体(图4)。
配置20μL反应体系:包含1μL线性化载体(~20ng/μL)、1μL引物二聚体(0.05μM)、1μL 10×T4 DNA连接酶Buffer和1μL T4 DNA连接酶,最后用无菌双蒸水补齐。25℃反应1h。
100μL大肠杆菌感受态细胞冰浴融化后,加入反应液10μL轻轻混匀,冰浴30min;42℃水浴热激60s,迅速放回冰中并静置2min;向离心管中加入900μL LB培养基混匀,37℃、180rpm条件下复苏菌种45min;取150μL菌液涂于含卡那霉素(50mg/L)和蔗糖(5%)的LB平板上;待平板已干,将其封口,倒置于37℃培养箱,过夜培养(图5)。
预期得到的载体文库的每个成员的图谱见图6。随机挑选7个单克隆,利用Sanger测序验证符合预期(图7)。
本发明能够高保真、高效和高通量地建立含不同标签序列的载体文库。由于通用引物能够重复使用,新的文库构建只需要定制单链的标签引物,且其长度很短,本发明还能显著降低文库构建的引物合成成本。标签序列可以是基因编辑靶点,实现高通量基因编辑。标签序列可用作DNA条形码,定制载体多态性,实现对转基因生物的身份识别。标签序列还可用于构建定点饱和突变文库。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,其特征在于,包括:
1)预备可用于所有文库构建的通用引物;
2)定制中间含预设标签序列的标签引物;
其中,标签引物为长度60nt以下的单链寡核苷酸,其中间是欲引入载体的标签序列,其两侧是退火序列;
通用引物为单链寡核苷酸,其中间为一个/多个尿嘧啶或其他可被寄主微生物识别为碱基损伤的修饰碱基,其两侧为标签引物退火序列的同源序列;标签引物及通用引物的两侧序列能互补配对;
3)将标签引物与等量的通用引物通过同源序列间的退火,获取引物二聚体;
所述引物二聚体的两侧为碱基配对的DNA双链,且引物二聚体两端为粘性末端;引物二聚体的中间为不配对的环状结构,环状结构的双链分别含有标签引物所携带的标签序列和通用引物携带的修饰碱基;
4)制备两粘性末端与引物二聚体粘性末端相兼容的线性化载体;
5)将引物二聚体和线性化载体骨架通过T4 DNA连接酶连接成重组分子;
6)转化大肠杆菌;
7)挑选单克隆,摇菌提质粒,测序验证。
2.根据权利要求1所述的一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,其特征在于,所述引物二聚体两端的粘性末端不相兼容。
3.根据权利要求2所述的一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,其特征在于,所述标签引物的标签序列为生物体基因组DNA的靶向序列。
4.根据权利要求2所述的一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,其特征在于,所述标签引物的标签序列为含有简并碱基的简并引物。
5.根据权利要求2所述的一种通过短寡核苷酸构建含标签序列载体文库的方法,其特征在于,所述线性化载体由环状质粒被Type II限制性内切酶的双酶切或被Type IIS型限制性内切酶的单酶切而获得,其两端为互不兼容且与引物二聚体的粘性末端相兼容的粘性末端。
6.一种如权利要求3所述的方法在构建a、b、c、d中的应用;
其中,a:在细胞基因组DNA指定位点造成成双链断裂的载体文库;
b:在细胞基因组DNA指定位点造成单链断裂的载体文库;
c:在细胞基因组DNA指定位点造成碱基损伤的载体文库;
d:在细胞基因组DNA指定位点募集转录调控因子的载体文库。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述调控因子包括激活因子、抑制因子。
8.一种如权利要求4所述的方法在构建蛋白/肽文库中的应用。
9.一种鉴定转基因生物身份的方法,其特征在于,由权利要求1-5任意一项方法获得的载体文库,通过标签序列鉴定文库中的每个成员。
10.根据权利要求9所述的鉴定转基因生物身份的方法,其特征在于,具体步骤为:将由权利要求1-5任意一项方法获得的载体文库稳定转化细胞后,提取转化子的DNA,利用测序鉴定整合在其基因组上的标签序列。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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