KR100441201B1

KR100441201B1 - 리포터 유전자를 포함하는 티벡터용 플라스미드 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100441201B1
Application number: KR10-2001-0055508A
Authority: KR
Inventors: 안상미; 조철만; 강병학
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2004-07-23
Also published as: KR20030021933A; WO2003023037A1; US20040235176A1

Abstract

본 발명은 프로모터(promoter) 분석에 용이한 티벡터(T-vector)용 플라스미드 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 티벡터로의 전환 및 저장하기에 쉬운 프로모터 분석에 용이한 티벡터용 플라스미드 및 1) 두 부분의 XcmⅠ 제한효소 인식부위 거리를 100 염기 이상의 거리로 떨어뜨리고, XcmⅠ으로 절단시 잘려나가는 유전자조각의 3' 말단에 아데닌 염기가 만들어지는 유전자에서 XcmⅠ 제한효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭된 유전자를 수득하는 단계; 2) 상기의 증폭된 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 조제하고, 대장균을 형질전환 시킨 후 형질전환체로부터 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및 3) 상기 재조합 벡터를 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분만을 수득하고 이를 프로모터 분석용 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입시키는 단계를 포함하는 티벡터용 플라스미드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 플라스미드는 티벡터로의 전환 및 저장하기가 용이하며 기존의 프로모터 분석과정에서 겪게되는 복잡한 유전자재조합 과정을 간편히 한다는 장점이 있다.

Description

리포터 유전자를 포함하는 티벡터용 플라스미드 및 그 제조방법{Reporter gene-containing plasmid which is convertible to T-vector and the preparation method thereof}

본 발명은 프로모터(promoter) 분석에 용이한 티벡터(T-vector)용 플라스미드 및 그의 제조방법에 관한 것으로서 좀 더 상세하게는 티벡터로의 전환 및 저장하기에 쉬운 프로모터 분석에 용이한 티벡터용 플라스미드와 1) 두 부분의 XcmⅠ 제한효소 인식부위 거리를 100 염기 이상의 거리로 떨어뜨리고, XcmⅠ으로 절단시잘려나가는 유전자조각의 3' 말단에 아데닌 염기가 만들어지는 유전자에서 XcmⅠ 제한효소 인식부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭된 유전자를 수득하는 단계; 2) 상기의 증폭된 유전자를 벡터에 클로닝하여 재조합 벡터를 조제하고, 대장균을 형질전환 시킨 후 형질전환체로부터 재조합 벡터를 수득하는 단계; 3) 상기 재조합 벡터를 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분만을 수득하고 이를 프로모터 분석용 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입시키는 단계를 포함하는 티벡터용 플라스미드의 제조방법에 관한 것이다.

유전자는 전사(transcription)와 번역(translation) 과정을 거쳐 하나의 단백질로 합성되게 되는데, 이중 전사조절을 담당하는 부위가 프로모터(promoter)이다. 프로모터의 활성화에는 유전자 특이적인 전사인자(transcription factor)가 프로모터의 특이부위에 결합하는 것이 필요한데, 이 결합이 RNA 폴리머라제의 결합을 유도(recruiting)함으로서 전사가 일어나게 되는 것이다. 유전자는 그로부터 합성되는 단백질의 생리활성과 더불어 그 유전자의 발현 조절기작을 밝히는 것도 중요한데, 최근 유전자의 프로모터 부위를 개똥벌레 형광효소(firefly luciferase), CAT(Chloramphenicol acetyltransferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 등의 리포터 유전자(repoter gene)를 가지는 벡터에 클로닝하여 핵심 프로모터(core promoter) 부위를 결정하거나, 어떤 신호에 대하여 작용하는 전사인자를 찾고, 이 전사인자가 결합하는 부위(cis-acting element)를 찾는 연구가 많이 보고되고 있다.

좀 더 구체적으로, 프로모터 분석 연구 중 핵심 프로모터 부위를 결정하는 과정을 보면, 클로닝된 프로모터의 5' 말단에서 전사 시작점 방향으로 일정하게 결손(deletion) 시킨 프로모터를 리포터 유전자를 가지는 벡터에 클로닝하게 되는데, 이때 주로 클로닝하려는 리포터 벡터의 다중 클로닝부위에 존재하는 제한효소의 인식부위와 동일한 제한효소 인식부위를 5'말단 부위에 달고 있는 중합효소연쇄반응 프라이머를 합성하여 각 프로모터 부위를 증폭하고, 정제 후 일치하는 제한효소로 절단하여 분석용 벡터에 클로닝하는 과정을 거치게 된다. 이러한 과정에 개똥벌레 형광유전자를 가지는 티벡터를 이용하면 그 과정이 훨씬 간단히 될 수 있다.

중합효소연쇄반응으로 생성된 유전자 증폭산물은 Taq DNA 중합효소(polymerase)의 말단 전이효소(terminal transferase) 활성에 의해 3' 말단 양끝에 아데닌 염기를 가진 뉴클레오티드가 하나 더 첨가된다(Clark, J. M.,Nucleic Acid Res.,1988, 16, 9677). 이러한 증폭된 유전자 산물의 특성으로 인하여, 유전자의 양끝 3' 말단에 티민 염기를 가진 뉴클레오티드가 하나 더 붙어있는 선형의 벡터인 티벡터는 중합효소연쇄반응으로 생성된 유전자 증폭산물이 쉽게 클로닝될 수 있도록 디자인된 벡터이다.

티벡터를 제조하는 방법으로는 첫째, 인위적으로 3' 말단에 티민 염기를 추가시키는 방법으로, pUC 시리즈의 플라스미드와 같은 유전자 클로닝 벡터를 평활 말단으로 만드는 제한효소로 절단한 다음, Taq 중합효소(Marchunk, D., et al.,Nucleic Acid Res.,1991, 19, 1154)를 이용하여 디옥시티미딘삼인산(deoxythymidine triphosphate, dTTP)을, 또는 터미널 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 이용하여(Holton, T. A., et al.,Nucleic Acid Res.,1991, 19, 1156) 디디옥시티미딘 삼인산(de-deoxythymidine triphosphate, ddTTP)을 선형의 유전자 3' 말단에 전달함으로써 제조될 수 있다. 그러나, 이 방법은 말단 전이효소의 활성효율에 의존하여 티벡터가 제조되어지므로, 최적 반응조건이 아니거나 비활성화된 효소로 인하여 티미딘 뉴클레오티드가 첨가되지 않은 불완전한 벡터가 제조됨에 따라 클로닝 과정에서 자가결합(self-ligation)으로 유전자 증폭산물이 클로닝되지 않은 티벡터로만 형질전환된 대장균이 발견되는 단점을 내포하고 있다.

제한효소를 이용하여 티벡터를 제조할 수 있는 다른 방법으로, 제한효소 중 유전자를 절단하였을 때 유전자의 3' 말단에 뉴클레오티드 하나만을 남길 수 있는 제한효소인 AspEⅠ(Yoshikazu, I., et al.,Gene,1993, 130, 152), HphⅠ(David A. M., et al.,Bio/Technology,1991, 9, 65), MboⅡ 또는 XcmⅠ를 이용하는 방법이다. 이 방법은 사용될 제한효소의 인식부위(recognition site) 2개를 나란히 배열하고 제한효소로 유전자를 절단하였을 때 유전자의 3' 말단에 티민염기 하나만 남도록 제조한 올리고뉴클레오티드를 모벡터에 클로닝한 후, 상기 제한효소로 절단하여 티벡터를 제조하는 것으로, 모벡터에 제한효소의 인식부위가 존재할 시에는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 모벡터로 많이 사용되는 pUC-19의 경우, 후보 제한효소 중 HphⅠ 및 MboⅡ는 각각 7곳에 상기 효소의 인식부위가 존재하고(Mead, D. A., et al.,Bio/Technology,1991, 9, 65), 단지 XcmⅠ만이 인식부위가 존재하지 않으므로, XcmⅠ을 이용한 티벡터 개발에 많은 연구자들의 연구가 집중 보고되고 있다(Kovalic, D., et al.,Nucleic Acid Res.,1991, 19, 4560; Cha, J., et al.,Gene,1993, 136, 369; Testoris, A., et al.,Gene,1994, 143, 151; Harrison, J., et al.,Analytical Biochem.,1994, 216, 235; Borovkov, A. Y., et al.,Biotechniques,1997, 22, 812).

그러나 지금까지는 제한효소로 절단했을 때 분리되는 올리고뉴클레오티드 조각이 너무 작아, 아가로스젤 전기영동 상에서는 유전자가 완전히 절단되었는지 아니면 2개의 인식부위 중 한 곳만 절단되었는지를 확인할 수가 없으며, 유전자가 완전히 절단되어 나간 티벡터와 절단되지 않았거나 혹은 2개의 인식부위 중 한 곳만 절단된 벡터 사이의 이동거리차가 적어 겔추출법으로 티벡터를 순수 분리할 때 불완전하게 잘려진 벡터가 혼재하게 된다. 그 결과, 제한효소로 잘려지지 않은 일부 벡터가 그대로 유전자 증폭산물을 클로닝하는데 이용됨으로 인하여, 잘려지지 않은 올리고뉴클레오티드가 그대로 존재하는 원형의 벡터가 형질전환된 대장균에서 높은 비율로 발견되는 단점을 내포하고 있었다.

따라서, 아가로스젤 전기영동 상에서 잘려져 나오는 DNA 절편을 뚜렷하게 식별하고, 불완전한 벡터가 제조되어 자가결합으로 유전자 증폭산물이 클로닝되지 않은 티벡터만 형질전환되는 문제를 해결하여, 형질전환시에 원형의 벡터가 발견되는 비율을 낮추기 위한 티벡터를 제조하는 기술을 개발하려는 노력이 계속되어 왔다(Jo, C. and Jo, S.A.,Plasmid,2001, 45, 37).

이에, 본 발명자들은 제한효소를 이용하여 티벡터를 제조하는 방법에서 발생되는 상기 문제점의 해결방안을 확립하고자 예의 노력한 결과, 염기서열이 보고된 유전자 중에서 두 부분의 XcmⅠ 제한효소 인식부위 사이의 거리가 약 100염기 이상되고, XcmI으로 잘랐을 때 잘려나가는 유전자조각의 3' 말단에 아데닌 염기가 만들어지는 유전자를 개똥벌레 유전자 바로 앞에 클로닝 할 때, 플라스미드로부터 티벡터로의 전환이 확실하게 구별됨은 물론 프로모터의 분석에 용이한 티벡터를 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 티벡터로의 전환이 아가로스겔상에서 용이하게 구별되며, 클로닝 부위 바로 뒤에 리포터 유전자를 포함함으로서 프로모터 분석이 용이한 티벡터용 플라스미드 및 상기 티벡터용 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

도 1은 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자의 cDNA를 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)으로 증폭시킨 후 전기영동한 결과를 나타내는 아가로스젤 전기영동 사진이고,

1레인: 100 bp DNA 래더,

2레인: 쥐의 뇌조직으로부터 분리한 1차 cDNA를 주형으로 하여 합성된 중합효소연쇄반응의 증폭산물

도 2는 증폭된 유전자가 클로닝된 티벡터를 SamⅠ과 HindⅢ 로 절단한 결과를 나타내는 아가로스젤 전기영동 사진이고,

1레인: 람다(λ) 파아지의 유전자를 제한효소인 HindⅢ 및 EcoRI으로 절단한 래더,

2레인: 제한효소 SamⅠ과 HindⅢ에 의해 절단되어 분리된 유전자

도 3은 대장균 XL1-blue로부터 분리한 본 발명의 pGL2-B 티벡터용 플라스미드의 아가로스젤 전기영동 사진이고,

1레인: 람다(λ) 파아지의 유전자를 제한효소인 EcoRI 및 HindⅢ로 절단한 래더,

2레인: 클로닝되어 분리된 pGL2-B 티벡터용 플라스미드

도 4는 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소 유전자를 이용하여 제조된 본 발명의 pGL2-X 티벡터용 플라스미드의 유전자지도를 나타내는 모식도이고,

도 5는 본 발명의 pGL2-X 티벡터용 플라스미드를 티벡터로 전환시키기 위하여 XcmⅠ 제한효소로 절단하여 전기영동한 결과를 나타내는 아가로스젤 전기영동 사진이고,

2레인: 클로닝되어 분리된 pGL2-X 티벡터용 플라스미드,

3레인: pGL2-X 티벡터용 플라스미드를 티벡터로 전환시키기 위하여 XcmⅠ 제한효소로 절단하여 만들어지는 티벡터(pGL2-T)

도 6은 본 발명의 pGL2-T 티벡터용 플라스미드에 포함된 클로닝부위의 염기서열을 나타내는 그림이고,

도 7은 아세틸콜린 리셉터 델타 서브유니트 프로모터(AchRδ subunit promoter) 유전자를 PCR로 증폭시킨 후 전기영동한 결과를 나타내는 아가로스젤 전기영동 사진이고,

1레인: 100 bp DNA 래더, 2레인: 증폭된 유전자 산물

도 8은 본 발명의 pGL2-X 티벡터용 플라스미드로부터 전환된 티벡터에 아세틸콜린 리셉터 델타 서브유니트 프로모터 유전자를 클로닝하고, StyⅠ 또는 PstⅠ으로 절단한 후 전기영동한 결과를 나타내는 아가로스젤 전기영동 사진이고,

2레인: 자가결합된(self-ligated) 플라스미드에서 잘려져 나오는 3,415 bp와 2,179 bp의 유전자 조각,

3레인: AchRδ 소단위(subunit) 프로모터가 바르게 클로닝된 플라스미드에서 잘려져 나오는 3,415 bp, 2,312 bp와 393 bp의 유전자 조각

4레인 :100 bp DNA 래더

도 9는 본 발명의 pGL2-X 티벡터용 플라스미드에 아세틸콜린 리셉터 델타 서브유니트 프로모터 유전자를 클로닝한 후 뉴레귤린(neuregulin)에 의한 프로모터 활성화를 보여주는 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터 분석에 용이한 티벡터용 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 티벡터용 플라스미드를 프로모터 분석에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 프로모터 분석에 용이한 티벡터용 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 티벡터용 플라스미드는 절단하였을 때 유전자의 3' 말단에 뉴클레오티드 하나만을 남길 수 있는 제한효소의 인식부위를 포함한다. 상기 제한효소에는 AspEⅠ, HphⅠ, MboⅡ 및 XcmⅠ등이 있으며, 상기 제한효소의 인식부위가 모벡터에 존재하지 않는 조합으로 모벡터와 제한효소 인식부위는 서로 선별하여 사용될 수 있다.

본 발명의 티벡터용 플라스미드는 두 개의 제한효소 절단부위 사이에 100 bp이상 임의의 염기서열이 존재하며, 제한효소로 잘랐을 때 잘려나가는 DNA 조각의 3' 말단에 아데닌 염기가 만들어지는 상기 염기서열이 리포터 유전자 바로 앞에 위치한다. 상기 염기서열은 임의의 유전자의 염기서열 중 일부 또는 전체일 수 있으며, 또는 임의의 무작위로 선택된 염기서열일 수도 있다. 유전자는 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehide 3-posphate dehydrogenase), S-아데노실메티오닌 디카르복실라제 (adenosylmethionine decarboxylase) 또는 α2-마크로글로불린 수용체(macroglobulin receptor) 등으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 리포터 유전자는 개똥벌레 형광효소, CAT(Chloramphenicol acetyltransferase), 알칼라인 포스파타제, 베타-갈락토시다제 등이 사용되는 것이 바람직하며 개똥벌레 형광효소인 것이 더욱 바람직하다. 상기 리포터 유전자에 제한효소의 절단부위가존재할 때에는 부위특이적 돌연변이 등을 유발시켜 인식부위를 변형시키는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 두 XcmI 제한효소 절단부위를 포함하는 유전자로서 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 선택하여 중합효소연쇄반응으로 증폭시켰다. 먼저, 제한효소인 EcoRI 및 XcmI의 인식부위를 가지는 프라이머를 합성하여 중합연쇄반응을 수행하고 그 증폭산물을 아가로스젤 전기영동으로 확인한 결과, 135 bp 크기의 증폭산물을 얻었으며(도 1참조), 이 PCR 산물을 젤 용출 키트(Gel-elution kit)를 사용하여 정제한 후 pBluescript SK 벡터에 클로닝하였다.

상기의 재조합 벡터를 제한효소로 절단하여 증폭된 유전자 부분만을 수득하고, 이를 프로모터 분석용 벡터의 다중클로닝부위에 클로닝하여 프로모터 분석이 용이한 티벡터용 플라스미드를 제조하였다. 이 때, 상기의 재조합 벡터를 티벡터용 플라스미드로 이용할 수도 있지만, 티벡터에 클로닝된 증폭 유전자를 용도에 맞는 다른 대장균용 또는 포유동물용 플라스미드나 셔틀벡터(shuttle vector) 또는 프로모터 분석용 벡터에 서브클로닝하여 다양한 티벡터를 제조할 수 있다. 본 발명에서는 프로모터 분석용 티벡터 개발이 목적이므로 프로모터 분석용 벡터에 증폭유전자를 서브클로닝 하였다. 제한효소는 증폭 유전자와 프로모터 분석용 벡터를 절단하지 않는 제한효소를 선별하여, 통상적인 반응에 의하여 절단하고, 이를 아가로스젤에 전기영동으로 전개시킨 다음 증폭된 유전자 부분만을 순수 분리한다. 다음으로, 이를 프로모터 분석용 벡터의 다중클로닝부위에 있는 적절한 제한효소 인식부위에 증폭된 유전자가 삽입될 수 있도록 클로닝하여 목적하는 티벡터용 플라스미드를 얻었다. 그러나 상기의 티벡터용 플라스미드는 개똥벌레 유전자에 XcmI의 인식부위가 존재하여 티벡터로의 전환 시, 리포터 유전자가 잘려 벡터로서의 기능을 할 수 없게 되므로, 본 발명자들은 특정부위 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법으로 XcmI의 인식부위를 돌연변이(silent mutation)시켜, 프로모터 분석이 용이한 티벡터용 플라스미드를 완성하였고, 이를 "pGL2-X"로 명명하였다.

본 발명의 프로모터 분석이 용이한 티벡터용 플라스미드는 티벡터용 플라스미드에 의하여 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드를 분리하고 이를 XcmI 제한효소로 절단한 다음 삽입된 유전자가 제외된 플라스미드 부분을 순수 분리함으로써 용이하게 티벡터로 전환시킬 수 있는 바, 저장성이 우수하며, 티벡터로의 전환이 용이함은 물론, 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭된 유전자를 클로닝하여 바로 프로모터 분석에 쉽게 적용시킬 수 있는 장점을 내포한다.

또한, 본 발명은 프로모터 분석에 용이한 티벡터용 플라스미드를 포함하는 대장균 형질전환체를 제공한다.

본 발명자들은 상기의 pGL2-X 티벡터용 플라스미드를 사용하여 대장균(XL1-Blue)을 형질전환시켜 형질전환체를 제조하였으며, 형질전환된 대장균을"Escherichia coli(TV-3)"라 명명하고, 이를 2001년 7월 28일부로 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10303).

먼저, 본 발명자들은 본 발명의 티벡터용 플라스미드를 티벡터로 전환시킨 후 티벡터의 클로닝 효율을 분석하였다. 고순도로 분리 및 정제한 본 발명의 티벡터용 플라스미드에 XcmⅠ 제한효소를 처리하여 전기영동한 결과, 아가로스젤 상에서의 이동거리에 차이가 남을 확인하였으며(도 5참조), 아가로스젤 상에서 분리된 티벡터를 정제하여 클로닝 효율 분석에 사용하였다. pGL2-X 티벡터용 플라스미드에 제한효소 XcmⅠ을 처리하여 전환된 티벡터의 클로닝 효율을 검증하기 위하여, 아세틸콜린 리셉터 델타서브유니트(AchRδsubunit) 프로모터를 중합효소연쇄반응으로 증폭한 다음, 티벡터에 연결하여 클로닝하였다. 먼저, AchRδ소단위(subunit) 프로모터 증폭을 위하여 유전자의 염기서열에 특이적인서열번호 5및서열번호 6로 기재되는 프라이머를 합성하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 유전자 산물을 전기영동으로 분석한 결과, 525 bp 크기의 AchRδ소단위 프로모터가 증폭된 것이 확인되었다(도 7참조). 상기의 AchRδ소단위 프로모터의 증폭산물을 정제하여 본 발명의 티벡터에 연결시킨 후 대장균에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균을 LB 배지에 배양한 다음 플라스미드를 분리하고, 티벡터 내에 존재하는 StyI 제한효소와 AchRδ소단위 프로모터 유전자 서열 내에 존재하는 PstI 제한효소로 잘라 클로닝 여부와 방향을 확인하였다(도 8참조). AchRδ소단위 프로모터가 바르게 클로닝된 콜로니의 수를 세어 AchRδ소단위 프로모터가 도입되지 않은 콜로니의 수와 비교한 결과, 총 8개의 콜로니 중 5개의 콜로니가 AchRδ소단위 프로모터를 가지는 것을 확인하였으며, 이는 63%의 클로닝 효율을 나타내는 것이었다.

또한, 본 발명자들은 본 발명에 의해 개발된 티벡터에 클로닝된 프로모터에 의해 개똥벌레 형광유전자가 활성을 나타내는지 그리고 AchRδ소단위 프로모터를 활성화시키는 것으로 보고된 신경영양인자의 일종인 뉴레귤린(neuregulin)에 의해 활성화 되는지 여부를 시험하여, 개발과정에서 부위 특이적인 돌연변이법으로 변이된 프로모터 분석 티벡터용 플라스미드 내에 존재하는 개똥벌레 형광유전자의 활성을 평가하였다. 그 결과, 뉴레귤린을 처리한 세포주에서 약 2.2배 정도 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었는데, 이러한 결과는 기 보고된 AchRδsubunit 프로모터분석 연구에서 보고된 결과(Si, J., et al., Journal of Biological Chemistry,1997, 272, 10367)와 거의 일치하는 것으로 pGL2-X에 존재하는 개똥벌레 형광 유전자는 돌연변이 후에도 활성에는 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다(도 9참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 중합효소연쇄반응에 의한 유전자의 증폭

<1-1> 쥐의 뇌조직으로부터 1차 cDNA 합성

본 발명자들은 두 XcmI 제한효소 절단부위를 포함하는 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭시킴에 있어서 주형으로 사용될 유전자를 확보하기 위하여, TRI 시약(Molecular Research Center, Inc., U.S.A.)을 이용하여 쥐의 뇌조직으로부터 총 RNA(total RNA)를 분리한 다음, 이 중 2 ㎍의 RNA를 주형으로 하여 40 U의 RNase 저해제, 1 ㎍의 올리고(dT)15 및 1 mM 디옥시뉴클레오티드 삼인산을 포함하는 시약조성에 10 U의 조류골수아구증 바이러스(avian myeloblastosis virus, AMV)로부터 조제된 역전사효소(reverse transcriptase, Promega, U.S.A.)를 첨가하여 1차 cDNA를 합성하였다. 먼저, RNA가 이루는 2차 또는 3차 구조를 제거하기 위하여 역전사효소를 제외한 반응액을 65℃에서 5분간 반응시킨 다음, 바로 얼음에 담그고 역전사 효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 실시하였다. 반응이 끝난 후, 중합효소연쇄반응의 저해제로 작용할 수 있는 역전사 효소를 불활성화하기 위하여 95℃에서 5분간 가열하였으며, 합성된 1차 cDNA를 중합효소연쇄반응의 주형으로 사용하였다.

<1-2> 유전자의 증폭

본 발명자들은 상기 <1-1>에서 합성된 cDNA를 중합효소연쇄반응(PCR)을 통하여 증폭시켰다. 프라이머로는 제한효소인 EcoRI 및 XcmI의 인식부위를 가지는서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 프라이머를 합성하여 사용하였으며, 50 mM 염화칼륨, 0.1% 트리톤 X-100, 1.5 mM 염화마그네슘 및 150 μM의 4종의 디옥시뉴클레오티드 삼인산(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)을 포함한 10 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 9.0) 용액 50 ㎕에 20 p㏖의 프라이머 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소(Promega, U.S.A.)를 첨가하고, cDNA 50 ng을 주형으로 하여, 중합효소연쇄반응기(GeneAmp 2400, Perkin Elmer, U.S.A.)에서 95℃에서 30초, 46℃에서 30초 및 72℃에서 45초를 단위 온도변화로 하는 30회의 사이클로 중합효소연쇄반응을 수행하고 그 증폭산물을 아가로스젤 전기영동으로 확인하였다.

그 결과, 중합효소연쇄반응에 의하여 135 bp 크기의 유전자 증폭산물을 상기한 주형에서 주요한 증폭산물로 얻을 수 있었으며(도 1), 상기 135 bp 크기의 유전자 증폭산물을 젤-용출키트(Gel-elution kit, Qiagen, Germany)를 사용하여 정해진 방법에 따라 정제하여 pBluescript SK 벡터에 클로닝하는데 사용하였다.

<실시예 2> pBluescript SK 벡터에 증폭된 유전자가 클로닝된 재조합 벡터의 제조

상기실시예 1에서 얻은 증폭된 유전자를 pBluescript SK 벡터에 클로닝하기 위하여, 먼저 증폭된 유전자와 pBluescript SK 벡터를 EcoRI으로 통상적인 방법으로 절단하였다. 1 ㎍ DNA당 5 U의 EcoRⅠ제한효소를 처리하여 37℃에서 10시간 동안 반응시킨 다음 1%의 아가로스젤 상에 전기영동 하고 젤-용출 키트를 이용하여 각각 고순도로 분리 및 정제하였다. 30 ng의 증폭된 유전자와 50 ng의pBluescript SK 벡터를 3 U의 T4 DNA 연결효소(Promega, U.S.A.)를 사용하여 연결반응을 실시하였다. 반응 완충액으로 10 mM 염화마그네슘, 10 mM DTT 및 1 mM 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate)이 포함된 30 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 7.8) 용액을 사용하였고, 18℃에서 12시간 내지 24시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 열쇼크(heat-shock) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰는 바, pBluescript SK 벡터와 연결반응을 시킨 유전자 용액 10 ㎕를 염화칼슘으로 처리된 100 ㎕의 대장균 XL1-Blue 균액에 첨가하여 얼음에서 방치하였다. 30분 후, 42℃에서 2분간 열을 가한 후 얼음에서 1분간 식히고 800 ㎕의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 45분간 진탕 배양한 다음, 앰피실린(ampicillin)이 50 ㎍/㎖의 농도로 들어있는 맥콩키(MacConkey) 아가 플레이트에 도말하고, 이 플레이트를 37℃에서 12시간 내지 18시간 동안 배양한 후, 생성된 콜로니(colony) 중 흰색을 띄는 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였다.

상기한 방법에 의하여 제조된 재조합 벡터를 제한효소인 SmaI과 HindIII로 절단하여 하기의 방법으로 증폭된 유전자가 삽입되었는지를 확인하고 프로모터 분석용 플라스미드로 서브클로닝하기 위하여 정제하였다. 고순도로 분리 및 정제된 재조합 벡터에 1 ㎍ DNA당 5 U의 각 SmaI과 HindIII 제한효소를 처리하여 37℃에서 5시간 동안 반응시킨 다음, 1% 아가로스젤에서 100 V로 15분간 전기영동하였다.

그 결과, 153 bp 크기의 유전자가　아가로스젤　상에　전개됨으로써 pBluescript SK 벡터에　클로닝된　것이 확인되었으며(도 2), 상기　153 bp 크기의　유전자를 젤-용출 키트를 사용하여 고순도로 정제하였다.

<실시예 3> 프로모터 분석용 플라스미드에 증폭된 유전자의 클로닝

상기실시예 2에서 얻은 XcmI 제한효소의 인식부위를 말단에 포함하는 153 bp 크기의 유전자를 프로모터 분석용 플라스미드에 클로닝하기 위하여, 프로모터 분석용 플라스미드로서 pGL2-Basic(Promega, U.S.A.)을 선택하였으며, 통상적인 재조합 기술에 의하여 클로닝하였다. pGL2-Basic 플라스미드 1 ㎍당 5 U의 각 SmaI과 HindIII 제한효소를 처리하여 37℃에서 5시간 동안 반응시켰고, 이 반응액을 중합효소연쇄반응 산물을 정제하는 키트인 QIAquick PCR 정제키트(Qiagen, Germany)로 정제한 후실시예 2에서 정제된 유전자와 3 U의 T4 DNA 연결효소(Promega, U.S.A.)를 이용하여 16℃에서 12시간 내지 18시간 동안 반응시킴으로써 연결하였다. 다음으로, 상기 반응액으로 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켰다. 유전자용액 10 ㎕를 100 ㎕의 대장균 XL1-Blue 균액에 첨가하여 얼음에서 방치하고 30분 후 42℃에서 2분간 열을 가한 후, 얼음에서 1분간 식히고, 800 ㎕의 LB 배지를 첨가하여 37℃에서 45분간 진탕 배양한 다음, 앰피실린이 50 ㎍/㎖의 농도로 들어있는 LB 배지 플레이트에 도말하였다. 이 플레이트를 37℃에서 12시간 내지 18시간 동안 배양한 다음 생성된 콜로니(colony)들로부터 사용 가능한 플라스미드로 분리하였으며, 이 티벡터용 플라스미드를 "pGL2-B"로 명명하였다.

분리된 pGL2-B 티벡터용 플라스미드를 1% 아가로스젤에서 전기영동하여 확인하였다(도 3).

<실시예 4> 개똥벌레 형광효소 유전자 내에 존재하는 XcmⅠ인식부위의 부위 특이적 돌연변이 유도

상기실시예 3에서 재조합된 프로모터 분석이 용이한 티벡터용 플라스미드 pGL2-B는 XcmI의 인식부위가 개똥벌레형광효소유전자 내에 존재함으로서 티벡터로 전환시 개똥벌레형광효소유전자가 절단되어 티벡터로의 전환이 불가능하다. 이 문제를 해결하기 위해 본 발명자들은 통상적으로 사용되는 부위 특이적인 돌연변이 키트(Transformer site-directed mutagenesis kit, Clontech, U.S.A.)를 사용하여 돌연변이(silent mutation)를 야기시켰다. 0.1 ㎍의 pGL2-B 벡터와 각 0.1 ㎍의서열번호 3으로 기재되는 선별프라이머(selection primer)와서열번호 4로 기재되는 변이프라이머(mutagenic primer)를 혼합하여 100℃에서 3분간 끓이고 식힌 후 3 U의 T4 DNA 중합효소와 5 U의 T4 DNA 결합효소를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 합성과 연결 반응을 실시하였다. 에탄올 침전법으로 반응정지와 유전자 정제를 동시에 시행한 후 첫 번째 선별반응으로 5 U의 SalI 제한효소를 37℃에서 2시간 동안 처리한 후 열쇼크 방법을 이용하여 대장균 BMH 71-18 mutS에 형질전환시켰다. 형질전환시킨 균주를 37℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하고, 미니프렙키트(mini-prep kit, Qiagen, Germany)를 사용하여 플라스미드를 회수하고 다시 SalI 제한효소를 처리하여 2차 선별한 후, 대장균 XL1-Blue로 형질전환 시켰다. 형질전환된 균주를 플레이트에 도말하고 37℃에서 12시간 내지 18시간 동안 배양한 다음 생성된 콜로니(colony)들로부터 부위특이적인 돌연변이가 일어났는지를 XcmI 제한효소 처리로 확인하였다.

그 결과, XcmI에 의해 절단되지 않는 개똥벌레 유전자를 가지는 pGL2-B 벡터를 확인하여 이를 “pGL2-X”로 명명하였다(도 4).

본 발명자들은 상기 티벡터용 플라스미드 pGL2-X를 대장균 XL1-Blue에 형질전환시켰으며, 상기 형질전환체를 2001년 7월 28일부로 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호: KCCM-10303).

<실험예 1> 티벡터용 플라스미드의 티벡터로의 전환

상기실시예 4에서 얻은 XcmI 제한효소의 인식부위를 말단에 포함하는 153 bp 크기의 유전자가 클로닝된 프로모터 분석이 용이한 티벡터용 플라스미드를 티벡터로 전환하기 위하여, 본 발명자들은 고순도로 분리 및 정제한 pGL2-X 티벡터용 플라스미드에 1㎍ DNA당 5 U의 XcmⅠ제한효소를 처리하여 37℃에서 7시간 동안 반응시킨 다음 1%의 아가로스젤 상에 전기영동 하였다.

그 결과, pGL2-X 티벡터용 플라스미드가 절단되었을 때에 아가로스젤 상에서의 이동거리에서 차이가 남을 확인하였다(도 5). 아가로스젤 상에서 분리된 티벡터를 젤-용출 키트를 사용하여 다시 정제한 다음 티벡터로 사용하였다. pGL2-X 티벡터용 플라스미드로부터 전환된 티벡터(pGL2-T)의 다중 클로닝부위의 유전자 염기서열(서열번호 7, 8, 9및10)을도 6에 나타내었다.

<실험예 2> 티벡터용 플라스미드로부터 전환된 티벡터를 이용한 클로닝

본 발명자들은 pGL2-X 티벡터용 플라스미드에 제한효소 XcmⅠ을 처리하여 전환된 본 발명의 티벡터 pGL2-T의 클로닝 효율을 검증하기 위하여, 아세틸콜린 리셉터 델타서브유니트(AchRδsubunit) 프로모터를 중합효소연쇄반응으로 증폭한 다음, 티벡터에 연결하여 클로닝하였다. 먼저, AchRδsubunit 프로모터 증폭을 위하여 유전자의 염기서열에 특이적인서열번호 5및서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 합성하였다.

유전자 증폭을 위하여, 50 ㎕당 10 mM 트리스 염화수소(pH9.0), 50 mM 염화칼륨, 0.1% 트리톤 X-100, 1.5 mM 염화마그네슘 및 150 μM의 4종류의 디옥시뉴클레오티드 삼인산(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)을 포함하는 시약조성에, 20 pmol의 상기 2종의 프라이머 및 2.5 U의 Taq DNA 중합효소(Promega, U.S.A.)를 첨가한 다음, 50 ng의 pcDNA/AchRδ소단위 프로모터를 주형으로 하여, 중합효소연쇄반응기(GeneAmp 2400, Perkin Elmer, U.S.A.)에서 95℃에서 30초 49℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분을 단위 온도 변화로 하는 30회의 사이클로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 유전자 증폭산물을 1% 아가로스젤에서 전기영동하여 확인한 후 유전자 증폭산물을 정제하는 QIAquick PCR 정제키트(Qiagen, Germany)를 사용하여 정제하였다.

그 결과, 525 bp 크기의 AchRδ소단위 프로모터가 증폭된 것이 확인되었으며(도 7), 정제된 30 ng의 AchRδ소단위 프로모터의 증폭산물과실험예 1에서 제조된 50 ng의 티벡터를 3 U의 T4 DNA 연결효소(Promega, U.S.A.)로 연결하여실시예 2에서와 동일한 방법으로 대장균 XL1-Blue을 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 다시 3 ㎖의 LB 배지에 배양한 다음 플라스미드를 분리하고, 티벡터내에 존재하는 StyI 제한효소와 AchRδ소단위 프로모터 유전자 서열 내에 존재하는 PstI 제한효소로 잘라 클로닝 여부와 방향을 확인하였다.

그 결과, 총 8개의 콜로니 중 5개의 콜로니가 AchRδ소단위 프로모터를 가지는 것을 확인하였으며, 이는 63%의 클로닝 효율을 나타낸다(도 8).

<실험예 3> pGL2-T/AchRδ 소단위 프로모터 플라스미드를 이용한 개똥벌레 형광유전자의 활성 분석

본 발명자들은 본 발명의 티벡터에 클로닝된 프로모터에 의해 개똥벌레 형광유전자가 활성을 나타내는지 그리고 AchRδ소단위 프로모터를 활성화하는 것으로 보고된 신경영양인자의 일종인 뉴레귤린(neuregulin)에 의해 활성화 되는지 여부를 분석하여, 개발과정에서 부위 특이적인 돌연변이법으로 변이된 프로모터 분석 티벡터용 플라스미드내에 존재하는 개똥벌레 형광유전자의 활성을 평가하였다. 각 1 ㎍의 pCMVβ-gal 플라스미드와 pGL2-T/AchRδ소단위 프로모터 플라스미드, 그리고 대조군으로 pGL2-Basic 벡터(Mock)를 10% FBS, DMEM에서 배양한 근육아세포(myoblast)의 일종인 C2C12 세포주에 리포펙타민(Lipofectamine, Gibco, USA)을 이용하여 트랜지언트 트랜스펙션(transient transfection) 시킨 후, 뉴레귤린을 처리하고 개똥벌레 형광유전자의 활성(Luciferase assay kit, Promega, USA)과 β-갈락토시다제(galactosidase)의 활성을 측정하였다.

그 결과, 뉴레귤린을 처리한 세포주에서 약 2.2배 정도 개똥벌레 형광유전자의 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 이러한 결과는 기존에 보고된AchRδ소단위 프로모터 분석 연구에서 보고된 결과와 거의 일치하는 결과로 pGL2-X에 존재하는 개똥벌레 형광 유전자는 돌연변이 후에도 활성에는 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 티벡터용 플라스미드는 티벡터로의 전환 및 저장하기가 용이하며, 기존의 프로모터 분석과정에서 겪게되는 복잡한 유전자재조합 과정을 간편히 한다는 장점이 있으므로 프로모터를 분석하는데 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> National Institute of Health <120> Reporter gene-containing plasmid which is convertible to T-vector and the preparation method thereof <130> 1p-06-31B <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase primer 1 <400> 1 ggaattccca tgtttgtgat ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase primer 2 <400> 2 ggaattccca aagttgtcat gga 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> selection primer <400> 3 ctggatccgt cagccgatgc cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutagenic primer <400> 4 ttgttccatt tcatcacggt tt 22 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acethylcoline receptor delta subunit primer <400> 5 actcattctg tagaccag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acethylcoline receptor subunit primer 2 <400> 6 cccttcagcc tgttgctg 18 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL2-T multi-cloning site <400> 7 aacagtaccg gaatgccaag cttgatatcg aattcccatg ttt 43 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL2-T multi-cloning site <400> 8 ttgtcatggc cttacggttc gaactatagc ttaagggtac aa 42 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL2-T multi-cloning site <400> 9 actttgggaa ttcctgcagc ccgggttatg ttagctcagt taca 44 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGL2-T multi-cloning site <400> 10 ttgaaaccct taaggacgtc gggcccaata caatcgagtc aatgt 45

Claims

약 100 bp 이상의 DNA, 상기 DNA의 하류(downstream)에 상기 DNA와 인접하여 위치하는 리포터 유전자 및 상기 DNA의 양쪽에 위치하고 상기 DNA를 절단하였을 때 상기 DNA의 양쪽 3' 말단에 티민 염기 하나만을 남길 수 있는 제한효소의 인식부위를 포함하는 티벡터용 플라스미드를 이용한 프로모터 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 DNA는 글리세르알데하이드 3-인산 탈수소효소(glyceraldehide 3-posphate dehydrogenase), S-아데노실메티오닌 디카르복실라제 (adenosylmethionine decarboxylase) 및 α2-마크로글로불린 수용체(macroglobulin receptor)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 제한효소는 AspEⅠ, HphⅠ, MboⅡ 및 XcmⅠ으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터 분석방법.
제 3항에 있어서, 상기 제한효소는 XcmⅠ인 것을 특징으로 하는 프로모터 분석방법.
제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 개똥벌레 형광효소(firefly luciferase), CAT(Chloramphenicol acetyltransferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 및 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로모터 분석방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 티벡터용 플라스미드는 XcmⅠ제한효소 인식부위 및 개똥벌레 형광효소 리포터 유전자를 포함하는 도 4에 기재된 pGL2-X인 것을 특징으로 하는 프로모터 분석방법.
도 4에 기재된 티벡터용 플라스미드 pGL2-X에 의하여 형질전환된 대장균 형질전환체Escherichia coli(TV-3)(KCCM-10303).
삭제