JP2024058391A - ゲノム編集方法およびゲノム編集用組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】真核細胞ゲノム内の新たなＰＡＭ配列を認識して当該ゲノムを部位特異的に改変可能なゲノム編集手段を提供する。【解決手段】真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変する方法であって、前記真核細胞中に、（１）塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、（２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む。【選択図】図１

Description

本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細にはゲノム編集の分野に関する。より具体的に、本発明は、真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための新たなゲノム編集方法および当該方法に用いられるゲノム編集用組成物等のゲノム編集手段に関する。

ゲノム編集技術として、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質を利用することが知られている。中でも近年では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated proteins）システムをゲノム編集に応用する技術が盛んに開発され、利用されている。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにはＩ型、II型、およびIII型があるが、ゲノム編集で最も多く用いられているのはII型である。II型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease：ＲＧＮ）ＲＧＮとして、Ｃａｓ９と呼ばれるヌクレアーゼを用いる。Ｃａｓ９は様々な真核細胞（例えば魚、植物、ヒト等）のゲノムを操作するのに使用されてきた（非特許文献１）。Ｃａｓ９は、一般的にはガイドＲＮＡとの複合体として用いられる。Ｃａｓ９とガイドＲＮＡとの複合体を細胞内に導入することにより、様々な動植物において標的遺伝子を変異させることができる。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成することにより、活性を有するエンドヌクレアーゼとして機能し、侵入したファージまたはプラスミド中の外来遺伝因子を切断する。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ＤＮＡ配列と相同な配列を有する短いｓｇＲＮＡを合成するだけで利用可能である上に、特にII型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、単一のタンパク質であるＣａｓ９を用いてゲノム編集が可能であるという利点がある。

Ｃａｓ９は、ＤＮＡ中のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ：protospacer adjacent motif）配列を認識し、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。Ｃａｓ９が認識するＰＡＭ配列の長さや塩基配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌種によってさまざまである。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のＣａｓ９（略称ＳｐｙＣａｓ９）は、５’－ＮＧＧ－３’という３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列の上流を切断できる（特許文献１）（なお、別途明記しない限り、本明細書における塩基配列中の「Ｎ」は任意の塩基を表す。）。また、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）は２種類のＣａｓ９を有し、それぞれ５’－ＮＧＧＮＧ－３’又は５’－ＮＮＡＧＡＡ－３’という５～６塩基の配列をＰＡＭ配列として認識する（特許文献２）。

国際公開第２０１４／０９３６６１号 特表２０１５－５１０７７８号公報

Charpentier and Doudna, Nature, 2013, 495:50-51

このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは優れたゲノム編集手段ではあるが、その汎用性を高めるために、認識可能なＰＡＭ配列の多様化が求められている。

本発明は上記課題に鑑みてなされたもので、その目的は、真核細胞ゲノム内の新たなＰＡＭ配列を認識して当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能な、新たなゲノム編集手段を提供することである。

本発明者らは、前述の課題解決のために鋭意検討を行なった結果、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’を含む新たなＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を見出し、斯かるＣａｓタンパク質をガイドＲＮＡと共に、標的ＤＮＡ配列をゲノム内に含む真核細胞内で発現させることで、新たな標的ＤＮＡ配列に基づく真核細胞ゲノムの部位特異的な改変が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下を包含する。
［項１］真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、
前記真核細胞中に、
（１）配列番号１に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
（２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む方法。
［項２］前記Ｃａｓタンパク質が、アビシコッカス（Abyssicoccus）属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来する、項１に記載の方法。
［項３］前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、項１または２に記載の方法
［項４］前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、項１～３の何れか一項に記載の方法。
［項５］前記Ｃａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、項１～４の何れか一項に記載の方法。
［項６］前記ＰＡＭ配列が、配列番号２に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’または配列番号３に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’を含む、項１～５の何れか一項に記載の方法。
［項７］前記ガイドＲＮＡが、１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であると共に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項１～６の何れか一項に記載の方法。
［項８］前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ相補鎖と二本鎖を形成することが可能な１５～３０ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、項７に記載の方法。
［項９］前記ｃｒＲＮＡが、１２～３６ヌクレオチド長のステムループを含む、項７又は８に記載の方法。
［項１０］前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、項１～９の何れか一項に記載の方法。
［項１１］前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、項１～１０の何れか一項に記載の方法。
［項１２］項１～１１の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
［項１３］前記のガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を更に含む、項１２に記載の組成物。

本発明のゲノム編集方法によれば、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’を含む新たなＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質を用いることにより、新たな標的ＤＮＡ配列に基づく真核細胞ゲノムの部位特異的な改変が可能となる。

図１は、実施例１におけるＡａｌＣａｓ９タンパク質生産用ベクターの構成を模式的に示す図である。 図２は、実施例２及び実施例３におけるｓｇＲＮＡの塩基配列（配列番号２３）及び構成を示す図である。 図３は、実施例２におけるＰＡＭドメインの解析結果を示すグラフである。 図４は、実施例３におけるインビトロＤＮＡ切断アッセイによる反応産物の電気泳動結果の例を示す写真である。左の写真は、反応溶液を２５℃で６０分間インキュベートした場合の結果を、右の写真は、反応溶液を３７℃で６０分間インキュベートした場合の結果をそれぞれ示している。 図５Ａ及びＢは、実施例３におけるインビトロＤＮＡ切断アッセイによるＡａｌＣａｓ９活性の経時変化を示すグラフである。図５Ａのグラフは、反応溶液を２５℃でインキュベートした場合の結果を、図５Ｂのグラフは、反応溶液を３７℃でインキュベートした場合の結果をそれぞれ示す。 図６Ａ及びＢは、実施例４におけるＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナプロトプラスト細胞のゲノムＤＮＡ編集結果を示す図である。図６Ａは、標的ＤＮＡ毎の編集率を、図６Ｂは、次世代シーケンサーによる変異ＤＮＡをそれぞれ示している。

以下、本発明を具体的な実施の形態に即して詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施の形態に束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。

なお、本発明において引用される特許文献（特許出願公開公報および特許公報等）並びに非特許文献は、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれるものとする。

また、本発明において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。

また、以下に説明するタンパク質または遺伝子のうち、公知のタンパク質または遺伝子の各配列に関する情報は、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。

また、別途記載する場合を除き、本明細書において、塩基配列中の「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミンをそれぞれ意味し、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味する。

・ゲノム編集方法：
本発明の一側面は、真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するためのゲノム編集方法（以下適宜「本発明のゲノム編集方法」又は「本発明の方法」と略称する。）に関する。本方法は、真核細胞中に、
（１）特定のＰＡＭ配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
（２）ガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含むことを主な特徴とする。

・細胞：
本明細書において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されないが、好ましくは真核細胞が使用される。原核細胞の例としては、細菌、古細菌が挙げられる。真核細胞の例としては、微生物細胞、植物細胞、動物細胞が挙げられる。微生物細胞としては、酵母、真菌、原生動物等の各種微生物に由来する細胞が挙げられる。植物細胞としては、種子植物、シダ・コケ類、藻類等の各種植物に由来する細胞が挙げられる。動物細胞としては、脊椎動物（哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）、節足動物（昆虫等）、軟体動物等の各種動物に由来する細胞が挙げられる。特に哺乳動物細胞の具体例としては、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞等が挙げられる。細胞の態様も特に制限されず、生体内（インビボ）細胞、培養細胞（インビトロ）、初代培養細胞（インビトロおよびエクスビボ）、移植細胞等の何れの態様であってもよい。斯かる各種の細胞は、当該技術分野において一般的に使用される。

・ゲノム編集：
本明細書において「ゲノム編集」とは、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質等を用いて、各種細胞内のゲノム上の標的部位に所望の改変を導入することにより、ゲノムを編集する技術を意味する。ここで「改変」の例としては、限定されるものではないが、ゲノム上の特定の遺伝子を切断して遺伝子を破壊すること、ゲノム上の標的部位のＤＮＡ断片を挿入又は置換すること、点変異を高効率に導入して遺伝子機能を改変すること等が挙げられる。ここで「標的部位」とは、ゲノム編集の対象となる真核細胞のゲノム内の所定の部位を意味する。ここで「切断」とは、ヌクレオチド分子の共有結合性の主鎖の切断を指す。

ゲノム編集の標的部位は、後述する部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質の種類に応じて適切に選択することが可能である。例えば、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質としてＣａｓタンパク質の一種であるＣａｓ９を使用する場合、ゲノム編集の標的部位としては、ＰＡＭ配列およびその５’側に隣接する所定塩基長（例えば２０塩基程度）の配列からなるＤＮＡ鎖（標的鎖）とその相補ＤＮＡ鎖（非標的鎖）からなる、ゲノムＤＮＡ上の部位とすることが好ましい。

ゲノム編集の対象となるゲノム上の標的部位は特に限定されないが、例としては、真核細胞ゲノム上の遺伝子であって、その改変や破壊等が望まれる遺伝子の一部又は全部、或いはその遺伝子と重複又は隣接する領域等が挙げられる。

ゲノム編集の対象となる遺伝子の具体例としては、１次代謝（アミノ酸等）関連遺伝子、２次代謝（フラボノイド、ポリフェノール等）関連遺伝子、糖代謝関連遺伝子、脂質代謝関連遺伝子、有用物質（医薬、酵素、色素、芳香成分等）生産関連遺伝子、収量性（数、大きさ等）、開花関連遺伝子、耐病虫性関連遺伝子、環境ストレス（低温、高温、乾燥、塩、光障害、紫外線）耐性関連遺伝子等が挙げられる。

・Ｃａｓタンパク質：
本明細書において「Ｃａｓタンパク質」とは、細菌および古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーに属するタンパク質であり、ＰＡＭ配列を認識して、その上流又は下流で二本鎖ＤＮＡを切断する標的特異的エンドヌクレアーゼである。Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease：ＲＧＮ）であり、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを構成する。該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを標的細胞内に導入又は構築することにより、ガイドＲＮＡがゲノム内の標的部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたＣａｓタンパク質によって標的部位のＤＮＡを切断することができる。

本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（配列番号１）を含む特定のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識することを特徴とする。中でも、５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’（配列番号２）または５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’（配列番号３）を含む特定のＰＡＭ配列を認識することが好ましい。

本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、上記の特定のＰＡＭ配列を認識できるものであれば、その種類は限定されるものではなく、任意の種類のＣａｓタンパク質を使用可能であるが、中でもＣａｓ９であることが好ましい。

本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、天然タンパク質であってもよいが、組換えタンパク質であってもよい。

本発明に使用されるＣａｓタンパク質の起源（由来）は、限定されるものではないが、アビシコッカス（Abyssicoccus）属の細菌に由来するＣａｓタンパク質が好ましく、中でもアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来するＣａｓ９であるＡａｌＣａｓ９が好ましい。野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列を配列番号４に示す。

本発明にＡａｌＣａｓ９を使用する場合、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する野生型ＡａｌＣａｓ９であってもよいが、その活性（例えば後述のエンドヌクレアーゼ活性）を損なわない限りにおいて、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して１又は２以上の変異を有する、変異型ＡａｌＣａｓ９であってもよい。具体的に、斯かる変異型ＡａｌＣａｓ９は、配列番号４に記載の野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列に対して、１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列を有すると共に、ＡａｌＣａｓ９タンパク質と同等又はそれ以上の活性（例えば後述のエンドヌクレアーゼ活性）を有するタンパク質であることが好ましい。中でも、斯かる変異型のＡａｌＣａｓ９タンパク質は、その親となる配列番号４に記載の野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列と、例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性（好ましくは配列同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。

ここで、２つのアミノ酸配列の「相同性」（similarity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基又は類似の（すなわち、物理化学的性質が類似する）アミノ酸残基が現れる比率であり、２つのアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、両アミノ酸配列をアラインメントした際に各対応箇所に同一のアミノ酸残基が現れる比率である。なお、２つのアミノ酸配列の「相同性」及び「同一性」は、例えばBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（Altschul et al., J. Mol. Biol., (1990), 215(3):403-10）等を用いて求めることが可能である。

本発明に使用されるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有し、真核細胞内で上記Ｃａｓタンパク質を発現することが可能な核酸であれば、制限されるものではない。斯かる核酸は、所望のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列情報を基に、適宜作成することが可能である。なお、当該核酸は化学合成等により作製してもよい。

本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸としては、配列番号４の野生型ＡａｌＣａｓ９をコードする核酸、及び、配列番号４の野生型ＡａｌＣａｓ９のアミノ酸配列に対して、例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸が挙げられる。例として、アビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）において配列番号４の野生型ＡａｌＣａｓ９をコードする野生型ＡａｌＣａｓ９遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。

本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、当該核酸を導入する真核細胞の翻訳系に合わせてコドンが最適化されたものであってもよい。例として、野生型ＡａｌＣａｓ９遺伝子の塩基配列を大腸菌に合わせてコドン最適化した塩基配列を配列番号６に、ヒトに合わせてコドン最適化した塩基配列を配列番号７に、シロイヌナズナに合わせてコドン最適化した塩基配列を配列番号８にそれぞれ示す。

本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸としては、上記の各種の塩基配列、例えば配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に記載の塩基配列に対して、例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含む核酸も挙げることができる。

本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、前記タンパク質または核酸を真核細胞において核輸送によって核中に輸送するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を含むことができる。当該ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の５’末端側または３’末端側の何れか一方のみに付加されていてもよく、あるいは５’末端側および３’末端側の両方に付加されてもよい。

本発明に用いられるＣａｓタンパク質をコードする核酸は、プロモーターやターミネーター等の調節配列と作用可能に連結された発現カセットの状態で、ベクターに組み込まれていてもよい。

・エンドヌクレアーゼ活性：
本発明に用いられるＣａｓタンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有することが好ましい。本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、本発明に用いられるエンドヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、標的となるＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有することが好ましい。

本発明に用いられるＣａｓタンパク質は、限定されるものではないが、例えば１０℃から８０℃の範囲の温度で、好ましくは２０℃から５０℃の範囲の温度で、さらに好ましくは２５℃から４０℃の範囲の温度で、標的ＤＮＡの切断または改変活性を有する。

・ＰＡＭ配列：
本発明に用いられるＣａｓタンパク質は、特定のＰＡＭ配列を認識する。本明細書において、「ＰＡＭ配列」（プロトスペーサー隣接モチーフ配列）とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列である。Ｃａｓタンパク質が認識可能なＰＡＭ配列の長さや塩基配列は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。

前述のように、本発明に使用されるＣａｓタンパク質は、５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（配列番号１）を含む特定のＰＡＭ配列を認識する。中でも、５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’（配列番号２）または５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’（配列番号３）を含む特定のＰＡＭ配列を認識することが好ましい。

・ガイドＲＮＡ：
ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質等の部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質をゲノム上の標的核酸の標的部位に誘導（ガイド）する機能を有するＲＮＡである。部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質は、通常は斯かるガイドＲＮＡと結合して、リボ核タンパク質又はリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）を形成する。ここで、ガイドＲＮＡがゲノム上の標的部位をターゲティングし、Ｃａｓタンパク質等の部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質がゲノム上の標的部位のＤＮＡを開裂することで、ゲノム上の標的部位のＤＮＡ配列を変更又は改変することができる。

ガイドＲＮＡの構造は、通常は部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質の種類に応じて選択される。例えば、部位特異的ＤＮＡ修飾タンパク質としてＣａｓタンパク質を使用する場合、ガイドＲＮＡは通常、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性に関与するｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）配列と、ゲノム上の標的部位に結合するｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating crRNA）配列とを含む。この場合、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとが相補的に結合してなるＲＮＡ複合体であってもよい。

ｃｒＲＮＡ配列は、リピート配列およびスペーサー配列を含む。スペーサー配列は、標的ＤＮＡ配列の相補鎖または実質的な相補鎖（標的配列に対して完全に一致していないが、標的配列に結合できる配列）と２本鎖を形成できる配列である。ｃｒＲＮＡ配列は、斯かるスペーサー配列を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの標的認識を行うことができる。スペーサー配列の長さは、限定されるものではないが、例えば１５～３０ヌクレオチド長、１８～２５ヌクレオチド長、１９～２３ヌクレオチド長、２０～２２ヌクレオチド長、特に２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチドであることが好ましい。ｃｒＲＮＡ配列の長さは制限されないが、例えば１２～３６塩基長程度のステムループを含む配列とすることができる。

ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、高繰り返し領域と、その後に続く１つまたは２つ以上（好ましくは２つ以上）のヘアピン構造とを含み、複数のステムループを形成可能な配列である。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の長さは制限されないが、例えば５０～１００塩基長程度の配列とすることができる。

本発明に用いられるガイドＲＮＡの構成は、ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能であれば、特に制限されない。本発明に使用されるＣａｓタンパク質及びそれが認識するＰＡＭ配列、並びに改変の対象となる真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列等に応じて、適切に設計すればよい。斯かるガイドＲＮＡの設計については、これまで多くの知見が存在しており（一例を挙げれば、国際公開第２０１３／１４２５７８号、同第２０１３／１７６７７２号、及び同２０１４／０９３５９５号等）、当業者であればこれらの知見を適宜参酌しながら、本発明に任意の変更を加えて実施することが可能である。

ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ等の核酸を用いる場合、その構成も特に制限されない。本発明に使用されるガイドＲＮＡの配列及び構成、並びに改変の対象となる真核細胞の種類等に応じて、適切なＤＮＡを設計すればよい。特にｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを用いる場合、ｃｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列をコードするＤＮＡとを独立した分子として用意してもよく、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方をコードする一体のＤＮＡ分子を用いてもよい。

なお、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ等の核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸とは独立した分子であってもよく、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と一体の分子となっていてもよい。また、ガイドＲＮＡをコードする核酸が単独で、或いはＣａｓタンパク質をコードする核酸と共に、プロモーターやターミネーター等の調節配列と作用可能に連結された発現カセットの状態で、ベクターに組み込まれてもいてもよい。

・標的ＤＮＡ配列：
一般に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおける部位特異的改変の対象となる標的ＤＮＡ配列は制限されず、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＲＮＡ配列、または一本鎖ＤＮＡ配列のいずれであってよい。但し、本発明では、真核細胞のゲノム内の二本鎖ＤＮＡ配列が標的配列となる。中でも通常は、ゲノム内のＤＮＡ配列のうち、Ｃａｓタンパク質が認識するＰＡＭ配列の近傍に位置するＤＮＡ配列が、標的ＤＮＡ配列として選択される。

・ゲノム編集の手順：
本発明の方法は、部位特異的改変の対象となる標的ＤＮＡ配列をゲノム内に含む真核細胞中に、前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸とを導入することにより実施される。これにより、ガイドＲＮＡが真核細胞ゲノム内の標的ＤＮＡ部位に結合し、該結合部位に呼び込まれたＣａｓタンパク質によって当該真核細胞のゲノムを標的ＤＮＡ部位で切断し、当該ゲノムを部位特異的に改変することが可能となる。

前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸とを、真核細胞内に導入する手法は特に制限されない。例としては、これらに限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リポソーム、ウイルスベクター、ナノ粒子、ウイスカー結晶、ＰＴＤ（タンパク質転移ドメイン）融合タンパク質を使用した手法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法等、当該技術分野において既知の様々な方法が挙げられる。

前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸と、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸とを細胞に導入した際、当該細胞を細胞増殖に適した条件下で培養すればよい。当該培養条件は、細胞が由来する生物種に適した培養条件であればよく、例えば、当業者が既知の細胞培養技術に基づいて決定することができる。

・その他：
以上、本発明のゲノム編集方法について説明したが、斯かるゲノム編集方法に使用される各種のゲノム編集手段、例えば前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸や、前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸も、本発明に含まれるものとする。

また、本発明の一側面によれば、本発明のゲノム編集方法に使用するためのゲノム編集用組成物及びゲノム編集用キットも提供される。ゲノム編集用組成物は、少なくとも前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸を含むと共に、任意により更に前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を含む組成物である。ゲノム編集用キットは、少なくとも前記のＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸を含む容器と、その使用方法を記載した指示書を含むと共に、任意により更に前記のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を含む容器を含むキットである。斯かるＣａｓタンパク質またはそれをコードする核酸や、ガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸の詳細は、上述したとおりである。

なお、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いたゲノム編集については、これまで多くの知見が存在しており（一例を挙げれば、国際公開第２０１３／１４２５７８号、同第２０１３／１７６７７２号、及び同２０１４／０９３５９５号等）、当業者であればこれらの知見を適宜参酌しながら、本発明に任意の変更を加えて実施することが可能である。なお、前述したように、これらの特許文献はその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれるものとする。

以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されるものではない。なお、上述のように「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味する。

［実施例１］アビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９タンパク質の作製：

（１）アビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９遺伝子の調製：
配列番号４に記載のアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）由来のアミノ酸配列の情報を基に、当該Ｃａｓタンパク質をコードする配列番号５に記載のＤＮＡ配列を人工合成した。当該ＤＮＡ配列はＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＧｅｎＢａｎｋなどのよく知られたデータベースにおいて見出すことができる。また、斯かるアビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９遺伝子を、大腸菌コドンについて最適化したＤＮＡ配列（配列番号６）、ヒトコドンについて最適化したＤＮＡ配列（配列番号７）、及び、シロイヌナズナについて最適化したＤＮＡ配列（配列番号８）も、それぞれ合成した。塩基配列の決定にはサンガー法又は次世代シーケンス法を用いた。なお、ＡａｌＣａｓ９タンパク質は、ＳｐｙＣａｓ９（１３６８アミノ酸）などの他のＣａｓ９オルソログと比べて、比較的小さな（１０５９アミノ酸）であった。

（２）大腸菌発現用ベクターの構築
以下に詳述する手順により、配列番号６のＡａｌＣａｓ９遺伝子に、公知のＮ末端核移行シグナル配列、Ｃ末端核移行シグナル配列、およびＨｉｓ－ｔａｇを付加し、ｐＥＴベクターに組み込んだＡａｌＣａｓ９生産用ベクターを構築した。当該ベクターの構成を図１に模式的に示す。

まず、下記のプライマー１（配列番号９）およびプライマー２（配列番号１０）を用い、ｐＥＴ２６ｂベクターを鋳型として、ＰＣＲ反応によりリニアＤＮＡの増幅を行った。

・プライマー１（配列番号９）：
５’－ＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧ－３’
・プライマー２（配列番号１０）：
５’－ＴＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣ－３’

別途、大腸菌用にコドン最適化したＡａｌＣａｓ９遺伝子（配列番号６）の５’末端および３’末端に対して、それぞれ以下のオリゴヌクレオチドＡ（Ｎ末端核移行シグナル配列、配列番号１１）およびオリゴヌクレオチドＢ（Ｃ末端核移行シグナル配列、配列番号１２）を付加したＤＮＡ断片を調製した。

・オリゴヌクレオチドＡ（Ｎ末端核移行シグナル配列、配列番号１１）：
５’－ＣＧＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡ－３’
・オリゴヌクレオチドＢ（Ｃ末端核移行シグナル配列、配列番号１２）：
５’－ＧＣＧＣＴＡＡＧＡＡＣＧＡＧＣＧＣＧ－３’

上記得られた大腸菌コドン最適化ＡａｌＣａｓ９遺伝子を含むＤＮＡ断片を、先に得られたｐＥＴベクターのＰＣＲ増幅産物と混合し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いてＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。

得られた環状プラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５ａを形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で培養することにより形質転換体を選択した。数個のコロニーをピックアップし、その中から目的の環状プラスミド（ｐＥＴ－ＡａｌＣａｓ９）をＡａｌＣａｓ９生産用ベクターとして作製した。

（３）ＡａｌＣａｓ９の調製：
得られたプラスミドベクターｐＥＴ－ＡａｌＣａｓ９を、常法により大腸菌ＲＯＳＥＴＴＡ２（ＤＥ３）ｐＬＹＳＳ株に導入した。得られた組換株を５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で培養し、ＯＤ値０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；ＩＰＴＧ）（終濃度０．２５ｍＭ）を添加し、２０℃で２０時間培養した。培養後、当該大腸菌を遠心分離（８，０００ｇ、１０分間）により回収した。回収した菌体を緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）で懸濁し、超音波破砕した。遠心分離（１２，０００ｇ、３０分間）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ－アフィニティカラム、次にＨｅｐａｒｉｎアフィニティカラムを用いて精製した後、緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０％ グリセロール）で平衡化したゲルろ過カラムにより精製した。精製したタンパク質は遠心式限外ろ過フィルターユニット（メルクミリポア）を用いて濃縮することにより、ＡａｌＣａｓ９を取得した。このようにして得られたＡａｌＣａｓ９は－８０℃で保存した。

［実施例２］ＰＡＭ配列の同定：

（１）プラスミドライブラリーの作製：
ＡａｌＣａｓ９遺伝子のＰＡＭ配列を同定するために、以下の手順でプラスミドライブラリーを作製した。

まず、市販のｐＵＣ１８を制限酵素ＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１で切断した断片に、公知のイネ由来ＰＤＳ（phytoene desaturase）遺伝子配列の一部（５’－ＧＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧ－３’）を含む５’末端をリン酸化した以下のオリゴヌクレオチドＣ（配列番号１３）およびオリゴヌクレオチドＤ（配列番号１４）をアニーリングした２本鎖ＤＮＡフラグメントを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてライゲーションした。

・オリゴヌクレオチドＣ（配列番号１３）：
５’－ｐＧＡＴＣＧＴＴＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧ－３’
・オリゴヌクレオチドＤ（配列番号１４）：
５’－ｐＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣＡＡＣ－３’

得られたライゲーション溶液を用いて、常法により大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有するクローンからプラスミドを精製した（ｐＵＣ１８－ＯｓＰＤＳ）。

精製したｐＵＣ１８－ＯｓＰＤＳを鋳型とし、以下のプライマー３（配列番号１５）およびプライマー４（配列番号１６）を用いて第１のＰＣＲ反応を実施し、増幅されたＤＮＡ断片を含む第１のＰＣＲ増幅産物を取得した。

・プライマー３（配列番号１５）
５’－ＡＣＡＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧＣＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧ－３’
・プライマー４（配列番号１６）
５’－ＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡＧＣ－３’

また、同じく精製したｐＵＣ１８－ＯｓＰＤＳを鋳型とし、ＮＧＳ解析に用いるアダプター配列を含む以下のプライマー５（配列番号１７）およびプライマー６（配列番号１８）を用いて第２のＰＣＲ反応を実施し、増幅されたＤＮＡ断片を含む第２のＰＣＲ増幅産物を取得した。

・プライマー５（配列番号１７）
５’－ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＧＡＧＡＧＧ－３’
・プライマー６（配列番号１８）
５’－ＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧ－３’

得られた第１および第２のＰＣＲ増幅産物を混合し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。環状化したプラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有するクローンからプラスミドを精製した（ｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ）。

得られたプラスミドｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳに、以下のオリゴヌクレオチドＥ（配列番号１９）およびオリゴヌクレオチドＦ（配列番号２０）を混合後、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて２本鎖ＤＮＡフラグメントを調製した。なお、オリゴヌクレオチドＦには、７つの塩基Ｎからなるランダム配列が含まれている。

・オリゴヌクレオチドＥ（配列番号１９）：
５’－ＧＧＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＡＧ－３’
・オリゴヌクレオチドＦ（配列番号２０）：
５’－ＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＮＮＮＮＮＮＮＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣ－３’

精製したｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳを鋳型とし、以下のプライマー７（配列番号２１）およびプライマー８（配列番号２２）を用いてＰＣＲ反応を実施し、増幅されたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ増幅産物を取得した。

・プライマー７（配列番号２１）：
５’－ＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＣ－３’
・プライマー８（配列番号２２）：
５’－ＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣ－３’

得られたＤＮＡ断片を含むＰＣＲ増幅産物と、調製したランダム配列を含む２本鎖ＤＮＡフラグメントとを混合し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘにより、ＤＮＡ断片を環状プラスミド化した。

得られた環状化プラスミドで大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選抜後、目的の組み換えプラスミドを有する約１０万コロニーをまとめて培養し、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＥＸｔｒａ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ（日本ジェネティクス）を用いて、プラスミドライブラリーｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ－７Ｎシリーズを作製した。

（２）プラスミドライブラリー切断用のＲＮＰの調製：
プラスミドライブラリーｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ－７Ｎ切断用のＡａｌＣａｓ９のｓｇＲＮＡ（配列番号２３）を、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ^TM ｓｇＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて試験管内転写により調製した。ＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの構成を図２に、塩基配列を配列番号２３に示す。なお、配列番号２３では、５’末端側のポリＮは省略して示している。このＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを用いて、２．５μＭ ＡａｌＣａｓ９、１２．５μＭ ｓｇＲＮＡとなるように、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅのＣａｓ９バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２５℃で２０分間放置して、複合体を形成させ、第１のＲＮＰ溶液を調製した。

・ＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ（配列番号２３）
５’－ＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＣＧＡＡＡＵＵＵＡＧＵＧＡＡＡＡＣＵＡＧＡＵＵＵＣＧＣＡＧＡＡＵＣＵＡＵＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＵＵＵＡＵＧＣＣＧＵＡＵＵＵＡＡＣＵＣＣＡＵＣＣＵＡＵＧＧＧＵＧＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＵ－３’

（３）ＮＧＳ解析を用いたＰＡＭ配列の同定：
上記（２）で調製した第１のＲＮＰ溶液に、濃度２０ｎＭとなるようにプラスミドライブラリーとＣａｓ９バッファーを加え、３０℃で２時間酵素反応させた。反応溶液に、濃度６０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加え、６０℃で５分間インキュベート後、アガロース電気泳動にて、未切断のプラスミドを精製した。

精製した未切断プラスミドを鋳型として、以下のプライマー９（配列番号２４）およびプライマー１０（配列番号２５）を用いてＰＣＲ反応を実施し、ランダム配列を含む約３７０ｂｐの２本鎖ＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ増幅産物を取得した。

・プライマー９（配列番号２４）
５’－ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ－３’
・プライマー１０（配列番号２５）
５’－ＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧ－３’

前記の２本鎖ＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ増幅産物を、濃度２００ｎＭとなるようにＣａｓ９バッファーで希釈し、上記（２）の第１のＲＮＰ溶液を加え、３７℃で３０分間酵素反応させた。反応溶液は上記と同様にアガロース電気泳動し、未切断の２本鎖ＤＮＡフラグメントを精製した。精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントは次世代シーケンサ（ＮＧＳ）によるＤＮＡ配列解析のサンプルとして使用した。

精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントおよびＲＮＰ未処理のプラスミドライブラリーは、Ｈｉｓｅｑ（Ｉｌｌｍｉｎａ社）によるＮＧＳ解析を行い、ランダム領域に含まれる配列を検出した。精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントのランダム領域に含まれる配列とＲＮＰ未処理のプラスミドライブラリーに含まれる配列を比較し、精製した２本鎖ＤＮＡフラグメントで検出頻度が１／１０に低下した配列に共通する配列を抽出することで、ＡａｌＣａｓ９のＰＡＭ配列をＮＮＡＣＧＮと特定した（図３）。

［実施例３］インビトロでのＤＮＡ切断活性測定：

（１）基質ＤＮＡの調製：
実施例２で作成したｐＵＣ１８－ＮＧＳ－ＯｓＰＤＳ－７Ｎを鋳型に、ＡａｌＣａｓ９のＰＡＭ配列を含む以下のプライマー１１（配列番号２６）とプライマー１２（配列番号２７）からなるプライマーセット、又は、公知のＳｐｙＣａｓ９のＰＡＭ配列を含む以下のプライマー１３（配列番号２８）とプライマー１２（配列番号２７）からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を実施し、各々約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を含むＰＣＲ増幅産物を調製した。調製したＤＮＡ断片はＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ エクストラクションキット（日本ジェネティクス）を用いて精製し、ＤＮＡ切断活性測定の基質として用いた。

＜ＡａｌＣａｓ９用＞
・プライマー１１（配列番号２６）
５’－ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＣＧＴＴＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣ－３’
・プライマー１２（配列番号２７）
５’－ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ－３’

＜ＳｐｙＣａｓ９用＞
・プライマー１３（配列番号２８）
５’－ＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣ－３’
・プライマー１２（配列番号２７）
５’－ＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣ－３’

（２）インビトロＤＮＡ切断活性測定用のＲＮＰの調製：
インビトロＤＮＡ切断活性用のＡａｌＣａｓ９のｓｇＲＮＡ（配列番号２３）を、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ^TM ｓｇＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて試験管内転写により調製した。このＡａｌＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを用いて、２μＭ ＡａｌＣａｓ９、２μＭ ｓｇＲＮＡとなるように、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅのＣａｓ９バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２５℃で２０分間放置して、複合体を形成させ、第２のＲＮＰ溶液を調製した。

（３）インビトロＤＮＡ切断活性測定：
上記（２）の第２のＲＮＰ溶液に、濃度１μＭ ＲＮＰ、１０ｎＭ 基質ＤＮＡとなるように、基質ＤＮＡとＣａｓ９バッファーを加えた。反応溶液は２５℃および３７℃でインキュベートし、５分後、１０分後、１５分後、３０分後に反応溶液の一部を回収し、濃度が５０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを加え、６５℃で５分間インキュベートすることで反応を停止させた。回収した反応液は、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津）を用いて未切断ＤＮＡと切断ＤＮＡを定量し、ＤＮＡ切断活性を測定した。

図４は、インビトロＤＮＡ切断アッセイによる反応産物の電気泳動結果の例を示す写真である。左の写真は、反応溶液を２５℃で６０分間インキュベートした場合の結果を、右の写真は、反応溶液を３７℃で６０分間インキュベートした場合の結果をそれぞれ示している。図５Ａ及びＢは、インビトロＤＮＡ切断アッセイによるＡａｌＣａｓ９活性の経時変化を示すグラフである。図５Ａのグラフは、反応溶液を２５℃でインキュベートした場合の結果を、図５Ｂのグラフは、反応溶液を３７℃でインキュベートした場合の結果をそれぞれ示す。これらの結果によれば、ＡａｌＣａｓ９は、３７℃では１５分後には８０％以上の基質ＤＮＡを切断し、２５℃では３０分後には約５０％の基質ＤＮＡを切断することが明らかになった。

［実施例４］植物細胞におけるＡａｌＣａｓ９による変異導入：

（１）シロイヌナズナプロトプラストのゲノム編集実験用のＲＮＰ調製：
下記の公知のシロイヌナズナ由来ＰＤＳ３遺伝子上のＰＡＭ配列ＡＣＧＮを含むｓｇＲＮＡ（配列番号２９）を、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ^TM ｓｇＲＮＡ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて試験管内転写により調製した。このｓｇＲＮＡを用いて、１０μＭ ＡａｌＣａｓ９、２０μＭ ｓｇＲＮＡとなるようにＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅのＣａｓ９バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈し、２５℃で２０分間放置して、複合体を形成させ、第３のＲＮＰ溶液を調製した。なお、配列番号２９では、５’末端側のポリＮは省略して示している。

・ＰＤＳ３ ｓｇＲＮＡ（配列番号２９）
５’－ＧＵＡＧＣＧＡＧＵＡＡＵＣＧＵＧＡＡＧＵＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＵＵＵＵＡＧＵＡＣＵＣＵＧＣＧＡＡＡＵＵＵＡＧＵＧＡＡＡＡＣＵＡＧＡＵＵＵＣＧＣＡＧＡＡＵＣＵＡＵＵＡＡＡＡＣＡＡＧＧＣＵＵＵＡＵＧＣＣＧＵＡＵＵＵＡＡＣＵＣＣＡＵＣＣＵＡＵＧＧＧＵＧＧＧＧＵＡＵＵＵＵＵＵ－３’

また、同様の手順にて、下記の公知の配列を有するＳｐｙＣａｓ９のｓｇＲＮＡ（配列番号３０）も調製し、ＡａｌＣａｓ９と同様にＲＮＰ複合体を形成させ、第４のＲＮＰ溶液を調製した。なお、配列番号３０では、５’末端側のポリＮは省略して示している。

・ＳｐｙＣａｓ９ ｓｇＲＮＡ（配列番号３０）
５’－ＧＧＡＣＵＵＵＵＧＣＣＡＧＣＣＡＵＧＧＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ－３’

（２）シロイヌナズナプロトプラストの調製：
３０日間生育させたシロイヌナズナの葉より表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を１．０％セルラーゼ－オノズカＲ－１０（ヤクルト社製）、０．２５％ マセロザイムＲ－１０（ヤクルト社製）、１０ｍＭ メルカプトエタノール、４００ｍＭマンニトール、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ₂、２０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）溶液に浸し、２２℃、５０ｒｐｍで振とうしながら、１時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径７０μｍのナイロンフィルターで濾した後、５０ｍＬ容チューブに集め、１００×ｇ、１０分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ₂、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは１００×ｇ、５分間遠心後、同緩衝液で再度懸濁した。この緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、４℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、１００×ｇ、５分間遠心後、４００ｍＭマンニトール、１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、４ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）緩衝液で再懸濁した。その後、１００×ｇ、５分間遠心することでプロトプラストを回収した後、２．０～３．０×１０⁵細胞／ｍＬになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。

（３）シロイヌナズナプロトプラストへのＲＮＰ導入：
上記（２）で得られたプロトプラスト懸濁液３５μＬと前記第３又は第４のＲＮＰ溶液各１０μＬを混合後、４０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００、２００ｍＭ マンニトール、１００ｍＭ ＣａＣｌ₂溶液を４５μＬずつ、それぞれ９６穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、９００ｒｐｍ、１５秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は１０分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液２００μＬを勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、１００×ｇ、５分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清２００μＬを捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、２２℃で１８時間静置し、ゲノムＤＮＡへの変異導入を行った。

（４）ゲノムＤＮＡのＮＧＳ解析：
上記（３）のＲＮＰ導入後、２２℃で１８時間静置したプロトプラスト懸濁液を２００μＬ容チューブに回収し、ゲノム抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）と混合後、９５℃で１０分間インキュベートした後、氷上で５分間静置した。熱処理後のプロトプラスト懸濁液からイソプロパノール沈殿によりゲノムＤＮＡを回収した。回収したゲノムＤＮＡは滅菌水で懸濁し、ＡａｌＣａｓ９については以下のプライマー１４（配列番号３１）およびプライマー１５（配列番号３２）からなるプライマーセット、ＳｐｙＣａｓ９については以下のプライマー１６（配列番号３３）およびプライマー１７（配列番号３４）からなるプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を実施し、約３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。得られた約３００ｂｐのＤＮＡ断片について、ｉＳｅｑ１００システム（Ｉｌｌｍｉｎａ社）により次世代シーケンス解析を行い、ゲノム編集の有無を検出した。

＜ＡａｌＣａｓ９用＞
・プライマー１４（配列番号３１）
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧ－３’
・プライマー１５（配列番号３２）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＡＴＴＡＡＡＧＧＧＧＣＴＡＴＡＧＴＡＧ－３’

＜ＳｐｙＣａｓ９用＞
・プライマー１６（配列番号３３）
５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧ－３’
・プライマー１７（配列番号３４）
５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＧＣＴＴＴＴＣ－３’

図６Ａ及びＢは、ＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナプロトプラスト細胞のゲノムＤＮＡ編集結果を示す図である。図６Ａは、標的ＤＮＡ毎の編集率を、図６Ｂは、次世代シーケンサーによる変異ＤＮＡをそれぞれ示している。

これらの結果によれば、ＡａｌＣａｓ９によるシロイヌナズナ細胞のゲノムＤＮＡ編集によれば、標的遺伝子においてヌクレオチドの短～長領域での欠失及び挿入が検出された。ＡａｌＣａｓ９による細胞当たりの変異率は２５．６％であり、ＳｐｙＣａｓ９の場合よりも優れていた。

本発明のアビシコッカス・アルバス由来Ｃａｓ９はゲノム変種が関与する農業、医薬産業、酵素産業等の種々の産業分野に幅広く利用可能である。

Claims (13)

1. 真核細胞のゲノム内の標的ＤＮＡ配列を部位特異的に改変するための方法であって、
   前記真核細胞中に、
   （１）配列番号１に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＮＮ－３’（ここで「Ｎ」は各々、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンから独立して選択される任意の１塩基を意味する。）を含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を認識するＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、および、
   （２）ゲノム内の前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし得ると共に、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を指向することが可能なガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸
   を導入することにより、前記真核細胞のゲノムを前記標的ＤＮＡ配列において改変することを含む方法。
2. 前記Ｃａｓタンパク質が、アビシコッカス（Abyssicoccus）属菌、好ましくはアビシコッカス・アルバス（Abyssicoccus albus）に由来する、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｃａｓタンパク質が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１または２に記載の方法
4. 前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号４に記載のアミノ酸配列と８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
5. 前記Ｃａｓタンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記ＰＡＭ配列が、配列番号２に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＧＮ－３’または配列番号３に記載の塩基配列５’－ＮＮＡＣＡＮ－３’を含む、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
7. 前記ガイドＲＮＡが、１本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であると共に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
8. 前記ｃｒＲＮＡが、標的ＤＮＡ相補鎖と二本鎖を形成することが可能な１５～３０ヌクレオチド長のスペーサー配列を含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ｃｒＲＮＡが、１２～３６ヌクレオチド長のステムループを含む、請求項７又は８に記載の方法。
10. 前記真核細胞が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞である、請求項１～９の何れか一項に記載の方法。
11. 前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列が、動物細胞、植物細胞、又は微生物細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１～１０の何れか一項に記載の方法。
12. 請求項１～１１の何れか一項に記載の方法に使用するためのゲノム編集用組成物であって、前記のＣａｓタンパク質、または、当該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む組成物。
13. 前記のガイドＲＮＡ、または、当該ガイドＲＮＡをコードする核酸を更に含む、請求項１２に記載の組成物。

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