WO2024080067A1 - ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物 - Google Patents

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WO2024080067A1
WO2024080067A1 PCT/JP2023/033481 JP2023033481W WO2024080067A1 WO 2024080067 A1 WO2024080067 A1 WO 2024080067A1 JP 2023033481 W JP2023033481 W JP 2023033481W WO 2024080067 A1 WO2024080067 A1 WO 2024080067A1
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sequence
seq
cas protein
genome
nucleic acid
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Application number
PCT/JP2023/033481
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English (en)
French (fr)
Inventor
輝彦 寺川
翼 矢野
展隆 光田
彰良 中村
茂夫 菅野
誠一郎 伊藤
洋一 牧野
Original Assignee
株式会社インプランタイノベーションズ
国立研究開発法人産業技術総合研究所
Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Definitions

  • the present invention relates to the field of genetic engineering, and more specifically to the field of genome editing. More specifically, the present invention relates to a new genome editing method for site-specifically modifying a target DNA sequence in the genome of a eukaryotic cell, and a genome editing means, such as a genome editing composition, used in the method.
  • CRISPR/Cas Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins
  • Cas9 RNA-guided nuclease
  • Cas9 is generally used as a complex with a guide RNA.
  • target genes can be mutated in various animals and plants.
  • Cas9 functions as an active endonuclease by forming a complex with two RNAs called CRISPR RNA (crRNA) and transactivating crRNA (tracrRNA), cleaving foreign genetic elements in the invading phage or plasmid.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA transactivating crRNA
  • the CRISPR/Cas system can be used simply by synthesizing a short sgRNA with a sequence homologous to the target DNA sequence, and the type II CRISPR/Cas system in particular has the advantage that genome editing is possible using a single protein, Cas9.
  • Cas9 recognizes PAM (protospacer adjacent motif) sequences in DNA and cleaves double-stranded DNA upstream of the sequences to produce blunt ends.
  • the length and base sequence of the PAM sequence recognized by Cas9 varies depending on the bacterial species from which Cas9 is derived.
  • Cas9 derived from Streptococcus pyogenes (abbreviated as SpyCas9) recognizes the three bases 5'-NGG-3' as a PAM sequence, and can cleave upstream of a sequence with two guanines in a row (Patent Document 1) (Note that unless otherwise specified, "N" in the base sequences in this specification represents any base.).
  • Streptococcus thermophilus has two types of Cas9, each of which recognizes a 5-6 base sequence, 5'-NGGNG-3' or 5'-NNAGAA-3', as a PAM sequence (Patent Document 2).
  • the present invention has been made in consideration of the above problems, and its purpose is to provide a new genome editing method that can recognize new PAM sequences in the genome of a eukaryotic cell and modify the genome in a site-specific manner.
  • the present invention includes the following.
  • [Item 1] A method for site-specifically modifying a target DNA sequence in the genome of a eukaryotic cell, comprising: In said eukaryotic cell, (1) A Cas protein that recognizes a PAM (protospacer adjacent motif) sequence containing the base sequence 5'-NNACNN-3' (wherein each "N” means any one base independently selected from adenine, cytosine, thymine, and guanine) described in SEQ ID NO: 1, or a nucleic acid encoding the Cas protein; and (2) Modifying the genome of the eukaryotic cell at the target DNA sequence by introducing a guide RNA capable of hybridizing to the target DNA sequence in the genome and forming a complex with the Cas protein and directing sequence-specific binding of the complex to the target DNA sequence, or a nucleic acid encoding the guide RNA.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • the Cas protein comprises a nuclear localization signal (NLS).
  • the Cas protein comprises an amino acid sequence having 80% or more, or 85% or more, or 90% or more, or 92% or more, or 95% or more, or 96% or more, or 97% or more, or 98% or more, or 99% or more sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO:4.
  • [Item 5] The method according to any one of items 1 to 4, wherein the Cas protein has endonuclease activity.
  • the PAM sequence comprises the base sequence 5'-NNACGN-3' set forth in SEQ ID NO: 2 or the base sequence 5'-NNACAN-3' set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the guide RNA is a single-stranded guide RNA (sgRNA) and includes crRNA and tracrRNA.
  • the crRNA comprises a stem loop of 12 to 36 nucleotides in length.
  • the eukaryotic cell is an animal cell, a plant cell, or a microbial cell.
  • the genome editing method of the present invention uses a Cas protein that recognizes a new PAM sequence, including 5'-NNACNN-3', making it possible to perform site-specific modification of a eukaryotic cell genome based on a new target DNA sequence.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of a vector for producing the AalCas9 protein in Example 1.
  • FIG. 2 shows the base sequence (SEQ ID NO: 23) and configuration of sgRNA in Examples 2 and 3.
  • FIG. 3 is a graph showing the analysis results of the PAM domain in Example 2.
  • 4 is a set of photographs showing examples of electrophoretic results of reaction products from the in vitro DNA cleavage assay in Example 3. The photograph on the left shows the results when the reaction solution was incubated at 25° C. for 60 minutes, and the photograph on the right shows the results when the reaction solution was incubated at 37° C. for 60 minutes.
  • 5A and 5B are graphs showing the time course of AalCas9 activity by an in vitro DNA cleavage assay in Example 3.
  • FIG. 5A shows the results when the reaction solution was incubated at 25 ° C.
  • the graph in Fig. 5B shows the results when the reaction solution was incubated at 37 ° C.
  • 6A and 6B are diagrams showing the results of genomic DNA editing of Arabidopsis thaliana protoplast cells by AalCas9 in Example 4.
  • Fig. 6A shows the editing rate for each target DNA
  • Fig. 6B shows mutated DNA by a next-generation sequencer.
  • FIG. 7 shows the efficiency of genomic DNA editing of Arabidopsis thaliana plants by AalCas9 in Example 5.
  • FIG. 8 shows the genome editing efficiency of human cultured cells HEK293FT by AalCas9 in Example 6.
  • A means adenine
  • G means guanine
  • C means cytosine
  • T means thymine
  • N means any one base selected from the group consisting of adenine, cytosine, thymine, and guanine.
  • Genome editing method relates to a genome editing method for site-specifically modifying a target DNA sequence in the genome of a eukaryotic cell (hereinafter, appropriately abbreviated as the "genome editing method of the present invention” or the “method of the present invention”).
  • a Cas protein that recognizes a specific PAM sequence, or a nucleic acid encoding the Cas protein; and
  • the main feature is that it includes modifying the genome of the eukaryotic cell at the target DNA sequence by introducing a guide RNA or a nucleic acid encoding the guide RNA.
  • the cell may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and is not particularly limited, but preferably a eukaryotic cell is used.
  • prokaryotic cells include bacteria and archaea.
  • eukaryotic cells include microbial cells, plant cells, and animal cells.
  • microbial cells include cells derived from various microorganisms such as yeast, fungi, and protozoa.
  • plant cells include cells derived from various plants such as seed plants, ferns, mosses, and algae.
  • animal cells include cells derived from various animals such as vertebrates (mammals, birds, reptiles, amphibians, fish, etc.), arthropods (insects, etc.), and mollusks.
  • mammalian cells include CHO cells, HeLa cells, HEK293 cells, and COS-1 cells.
  • the form of the cell is not particularly limited, and may be any of in vivo cells, cultured cells (in vitro), primary cultured cells (in vitro and ex vivo), transplanted cells, etc. Such various cells are commonly used in the technical field.
  • Genome editing refers to a technique for editing genomes by introducing desired modifications into target sites on the genome in various cells using site-specific DNA modification proteins or the like.
  • modification include, but are not limited to, cleaving a specific gene on the genome to destroy the gene, inserting or substituting a DNA fragment at a target site on the genome, and introducing point mutations with high efficiency to modify gene function.
  • target site refers to a specific site in the genome of a eukaryotic cell that is the subject of genome editing.
  • cleavage refers to cleavage of the covalent backbone of a nucleotide molecule.
  • the target site for genome editing can be appropriately selected depending on the type of site-specific DNA modifying protein described below.
  • a type of Cas protein as the site-specific DNA modifying protein, it is preferable that the target site for genome editing is a site on the genomic DNA consisting of a DNA strand (target strand) consisting of a PAM sequence and a sequence of a predetermined base length (e.g., about 20 bases) adjacent to the 5' side thereof and its complementary DNA strand (non-target strand).
  • the target site on the genome that is the subject of genome editing is not particularly limited, but examples include a part or all of a gene on the genome of a eukaryotic cell that is desired to be modified or destroyed, or a region that overlaps with or is adjacent to that gene.
  • genes that can be subject to genome editing include genes related to primary metabolism (amino acids, etc.), genes related to secondary metabolism (flavonoids, polyphenols, etc.), genes related to sugar metabolism, genes related to lipid metabolism, genes related to the production of useful substances (medicines, enzymes, pigments, aromatic components, etc.), genes related to yield (number, size, etc.), genes related to flowering, genes related to disease and pest resistance, and genes related to resistance to environmental stress (low temperature, high temperature, drought, salt, light damage, ultraviolet light), etc.
  • Cas protein refers to a protein belonging to the Cas protein family that constitutes the adaptive immune system that provides acquired resistance to invading foreign nucleic acids in bacteria and archaea, and is a target-specific endonuclease that recognizes a PAM sequence and cleaves double-stranded DNA upstream or downstream of it.
  • the Cas protein is an RNA-guided nuclease (RGN) that constitutes the CRISPR/Cas system together with a guide RNA (gRNA).
  • RGN RNA-guided nuclease
  • gRNA guide RNA
  • the guide RNA By introducing or constructing the CRISPR/Cas system into a target cell, the guide RNA binds to a target site in the genome, and the DNA at the target site can be cleaved by the Cas protein that has been called to the binding site.
  • the Cas protein used in the present invention is characterized by recognizing a specific PAM (protospacer adjacent motif) sequence that includes 5'-NNACNN-3' (SEQ ID NO: 1). Of these, it is preferable to recognize a specific PAM sequence that includes 5'-NNACGN-3' (SEQ ID NO: 2) or 5'-NNACAN-3' (SEQ ID NO: 3).
  • PAM protospacer adjacent motif
  • the Cas protein used in the present invention is not limited to a particular type, and any type of Cas protein can be used as long as it can recognize the specific PAM sequence described above, with Cas9 being preferred.
  • the Cas protein used in the present invention may be a natural protein or a recombinant protein.
  • the origin (derived) of the Cas protein used in the present invention is not limited, but a Cas protein derived from bacteria of the genus Abyssicoccus is preferred, and AalCas9, which is Cas9 derived from Abyssicoccus albus, is particularly preferred.
  • AalCas9 which is Cas9 derived from Abyssicoccus albus.
  • the amino acid sequence of wild-type AalCas9 is shown in SEQ ID NO:4.
  • AalCas9 When used in the present invention, it may be a wild-type AalCas9 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but it may also be a mutant AalCas9 having one or more mutations in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4, so long as its activity (e.g., the endonuclease activity described below) is not impaired.
  • such a mutant AalCas9 is preferably a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, or inserted relative to the amino acid sequence of the wild-type AalCas9 set forth in SEQ ID NO: 4, and having activity equivalent to or greater than that of the AalCas9 protein (e.g., the endonuclease activity described below).
  • mutant AalCas9 proteins preferably have an amino acid sequence that has, for example, 80% or more, or 85% or more, or 90% or more, or 92% or more, or 95% or more, or 96% or more, or 97% or more, or 98% or more, or 99% or more sequence homology (preferably sequence identity) with the amino acid sequence of its parent wild-type AalCas9 described in SEQ ID NO: 4.
  • the "similarity" of two amino acid sequences is the ratio at which identical or similar (i.e., with similar physicochemical properties) amino acid residues appear in corresponding positions when the two amino acid sequences are aligned
  • the “identity” of two amino acid sequences is the ratio at which identical amino acid residues appear in corresponding positions when the two amino acid sequences are aligned.
  • the "homology” and “identity” of two amino acid sequences can be determined, for example, using the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) program (Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10).
  • the nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention is not limited as long as it has a base sequence corresponding to the amino acid sequence of the above-mentioned Cas protein and is capable of expressing the above-mentioned Cas protein in a eukaryotic cell.
  • Such a nucleic acid can be appropriately prepared based on the amino acid sequence information of the desired Cas protein.
  • the nucleic acid may also be prepared by chemical synthesis, etc.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention includes a nucleic acid encoding the wild-type AalCas9 of SEQ ID NO: 4, and a nucleic acid containing a base sequence encoding a protein containing an amino acid sequence having, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity to the amino acid sequence of the wild-type AalCas9 of SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence of the wild-type AalCas9 gene encoding the wild-type AalCas9 of SEQ ID NO: 4 in Abyssicoccus albus is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention may be one in which the codons are optimized to suit the translation system of the eukaryotic cell into which the nucleic acid is introduced.
  • the wild-type AalCas9 gene base sequence codon-optimized for Escherichia coli is shown in SEQ ID NO: 6
  • the base sequence codon-optimized for humans is shown in SEQ ID NO: 7
  • the base sequence codon-optimized for Arabidopsis thaliana is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention may also include a nucleic acid containing a base sequence that has, for example, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity to the various base sequences described above, for example, the base sequences set forth in SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, or SEQ ID NO:8.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention may contain a nuclear localization signal (NLS) sequence for transporting the protein or nucleic acid into the nucleus by nuclear transport in eukaryotic cells.
  • the NLS may be added to only one of the 5'-end or 3'-end of the nucleic acid encoding the Cas protein, or may be added to both the 5'-end and 3'-end.
  • the nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention may be incorporated into a vector in the form of an expression cassette operably linked to a regulatory sequence such as a promoter or terminator.
  • Endonuclease activity The Cas protein used in the present invention preferably has endonuclease activity.
  • "endonuclease” means an enzyme that cuts the middle of a nucleotide chain.
  • the Cas9 protein with endonuclease activity used in the present invention is preferably induced by guide RNA and has the enzyme activity of cutting the middle of a target DNA chain.
  • the Cas protein used in the present invention has activity of cleaving or modifying target DNA at temperatures, for example but not limited to, in the range of 10°C to 80°C, preferably in the range of 20°C to 50°C, and more preferably in the range of 25°C to 40°C.
  • PAM sequence The Cas protein used in the present invention recognizes a specific PAM sequence.
  • a "PAM sequence” protospacer adjacent motif sequence
  • the length and base sequence of the PAM sequence recognizable by the Cas protein vary depending on the type of Cas protein.
  • the Cas protein used in the present invention recognizes a specific PAM sequence that includes 5'-NNACNN-3' (SEQ ID NO: 1).
  • the Cas protein recognize a specific PAM sequence that includes 5'-NNACGN-3' (SEQ ID NO: 2) or 5'-NNACAN-3' (SEQ ID NO: 3).
  • Guide RNA is an RNA that has the function of guiding a site-specific DNA modification protein such as a Cas protein to a target site of a target nucleic acid on a genome.
  • the site-specific DNA modification protein usually binds to such a guide RNA to form a ribonucleoprotein or ribonucleoprotein (RNP).
  • RNP ribonucleoprotein
  • the guide RNA targets the target site on the genome, and the site-specific DNA modification protein such as a Cas protein cleaves the DNA of the target site on the genome, thereby changing or modifying the DNA sequence of the target site on the genome.
  • the structure of the guide RNA is usually selected depending on the type of site-specific DNA-modifying protein.
  • the guide RNA when a Cas protein is used as the site-specific DNA-modifying protein, the guide RNA usually contains a crRNA (CRISPR RNA) sequence involved in the activity of the CRISPR/Cas system and a tracrRNA (trans-activating crRNA) sequence that binds to a target site on the genome.
  • CRISPR RNA crRNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • the guide RNA may be a single-stranded RNA (sgRNA) containing a crRNA sequence and a tracrRNA sequence, or an RNA complex formed by complementary binding of an RNA containing a crRNA sequence and an RNA containing a tracrRNA sequence.
  • the crRNA sequence includes a repeat sequence and a spacer sequence.
  • the spacer sequence is a sequence that can form a double strand with a complementary strand or a substantially complementary strand (a sequence that does not completely match the target sequence but can bind to the target sequence) of the target DNA sequence. By including such a spacer sequence, the crRNA sequence can perform target recognition by the CRISPR/Cas system.
  • the length of the spacer sequence is not limited, but is preferably, for example, 15 to 30 nucleotides, 18 to 25 nucleotides, 19 to 23 nucleotides, or 20 to 22 nucleotides, particularly 20 nucleotides, 21 nucleotides, or 22 nucleotides.
  • the length of the crRNA sequence is not limited, but can be, for example, a sequence that includes a stem loop of about 12 to 36 bases.
  • the tracrRNA sequence contains a highly repeated region followed by one or more (preferably two or more) hairpin structures, and is capable of forming multiple stem loops.
  • the length of the tracrRNA sequence is not limited, but can be, for example, a sequence of about 50 to 100 bases long.
  • the configuration of the guide RNA used in the present invention is not particularly limited as long as it can hybridize to the target DNA sequence in the genome, form a complex with the Cas protein, and direct the sequence-specific binding of the complex to the target DNA sequence. It may be appropriately designed depending on the Cas protein used in the present invention and the PAM sequence it recognizes, as well as the target DNA sequence in the genome of the eukaryotic cell to be modified. There has been a lot of knowledge about the design of such guide RNA (for example, International Publication Nos. 2013/142578, 2013/176772, and 2014/093595, etc.), and a person skilled in the art can carry out the present invention by making any modifications while appropriately taking into consideration these knowledge.
  • the composition is not particularly limited.
  • Appropriate DNA may be designed depending on the sequence and composition of the guide RNA used in the present invention, as well as the type of eukaryotic cell to be modified.
  • the DNA encoding the crRNA sequence and the DNA encoding the tracrRNA sequence may be prepared as independent molecules, or an integrated DNA molecule encoding both the crRNA sequence and the tracrRNA sequence may be used.
  • the nucleic acid, such as DNA, encoding the guide RNA may be an independent molecule from the nucleic acid encoding the Cas protein, or may be an integral molecule with the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • the nucleic acid encoding the guide RNA may be incorporated into a vector alone or together with the nucleic acid encoding the Cas protein in the form of an expression cassette operably linked to a regulatory sequence such as a promoter or terminator.
  • Target DNA sequence In general, the target DNA sequence that is the subject of site-specific modification in the CRISPR/Cas system is not limited, and may be any of double-stranded DNA sequence, single-stranded RNA sequence, or single-stranded DNA sequence.However, in the present invention, the double-stranded DNA sequence in the genome of eukaryotic cell is the target sequence.
  • the DNA sequence located near the PAM sequence recognized by Cas protein is usually selected as the target DNA sequence.
  • the method of the present invention is carried out by introducing the Cas protein or a nucleic acid encoding the same and the guide RNA or a nucleic acid encoding the same into a eukaryotic cell containing a target DNA sequence to be site-specifically modified in its genome, whereby the guide RNA binds to a target DNA site in the eukaryotic cell genome, and the Cas protein called to the binding site cleaves the genome of the eukaryotic cell at the target DNA site, thereby enabling site-specific modification of the genome.
  • the method for introducing the Cas protein or the nucleic acid encoding it, and the guide RNA or the nucleic acid encoding it into eukaryotic cells is not particularly limited. Examples include, but are not limited to, various methods known in the art, such as electroporation, liposomes, viral vectors, nanoparticles, whisker crystals, methods using PTD (protein translocation domain) fusion proteins, particle gun methods, and Agrobacterium methods.
  • the cell When the Cas protein or the nucleic acid encoding it and the guide RNA or the nucleic acid encoding it are introduced into a cell, the cell may be cultured under conditions suitable for cell growth.
  • the culture conditions may be suitable for the species of organism from which the cell is derived, and may be determined, for example, by a person skilled in the art based on known cell culture techniques.
  • a genome editing composition and a genome editing kit for use in the genome editing method of the present invention are provided.
  • the genome editing composition is a composition that contains at least the Cas protein or a nucleic acid encoding it, and optionally further contains the guide RNA or a nucleic acid encoding it.
  • the genome editing kit is a kit that includes a container that contains at least the Cas protein or a nucleic acid encoding it, and an instruction manual that describes how to use it, and optionally further contains the guide RNA or a nucleic acid encoding it. Details of such Cas protein or the nucleic acid encoding it, and guide RNA or the nucleic acid encoding it are as described above.
  • N refers to any one base selected from the group consisting of adenine, cytosine, thymine, and guanine.
  • linear DNA was amplified by PCR using the following primer 1 (sequence number 9) and primer 2 (sequence number 10) and the pET26b vector as a template.
  • Primer 1 (SEQ ID NO: 9): 5'-TCCTCCAGAGACTTTCCGCTTCTTCTTCTTTGGGGCTTTATGATTCATATGTATATCTCCTTCTTTAAAG-3'
  • Primer 2 (SEQ ID NO: 10): 5'-TCTGGCGGCTCAAAAGAACCGCCGGCAGCGCGAATTCGAGCCCAAGAAGAAGGGAAAGTCCTCGAGCACCACCAC-3'
  • a DNA fragment was prepared by attaching the following oligonucleotide A (N-terminal nuclear localization signal sequence, SEQ ID NO: 11) and oligonucleotide B (C-terminal nuclear localization signal sequence, SEQ ID NO: 12) to the 5' and 3' ends of the AalCas9 gene (SEQ ID NO: 6) that had been codon-optimized for E. coli.
  • Oligonucleotide A N-terminal nuclear localization signal sequence, SEQ ID NO: 11
  • Oligonucleotide B C-terminal nuclear localization signal sequence, SEQ ID NO: 12
  • the DNA fragment containing the E. coli codon-optimized AalCas9 gene obtained above was mixed with the PCR amplified product of the pET vector obtained earlier, and the DNA fragment was made into a circular plasmid using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix.
  • the obtained circular plasmid was used to transform E. coli DH5a, and transformants were selected by culturing on an LB agar plate containing 50 ⁇ g/mL kanamycin. Several colonies were picked, and the desired circular plasmid (pET-AalCas9) was prepared from among them as a vector for AalCas9 production.
  • AalCas9 The obtained plasmid vector pET-AalCas9 was introduced into E. coli ROSETTA2 (DE3) pLYSS strain by a conventional method.
  • the obtained recombinant strain was cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and when it was cultured until the OD value reached 0.8, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (final concentration 0.25 mM) was added as an expression inducer, and the strain was cultured at 20 ° C. for 20 hours. After the culture, the E. coli was collected by centrifugation (8,000 g, 10 minutes).
  • the collected cells were suspended in buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) and ultrasonically disrupted.
  • the supernatant was collected by centrifugation (12,000 g, 30 min), and purified using a Ni-affinity column equilibrated with buffer A, then a Heparin affinity column, and then a gel filtration column equilibrated with buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , 10% glycerol).
  • the purified protein was concentrated using a centrifugal ultrafiltration filter unit (Merck Millipore) to obtain AalCas9.
  • the AalCas9 thus obtained was stored at -80°C.
  • plasmid library In order to identify the PAM sequence of the AalCas9 gene, a plasmid library was prepared by the following procedure.
  • a fragment obtained by cleaving commercially available pUC18 with the restriction enzymes BamH1 and EcoR1 was mixed with a double-stranded DNA fragment containing a portion of the known rice-derived PDS (phytoene desaturase) gene sequence (5'-GTTGGTCTTTGCTCCTGCAG-3') and annealed with the following oligonucleotide C (SEQ ID NO: 13) and oligonucleotide D (SEQ ID NO: 14), both of which have phosphorylated 5' ends, and ligated using Ligation mix (manufactured by TAKARA).
  • PDS phytoene desaturase
  • Oligonucleotide C (SEQ ID NO: 13): 5'-pGATCGTTGGTCTTTGCTCCTGCAGAGG-3' Oligonucleotide D (SEQ ID NO: 14): 5'-pAATTCCTCTGCAGGAGCAAAGACCAAC-3'
  • the resulting ligation solution was used to transform E. coli DH5 ⁇ using standard methods, and after selection on an LB agar plate containing 100 ⁇ g/mL ampicillin, the plasmid was purified from the clones carrying the desired recombinant plasmid (pUC18-OsPDS).
  • the first PCR reaction was carried out using the purified pUC18-OsPDS as a template and the following primer 3 (sequence number 15) and primer 4 (sequence number 16), and a first PCR amplification product containing an amplified DNA fragment was obtained.
  • Primer 3 (SEQ ID NO: 15) 5'-ACATCTGACGCTGCCGACGACAAGCTTGGCACTGGCCGTCG-3'
  • Primer 4 (SEQ ID NO: 16) 5'-CCGGAGCATAAAGTGTAAAGC-3'
  • a second PCR reaction was carried out using the following primer 5 (sequence number 17) and primer 6 (sequence number 18), which contain the adapter sequence used in NGS analysis, with the purified pUC18-OsPDS as a template, to obtain a second PCR amplification product containing the amplified DNA fragment.
  • Primer 5 (SEQ ID NO: 17) 5'-CTTGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCATGCCTGCAGGTCGACTCGAGAGG-3'
  • Primer 6 (SEQ ID NO: 18) 5'-ACACTTTATGCTTCCGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG-3'
  • the first and second PCR amplification products were mixed, and the DNA fragments were made into a circular plasmid using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed with the circularized plasmid, and the plasmid was selected on an LB agar plate containing 100 ⁇ g/mL ampicillin, after which the plasmid was purified from the clones carrying the desired recombinant plasmid (pUC18-NGS-OsPDS).
  • oligonucleotide F contains a random sequence consisting of seven N bases.
  • Oligonucleotide E (SEQ ID NO: 19): 5'-GGTCTTTGCTCCTGCAGG-3' Oligonucleotide F (SEQ ID NO: 20): 5'-AGCTATGACCATGATTACGAATTCNNNNNCTGCAGGAGCAAAGACC-3'
  • a PCR reaction was carried out using the purified pUC18-NGS-OsPDS as a template and the following primers 7 (sequence number 21) and 8 (sequence number 22), to obtain a PCR amplification product containing the amplified DNA fragment.
  • Primer 7 (SEQ ID NO:21): 5'-CTGCAGGAGCAAAGACC-3'
  • Primer 8 (SEQ ID NO: 22): 5'-GTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC-3'
  • the PCR amplification product containing the obtained DNA fragment was mixed with the prepared double-stranded DNA fragment containing the random sequence, and the DNA fragment was converted into a circular plasmid using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ was transformed with the obtained circularized plasmid and selected on an LB agar plate containing 100 ⁇ g/mL ampicillin. Approximately 100,000 colonies containing the desired recombinant plasmid were then cultured together and the plasmid library pUC18-NGS-OsPDS-7N series was created using NucleoBond EXtra Midi Plus (Nihon Genetics).
  • AalCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 23) for cleaving the plasmid library pUC18-NGS-OsPDS-7N was prepared by in vitro transcription using Guide-it TM sgRNA In Vitro Transcription Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the structure of AalCas9 sgRNA is shown in FIG. 2, and the base sequence is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the polyN at the 5' end is omitted.
  • This AalCas9 sgRNA was diluted with RNase-free Cas9 buffer (20 mM HEPES-Na, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA) to 2.5 ⁇ M AalCas9 and 12.5 ⁇ M sgRNA, and left at 25° C. for 20 minutes to form a complex, preparing a first RNP solution.
  • AalCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 23) 5'-GUUUUAGUACUCUGCGAAAUUUUAGUGAAACUAGAUUUCGCAGAAUCUAUUAAAACAAGGCUUUAUGCCGUAUUUAAACUCCAUCCUAUGGGUGGGGGUAUUUUU-3'
  • a PCR reaction was carried out using the purified uncleaved plasmid as a template and the following primers 9 (sequence number 24) and 10 (sequence number 25), and a PCR amplification product containing a double-stranded DNA fragment of approximately 370 bp containing a random sequence was obtained.
  • the PCR amplification product containing the double-stranded DNA fragment was diluted with Cas9 buffer to a concentration of 200 nM, and the first RNP solution described above in (2) was added and the enzyme reaction was carried out at 37°C for 30 minutes.
  • the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis in the same manner as above, and the uncleaved double-stranded DNA fragment was purified.
  • the purified double-stranded DNA fragment was used as a sample for DNA sequence analysis by next-generation sequencer (NGS).
  • NGS next-generation sequencer
  • the purified double-stranded DNA fragments and the RNP-untreated plasmid library were subjected to NGS analysis using Hiseq (Illmina) to detect sequences contained in the random region.
  • the sequences contained in the random region of the purified double-stranded DNA fragments were compared with the sequences contained in the RNP-untreated plasmid library, and the PAM sequence of AalCas9 was identified as NNACGN by extracting a sequence common to the sequences whose detection frequency in the purified double-stranded DNA fragments was reduced to 1/10 (Figure 3).
  • Primer 11 (SEQ ID NO: 26) 5'-CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTGCGTTACTGCAGGAGC-3'
  • Primer 12 (SEQ ID NO: 27) 5'-GCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3'
  • Primer 13 (SEQ ID NO: 28) 5'-CGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCTTTCCCACTGCAGGAGC-3'
  • Primer 12 (SEQ ID NO: 27) 5'-GCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3'
  • AalCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 23) for in vitro DNA cleavage activity was prepared by in vitro transcription using Guide-it TM sgRNA In Vitro Transcription Kit (Takara Bio Inc.). This AalCas9 sgRNA was used to dilute RNase-free Cas9 buffer (20 mM HEPES-Na, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA) to 2 ⁇ M AalCas9 and 2 ⁇ M sgRNA, and left at 25 ° C. for 20 minutes to form a complex, and a second RNP solution was prepared.
  • RNase-free Cas9 buffer (20 mM HEPES-Na, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA
  • Figure 4 is a photograph showing an example of the electrophoresis results of the reaction products in an in vitro DNA cleavage assay.
  • the photograph on the left shows the results when the reaction solution was incubated at 25°C for 60 minutes, and the photograph on the right shows the results when the reaction solution was incubated at 37°C for 60 minutes.
  • Figures 5A and B are graphs showing the time course of AalCas9 activity in an in vitro DNA cleavage assay.
  • the graph in Figure 5A shows the results when the reaction solution was incubated at 25°C
  • the graph in Figure 5B shows the results when the reaction solution was incubated at 37°C.
  • sgRNA for genome editing experiments in Arabidopsis protoplasts: The following known sgRNA (SEQ ID NO: 29) containing the PAM sequence ACGN on the Arabidopsis thaliana PDS3 gene was prepared by in vitro transcription using Guide-it TM sgRNA In Vitro Transcription Kit (Takara Bio). Using this sgRNA, 10 ⁇ M AalCas9, 20 ⁇ M sgRNA was diluted with RNase-free Cas9 buffer (20 mM HEPES-Na, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM EDTA) to form a complex at 25 ° C. for 20 minutes to prepare a third RNP solution. In addition, in SEQ ID NO: 29, the poly N on the 5'-end side is omitted.
  • PDS3 sgRNA (SEQ ID NO: 29) 5'-GUAGCGAGUAAUCGUGAAGUAGAGAAACAGGGUUUUAGUACUCUGCGAAAUUUAGUGAAACUAGAUUUCGCAGAACUAUUUCAUUAAAACAAGGCUUUAUGCCGUAUUUAAAACUCCAUCCUAUGGGUGGGGGUAUUUUU-3'
  • SpyCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 30) having the following known sequence was also prepared, and an RNP complex was formed in the same manner as AalCas9 to prepare a fourth RNP solution. Note that in SEQ ID NO: 30, the polyN on the 5' end is omitted.
  • SpyCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 30) 5'-GGACUUUUGCCAGCCAUGGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUU-3'
  • the protoplasts were filtered through a nylon filter with a pore size of 70 ⁇ m, collected in a 50 mL tube, and centrifuged at 100 ⁇ g for 10 minutes to recover the protoplasts. The supernatant was discarded, and the protoplasts were resuspended in 150 mM NaCl, 125 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, and 2 mM MES (pH 5.7) buffer (W5 buffer). The resuspended protoplasts were centrifuged at 100 ⁇ g for 5 minutes, and then resuspended in the same buffer. After washing with this buffer twice, the protoplasts were incubated at 4° C. for 10 minutes.
  • the protoplasts were centrifuged at 100 ⁇ g for 5 minutes, and then resuspended in 400 mM mannitol, 15 mM MgCl 2 , and 4 mM MES (pH 5.7) buffer. Thereafter, the protoplasts were collected by centrifugation at 100 ⁇ g for 5 minutes, and the cell concentration was adjusted to 2.0-3.0 ⁇ 10 5 cells/mL with the same buffer to obtain a protoplast suspension for transformation.
  • the collected genomic DNA was suspended in sterile water, and a PCR reaction was carried out using a primer set consisting of the following primer 14 (SEQ ID NO: 31) and primer 15 (SEQ ID NO: 32) for AalCas9, and a primer set consisting of the following primer 16 (SEQ ID NO: 33) and primer 17 (SEQ ID NO: 34) for SpyCas9, to amplify a DNA fragment of about 300 bp.
  • the resulting DNA fragment of approximately 300 bp was subjected to next-generation sequencing analysis using the iSeq100 system (Illmina) to detect the presence or absence of genome editing.
  • Primer 16 (SEQ ID NO: 33) 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAAAATAATTAAAGTTGTTGCTGTTGG-3'
  • Primer 17 (SEQ ID NO: 34) 5'-GTCTCGTGGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTAGCCTAACTTGCCTGCTTTTC-3'
  • Figures 6A and 6B show the results of genomic DNA editing of Arabidopsis thaliana protoplast cells using AalCas9.
  • Figure 6A shows the editing rate for each target DNA
  • Figure 6B shows mutated DNA analyzed by a next-generation sequencer.
  • sequence (SEQ ID NO: 37) in which the Arabidopsis U6 promoter sequence was added to the sgRNA of AalCas9 for Arabidopsis mutation introduction designed to easily introduce the target sequence was incorporated into pCA-NLS-AalCas9-NLS by a known method, to prepare pCA-NLS-AalCas9-NLS-U6-Bsa1-gRNA.
  • This pCA-NLS-AalCas9-NLS-U6-Bsa1-gRNA was cleaved with Bsa1, and the following oligonucleotide G (SEQ ID NO: 38) and oligonucleotide H (SEQ ID NO: 39) containing a part of the Arabidopsis-derived PDS3 gene sequence and its complementary sequence phosphorylated at the 5' end were mixed and ligated with a double-stranded DNA fragment annealed thereto.
  • the resulting ligation solution was transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ , and the clones were selected on an LB agar plate containing 50 ⁇ g/mL spectinomycin, after which the plasmid was purified from the clones carrying the desired recombinant plasmid (pCA-NLS-AalCas9-NLS-U6-PDS3-gRNA).
  • the obtained bacteria were cultured for 2 days in LB medium containing 20 mL of antibiotics (50 ⁇ g/mL spectinomycin, 25 ⁇ g/mL gentamicin, and 50 ⁇ g/mL rifampicillin), and the bacteria were collected and suspended in 30 mL of infiltration medium.
  • antibiotics 50 ⁇ g/mL spectinomycin, 25 ⁇ g/mL gentamicin, and 50 ⁇ g/mL rifampicillin
  • Arabidopsis wild-type strain Col-0 was grown for 45-60 days until it flowered, and then grown for another 10 days after cutting the main stem before being used for transformation.
  • Arabidopsis was infected by dropping an infiltration medium containing a suspension of cells into which the transformation vector had been introduced, and grown as normal to harvest T1 seeds. The T1 seeds were then sterilized with 50% bleach and 0.02% Triton X-100 solution for 7 minutes, rinsed three times with sterile water, and sown on MS selection medium containing 25 ⁇ g/mL hygromycin.
  • the collected genomic DNA was suspended in sterile water, and a DNA fragment of about 300 bp amplified using a primer set consisting of the following primer 14 (SEQ ID NO: 31) and primer 15 (SEQ ID NO: 32) was subjected to NGS analysis using the iSeq100 system (Illmina Co., Ltd.) to detect genome editing.
  • Primer 14 (SEQ ID NO: 31) 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGAAAAGAATCATATGGTCATCAATTCG-3'
  • Primer 15 (SEQ ID NO: 32) 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGGACTTGAATTAAAGGGGCTATAGTAG-3'
  • Figure 7 shows the editing efficiency (maximum value 1) of each base in the PDS3 gene detected in each T1 individual number as a result of genomic DNA analysis of leaves of Arabidopsis thaliana T1 individuals transformed with pCA-NLS-AalCas9-NLS-U6-PDS3-gRNA using the above procedure.
  • a sequence (SEQ ID NO: 40) in which a human-derived U6 promoter sequence was added to the AalCas9 sgRNA designed to facilitate the introduction of the target sequence was inserted into pCMV-NLS-AalCas9-NLS using a known method to produce pCMV-NLS-AalCas9-NLS-U6-Bbs1-gRNA.
  • the resulting pCMV-NLS-AalCas9-NLS-U6-Bbs1-gRNA was cleaved with Bbs1, and a double-stranded DNA fragment annealed with the following oligonucleotide I (SEQ ID NO: 41) and oligonucleotide J (SEQ ID NO: 42), which contain a portion of the human-derived AAVS1 gene sequence and have phosphorylated 5' ends, was mixed and ligated to the resulting fragment.
  • Oligonucleotide I (SEQ ID NO:41): 5'-pCACCCTGCAGCACCAGGATCAGTG-3'
  • Oligonucleotide J (SEQ ID NO: 42): 5'-pAAACACTGATCCTGGTGCTGCAG-3'
  • the resulting ligation solution was transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ , and the clones were selected on an LB agar plate containing 100 ⁇ g/mL ampicillin, after which the plasmid was purified from the clones carrying the desired recombinant plasmid (pCMV-NLS-AalCas9-NLS-U6-hAAVS1-gRNA).
  • AalCas9 expression vector into human cultured cells
  • the pCMV-NLS-AalCas9-NLS-U6-hAAVS1-gRNA prepared in (1) above was mixed with Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), transfected into HEK293FT cells (about 10 4 cells) cultured in a 96-well plate, and cultured for 3 days.
  • the transfected HEK293FT cells were collected and disrupted by mixing with 0.1 N NaOH.
  • NGS analysis of genomic DNA The HEK293FT cells cultured as described above were collected and disrupted by mixing with 0.1 N NaOH. A portion of the disrupted solution and a primer set consisting of primer 18 (SEQ ID NO: 43) and primer 19 (SEQ ID NO: 44) were used to amplified an approximately 300 bp DNA fragment. NGS analysis was performed using an iSeq100 system (Illmina) to detect genome editing due to deletion of the target sequence.
  • Illmina iSeq100 system
  • Primer 18 (SEQ ID NO:43): 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAACTGCTTCTCCTCTTGGGA-3'
  • Primer 19 (SEQ ID NO:44): 5'-GTCTCGTGGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCAGATTCCTTATCTGGTGACACA-3'
  • the Abyssicoccus albus-derived Cas9 of the present invention can be widely used in various industrial fields involving genome variants, such as agriculture, the pharmaceutical industry, and the enzyme industry.

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Abstract

真核細胞ゲノム内の新たなＰＡＭ配列を認識して当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能な、新たなゲノム編集手段を提供する。本方法は、真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、前記真核細胞中に、 （１）配列番号１に記載の塩基配列５'－ＮＮＡＣＮＮ－３'（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、 （２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸 を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む。

Description

ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物
　本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細にはゲノム編集の分野に関する。より具体的に、本発明は、真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための新たなゲノム編集方法および当該方法に用いられるゲノム編集用組成物等のゲノム編集手段に関する。
　ゲノム編集技術として、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質を利用することが知られている。中でも近年では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins）システムをゲノム編集に応用する技術が盛んに開発され、利用されている。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにはＩ型、II型、およびIII型があるが、ゲノム編集で最も多く用いられているのはII型である。II型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease：ＲＧＮ）ＲＧＮとして、Ｃａｓ９と呼ばれるヌクレアーゼを用いる。Ｃａｓ９は様々な真核細胞（例えば魚、植物、ヒト等）のゲノムを操作するのに使用されてきた（非特許文献１）。Ｃａｓ９は、一般的にはガイドＲＮＡとの複合体として用いられる。Ｃａｓ９とガイドＲＮＡとの複合体を細胞内に導入することにより、様々な動植物において標的遺伝子を変異させることができる。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成することにより、活性を有するエンドヌクレアーゼとして機能し、侵入したファージまたはプラスミド中の外来遺伝因子を切断する。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有する短いｓｇＲＮＡを合成するだけで利用可能である上に、特にII型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、単一のタンパク質であるＣａｓ９を用いてゲノム編集が可能であるという利点がある。
　Ｃａｓ９は、ＤＮＡ中のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ：protospacer adjacent motif）配列を認識し、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。Ｃａｓ９が認識するＰＡＭ配列の長さや塩基配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌種によってさまざまである。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（略称ＳｐｙＣａｓ９）は、５’－ＮＧＧ－３’という３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列の上流を切断できる（特許文献１）（なお、別途明記しない限り、本明細書における塩基配列中の「Ｎ」は任意の塩基を表す。）。また、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）は２種類のＣａｓ９を有し、それぞれ５’－ＮＧＧＮＧ－３’又は５’－ＮＮＡＧＡＡ－３’という５～６塩基の配列をＰＡＭ配列として認識する（特許文献２）。
国際公開第２０１４／０９３６６１号 特表２０１５－５１０７７８号公報
Charpentier and Doudna, Nature, 2013, 495:50-51
　このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは優れたゲノム編集手段ではあるが、その汎用性を高めるために、認識可能なＰＡＭ配列の多様化が求められている。
　本発明は上記課題に鑑みてなされたもので、その目的は、真核細胞ゲノム内の新たなＰＡＭ配列を認識して当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能な、新たなゲノム編集手段を提供することである。
　本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった結果、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’を含む新たなＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を見出し、斯かるＣａｓタンパク質をガイドＲＮＡと共に、標的ＤＮＡ配列をゲノム内に含む真核細胞内で発現させることで、新たな標的ＤＮＡ配列に基づく真核細胞ゲノムの部位特異的な改変が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
［項１］真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、
前記真核細胞中に、
（１）配列番号１に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
（２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む方法。
［項２］前記Ｃａｓタンパク質が、アビシコッカス（Abyssicoccus）属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来する、項１に記載の方法。
［項３］前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項１または２に記載の方法
［項４］前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項１～３の何れか一項に記載の方法。
［項５］前記Ｃａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、項１～４の何れか一項に記載の方法。
［項６］前記ＰＡＭ配列が、配列番号２に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’または配列番号３に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’を含む、項１～５の何れか一項に記載の方法。
［項７］前記ガイドＲＮＡが、１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であると共に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項１～６の何れか一項に記載の方法。
［項８］前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ相補鎖と二本鎖を形成することが可能な１５～３０ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、項７に記載の方法。
［項９］前記ｃｒＲＮＡが、１２～３６ヌクレオチド長のステムループを含む、項７又は８に記載の方法。
［項１０］前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、項１～９の何れか一項に記載の方法。
［項１１］前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、項１～１０の何れか一項に記載の方法。
［項１２］項１～１１の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
［項１３］前記のガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を更に含む、項１２に記載の組成物。
　本発明のゲノム編集方法によれば、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’を含む新たなＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を用いることにより、新たな標的ＤＮＡ配列に基づく真核細胞ゲノムの部位特異的な改変が可能となる。
図１は、実施例１におけるＡａｌＣａｓ９タンパク質生産用ベクターの構成を模式的に示す図である。 図２は、実施例２及び実施例３におけるｓｇＲＮＡの塩基配列（配列番号２３）及び構成を示す図である。 図３は、実施例２におけるＰＡＭドメインの解析結果を示すグラフである。 図４は、実施例３におけるインビトロＤＮＡ切断アッセイによる反応産物の電気泳動結果の例を示す写真である。左の写真は、反応溶液を２５℃で６０分間インキュベートした場合の結果を、右の写真は、反応溶液を３７℃で６０分間インキュベートした場合の結果をそれぞれ示している。 図５Ａ及びＢは、実施例３におけるインビトロＤＮＡ切断アッセイによるＡａｌＣａｓ９活性の経時変化を示すグラフである。図５Ａのグラフは、反応溶液を２５℃でインキュベートした場合の結果を、図５Ｂのグラフは、反応溶液を３７℃でインキュベートした場合の結果をそれぞれ示す。 図６Ａ及びＢは、実施例４におけるＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナプロトプラスト細胞のゲノムＤＮＡ編集結果を示す図である。図６Ａは、標的ＤＮＡ毎の編集率を、図６Ｂは、次世代シーケンサーによる変異ＤＮＡをそれぞれ示している。 図７は、実施例５におけるＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナ植物体のゲノムＤＮＡ編効率を示す図である。 図８は、実施例６におけるＡａｌＣａｓ９によるヒト培養細胞ＨＥＫ２９３ＦＴのゲノム編集効率を示す図である。
　以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
　なお、本発明において引用される特許文献（特許出願公開公報および特許公報等）並びに非特許文献は、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれるものとする。
　また、本発明において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
　また、以下に説明するタンパク質または遺伝子のうち、公知のタンパク質または遺伝子の各配列に関する情報は、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。
　また、別途記載する場合を除き、本明細書において、塩基配列中の「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミンをそれぞれ意味し、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味する。
・ゲノム編集方法：
　本発明の一側面は、真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集方法（以下適宜「本発明のゲノム編集方法」又は「本発明の方法」と略称する。）に関する。本方法は、真核細胞中に、
（１）特定のＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
（２）ガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含むことを主な特徴とする。
・細胞：
　本明細書において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されないが、好ましくは真核細胞が使用される。原核細胞の例としては、細菌、古細菌が挙げられる。真核細胞の例としては、微生物細胞、植物細胞、動物細胞が挙げられる。微生物細胞としては、酵母、真菌、原生動物等の各種微生物に由来する細胞が挙げられる。植物細胞としては、種子植物、シダ・コケ類、藻類等の各種植物に由来する細胞が挙げられる。動物細胞としては、脊椎動物（哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）、節足動物（昆虫等）、軟体動物等の各種動物に由来する細胞が挙げられる。特に哺乳動物細胞の具体例としては、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞等が挙げられる。細胞の態様も特に制限されず、生体内（インビボ）細胞、培養細胞（インビトロ）、初代培養細胞（インビトロおよびエクスビボ）、移植細胞等の何れの態様であってもよい。斯かる各種の細胞は、当該技術分野において一般的に使用される。
・ゲノム編集：
　本明細書において「ゲノム編集」とは、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質等を用いて、各種細胞内のゲノム上の標的部位に所望の改変を導入することにより、ゲノムを編集する技術を意味する。ここで「改変」の例としては、限定されるものではないが、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して遺伝子を破壊すること、ゲノム上の標的部位のＤＮＡ断片を挿入又は置換すること、点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変すること等が挙げられる。ここで「標的部位」とは、ゲノム編集の対象となる真核細胞のゲノム内の所定の部位を意味する。ここで「切断」とは、ヌクレオチド分子の共有結合性の主鎖の切断を指す。
　ゲノム編集の標的部位は、後述する部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質の種類に応じて適切に選択することが可能である。例えば、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質としてＣａｓタンパク質の一種であるＣａｓ９を使用する場合、ゲノム編集の標的部位としては、ＰＡＭ配列およびその５’側に隣接する所定塩基長（例えば２０塩基程度）の配列からなるＤＮＡ鎖（標的鎖）とその相補ＤＮＡ鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムＤＮＡ上の部位とすることが好ましい。
　ゲノム編集の対象となるゲノム上の標的部位は特に限定されないが、例としては、真核細胞ゲノム上の遺伝子であって、その改変や破壊等が望まれる遺伝子の一部又は全部、或いはその遺伝子と重複又は隣接する領域等が挙げられる。
　ゲノム編集の対象となる遺伝子の具体例としては、１次代謝（アミノ酸等）関連遺伝子、２次代謝（フラボノイド、ポリフェノール等）関連遺伝子、糖代謝関連遺伝子、脂質代謝関連遺伝子、有用物質（医薬、酵素、色素、芳香成分等）生産関連遺伝子、収量性（数、大きさ等）、開花関連遺伝子、耐病虫性関連遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、塩、光障害、紫外線）耐性関連遺伝子等が挙げられる。
・Ｃａｓタンパク質：
　本明細書において「Ｃａｓタンパク質」とは、細菌および古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーに属するタンパク質であり、ＰＡＭ配列を認識して、その上流又は下流で二本鎖ＤＮＡを切断する標的特異的エンドヌクレアーゼである。Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease：ＲＧＮ）であり、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを構成する。該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを標的細胞内に導入又は構築することにより、ガイドＲＮＡがゲノム内の標的部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたＣａｓタンパク質によって標的部位のＤＮＡを切断することができる。
　本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（配列番号１）を含む特定のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識することを特徴とする。中でも、５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’（配列番号２）または５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’（配列番号３）を含む特定のＰＡＭ配列を認識することが好ましい。
　本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、上記の特定のＰＡＭ配列を認識できるものであれば、その種類は限定されるものではなく、任意の種類のＣａｓタンパク質を使用可能であるが、中でもＣａｓ９であることが好ましい。
　本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、天然タンパク質であってもよいが、組換えタンパク質であってもよい。
　本発明に使用されるＣａｓタンパク質の起源（由来）は、限定されるものではないが、アビシコッカス（Abyssicoccus）属の細菌に由来するＣａｓタンパク質が好ましく、中でもアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来するＣａｓ９であるＡａｌＣａｓ９が好ましい。野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
　本発明にＡａｌＣａｓ９を使用する場合、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する野生型ＡａｌＣａｓ９であってもよいが、その活性（例えば後述のエンドヌクレアーゼ活性）を損なわない限りにおいて、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１又は２以上の変異を有する、変異型ＡａｌＣａｓ９であってもよい。具体的に、斯かる変異型ＡａｌＣａｓ９は、配列番号４に記載の野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列に対して、１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列を有すると共に、ＡａｌＣａｓ９タンパク質と同等又はそれ以上の活性（例えば後述のエンドヌクレアーゼ活性）を有するタンパク質であることが好ましい。中でも、斯かる変異型のＡａｌＣａｓ９タンパク質は、その親となる配列番号４に記載の野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列と、例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。
　ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」（similarity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基又は類似の（すなわち、物理化学的性質が類似する）アミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。
　本発明に使用されるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有し、真核細胞内で上記Ｃａｓタンパク質を発現することが可能な核酸であれば、制限されるものではない。斯かる核酸は、所望のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列情報を基に、適宜作製することが可能である。なお、当該核酸は化学合成等により作製してもよい。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸としては、配列番号４の野生型ＡａｌＣａｓ９をコードする核酸、及び、配列番号４の野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列に対して、例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸が挙げられる。例として、アビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）において配列番号４の野生型ＡａｌＣａｓ９をコードする野生型ＡａｌＣａｓ９遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、当該核酸を導入する真核細胞の翻訳系に合わせてコドンが最適化されたものであってもよい。例として、野生型ＡａｌＣａｓ９遺伝子の塩基配列を大腸菌に合わせてコドン最適化した塩基配列を配列番号６に、ヒトに合わせてコドン最適化した塩基配列を配列番号７に、シロイヌナズナに合わせてコドン最適化した塩基配列を配列番号８にそれぞれ示す。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸としては、上記の各種の塩基配列、例えば配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載の塩基配列に対して、例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸も挙げることができる。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、前記タンパク質または核酸を真核細胞において核輸送によって核中に輸送するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含むことができる。当該ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の５’末端側または３’末端側の何れか一方のみに付加されていてもよく、あるいは５’末端側および３’末端側の両方に付加されてもよい。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、プロモーターやターミネーター等の調節配列と作用可能に連結された発現カセットの状態で、ベクターに組み込まれていてもよい。
・エンドヌクレアーゼ活性：
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、標的となるＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有することが好ましい。
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質は、限定されるものではないが、例えば１０℃から８０℃の範囲の温度で、好ましくは２０℃から５０℃の範囲の温度で、さらに好ましくは２５℃から４０℃の範囲の温度で、標的ＤＮＡの切断または改変活性を有する。
・ＰＡＭ配列：
　本発明に用いられるＣａｓタンパク質は、特定のＰＡＭ配列を認識する。本明細書において、「ＰＡＭ配列」（プロトスペーサー隣接モチーフ配列）とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列である。Ｃａｓタンパク質が認識可能なＰＡＭ配列の長さや塩基配列は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。
　前述のように、本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（配列番号１）を含む特定のＰＡＭ配列を認識する。中でも、５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’（配列番号２）または５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’（配列番号３）を含む特定のＰＡＭ配列を認識することが好ましい。
・ガイドＲＮＡ：
　ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質等の部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質をゲノム上の標的核酸の標的部位に誘導（ガイド）する機能を有するＲＮＡである。部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質は、通常は斯かるガイドＲＮＡと結合して、リボ核タンパク質又はリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成する。ここで、ガイドＲＮＡがゲノム上の標的部位をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質等の部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質がゲノム上の標的部位のＤＮＡを開裂することで、ゲノム上の標的部位のＤＮＡ配列を変更又は改変することができる。
　ガイドＲＮＡの構造は、通常は部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質の種類に応じて選択される。例えば、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質としてＣａｓタンパク質を使用する場合、ガイドＲＮＡは通常、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性に関与するｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）配列と、ゲノム上の標的部位に結合するｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating crRNA）配列とを含む。この場合、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとが相補的に結合してなるＲＮＡ複合体であってもよい。
　ｃｒＲＮＡ配列は、リピート配列およびスペーサー配列を含む。スペーサー配列は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖または実質的な相補鎖（標的配列に対して完全に一致していないが、標的配列に結合できる配列）と２本鎖を形成できる配列である。ｃｒＲＮＡ配列は、斯かるスペーサー配列を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的認識を行うことができる。スペーサー配列の長さは、限定されるものではないが、例えば１５～３０ヌクレオチド長、１８～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、２０～２２ヌクレオチド長、特に２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチドであることが好ましい。ｃｒＲＮＡ配列の長さは制限されないが、例えば１２～３６塩基長程度のステムループを含む配列とすることができる。
　ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、高繰り返し領域と、その後に続く１つまたは２つ以上（好ましくは２つ以上）のヘアピン構造とを含み、複数のステムループを形成可能な配列である。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の長さは制限されないが、例えば５０～１００塩基長程度の配列とすることができる。
　本発明に用いられるガイドＲＮＡの構成は、ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能であれば、特に制限されない。本発明に使用されるＣａｓタンパク質及びそれが認識するＰＡＭ配列、並びに改変の対象となる真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列等に応じて、適切に設計すればよい。斯かるガイドＲＮＡの設計については、これまで多くの知見が存在しており（一例を挙げれば、国際公開第２０１３／１４２５７８号、同第２０１３／１７６７７２号、及び同２０１４／０９３５９５号等）、当業者であればこれらの知見を適宜参酌しながら、本発明に任意の変更を加えて実施することが可能である。
　ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ等の核酸を用いる場合、その構成も特に制限されない。本発明に使用されるガイドＲＮＡの配列及び構成、並びに改変の対象となる真核細胞の種類等に応じて、適切なＤＮＡを設計すればよい。特にｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを用いる場合、ｃｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとを独立した分子として用意してもよく、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方をコードする一体のＤＮＡ分子を用いてもよい。
　なお、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ等の核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸とは独立した分子であってもよく、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と一体の分子となっていてもよい。また、ガイドＲＮＡをコードする核酸が単独で、或いはＣａｓタンパク質をコードする核酸と共に、プロモーターやターミネーター等の調節配列と作用可能に連結された発現カセットの状態で、ベクターに組み込まれてもいてもよい。
・標的ＤＮＡ配列：
　一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける部位特異的改変の対象となる標的ＤＮＡ配列は制限されず、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＲＮＡ配列、または一本鎖ＤＮＡ配列のいずれであってよい。但し、本発明では、真核細胞のゲノム内の二本鎖ＤＮＡ配列が標的配列となる。中でも通常は、ゲノム内のＤＮＡ配列のうち、Ｃａｓタンパク質が認識するＰＡＭ配列の近傍に位置するＤＮＡ配列が、標的ＤＮＡ配列として選択される。
・ゲノム編集の手順：
　本発明の方法は、部位特異的改変の対象となる標的ＤＮＡ配列をゲノム内に含む真核細胞中に、前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸とを導入することにより実施される。これにより、ガイドＲＮＡが真核細胞ゲノム内の標的ＤＮＡ部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたＣａｓタンパク質によって当該真核細胞のゲノムを標的ＤＮＡ部位で切断し、当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能となる。
　前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸とを、真核細胞内に導入する手法は特に制限されない。例としては、これらに限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リポソーム、ウイルスベクター、ナノ粒子、ウイスカー結晶、ＰＴＤ（タンパク質転移ドメイン）融合タンパク質を使用した手法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法等、当該技術分野において既知の様々な方法が挙げられる。
　前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸とを細胞に導入した際、当該細胞を細胞増殖に適した条件下で培養すればよい。当該培養条件は、細胞が由来する生物種に適した培養条件であればよく、例えば、当業者が既知の細胞培養技術に基づいて決定することができる。
・その他：
　以上、本発明のゲノム編集方法について説明したが、斯かるゲノム編集方法に使用される各種のゲノム編集手段、例えば前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸や、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸も、本発明に含まれるものとする。
　また、本発明の一側面によれば、本発明のゲノム編集方法に使用するためのゲノム編集用組成物及びゲノム編集用キットも提供される。ゲノム編集用組成物は、少なくとも前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸を含むと共に、任意により更に前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を含む組成物である。ゲノム編集用キットは、少なくとも前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸を含む容器と、その使用方法を記載した指示書を含むと共に、任意により更に前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を含む容器を含むキットである。斯かるＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸や、ガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸の詳細は、上述したとおりである。
　なお、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いたゲノム編集については、これまで多くの知見が存在しており（一例を挙げれば、国際公開第２０１３／１４２５７８号、同第２０１３／１７６７７２号、及び同２０１４／０９３５９５号等）、当業者であればこれらの知見を適宜参酌しながら、本発明に任意の変更を加えて実施することが可能である。なお、前述したように、これらの特許文献はその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれるものとする。
　以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。なお、上述のように「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味する。
［実施例１］アビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９タンパク質の作製：
（１）アビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９遺伝子の調製：
　配列番号４に記載のアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）由来のアミノ酸配列の情報を基に、当該Ｃａｓタンパク質をコードする配列番号５に記載のＤＮＡ配列を人工合成した。当該ＤＮＡ配列はＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。また、斯かるアビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９遺伝子を、大腸菌コドンについて最適化したＤＮＡ配列（配列番号６）、ヒトコドンについて最適化したＤＮＡ配列（配列番号７）、及び、シロイヌナズナについて最適化したＤＮＡ配列（配列番号８）も、それぞれ合成した。塩基配列の決定にはサンガー法又は次世代シーケンス法を用いた。なお、ＡａｌＣａｓ９タンパク質は、ＳｐｙＣａｓ９（１３６８アミノ酸）などの他のＣａｓ９オルソログと比べて、比較的小さな（１０５９アミノ酸）であった。
（２）大腸菌発現用ベクターの構築
　以下に詳述する手順により、大腸菌コドンについて最適化した配列番号６のＡａｌＣａｓ９遺伝子に、公知のＮ末端核移行シグナル配列、Ｃ末端核移行シグナル配列、およびＨｉｓ－ｔａｇを付加し、ｐＥＴベクターに組み込んだＡａｌＣａｓ９生産用ベクターを構築した。当該ベクターの構成を図１に模式的に示す。
　まず、下記のプライマー１（配列番号９）およびプライマー２（配列番号１０）を用い、ｐＥＴ２６ｂベクターを鋳型として、ＰＣＲ反応によりリニアＤＮＡの増幅を行った。
・プライマー１（配列番号９）：
５’－ＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧ－３’
・プライマー２（配列番号１０）：
５’－ＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣ－３’
　別途、大腸菌用にコドン最適化したＡａｌＣａｓ９遺伝子（配列番号６）の５’末端および３’末端に対して、それぞれ以下のオリゴヌクレオチドＡ（Ｎ末端核移行シグナル配列、配列番号１１）およびオリゴヌクレオチドＢ（Ｃ末端核移行シグナル配列、配列番号１２）を付加したＤＮＡ断片を調製した。
・オリゴヌクレオチドＡ（Ｎ末端核移行シグナル配列、配列番号１１）：
５’－ＣＧＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡ－３’
・オリゴヌクレオチドＢ（Ｃ末端核移行シグナル配列、配列番号１２）：
５’－ＧＣＧＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧ－３’
　上記得られた大腸菌コドン最適化ＡａｌＣａｓ９遺伝子を含むＤＮＡ断片を、先に得られたｐＥＴベクターのＰＣＲ増幅産物と混合し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。
　得られた環状プラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、その中から目的の環状プラスミド（ｐＥＴ－ＡａｌＣａｓ９）をＡａｌＣａｓ９生産用ベクターとして作製した。
（３）ＡａｌＣａｓ９の調製：
　得られたプラスミドベクターｐＥＴ－ＡａｌＣａｓ９を、常法により大腸菌ＲＯＳＥＴＴＡ２（ＤＥ３）ｐＬＹＳＳ株に導入した。得られた組換株を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、ＯＤ値０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；ＩＰＴＧ）（終濃度０．２５ｍＭ）を添加し、２０℃で２０時間培養した。培養後、当該大腸菌を遠心分離（８，０００ｇ、１０分間）により回収した。回収した菌体を緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（１２，０００ｇ、３０分間）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ－アフィニティカラム、次にＨｅｐａｒｉｎアフィニティカラムを用いて精製した後、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ グリセロール）で平衡化したゲルろ過カラムにより精製した。精製したタンパク質は遠心式限外ろ過フィルターユニット（メルクミリポア）を用いて濃縮することにより、ＡａｌＣａｓ９を取得した。このようにして得られたＡａｌＣａｓ９は－８０℃で保存した。
［実施例２］ＰＡＭ配列の同定：
（１）プラスミドライブラリーの作製：
　ＡａｌＣａｓ９遺伝子のＰＡＭ配列を同定するために、以下の手順でプラスミドライブラリーを作製した。
　まず、市販のｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１で切断した断片に、公知のイネ由来ＰＤＳ（phytoene desaturase）遺伝子配列の一部（５’－ＧＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧ－３’）を含む５’末端をリン酸化した以下のオリゴヌクレオチドＣ（配列番号１３）およびオリゴヌクレオチドＤ（配列番号１４）をアニーリングした２本鎖ＤＮＡフラグメントを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてライゲーションした。
・オリゴヌクレオチドＣ（配列番号１３）：
５’－ｐＧＡＴＣＧＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧ－３’
・オリゴヌクレオチドＤ（配列番号１４）：
５’－ｐＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＡＡＣ－３’
　得られたライゲーション溶液を用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有するクローンからプラスミドを精製した（ｐＵＣ１８－ＯｓＰＤＳ）。
　精製したｐＵＣ１８－ＯｓＰＤＳを鋳型とし、以下のプライマー３（配列番号１５）およびプライマー４（配列番号１６）を用いて第１のＰＣＲ反応を実施し、増幅されたＤＮＡ断片を含む第１のＰＣＲ増幅産物を取得した。
・プライマー３（配列番号１５）
５’－ＡＣＡＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧ－３’
・プライマー４（配列番号１６）
５’－ＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣ－３’
　また、同じく精製したｐＵＣ１８－ＯｓＰＤＳを鋳型とし、ＮＧＳ解析に用いるアダプター配列を含む以下のプライマー５（配列番号１７）およびプライマー６（配列番号１８）を用いて第２のＰＣＲ反応を実施し、増幅されたＤＮＡ断片を含む第２のＰＣＲ増幅産物を取得した。
・プライマー５（配列番号１７）
５’－ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＧＧ－３’
・プライマー６（配列番号１８）
５’－ＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧ－３’
　得られた第１および第２のＰＣＲ増幅産物を混合し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。環状化したプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有するクローンからプラスミドを精製した（ｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ）。
　得られたプラスミドｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳに、以下のオリゴヌクレオチドＥ（配列番号１９）およびオリゴヌクレオチドＦ（配列番号２０）を混合後、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて２本鎖ＤＮＡフラグメントを調製した。なお、オリゴヌクレオチドＦには、７つの塩基Ｎからなるランダム配列が含まれている。
・オリゴヌクレオチドＥ（配列番号１９）：
５’－ＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧ－３’
・オリゴヌクレオチドＦ（配列番号２０）：
５’－ＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＮＮＮＮＮＮＮＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣ－３’
　精製したｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳを鋳型とし、以下のプライマー７（配列番号２１）およびプライマー８（配列番号２２）を用いてＰＣＲ反応を実施し、増幅されたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ増幅産物を取得した。
・プライマー７（配列番号２１）：
５’－ＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣ－３’
・プライマー８（配列番号２２）：
５’－ＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣ－３’
　得られたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ増幅産物と、調製したランダム配列を含む２本鎖ＤＮＡフラグメントとを混合し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。
　得られた環状化プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有する約１０万コロニーをまとめて培養し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＥＸｔｒａ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ（日本ジェネティクス）を用いて、プラスミドライブラリーｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ－７Ｎシリーズを作製した。
（２）プラスミドライブラリー切断用のＲＮＰの調製：
　プラスミドライブラリーｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ－７Ｎ切断用のＡａｌＣａｓ９のｓｇＲＮＡ（配列番号２３）を、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔＴＭ ｓｇＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて試験管内転写により調製した。ＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの構成を図２に、塩基配列を配列番号２３に示す。なお、配列番号２３では、５’末端側のポリＮは省略して示している。このＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを用いて、２．５μＭ ＡａｌＣａｓ９、１２．５μＭ ｓｇＲＮＡとなるように、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅのＣａｓ９バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２５℃で２０分間放置して、複合体を形成させ、第１のＲＮＰ溶液を調製した。
・ＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ（配列番号２３）
５’－ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＣＧＡＡＡＵＵＵＡＧＵＧＡＡＡＡＣＵＡＧＡＵＵＵＣＧＣＡＧＡＡＵＣＵＡＵＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＵＵＵＡＵＧＣＣＧＵＡＵＵＵＡＡＣＵＣＣＡＵＣＣＵＡＵＧＧＧＵＧＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＵ－３’
（３）ＮＧＳ解析を用いたＰＡＭ配列の同定：
　上記（２）で調製した第１のＲＮＰ溶液に、濃度２０ｎＭとなるようにプラスミドライブラリーとＣａｓ９バッファーを加え、３０℃で２時間酵素反応させた。反応溶液に、濃度６０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加え、６０℃で５分間インキュベート後、アガロース電気泳動にて、未切断のプラスミドを精製した。
　精製した未切断プラスミドを鋳型として、以下のプライマー９（配列番号２４）およびプライマー１０（配列番号２５）を用いてＰＣＲ反応を実施し、ランダム配列を含む約３７０ｂｐの２本鎖ＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ増幅産物を取得した。
・プライマー９（配列番号２４）
５’－ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ－３’
・プライマー１０（配列番号２５）
５’－ＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧ－３’
　前記の２本鎖ＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ増幅産物を、濃度２００ｎＭとなるようにＣａｓ９バッファーで希釈し、上記（２）の第１のＲＮＰ溶液を加え、３７℃で３０分間酵素反応させた。反応溶液は上記と同様にアガロース電気泳動し、未切断の２本鎖ＤＮＡフラグメントを精製した。精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントは次世代シーケンサ（ＮＧＳ）によるＤＮＡ配列解析のサンプルとして使用した。
　精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントおよびＲＮＰ未処理のプラスミドライブラリーは、Ｈｉｓｅｑ（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によるＮＧＳ解析を行い、ランダム領域に含まれる配列を検出した。精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントのランダム領域に含まれる配列とＲＮＰ未処理のプラスミドライブラリーに含まれる配列を比較し、精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントで検出頻度が１／１０に低下した配列に共通する配列を抽出することで、ＡａｌＣａｓ９のＰＡＭ配列をＮＮＡＣＧＮと特定した（図３）。
［実施例３］インビトロでのＤＮＡ切断活性測定：
（１）基質ＤＮＡの調製：
　実施例２で作製したｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ－７Ｎを鋳型に、ＡａｌＣａｓ９のＰＡＭ配列を含む以下のプライマー１１（配列番号２６）とプライマー１２（配列番号２７）からなるプライマーセット、又は、公知のＳｐｙＣａｓ９のＰＡＭ配列を含む以下のプライマー１３（配列番号２８）とプライマー１２（配列番号２７）からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を実施し、各々約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を含むＰＣＲ増幅産物を調製した。調製したＤＮＡ断片はＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ エクストラクションキット（日本ジェネティクス）を用いて精製し、ＤＮＡ切断活性測定の基質として用いた。
＜ＡａｌＣａｓ９用＞
・プライマー１１（配列番号２６）
５’－ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣ－３’
・プライマー１２（配列番号２７）
５’－ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ－３’
＜ＳｐｙＣａｓ９用＞
・プライマー１３（配列番号２８）
５’－ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣ－３’
・プライマー１２（配列番号２７）
５’－ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ－３’
（２）インビトロＤＮＡ切断活性測定用のＲＮＰの調製：
　インビトロＤＮＡ切断活性用のＡａｌＣａｓ９のｓｇＲＮＡ（配列番号２３）を、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔＴＭ ｓｇＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて試験管内転写により調製した。このＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを用いて、２μＭ ＡａｌＣａｓ９、２μＭ ｓｇＲＮＡとなるように、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅのＣａｓ９バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２５℃で２０分間放置して、複合体を形成させ、第２のＲＮＰ溶液を調製した。
（３）インビトロＤＮＡ切断活性測定：
　上記（２）の第２のＲＮＰ溶液に、濃度１μＭ ＲＮＰ、１０ｎＭ 基質ＤＮＡとなるように、基質ＤＮＡとＣａｓ９バッファーを加えた。反応溶液は２５℃および３７℃でインキュベートし、５分後、１０分後、１５分後、３０分後に反応溶液の一部を回収し、濃度が５０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加え、６５℃で５分間インキュベートすることで反応を停止させた。回収した反応液は、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津）を用いて未切断ＤＮＡと切断ＤＮＡを定量し、ＤＮＡ切断活性を測定した。
　図４は、インビトロＤＮＡ切断アッセイによる反応産物の電気泳動結果の例を示す写真である。左の写真は、反応溶液を２５℃で６０分間インキュベートした場合の結果を、右の写真は、反応溶液を３７℃で６０分間インキュベートした場合の結果をそれぞれ示している。図５Ａ及びＢは、インビトロＤＮＡ切断アッセイによるＡａｌＣａｓ９活性の経時変化を示すグラフである。図５Ａのグラフは、反応溶液を２５℃でインキュベートした場合の結果を、図５Ｂのグラフは、反応溶液を３７℃でインキュベートした場合の結果をそれぞれ示す。これらの結果によれば、ＡａｌＣａｓ９は、３７℃では１５分後には８０％以上の基質ＤＮＡを切断し、２５℃では３０分後には約５０％の基質ＤＮＡを切断することが明らかになった。
［実施例４］植物細胞におけるＡａｌＣａｓ９による変異導入：
（１）シロイヌナズナプロトプラストのゲノム編集実験用のＲＮＰ調製：
　下記の公知のシロイヌナズナ由来ＰＤＳ３遺伝子上のＰＡＭ配列ＡＣＧＮを含むｓｇＲＮＡ（配列番号２９）を、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔＴＭ ｓｇＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて試験管内転写により調製した。このｓｇＲＮＡを用いて、１０μＭ ＡａｌＣａｓ９、２０μＭ ｓｇＲＮＡとなるようにＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅのＣａｓ９バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２５℃で２０分間放置して、複合体を形成させ、第３のＲＮＰ溶液を調製した。なお、配列番号２９では、５’末端側のポリＮは省略して示している。
・ＰＤＳ３ ｓｇＲＮＡ（配列番号２９）
５’－ＧＵＡＧＣＧＡＧＵＡＡＵＣＧＵＧＡＡＧＵＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＣＧＡＡＡＵＵＵＡＧＵＧＡＡＡＡＣＵＡＧＡＵＵＵＣＧＣＡＧＡＡＵＣＵＡＵＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＵＵＵＡＵＧＣＣＧＵＡＵＵＵＡＡＣＵＣＣＡＵＣＣＵＡＵＧＧＧＵＧＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＵ－３’
　また、同様の手順にて、下記の公知の配列を有するＳｐｙＣａｓ９のｓｇＲＮＡ（配列番号３０）も調製し、ＡａｌＣａｓ９と同様にＲＮＰ複合体を形成させ、第４のＲＮＰ溶液を調製した。なお、配列番号３０では、５’末端側のポリＮは省略して示している。
・ＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ（配列番号３０）
５’－ＧＧＡＣＵＵＵＵＧＣＣＡＧＣＣＡＵＧＧＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ－３’
（２）シロイヌナズナプロトプラストの調製：
　３０日間生育させたシロイヌナズナの葉より表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を１．０％セルラーゼ－オノズカＲ－１０（ヤクルト社製）、０．２５％ マセロザイムＲ－１０（ヤクルト社製）、１０ｍＭ メルカプトエタノール、４００ｍＭマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）溶液に浸し、２２℃、５０ｒｐｍで振とうしながら、１時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径７０μｍのナイロンフィルターで濾した後、５０ｍＬ容チューブに集め、１００×ｇ、１０分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは１００×ｇ、５分間遠心後、同緩衝液で再度懸濁した。この緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、４℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、１００×ｇ、５分間遠心後、４００ｍＭマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液で再懸濁した。その後、１００×ｇ、５分間遠心することでプロトプラストを回収した後、２．０～３．０×１０５細胞／ｍＬになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。
（３）シロイヌナズナプロトプラストへのＲＮＰ導入：
　上記（２）で得られたプロトプラスト懸濁液３５μＬと前記第３又は第４のＲＮＰ溶液各１０μＬを混合後、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、２００ｍＭ マンニトール、１００ｍＭ ＣａＣｌ２溶液を４５μＬずつ、それぞれ９６穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、９００ｒｐｍ、１５秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は１０分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液２００μＬを勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、１００×ｇ、５分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清２００μＬを捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、２２℃で１８時間静置し、ゲノムＤＮＡへの変異導入を行った。
（４）ゲノムＤＮＡのＮＧＳ解析：
　上記（３）のＲＮＰ導入後、２２℃で１８時間静置したプロトプラスト懸濁液を２００μＬ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合後、９５℃で１０分間インキュベートした後、氷上で５分間静置した。熱処理後のプロトプラスト懸濁液からイソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡは滅菌水で懸濁し、ＡａｌＣａｓ９については以下のプライマー１４（配列番号３１）およびプライマー１５（配列番号３２）からなるプライマーセット、ＳｐｙＣａｓ９については以下のプライマー１６（配列番号３３）およびプライマー１７（配列番号３４）からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を実施し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。得られた約３００ｂｐのＤＮＡ断片について、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）により次世代シーケンス解析を行い、ゲノム編集の有無を検出した。
＜ＡａｌＣａｓ９用＞
・プライマー１４（配列番号３１）
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧ－３’
・プライマー１５（配列番号３２）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＧＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧ－３’
＜ＳｐｙＣａｓ９用＞
・プライマー１６（配列番号３３）
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧ－３’
・プライマー１７（配列番号３４）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＣ－３’
　図６Ａ及びＢは、ＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナプロトプラスト細胞のゲノムＤＮＡ編集結果を示す図である。図６Ａは、標的ＤＮＡ毎の編集率を、図６Ｂは、次世代シーケンサーによる変異ＤＮＡをそれぞれ示している。
　これらの結果によれば、ＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナ細胞のゲノムＤＮＡ編集によれば、標的遺伝子においてヌクレオチドの短～長領域での欠失及び挿入が検出された。ＡａｌＣａｓ９による細胞当たりの変異率は２５．６％であり、ＳｐｙＣａｓ９の場合よりも優れていた。
［実施例５］アグロバクテリウム法によるＡａｌＣａｓ９を用いたシロイヌナズナ植物体のゲノム編集
（１）バイナリーベクターの構築
　ヒトコドンについて最適化されたＡａｌＣａｓ９遺伝子（配列番号５）に、Ｎ末端核移行シグナル配列（配列番号３５）及びＣ末端核移行シグナル配列（配列番号３６）を付加した配列を、ＲＰＳ５ａプロモーター配列並びにＨＳＰターミネーター配列及びＰｅａ３ターミネーター配列で発現制御されるバイナリーベクター（ｐＣＡ）に公知の手法で組み込み、ｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳを作製した。
　次に、ターゲット配列を導入しやすく設計したシロイヌナズナ変異導入用のＡａｌＣａｓ９のｓｇＲＮＡにシロイヌナズナＵ６プロモーター配列を付加した配列（配列番号３７）を、ｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳに公知の手法で組み込むことにより、ｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－Ｂｓａ１－ｇＲＮＡを作製した。このｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－Ｂｓａ１－ｇＲＮＡをＢｓａ１で切断した断片に、シロイヌナズナ由来ＰＤＳ３遺伝子配列の一部（５’－ＴＣＧＴＧＡＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧ－３’）及びその相補配列を含む５’末端をリン酸化した以下のオリゴヌクレオチドＧ（配列番号３８）およびオリゴヌクレオチドＨ（配列番号３９）をアニーリングした２本鎖ＤＮＡフラグメントを混合しライゲーションした。
・オリゴヌクレオチドＧ（配列番号３８）：
５’－ｐＡＴＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧ－３’
・オリゴヌクレオチドＨ（配列番号３９）：
５’－ｐＡＡＡＣＣＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＧＡ－３’
　得られたライゲーション溶液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜した後、目的の組み換えプラスミドを有するクローンからプラスミドを精製した（ｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ＰＤＳ３－ｇＲＮＡ）。
（２）フローラルディップ法を用いたｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ＰＤＳ３－ｇＲＮによるシロイヌナズナの形質転換
　上記（１）で作製したｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ＰＤＳ３－ｇＲＮＡを、公知（Koncz et al, Mol. Gen. Genet., (1986), 204:383-396参照）のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 (C58C1 Rifr) pMP90 (Gmr)株に対して、エレクトロポレーション法で導入した。得られた菌を、２０ｍＬの抗生物質（５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び５０μｇ／ｍＬリファンピシリン）を含むＬＢ培地で２日間培養し、菌体を回収し、３０ｍＬの浸潤培地（Infiltration medium）に懸濁した。
　シロイヌナズナ野生株Ｃｏｌ－０を４５～６０日間育てて花を咲かせ、主茎を切った後にさらに１０日間育ててから形質転換に用いた。形質転換は、前記の形質転換用ベクターを導入した菌体を懸濁させた浸潤培地をシロイヌナズナに滴下して感染させ、通常通り育成しＴ１種子を収穫した。その後、Ｔ１種子を５０％ブリーチ、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液で７分間滅菌し、滅菌水で３回リンスし、２５μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含むＭＳ選択培地に播種した。
（３）ゲノムＤＮＡのＮＧＳ解析
　上記（２）で２週間選抜したシロイヌナズナ個体から葉を回収し、ゲノム抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ）と混合後、シェイクマスター（バイオメディカルサイエンス社製）で破砕し、イソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡを滅菌水で懸濁し、以下のプライマー１４（配列番号３１）およびプライマー１５（配列番号３２）からなるプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＮＧＳ解析を行い、ゲノム編集を検出した。
・プライマー１４（配列番号３１）
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧ－３’
・プライマー１５（配列番号３２）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＧＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧ－３’
　図７は、上記手順によりｐＣＡ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ＰＤＳ３－ｇＲＮＡで形質転換したシロイヌナズナＴ１個体の葉のゲノムＤＮＡ分析の結果、各Ｔ１個体番号において検出されたＰＤＳ３遺伝子の各塩基の編集効率（最大値１）を示す図である。これらの結果によれば、ＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナ植物体のゲノムＤＮＡ編集により、標的遺伝子においてヌクレオチドの欠失及び挿入がホモで導入されたゲノム編集個体が高効率で確認できた。
［実施例６］ＡａｌＣａｓ９を用いたヒト培養細胞のゲノム編集
（１）ベクターの構築
　ヒトコドンについて最適化されたＡａｌＣａｓ９遺伝子（配列番号５）に、Ｎ末端核移行シグナル配列（配列番号３５）及びＣ末端核移行シグナル配列（配列番号３６）を付加した配列を、ＣＭＶプロモーター配列及びＢＧＨ ｐｏｌｙＡ配列で発現制御されるプラスミド（ｐＣＭＶ）に公知の手法で組み込みｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳを作製した。
　次に、ターゲット配列を導入しやすく設計したＡａｌＣａｓ９のｓｇＲＮＡにヒト由来Ｕ６プロモーター配列を付加した配列（配列番号４０）を、ｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳに公知の手法で組み込みｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－Ｂｂｓ１－ｇＲＮＡを作製した。作製したｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－Ｂｂｓ１－ｇＲＮＡをＢｂｓ１で切断した断片に、ヒト由来ＡＡＶＳ１遺伝子配列の一部を含む５’末端をリン酸化した以下のオリゴヌクレオチドＩ（配列番号４１）およびオリゴヌクレオチドＪ（配列番号４２）をアニーリングした２本鎖ＤＮＡフラグメントを混合しライゲーションした。
・オリゴヌクレオチドＩ（配列番号４１）：
５’－ｐＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＧ－３’
・オリゴヌクレオチドＪ（配列番号４２）：
５’－ｐＡＡＡＣＣＡＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧ－３’
　得られたライゲーション溶液で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有するクローンからプラスミドを精製した（ｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ｈＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡ）。
（２）ヒト培養細胞へのＡａｌＣａｓ９発現ベクターの導入
　上記（１）で作製したｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ｈＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡをリポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と混合し、９６穴プレートで培養したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（約１０４細胞）へトランスフェクションし、３日間培養した。トランスフェクションしたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を回収し、０．１Ｎ ＮａＯＨと混合することで細胞を破砕した。
（３）ゲノムＤＮＡのＮＧＳ解析
　上記で培養したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を回収し、０．１Ｎ ＮａＯＨと混合することで細胞を破砕し、破砕液の一部と以下のプライマー１８（配列番号４３）およびプライマー１９（配列番号４４）からなるプライマーセットを使用して増幅した約３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によりＮＧＳ解析を行い、標的配列の欠失によるゲノム編集を検出した。
・プライマー１８（配列番号４３）：
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＡ－３’
・プライマー１９（配列番号４４）：
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＣＴＴＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡ－３’
　図８は、上記手順によりｐＣＭＶ－ＮＬＳ－ＡａｌＣａｓ９－ＮＬＳ－Ｕ６－ｈＡＡＶＳ１－ｇＲＮＡで形質転換したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のゲノムＤＮＡと元のヒトゲノムｈＡＡＶＳ１遺伝子の配列とを比較した結果、検出されたゲノムＤＮＡ配列（ｒｅａｄ数）及び編集割合（＝編集が検出されたＤＮＡ数／分析した全ＤＮＡ数）を示す図である。これらの結果によれば、ＡａｌＣａｓ９によるヒト培養細胞のゲノムＤＮＡ編集により、標的遺伝子のｇＲＮＡ結合部位においてヌクレオチドの欠失が検出された。
　本発明のアビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９はゲノム変種が関与する農業、医薬産業、酵素産業等の種々の産業分野に幅広く利用可能である。

Claims (13)

  1. 　真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、
    前記真核細胞中に、
    （１）配列番号１に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
    （２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
    を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む方法。
  2. 　前記Ｃａｓタンパク質が、アビシコッカス（Abyssicoccus）属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１または２に記載の方法
  4. 　前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
  5. 　前記Ｃａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
  6. 　前記ＰＡＭ配列が、配列番号２に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’または配列番号３に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
  7. 　前記ガイドＲＮＡが、１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であると共に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
  8. 　前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ相補鎖と二本鎖を形成することが可能な１５～３０ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ｃｒＲＮＡが、１２～３６ヌクレオチド長のステムループを含む、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
  11. 　前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１０の何れか一項に記載の方法。
  12. 　請求項１～１１の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
  13. 　前記のガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
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GASIUNAS GIEDRIUS, YOUNG JOSHUA K., KARVELIS TAUTVYDAS, KAZLAUSKAS DARIUS, URBAITIS TOMAS, JASNAUSKAITE MONIKA, GRUSYTE MANTVYDA M: "A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 11, no. 1, 1 December 2020 (2020-12-01), pages 1 - 10, XP055929454, DOI: 10.1038/s41467-020-19344-1 *

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