CN112458080A - 一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法 - Google Patents

一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法 Download PDF

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Abstract

为克服现有LncRNA的siRNA的筛选、鉴定技术存在可靠性差和筛选成本高的问题，本发明提供了一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，包括以下操作步骤：获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段；对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。本发明提供的siRNA钓取方法从实验入手，更方便和精准地钓取lncRNA的靶siRNA,其结果可靠、准确、全面。

Description

一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法。
背景技术
LncRNA占人类总基因数的一半以上，在许多疾病的调节过程中发挥关键作用，超过95％的疾病相关GWAS SNPS位于非编码区。
2型糖尿病(T2D)是世界范围内不断增长的疾病，由多种因素与胰岛素敏感性和分泌途径的遗传易感性相互作用而产生，从而增加风险(Knowler等人，2000年)。1981年；Narayan等人，2006年；Cauchi等人，2008年)。对T2D及其危险因素的遗传决定因素的研究揭示了超过400个常见的变异，这些变异位于250多个编码和调控基因组位点，影响了T2D病理生理学的多个不同方面(Manning等人，2012；Wessel等人，2015；Fuchsberger等人，2016；Mahajan等人，2018a，b)。在15年的全基因组关联发现提供了丰富的位点和变异与T2D风险及其潜在的代谢病理生理学。T2D的遗传结构主要是由非编码的、调节性的、主要是常见的变异控制的，仅有的变异能令人信服地证明在欧洲人中直接编码蛋白质改变突变。(富克斯伯格等人，2016年；马哈扬等人，2018年a)。这几百种非编码变异体的功能正被基因组关联数据和基因组功能信息的整合所阐明；对于T2D，到目前为止大多数数据来自胰岛染色质调控图谱。(Pasquali等人，2014年；van de Bunt等人，2015年；Varshney等人，2017年)。与GWAS信号相关的胰岛基因组调控功能包括：增强子位点破坏(Roman等人，2017年)，拉伸增强子增强(Kycia等人，2018年)，以及人类的lncRNA突变(Akerman等人，2017年)等。肝脏、肌肉和脂肪组织的T2D病理生理学，在这方面也取得了进展，将人类组织特异性调控图与GWAS信号联系起来(Scott等人，2016；Pan等人，2018)。在人类肝细胞的lncRNA LOC157273是转录在GWAS发现的chr8p23.1“PPP1R3B”位点，通过沉默lncRNA LOC157273基因可用于调控体内葡萄糖向糖原转化(Leonard Lipovich和Alisa K.Manning等人，2020年)。然而，如何基于lncRNA LOC157273基因设计siRNA却存在着一定的问题。
在LncRNA的siRNA的筛选、鉴定技术领域，目前的技术手段可以分为三类：1.生物信息学方法：用生物信息学手段进行预测，采用各种线上或线下软件，对其分子的相互作用进行分析。2.siRNA文库杂交实验的方法：采用大规模siRNA文库与目标LncRNA进行杂交，以从中钓取相应的siRNA。3.逐段实验法：这类方法就是穷举所有可能靶向目标LncRNA的siRNA，逐个实验，从而筛选出相应的siRNA的方法。在这些技术手段中，1.生物信息学手段：优点是简单快速，成本较低，能进行高通量操作。缺点和面临的问题是，可靠性很差，需要用实验手段再验证，从而极大的增加了筛选和鉴定的成本和难度。2.siRNA文库杂交实验的方法：这个本质上是一个随机碰撞实验，目前现有的大规模siRNA文库虽然很大，但是具体到每个lncRNA，能配上的概率非常小，因此该方法存在许多不确定性。3.逐段实验法：这类方法是穷举法，由于需要逐个实验，工作量就十分巨大，费时，效率极低，成本极高。
发明内容
针对现有LncRNA的siRNA的筛选、鉴定技术存在可靠性差和筛选成本高的问题，本发明提供了一种全新的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，克服了上述技术方法的缺陷，为后续治疗性药物的开发奠定了基础。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，包括以下操作步骤：
步骤一：以lncRNA LOC157273基因为模板，获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；
步骤二：将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；
步骤三：制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；
步骤四：将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；
步骤五：采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；
步骤六：对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNALOC157273基因片段；
步骤七：对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。
可选的，所述步骤一包括以下操作：
通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因；
通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNALOC157273基因片段。
可选的，所述“通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因”包括以下操作：
(1)特异性引物的设计合成：
上游引物：ATTCATTCCACAAACATTTCTAAGTG
下游引物：CTTTATTTGAAGACAACAAACGTACAG
(2)获取LncRNA LOC157273cDNA：
提取并纯化人转录组RNA，利用上述的特异性引物，通过逆转录，获得LncRNALOC157273cDNA；
(3)PCR扩增：用高保真酶扩增LncRNA LOC157273基因；
(4)连接载体并测序：
将得到的LncRNA LOC157273基因连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并测序鉴定。
可选的，所述“通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段”包括以下操作：
(1)采用限制性内切酶消化lncRNA LOC157273基因；
(2)设计合成RD-PCR通用接头和引物：通用接头序列为5’-pGATC，SIP：5’-pGATCCACACCAGCCAAACCCA-3’，SIR：5’-GGTTTGGCTGGTGTG-3’；通用引物M：GTTTGGCTGGTGTGGATC；在通用引物的3’端分别延伸不同的碱基得到多个RD-PCR的选择性引物；
(3)连接通用接头：取经过限制性内切酶处理和纯化得到的酶切片段与通用接头混合，加入T4连接酶，将酶切片段与通用接头连接；
(4)RD-PCR：取上一步获得的反应液作为模板，加入不同配对的选择性引物，进行多组PCR循环，切胶纯化；最终得到多组纯净的限制性LncRNA LOC157273DNA片段；
(3)连接载体并扩增：将得到的多组限制性LncRNA LOC157273DNA片段分别连到载体上，然后LncRNA LOC157273-pMD-18T载体分别转化入感受态细胞内，增殖；
(4)提取纯化细胞内的LncRNA LOC157273-pMD-18T载体。
(3)分离纯化并鉴定LncRNA LOC157273-pMD-18T载体上的LncRNA LOC157273基因片段，得到多组LncRNA LOC157273基因片段。
可选的，RD-PCR操作中，选择性引物是在通用引物的3’端分别延伸一个碱基G，A，T，C而得，分别命名为MG，MA，MT，MC；
4种不同选择性引物MA、MG、MT、MC共有10种不同的组合，因此PCR分成10组进行。
可选的，所述步骤二包括以下操作：
将纯化的多组LncRNA LOC157273基因片段作为探针，分别列印至硅基玻片表面，制作基因芯片。
可选的，所述步骤三包括以下操作：
(1)探针标记：采用cy3-dUTP作为探针的标记，T7 RNA聚和酶进行LncRNALOC157273基因全长片段的体外转录，产生含有标记物的LncRNA LOC157273-dsRNA；
(2)纯化、鉴定LncRNA LOC157273-dsRNA：琼脂糖凝胶电泳纯化LncRNALOC157273-dsRNA片段，并测序鉴定；
(3)Dicer酶消化，制备siRNA文库：用Dicer酶消化上一步纯化并鉴定过的LncRNALOC157273-dsRNA，制备靶向LncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库。
可选的，所述步骤四包括以下操作：
(1)预杂交：将制备的基因芯片置于预杂交溶液中反应，进行表面清洗，表面干燥；
(2)杂交：取制备好的siRNA探针，与Cot-1 DNA混匀，95℃变性，瞬时离心后加入到杂交缓冲液中，混匀并滴加到基因芯片上；水浴，完成杂交。
(3)清洗：将杂交好的基因芯片进行表面清洗，表面干燥。
可选的，所述步骤六包括以下操作：
(1)以基因芯片上的阳性点为模板，进行原位PCR反应；
(2)纯化PCR反应产物：采用琼脂糖凝胶切胶纯化的方法，对上一步的PCR产物进行纯化；
(3)连接载体并测序：将纯化的PCR产物连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并分离纯化得到发生杂交的LncRNA LOC157273基因片段。
可选的，所述原位PCR反应中，采用5’-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3’作为上游引物，采用5’-GATCCACACCAGCCAAC-3’作为下游引物。
根据本发明提供的siRNA钓取方法，采用将lncRNA LOC157273所有特征片段列印到硅基玻片上，制成相应的基因芯片，利用该芯片钓取相应的siRNA，同时对相应的特异性结合位点上的DNA片段进行PCR扩增，以便最终确定siRNA序列，本siRNA钓取方法直接从实验入手，更方便和精准地钓取lncRNA的靶siRNA,其结果可靠、准确、全面。因此本发明可以用于lncRNA LOC157273相关疾病(尤其是糖尿病)的新药研发，以及新药临床后适应症的筛选和基因诊断。
附图说明
图1是本发明提供的LncRNA LOC157273基因克隆反应流程图；
图2是本发明提供的基因芯片杂交原理示意图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，包括以下操作步骤：
步骤一：以lncRNA LOC157273基因为模板，获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；
步骤二：将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；
步骤三：制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；
步骤四：将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；
步骤五：采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；
步骤六：对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNALOC157273基因片段；
步骤七：对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。
本siRNA钓取方法直接从实验入手，更方便和精准地钓取lncRNA的靶siRNA,其结果可靠、准确、全面。因此本发明可以用于lncRNA LOC157273相关疾病(尤其是糖尿病)的新药研发，以及新药临床后适应症的筛选和基因诊断。
在一些实施例中，所述步骤一包括以下操作：
通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因；
通过RD-PCR(Restriction Display Polymerase Chain Reaction)技术对lncRNALOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段。
在优选的实施例中，所述“通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因”包括以下操作：
(1)特异性引物的设计合成：
上游引物：ATTCATTCCACAAACATTTCTAAGTG
下游引物：CTTTATTTGAAGACAACAAACGTACAG
所述特异性引物的设计主要依据lncRNA LOC157273基因的头尾端的核糖核苷酸序列，以保留lncRNA LOC157273基因的全部特征片段。
需要说明的是，在其他实施例中，本领域技术人员可根据需要对所述特异性引物的核苷酸序列进行增加或删减，或是根据lncRNA LOC157273基因的序列设计其他特异性引物。
(2)获取LncRNA LOC157273 cDNA：
提取并纯化人转录组RNA，利用上述的特异性引物，通过逆转录，获得LncRNALOC157273 cDNA；
(3)PCR扩增：用高保真酶扩增LncRNA LOC157273基因；
反应条件如图1所示，将LncRNA LOC157273 cDNA、高保真酶和引物置于95℃条件下保持5min，再进行变性--退火--延伸的循环，包括在95℃下保持1min，61℃下保持1min，再在72℃下保持5min，循环32次后，在72℃下保持10min，退火后的LncRNA LOC157273基因于4℃下保存。
(4)连接载体并测序：
将得到的LncRNA LOC157273基因连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并测序鉴定。
术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本发明中，LncRNA LOC157273基因的重组载体可转化或转导入感受态细胞，以构成含有该LncRNA LOC157273基因的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明的含有所述LncRNA LOC157273基因的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
在一些实施例中，所述“通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNA LOC157273基因片段”包括以下操作：
(1)采用限制性内切酶消化lncRNA LOC157273基因；
具体的，所述限制性内切酶选自Sau3A I，反应条件为37℃酶切3h，然后70℃保持10min。
(2)设计合成RD-PCR通用接头和引物：通用接头序列为5’-pGATC，SIP：5’-pGATCCACACCAGCCAAACCCA-3’，SIR：5’-GGTTTGGCTGGTGTG-3’；通用引物M：GTTTGGCTGGTGTGGATC；在通用引物的3’端分别延伸不同的碱基得到多个RD-PCR的选择性引物；
(3)连接通用接头：取经过限制性内切酶处理和纯化得到的酶切片段与通用接头混合，加入T4连接酶，将酶切片段与通用接头连接；
(4)RD-PCR：取上一步获得的反应液作为模板，加入不同配对的选择性引物，进行多组PCR循环，切胶纯化；最终得到多组纯净的限制性LncRNA LOC157273DNA片段；
(3)连接载体并扩增：将得到的多组限制性LncRNA LOC157273DNA片段分别连到载体上，然后LncRNA LOC157273-pMD-18T载体分别转化入感受态细胞内，增殖；
(4)提取纯化细胞内的LncRNA LOC157273-pMD-18T载体。
(3)分离纯化并鉴定LncRNA LOC157273-pMD-18T载体上的LncRNA LOC157273基因片段，得到多组LncRNA LOC157273基因片段。
在优选的实施例中，RD-PCR操作中，选择性引物是在通用引物的3’端分别延伸一个碱基G，A，T，C而得，分别命名为MG，MA，MT，MC；
4种不同选择性引物MA、MG、MT、MC共有10种不同的组合，因此PCR分成10组进行。
通过设置10组通用引物组合方案，能够有效将LncRNA LOC157273基因的不同特征序列分离，进而得到尽可能多的组合，有利于降低后续基于杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列的难度。
在一些实施例中，所述步骤二包括以下操作：
将纯化的多组LncRNA LOC157273基因片段作为探针，分别列印至硅基玻片表面，制作基因芯片。
除硅基玻片外，作为基板的材料可以是普通玻璃、优质石英以及有机高聚物等。
需要说明的是，在本技术方案中，不同组的LncRNA LOC157273基因片段探针应在所述硅基玻片表面表面具有较大的间隔，以便于后续对于阳性点的采集和原位PCR操作，优选的，不同组的LncRNA LOC157273基因片段探针之间的间隔应是肉眼可识别和操作的。
在一些实施例中，所述步骤三包括以下操作：
(1)探针标记：采用cy3-dUTP作为探针的标记，T7 RNA聚和酶进行LncRNALOC157273基因全长片段的体外转录，产生含有标记物的LncRNA LOC157273-dsRNA；
(2)纯化、鉴定LncRNA LOC157273-dsRNA：琼脂糖凝胶电泳纯化LncRNALOC157273-dsRNA片段，并测序鉴定；
(3)Dicer酶消化，制备siRNA文库：用Dicer酶消化上一步纯化并鉴定过的LncRNALOC157273-dsRNA，制备靶向LncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库。
在一些实施例中，所述步骤四包括以下操作：
(1)预杂交：将制备的基因芯片置于预杂交溶液中反应，进行表面清洗，表面干燥；
(2)杂交：取制备好的siRNA探针，与Cot-1 DNA混匀，95℃变性，瞬时离心后加入到杂交缓冲液中，混匀并滴加到基因芯片上；水浴，完成杂交。
杂交过程如图2所示，其中LncRNA LOC157273基因片段1的两端分别为接头序列2和接头序列5，其中，作为示例，接头序列2为5’-GATCCACACCAGCCAAC-3’，接头序列5为5’-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3’，接头序列5固定于硅基玻片3上，siRNA探针4通过杂交结合至所述LncRNA LOC157273基因片段1上，部分的LncRNA LOC157273基因片段1上未出现杂交的siRNA探针4。
(3)清洗：将杂交好的基因芯片进行表面清洗，表面干燥。
在一些实施例中，所述步骤六包括以下操作：
(1)以基因芯片上的阳性点为模板，进行原位PCR反应；
(2)纯化PCR反应产物：采用琼脂糖凝胶切胶纯化的方法，对上一步的PCR产物进行纯化；
(3)连接载体并测序：将纯化的PCR产物连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并分离纯化得到发生杂交的LncRNA LOC157273基因片段。
在一些实施例中，所述原位PCR反应中，采用5’-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3’作为上游引物，采用5’-GATCCACACCAGCCAAC-3’作为下游引物。
以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
本实施例用于说明本发明公开的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，包括以下操作步骤：
1.PCR扩增获得LOC157273基因片段
(1)引物的设计合成：依据LncRNA LOC157273基因序列设计如下引物。
上游引物：ATTCATTCCACAAACATTTCTAAGTG
下游引物：CTTTATTTGAAGACAACAAACGTACAG
(2)获取LncRNA LOC157273 cDNA：提取并纯化人转录组RNA，利用上一步设计的特异性引物，通过逆转录，获得LncRNA LOC157273 cDNA。
(3)PCR扩增：用高保真酶扩增LncRNA LOC157273基因片段，反应进行条件为：将LncRNA LOC157273 cDNA、高保真酶和引物置于95℃条件下保持5min，再进行变性--退火--延伸的循环，包括在95℃下保持1min，61℃下保持1min，再在72℃下保持5min，循环32次后，在72℃下保持10min，退火后的LncRNA LOC157273基因于4℃下保存。
(4)连接T载体并测序：
连接到pMD-18T载体上，转化入感受态细胞DH5α内，增殖并测序鉴定。
2.用RD-PCR技术将LncRNA LOC157273基因有序分离
(1)酶切：用限制性内切酶(Sau3A I)消化经过测序鉴定并纯化、定量的LncRNALOC157273基因DNA片段，反应条件为37℃酶切3h，然后70℃10min。
(2)设计合成RD-PCR通用接头和引物：通用接头序列为5’-pGATC。SIP：5’-pGATCCACACCAGCCAAACCCA-3’，SIR：5’-GGTTTGGCTGGTGTG-3’。通用引物M：GTTTGGCTGGTGTGGATC。RD-PCR选择性引物是在通用引物的3’端分别延伸一个碱基G，A，T，C而得，分别命名为MG，MA，MT，MC。
(3)连接通用接头：取经过Sau3A I酶切和纯化得到的酶切片段5μl与5μl通用接头混合，加T4连接酶1μl，然后加水将总反应体积调整至30μl，16℃连接3h即完成连接反应。
(4)RD-PCR：取上一步获得的反应液1μl作为模板，配对的选择性引物(如MG和MA，浓度均为10μmol/L)各1μl，加水将总反应体积调整至50μl，进行3轮PCR扩增，每次循环均进行切胶纯化。4种不同选择性引物MA、MG、MT、MC共有10种不同的组合，因此PCR分成10组进行。最终得到纯净的限制性LncRNA LOC157273DNA片段。
(3)连接T载体并测序：将限制性LncRNA LOC157273DNA片段分别连到T载体(pMD-18T)上，然后分别转化入感受态细胞DH5α内，增殖，提取、纯化细胞内的LncRNA LOC157273-pMD-18T载体。
(4)分离纯化并鉴定载体上的LncRNA LOC157273基因片段
3.基因芯片的制备：
使用分离并鉴定后的LncRNA LOC157273基因片段作为探针，将其打印到硅片基表面，制作基因芯片。
4.制备和标记siRNA文库：
(1)探针标记：采用cy3-dUTP作为探针的标记。具体实施步骤如下：T7 RNA聚和酶进行LncRNA LOC157273基因全长片段的体外转录，产生含有标记物的LncRNA LOC157273-dsRNA。
(2)纯化、鉴定LncRNA LOC157273-dsRNA：琼脂糖凝胶电泳纯化LncRNALOC157273-dsRNA片段，并测序鉴定。
(3)Dicer酶消化，制备siRNA文库：用Dicer酶(DICER1)消化上一步纯化并鉴定过的LncRNA LOC157273-dsRNA，制备靶向LncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库。
5.与基因芯片分子杂交：
(1)预杂交：将制备的LncRNA LOC157273芯片置于预杂交溶液中，42℃反应45min，用去离子无菌水清洗6次，再用异丙醇清洗一次，置于空气中晾干。
(2)杂交：取制备好的siRNA探针9μl，与1μl Cot-1 DNA混匀，95℃变性3min，瞬时离心后加入到10μl的42℃的2X的杂交缓冲液中(50％甲酞胺，10XSSC，0.2％SDS)，混匀并滴加到芯片上。42℃水浴16h～20h，完成杂交。
(3)清洗：将杂交好的芯片用42℃的1XSSC，0.2％SDS清洗2次。然后再用室温的0.1XSSC，0.2％SDS清洗1次。然后空气中晾干。
6.基因芯片扫描：
用基因芯片扫描仪对杂交好的芯片进行扫描，得到杂交结果。
7.PCR扩增杂交片段：
(1)PCR：以芯片上发生杂交的LncRNA LOC157273 DNA片段为模板，用5’-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3’作为上游引物，用5’-GATCCACACCAGCCAAC-3’作为下游引物，进行原位PCR反应。
(2)纯化PCR反应产物：采用琼脂糖凝胶切胶纯化的方法，对上一步的PCR产物进行纯化。
(3)连接T载并测序：连接到pMD-18T上，转化入感受态细胞DH5α内，增殖并测序鉴定。
8.确定siRNA序列：
根据测序获得的发生杂交的LncRNA LOC157273 DNA片段，反向推导出相应的siRNA的序列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
步骤一：以lncRNA LOC157273基因为模板，获取不同的lncRNA LOC157273基因片段；
步骤二：将多个lncRNA LOC157273基因片段分散结合至基板表面，制作基因芯片；
步骤三：制备靶向lncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库；
步骤四：将基因芯片与siRNA探针文库进行杂交；
步骤五：采用基因芯片扫描仪对杂交后的基因芯片进行扫描，确定发生杂交的阳性点；
步骤六：对基因芯片上的阳性点进行PCR，扩增纯化得到发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段；
步骤七：对发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段进行测序获知其基因序列，根据发生杂交的lncRNA LOC157273基因片段的基因序列反向推导出siRNA序列。
2.根据权利要求1所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述步骤一包括以下操作：
通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因；
通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNALOC157273基因片段。
3.根据权利要求2所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述“通过PCR扩增获得lncRNA LOC157273基因”包括以下操作：
(1)特异性引物的设计合成：
上游引物：ATTCATTCCACAAACATTTCTAAGTG
下游引物：CTTTATTTGAAGACAACAAACGTACAG
(2)获取LncRNA LOC157273 cDNA：
提取并纯化人转录组RNA，利用上述的特异性引物，通过逆转录，获得LncRNALOC157273 cDNA；
(3)PCR扩增：用高保真酶扩增LncRNA LOC157273基因；
(4)连接载体并测序：
将得到的LncRNA LOC157273基因连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并测序鉴定。
4.根据权利要求2所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述“通过RD-PCR技术对lncRNA LOC157273基因进行有序分离，得到多种不同的lncRNALOC157273基因片段”包括以下操作：
(1)采用限制性内切酶消化lncRNA LOC157273基因；
(2)设计合成RD-PCR通用接头和引物：通用接头序列为5’-pGATC，SIP：5’-pGATCCACACCAGCCAAACCCA-3’，SIR：5’-GGTTTGGCTGGTGTG-3’；通用引物M：GTTTGGCTGGTGTGGATC；在通用引物的3’端分别延伸不同的碱基得到多个RD-PCR的选择性引物；
(3)连接通用接头：取经过限制性内切酶处理和纯化得到的酶切片段与通用接头混合，加入T4连接酶，将酶切片段与通用接头连接；
(4)RD-PCR：取上一步获得的反应液作为模板，加入不同配对的选择性引物，进行多组PCR循环，切胶纯化；最终得到多组纯净的限制性LncRNA LOC157273DNA片段；
(3)连接载体并扩增：将得到的多组限制性LncRNA LOC157273DNA片段分别连到载体上，然后LncRNA LOC157273-pMD-18T载体分别转化入感受态细胞内，增殖；
(4)提取纯化细胞内的LncRNA LOC157273-pMD-18T载体。
(3)分离纯化并鉴定LncRNA LOC157273-pMD-18T载体上的LncRNA LOC157273基因片段，得到多组LncRNA LOC157273基因片段。
5.根据权利要求4所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，RD-PCR操作中，选择性引物是在通用引物的3’端分别延伸一个碱基G，A，T，C而得，分别命名为MG，MA，MT，MC；
4种不同选择性引物MA、MG、MT、MC共有10种不同的组合，因此PCR分成10组进行。
6.根据权利要求1所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述步骤二包括以下操作：
将纯化的多组LncRNA LOC157273基因片段作为探针，分别列印至硅基玻片表面，制作基因芯片。
7.根据权利要求1所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述步骤三包括以下操作：
(1)探针标记：采用cy3-dUTP作为探针的标记，T7 RNA聚和酶进行LncRNA LOC157273基因全长片段的体外转录，产生含有标记物的LncRNA LOC157273-dsRNA；
(2)纯化、鉴定LncRNA LOC157273-dsRNA：琼脂糖凝胶电泳纯化LncRNA LOC157273-dsRNA片段，并测序鉴定；
(3)Dicer酶消化，制备siRNA文库：用Dicer酶消化上一步纯化并鉴定过的LncRNALOC157273-dsRNA，制备靶向LncRNA LOC157273基因的siRNA探针文库。
8.根据权利要求1所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述步骤四包括以下操作：
(1)预杂交：将制备的基因芯片置于预杂交溶液中反应，进行表面清洗，表面干燥；
(2)杂交：取制备好的siRNA探针，与Cot-1 DNA混匀，95℃变性，瞬时离心后加入到杂交缓冲液中，混匀并滴加到基因芯片上；水浴，完成杂交。
(3)清洗：将杂交好的基因芯片进行表面清洗，表面干燥。
9.根据权利要求4所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述步骤六包括以下操作：
(1)以基因芯片上的阳性点为模板，进行原位PCR反应；
(2)纯化PCR反应产物：采用琼脂糖凝胶切胶纯化的方法，对上一步的PCR产物进行纯化；
(3)连接载体并测序：将纯化的PCR产物连接到载体上，转化入感受态细胞内，增殖并分离纯化得到发生杂交的LncRNA LOC157273基因片段。
10.根据权利要求9所述的获得针对lncRNA LOC157273的siRNA钓取方法，其特征在于，所述原位PCR反应中，采用5’-GTTTGGCTGGTGTGGATC-3’作为上游引物，采用5’-GATCCACACCAGCCAAC-3’作为下游引物。
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