CN101177690B - 可定向克隆启动子并研究其活性的t载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可直接定向克隆启动子并研究启动子活性的T载体及其构建方法，包括以下步骤：1)制备含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T载体，包括间隔DNA序列即带有与出发载体具有不同抗性基因或其它选择标记的序列，紧密连接于此间隔DNA序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列；2)用XcmI酶或XcmI酶同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体；其中所述步骤1)中的XcmI盒通过PCR扩增得到，在上游引物XcmI酶识别位点中尚包含稀有限制酶PmeI识别位点的前半部分，用于启动子PCR产物的定向克隆分析。本发明中的方法同样适用于普通克隆型T载体和表达型T载体的制备，将在基因工程领域中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，特别是一种高通量可直接定向克隆启动子并研究启动子功能的T载体构建方法。
背景技术
T载体是用于直接克隆PCR产物的线性载体，A-T克隆技术被证明对PCR产物的克隆极具价值。此方法的原理是利用Taq DNA聚合酶可向扩增产物的3’端多加一个非模板依赖的dA碱基，此dA刚与线性T载体3’突出端的dT配对，直接进行高效率的连接，而无需限制性内切酶酶切的过程。
在启动子研究领域中，启动子的PCR扩增产物往往需要克隆到带有报道基因如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(luciferase)或分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的载体中，常规的方法是通过亚克隆完成，即首先将PCR产物克隆至传统克隆型T载体，之后采用限制性内切酶切割下目的基因片段，再将其亚克隆至无启动子的报告基因载体。然而这种方法有两个缺点：一是亚克隆的效率受到酶切效果、目的基因回收质量、得率和连接效率等诸多因素的制约；二是在启动子的研究过程中，通常片段愈长，其含有的限制性内切酶位点就愈多，在克隆过程中必然会受到酶切位点选择的限制问题。这种矛盾在进行高通量筛选启动子时显得尤其突出。它可以通过制备直接用于启动子克隆和功能分析的T载体而得到解决。目前尚无商品化的启动子分析性T载体。
pEGFP-1是用于研究启动子活性的载体，其中报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)由于荧光性质稳定，荧光强度高，对细胞无毒性，检测方便，广泛用于启动子的研究中。该载体具有原核和真核的复制起始点如pUC、f1和SV40的复制起始点，同时具有卡那霉素(Kana)抗性基因和新霉素(Neo)抗性基因作为筛选标记，EGFP基因序列位于其多克隆位点的下游。pGL3-basic和pSEAP2-basic是另2种常用的启动子分析载体，分别以luciferase和SEAP作为报告基因，都具有氨苄青霉素(Amp)抗性基因作为筛选标记。
目前，经典的T载体的构建方法有2种。第一种方法是先将质粒通过SmaI或EcoRV等产生平端切点的内切酶线性化，然后利用末端转移酶或具有末端转移酶活性的Taq酶在dTTP或ddTTP环境中实现T的添加(Papp T，Kirchner S，Diener U，Jafari，M，GolkaA，SchiffmannD，1995.Cloning of PCR fragments with a modified M13mpl8 T-vector.Trends Genet.11，169)。第二种方法是限制性内切酶酶切的方法，首先制备前T载体，即在出发载体中引入2个串联的能产生3’突出单碱基末端的限制性内切酶如XcmI、AhdI(或它们的同裂酶)等的识别位点，称为XcmI盒、AhdI盒，这些酶切割特异性序列后产生的末端为3’突出单碱基N(任意碱基)，如果将该碱基设计为T，则可以通过酶切前T载体使其产生2个3’突出T碱基而成为T载体(Vries E.，1998.A vector for direct cloning of PCR products in a double Xcm I restriction siteoffering compatible single 3’overhanging T residues.Mol Biotechnol.10，273)。
目前就T载体的制备方法来讲，存在着不足之处，主要表现在以下两个方面：
一、非重组背景较高，克隆效率低下。
末端转移酶或Taq酶制备T载体有时由于酶加T的效率低下，有些载体分子末端根本没被修饰从而导致两端均未加T的平端线性质粒的存在，在连接过程中难以避免载体自身环化，有时也存在线性质粒在加T尾过程中其两端的序列被部分删除的问题。
采用XcmI、AhdI等限制性内切酶制备T载体的方法也会因为酶切效率相对较低，经常产生酶切不完全的现象，出现克隆过程中非重组背景过高的问题。目前解决这一问题最有效的方法是在前T载体的两个XcmI或两个AhdI酶切位点之间引入足够长的间隔DNA，经琼脂糖电泳后将完全酶切的质粒和部分酶切的质粒分开。然而，引入间隔DNA带来的一个新问题是：由于环型超螺旋质粒在琼脂糖凝胶电泳中比分子量相当的线性质粒涌动快，因此完全未被酶切的环型超螺旋前T载体往往与分子量小于它的T载体(完全切开)混杂，因此造成非重组转化子的本底较高，如果前T载体缺乏区别于T载体的筛选标记，就要面临较繁琐的筛选工作。
二、无法实现定向克隆，筛选工作量大。
在使用商品化的传统T载体进行目的基因的克隆时，目的基因会以不确定的方向插入载体，两个方向插入的机率相同。如果此T载体仅仅用来进行目的基因的克隆、扩增和保存，并无妨碍；但如果是用于基因的表达或启动子分析等，则需要进行较繁琐的筛选工作筛选出方向正确的克隆，耗时耗力，尤其不适合高通量筛选启动子的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效率可定向克隆启动子扩增产物的T载体制备方法，真正做到高通量、直接、定向的克隆表达，此方法同样适用于普通克隆型T载体和表达型T载体的制备，将在基因工程领域中发挥重要作用。
本发明所提供的制备T载体的方法，包括以下步骤：
1)制备含有XcmI盒(或AhdI盒)的前T载体pEGFP-UC，pGL3-UC和pSEAP2-UC。所述XcmI盒包括间隔DNA序列，紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列；
其中前T载体pEGFP-UC间隔序列为质粒pUC18基因全序列，所述XcmI盒还包括连接于所述各一个Xcm I酶切位点序列的酶切位点BglII和XhoI，上游引物的XcmI识别位点中尚有稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即“GTTT”，最后一个T将构成XcmI酶切割得到的3’突出T。PmeI位点的特征是：①不存在于出发载体pEGFP-1序列中；②识别序列中除两端以外的碱基中含有T，由它构成3’突出T。其它符合该2个条件的位点如PacI、SgfI、EcoRV等的位点亦可引入至XcmI盒中。
前T载体pGL3-UC和pSEAP2-UC间隔序列为质粒pUC-K基因全序列，pUC-K为发明人自行构建的质粒，其特征为以卡那霉素抗性基因取代pUC18中的氨苄青霉素抗性基因，其余序列与pUC18相同。所述XcmI盒还包括连接于所述各一个XcmI位点的MluI和XhoI酶切位点，上游引物的XcmI切割位点前(包括潜在的3’突出T)尚有稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即“GTTT”。
2)用XcmI或XcmI同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体；
本发明具体实现过程如下：
1.XcmI盒的制备
根据质粒pUC18和pUC-K的序列，设计引物序列为：
pUC-F：5’-CGAAGATCT AGACCAAGTTTACTCA-3’
pUC-R：5’-CAACTCGAG 
ACAGTTACCAATGCT-3’
pUC-KF：5’-CGAACGCGT 
AGACCAAGTTTACTCA-3’
三条引物的5’端分别引入限制性内切酶BglII、XhoI和MluI识别位点，用单线标示；XcmI酶识别位点用斜体标示；在pUC-F和pUC-KF引物的XcmI识别位点中尚包含稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即GTTT，最后一个T将构成XcmI酶切割得到的3’突出T，用波线标示，用于启动子PCR产物的定向克隆分析。
pUC-F和pUC-R用于扩增pUC18；pUC-KF和pUC-R用于扩增pUC-K。将所得PCR产物自身环化，涂布于带有相应抗生素的平板并进行蓝白斑筛选，确定其抗生素抗性和LacZ’筛选标记完整，同时酶切鉴定筛选XcmI盒正确引入的阳性克隆，分别命名为pUC-X和pUC-KX。用BglII、XhoI双酶切pUC-X，用MluI和XhoI双酶切pUC-KX，制成XcmI盒。
2.在载体pEGFP-1、pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位点中引入XcmI盒构建前T载体
pEGFP-1载体用BglII和SalI酶切，由于内切酶XhoI和SalI是同尾酶，所以pUC-X和pEGFP-1在酶切回收后可以直接进行连接反应。pGL3-basic和pSEAP2-basic用MluI和XhoI双酶切，酶切产物与MluI和XhoI双酶切的pUC-KX进行连接。XcmI盒的引入使三种重组子均带有Amp和Kana双抗性和LacZ’筛选标记，因此将连接产物转化、涂布于具有Amp和Kana双抗生素的平板，大大减少非重组背景，提高克隆效率。经BamHI酶切进一步鉴定，构建的载体分别命名为pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，即为前T载体(图1，2，3)。
3.T载体的制备 [0028] 3.T载体的制备
用XcmI酶切前T载体pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，经1％琼脂糖凝胶电泳后回收大片段。切胶回收的大片段即是T载体pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T，可以用于PCR产物的定向克隆。此时，该载体产生的粘性末端为：
5’---CCAGGTTT CGGTTGG---3’
3’---GGTCAAA TGCCAACC---5’
4.启动子PCR扩增产物与T载体的连接及定向克隆
启动子扩增引物的设计必须遵循的原则是：将稀有酶PmeI(或引入的其它酶位点)识别位点的后半部分“AAAC”作为下游引物5’端起始碱基，而上游引物5’端不能以“AAAC”起始。PCR产物采用Taq DNA扩增酶扩增，或者采用Pfu、Primestar等高保真酶扩增后再通过Taq扩增酶加A尾，得到的粘性末端为：
5’NNN-------------NGTTTA 3’
3’ANNN-------------NCAAA 5，
这样当PCR扩增产物与上述T载体反向连接时，由下游引物提供的5’端“AAAC”与T 载体XcmI盒提供的“GTTT”融合而形成完整的PmeI位点(GTTTAAAC)，且pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T载体本身并没有此识别位点，因此可以通过PmeI酶切连接产物而去除反向连接克隆。PmeI酶切过程于转化前完成，大大提高筛选得到PCR产物正向插入的阳性克隆的机率。流程如图4所示。
5.通过蓝白斑筛选标记筛选阳性克隆。
考虑到T载体中可能混杂的未被XcmI酶切的或仅在其单一位点酶切后自身环化的质粒，它们带有完整的LacZ’读码框，其转化子在含有IPTG和X-Gal的固体培养基上生长为蓝色菌落，而T载体克隆产物呈白色菌落，因而可以通过蓝白斑筛选的方法排除这些非重组转化子，挑取白色菌落进行鉴定，进一步提高阳性克隆效率。
本发明中构建T载体的方法具有如下优势：
1.XcmI盒中的长间隔序列选用质粒pUC18或pUC-K基因的全序列或其它符合条件(带有与出发载体不同的筛选标记)的序列，以质粒作为模板进行PCR扩增，扩增效率高。
2.XcmI盒中的质粒pUC18或pUC-K基因全序列为前T载体增加了筛选标记，使前T载体可以具备卡那霉素和氨苄青霉素双重抗性，同时又具有蓝白斑筛选标记，可以简便、高效地筛选带有间隔基因序列的前T载体。
3.在采用XcmI切割前T载体而制备T载体的过程中，长间隔序列有助于将XcmI完全酶切产生的T载体和部分酶切的质粒分离开。但在酶活性较低的情况下，存在较多的完全未被酶切的环型超螺旋前T载体，它们往往与分子量小于它的T载体(完全切开者)混杂，因此造成非重组转化子的本底较高，也影响了T载体的得率。解决此问题的备择方案是：再选用位于长间隔序列中间的一个常用内切酶如EcoRI进行酶切，将未被XcmI酶切的环型质粒线性化，从而使其易于与T载体进行分离，选择这个酶的原则是在T载体的序列中不应出现该酶的识别位点。
4.实现PCR产物定向克隆于T载体。
XcmI盒设计精密，前一个XcmI切割位点前(包括潜在的3’突出T)尚有稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即“GTTT”。为实现目的基因的定向克隆，扩增启动子的引物也需要特殊设计，必须遵循的原则是：将PmeI位点的后半部分即“AAAC”作为下游引物5’端起始碱基，而上游引物5’端不能以“AAAC”起始。PCR产物采用Taq DNA扩增酶扩增，或者采用Pfu、Primestar等高保真酶扩增后再通过Taq扩增酶加A尾。这样当PCR扩增产物与上述T载体反向连接时，由下游引物提供的5’端“AAAC”与T载体XcmI盒提供的“GTTT”融合而形成完整的PmeI位点(GTTTAAAC)，因此可以通过PmeI酶切连接产物而去除反向连接克隆，大大提高筛选到正向克隆的机率。
5.蓝白斑筛选进一步排除T载体中可能混杂的未被酶切的或单酶切后自身环化的非重组转化子，大大提高阳性克隆效率。
6.本方法同样适用于普通克隆型T载体和表达型T载体的制备。
附图说明
图1为前T载体pEGFP-UC的结构示意图
图2为前T载体pGL3-UC的结构示意图
图3为前T载体pSEAP2-UC的结构示意图
图4为利用T载体定向克隆启动子PCR产物的流程图
具体实施方式
实施例一：T载体pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T的制备
1.XcmI盒的制备
根据质粒pUC18和pUC-K的序列，设计引物序列为：
pUC-F：5’-CGAAGATCT 
AGACCAAGTTTACTCA-3’
pUC-R：5’-CAACTCGAG 
ACAGTTACCAATGCT-3’
pUC-KF：5’-CGAACGCGT AGACCAAGTTTACTCA-3’
三条引物的5’端分别插入的限制性内切酶BglII、XhoI和MluI识别位点，用单线标示；XcmI酶识别位点用斜体标示；在pUC-F和pUC-KF引物的XcmI识别位点中尚包含稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即GTTT，最后一个T将构成XcmI酶切割得到的3’突出T，用波线标示，用于启动子PCR产物的定向克隆分析。
以质粒pUC18为模板，pUC-F和pUC-R为引物进行PCR扩增；以质粒pUC-K为模板，pUC-KF和pUC-R为引物进行PCR扩增。50μL扩增体系中含2U Primestar DNA聚合酶，0.2mmol/L dNTP，1×Primestar buffer，引物各0.4μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃30s；59℃30s；72℃2min)×25，72℃最后延伸10分钟。经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收PCR扩增产物，然后T4DNA激酶37℃作用60min，70℃10min将该酶灭活。之后，建立如下自环化连接反应：10μL，连接体系中含1U连接酶(MBI)，1×连接Buffer，约100ng PCR产物。4℃连接16小时。将连接产物转化大肠杆菌(JM109)后，经蓝白斑及抗生素抗性筛选后得到阳性克隆，限制性内切酶酶切进一步鉴定XcmI盒是否正确引入，将构建的两载体分别命名为pUC-X和pUC-KX。
2.在pEGFP-1、pGL3-basic和pSEAP2-basic的多克隆位点中引入XcmI盒构建前T载体
已构建的载体pUC-X用BglII、XhoI酶切，37℃作用2小时，50μL酶切体系为：5μgpUC-X，BglII、XhoI内切酶各20U，10mM Tris-HCl(pH 8.5)，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA。同时，pEGFP-1载体用BglII和SalI酶切，50μL酶切体系如下：5μgpEGFP-1，BglII和SalI内切酶各20U，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl，0.1mMBSA。由于内切酶XhoI和SalI是同尾酶，所以pUC-X和pEGFP-1在酶切回收后可以直接进行连接反应。10μL连接体系为：1U连接酶(MBI)，1×连接Buffer，约50ng酶切后纯化的pUC-X，50ng酶切后纯化的pEGFP-1。连接产物按常规方法转化JM109菌株，经Amp(50mg/ml)和Kana(25mg/ml)双抗性筛选得到阳性菌落，经BamHI酶切进一步鉴定，构建的载体命名为pEGFP-UC，即为前pEGFP-1的T载体。
将载体pUC-KX用MluI和XhoI双酶切，反应buffer和条件与pUC-X相同，回收大片段质粒；同时，pGL3-basic和pSEAP2-basic也分别采用相同的限制酶处理，回收大片段质粒后分别与相同酶切处理的pUC-KX建立连接反应，反应体系、条件及阳性克隆筛选条件均与上段叙述相同。构建的载体分别命名为pGL3-UC和pSEAP2-UC。
3.T载体的制备
用XcmI分别酶切前T载体pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，50μL酶切反应体系如下：20U XcmI内切酶，10mM Tris-Cl(pH 7.9)，10mM MgCl2，50mM NaCl，1mM DTT，5μg质粒。37℃酶切3小时后，经1％琼脂糖凝胶电泳后分别回收大片段。切胶回收的大片段即是T载体pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T，可以用于PCR产物的定向克隆。
实施例二：T载体pEGFP-T的正向克隆的筛选及效率检测
用Taq DNA聚合酶扩增趋化因子受体CXCR4最小启动子，引物设计遵循以下原则：即在下游引物的5’端以“AAAC”为起始碱基，而上游引物不以“AAAC”起始。这样仅当PCR扩增产物与上述T载体反向连接时，完整的内切酶PmeI的识别位点形成(GTTTAAAC)，而且pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T载体本身并没有此识别位点。因此可以通过PmeI酶切来去除反向连接克隆。具体步骤如下：
CXCR4启动子引物设计如下：
CXCR4-F：5’-TACCGACCACCCGCAAACAG-3’
CXCR4-R：5’-AAACTAACCGCTGGTTCTCCAGA-3’
CXCR4 PCR产物分别与pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T载体进行连接反应，10μL连接体系如下：25ng PCR产物，50ng T载体，3U T4 DNA连接酶，16℃连接16小时。这个反应Buffer不仅适用于T4 DNA连接酶，同时适用于PmeI酶和碱性磷酸酶(CIAP)。反应Buffer的组成为：10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，0.1mg/ml BSA和0.5mM ATP。连接产物经70℃ 10min灭活T4 DNA连接酶后，加入10 U PmeI酶和1 U碱性磷酸酶。碱性磷酸酶的作用是去除酶切产物的5’磷酸以防止自身环化。再经85℃灭活15min，将经过以上处理的连接产物转化JM109菌株，并进行蓝白斑筛选。提取质粒后建立酶切反应鉴定插入片段存在与否，PCR反应鉴定克隆方向(两条引物分别位于载体和插入片段上)。结果表明，3种T载体转化效率均不低于5×105cfu/mg，90％以上菌落为白色，且正向插入者均为90％以上。重组载体分别命名为pEGFP-T/CXCR4、pGL3/CXCR4和pSEAP2/CXCR4。
实施例三：重组T载体的功能检测
乳腺癌细胞MCF-7分别用含10％FBS的RPMI 1640培养液于37℃、5％CO2条件下培养。转染前1天，取生长良好的细胞，胰酶消化计数，将细胞浓度调至2×105ml，在24孔培养板中加入上述细胞的RPMI 1640培养液，使每孔细胞数为1×105。在Lipofectamine 2000的介导下分别转染前述3种克隆有CXCR4启动子的重组T载体，以pEGFP-1、pGL3-basic和pSEAP2-basic质粒作为阴性对照。每种质粒的转染量为1μg/孔，脂质体用量为每孔2μl。培养5小时后更换新鲜培养液，在37℃、5％CO2条件下继续培养，24h后于倒置荧光显微镜观察重组pEGFP-T/CXCR4转染的细胞，可见大部分MCF-7细胞呈现很强的绿色荧光。采用luciferase和SEAP检测试剂盒分别测定pGL3/CXCR4和pSEAP2/CXCR4转染的细胞中各自酶活性(化学发光检测)，较阴性对照者分别提高50倍以上，证明我们构建的T载体是有功能的，可以用于启动子的克隆和功能研究。
Claims (2)
1.一种用于克隆启动子的T载体pEGFP-T、pGL3-T和pSEAP2-T的制备方法，包括以下步骤：
1)制备含有XcmI盒的前T载体pEGFP-UC、pGL3-UC和pSEAP2-UC，所述XcmI盒包括间隔DNA序列和紧密连接于所述间隔DNA序列两侧的各一个XcmI酶切位点序列；所述XcmI盒还包括连接于所述各一个XcmI位点的酶切位点序列，即用于前T载体pEGFP-UC制备的BglII和XhoI识别位点或用于前T载体pGL3-UC与pSEAP2-UC制备的MluI和XhoI位点，在出发载体pEGFP-1的多克隆位点的BglII位点和SalI位点引入所述XcmI盒构成前T载体pEGFP-UC，或在出发载体pGL3-basic的多克隆位点的MluI位点和XhoI位点引入所述XcmI盒构成前T载体pGL3-UC或在出发载体pSEAP2-basic的多克隆位点的MluI位点和XhoI位点引入所述XcmI盒构成前T载体pSEAP2-UC；所述间隔DNA序列为带有与出发载体具有不同抗性基因或其它选择标记的序列，所述用于制备前T载体pEGFP-UC的XcmI盒的间隔DNA序列为质粒pUC18全序列，所述用于制备前T载体pGL3-UC的XcmI盒的间隔DNA序列为质粒pUC-K序列，所述用于制备前T载体pSEAP2-UC的XcmI盒的间隔DNA序列为质粒pUC-K序列，所述质粒pUC-K的特征为以卡那霉素抗性基因取代pUC18中的氨苄青霉素抗性基因，其余序列与pUC18相同；所述XcmI盒由PCR扩增得到，pUC-F和pUC-R用于扩增pUC18，pUC-KF和pUC-R用于扩增pUC-K；
pUC-F：5’-CGAAGATCT 
AGACCAAGTTTACTCA-3’
pUC-R：5’-CAACTCGAG 
ACAGTTACCAATGCT-3’
pUC-KF：5’-CGAACGCGT AGACCAAGTTTACTCA-3’
三条引物的5’端分别引入限制性内切酶BglII、XhoI和MluI的识别位点，用单线标示；XcmI酶识别位点用斜体标示；在pUC-F和pUC-KF引物的XcmI识别位点中尚包含稀有限制酶位点PmeI位点的前半部分即GTTT，最后一个T将构成XcmI酶切割得到的3’突出T，用波线标示，用于启动子PCR产物的定向克隆分析；
2)用XcmI酶或XcmI酶的同裂酶酶切步骤1)中的前T载体，得到T载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于XcmI盒中作为间隔DNA序列的质粒pUC18或pUC-K全基因序列，具有完整的LacZ’读码框架，通过蓝白斑筛选进一步排除T载体中可能混杂的未被酶切的或单酶切后自身环化的非重组转化子，提高阳性克隆效率。
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