JP2020507347A - 高忠実度ｃａｓ９バリアントおよびそれらの利用 - Google Patents

Abstract

ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の非特異的なゲノム切断に由来する制限を解決するため、およびより高切断忠実度を有するバリアントを同定するため、本発明は、工学的に操作された２つのゲノム標的に対するオンターゲット活性およびオフターゲット活性を同時に評価できるイーストベースのアッセイについて記載する。Ｒｅｄ−ＩＩドメインのランダム変異誘発によって得たＳｐＣａｓ９バリアントのスクリーニングは、オン／オフ比が増加したヒットの同定を可能にした。最良性能のヌクレアーゼｅｖｏＣａｓ９は、単一のバリアント内で同定された変異の組合せによって単離された。以前に報告された合理的に設計されたバリアントとの対照分析は、本発明のｅｖｏＣａｓ９の忠実度の著しい改善を実証した。

Description

本発明は、酵素および核酸結合タンパク質、特にＣａｓ９バリアントの分野に関する。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを含むバイオテクノロジー利用の数は、この新しいゲノム編集ツールのフレキシビリティおよび有効性によって駆り立てられ、ここ数年で大幅に増加している。標的部位は通常、プロトスペーサー配列を含む、標的核酸に相補的な、いわゆる「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）配列を通して、Ｃａｓ９によって認識される。標的認識は、短い隣接するＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列の存在も必要とする。標的核酸は通常ＤＮＡであるが、ある環境下ではＲＮＡであってもよい。ガイドＲＮＡは１つまたは複数の小分子ＲＮＡによって形成され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９手法によるゲノム編集は、様々な細胞型および種に成功裏に利用されており、大きな影響を与える革新的な技術を特徴づける有効性および頑強性をはっきりと実証する。重要なことに、基礎研究および治療に向けた利用のどちらも、効果は別として、編集のための高い標的化特異性を必要とする。しかしながら、いくつかの研究は、ゲノムのＣａｓ９切断はいつも意図した部位に向かうわけではなく、望まない損傷が、選択した標的と異なるレベルの類似性を共有するＤＮＡ領域に導入され得ることを示した。さらに、現象を決定する簡単なルールがないため、そのような望まない活性の予測は困難であり、信頼できないことが多い。さらに、オフターゲット効果の評価はいつも簡単なわけではなく、異なる方法を利用して得られた結果は一致しないことが多い。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ツールキットの特異性の増強は、全ての利用分野、特にヒト治療利用におけるその安全な使用を可能にするこの主要技術の非常に望ましい改善である。

ストレプトコッカス・ピオゲネス（化膿性連鎖球菌：streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）細胞内レベルの厳格なコントロール、標的配列に相補性がより低い短いプロトスペーサーによって特徴づけられる工学的に操作されたｇＲＮＡ（トランケートｇＲＮＡ）の導入、その結合または対のＳｐＣａｓ９ニッカーゼおよびＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに融合した対の触媒的に不活性なＳｐＣａｓ９の利用を方向付けるＳｐＣａｓ９の特異的ＤＮＡ結合ドメインへの融合のような、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による望まないオフターゲット変異の導入を減らすために異なる戦略が提案されている。しかしながら、これらの手法はオフターゲットが無いものはなく、それらの固有な分子の複雑性により、オンターゲット活性を欠損していることが多い。

近年、２つのグループが、オフターゲット部位を切断する低い傾向によって特徴づけられるＳｐＣａｓ９バリアントの構造情報に基づく合理的な工学的作製を報告した。

Slaymaker et al. (Science. 2016, 351(6268):84-8)は、効率（野生型レベルに近いオンターゲット挿入−欠損（インデル）形成）および特異性（ＥＭＸ（１）およびＶＥＧＦＡ（１）オフターゲット部位、特異性アッセイのための標準的な遺伝子座での検出可能なインデル形成無し）の両方が高い３つのＳｐＣａｓ９変異体を生成した：ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）［ｅＳｐＣａｓ９（１．０）とも呼ばれる］、およびＳｐＣａｓ９（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）［ｅＳｐＣａｓ９（１．１）とも呼ばれる］。

Kleinstiver BP et al. (Nature. 2016, 529(7587):490-5)は、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、およびＱ９２６Ａ置換の全ての可能な１ヵ所、２重、３重および４重の組合せを有する１５の異なるＳｐＣａｓ９バリアントを生成した。３重変異のバリアント（Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）および４重置換のバリアント（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、以降ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１と呼ぶ）の両方は、４つのミスマッチｓｇＲＮＡによるほぼバックグラウンドレベルでの最小のＥＧＦＰ破壊を示した。

これらの近年の努力からも、この分野の主な必要性が、オフターゲット活性のないゲノム編集システムの生成であることが明らかである。

本発明の目的は、新規の、少なくとも代替えの、高忠実度Ｃａｓ９バリアントを提供することである。

本発明の主題は、Ｋ３７７、Ｅ３８７、Ｄ３９７、Ｒ４００、Ｄ４０６、Ａ４２１、Ｌ４２３、Ｒ４２４、Ｑ４２６、Ｙ４３０、Ｋ４４２、Ｐ４４９、Ｖ４５２、Ａ４５６、Ｒ４５７、Ｗ４６４、Ｍ４６５、Ｋ４６８、Ｅ４７０、Ｔ４７４、Ｐ４７５、Ｗ４７６、Ｆ４７８、Ｋ４８４、Ｓ４８７、Ａ４８８、Ｔ４９６、Ｆ４９８、Ｌ５０２、Ｎ５０４、Ｋ５０６、Ｐ５０９、Ｆ５１８、Ｎ５２２、Ｅ５２３、Ｋ５２６、Ｌ５４０、Ｓ５４１、Ｉ５４８、Ｄ５５０、Ｆ５５３、Ｖ５６１、Ｋ５６２、Ｅ５７３、Ａ５８９、Ｌ５９８、Ｄ６０５、Ｌ６０７、Ｎ６０９、Ｎ６１２、Ｅ６１７、Ｄ６１８、Ｄ６２８、Ｒ６２９、Ｒ６３５、Ｋ６３７、Ｌ６５１、Ｋ６５２、Ｒ６５４、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｌ６６６、Ｋ６７３、Ｓ６７５Ｃ、Ｉ６７９Ｖ、Ｌ６８０、Ｌ６８３、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｆ６９３、Ｓ７０１、Ｆ７０４、Ｑ７１２、Ｇ７１５、Ｑ７１６、Ｈ７２３、Ｉ７２４、Ｌ７２７、Ｉ７３３、Ｌ７３８およびＱ７３９からなる群から選択されるアミノ酸残基位置に位置する少なくとも１つの変異を含む、単離した改変Ｃａｓ９分子であり、ここで、改変アミノ酸配列の位置は、配列番号１によって同定される非改変の成熟ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の対応位置のアミノ酸番号を参照して同定される。

好ましい実施形態では、改変Ｃａｓ９は、Ｋ５２６位に少なくとも１つの変異を含む。
本発明によるＳｐＣａｓ９バリアントは、まずそのＲＥＣ１−ＩＩドメインのランダム変異誘発によって得られ、工学的に操作された２つのゲノム標的に対するオンおよびオフターゲット活性を同時に評価することを可能にするイーストベースのアッセイによってオン／オフ比が増加したヒットの同定のためにスクリーニングされた。哺乳動物細胞におけるさらなる検証後、本発明によるＣａｓ９バリアントが生成された。驚くべきことに、本発明による改変ＳｐＣａｓ９は、野生型ＳｐＣａｓ９と比較した場合に、著しく減少したオフターゲット活性を示し、以前に報告された合理的に設計されたバリアントとの比較分析により本発明のＳｐＣａｓ９バリアントの忠実度の著しい改善を実証した。さらに、本発明による、および転写活性化ドメイン（ＶＰ６４）と融合したさらなるＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を有する改変ＳｐＣａｓ９は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ変異を含有する野生型Ｃａｓ９バリアントと比較した場合、著しく減少したオフターゲット活性を示した。

ＳｐＣａｓ９のオンおよびオフターゲット活性を定量するインビボイーストアッセイの設計を示す。 野生型ＳｐＣａｓ９を使用するｙＡＣＭＯ株の検証を示す。 ランダムなライブラリー生成のための標的ドメインの選択を示す。 高特異性ＳｐＣａｓ９バリアントのイーストスクリーニングを示す。 哺乳動物細胞において最適化されたＳｐＣａｓ９バリアントの選択を示す。 ＥＧＦＰに対するｅｖｏＣａｓ９オンターゲット活性を示す。 内因性遺伝子座へのｅｖｏＣａｓ９活性を示す。 ｅｖｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１特異性の対照比較を示す。 標的化ディープシーケンシングによるｅｖｏＣａｓ９特異性の検証を示す。 ｅｖｏＣａｓ９のゲノム全体での特異性を示す。 ｅｖｏＣａｓ９の転写活性を示す。 ｅｖｏＣａｓ９の長期特異性を示す。

本発明は、Ｃａｓ９のＲＥＣ１−ＩＩドメインのランダム変異誘発、ならびに各生成したバリアントのオンおよびオフターゲット活性を同時に評価するイーストベースアッセイを使用するスクリーニングによって得られた特異性の増加した単離したＣａｓ９分子を記載する。選択されたヒットは、哺乳動物システムにおけるスクリーニングによってさらに洗練された。

本発明の第１の態様では、Ｃａｓ９バリアントは、Ｋ５２６、Ｋ３７７、Ｅ３８７、Ｄ３９７、Ｒ４００、Ｄ４０６、Ａ４２１、Ｌ４２３、Ｒ４２４、Ｑ４２６、Ｙ４３０、Ｋ４４２、Ｐ４４９、Ｖ４５２、Ａ４５６、Ｒ４５７、Ｗ４６４、Ｍ４６５、Ｋ４６８、Ｅ４７０、Ｔ４７４、Ｐ４７５、Ｗ４７６、Ｆ４７８、Ｋ４８４、Ｓ４８７、Ａ４８８、Ｔ４９６、Ｆ４９８、Ｌ５０２、Ｎ５０４、Ｋ５０６、Ｐ５０９、Ｆ５１８、Ｎ５２２、Ｅ５２３、Ｌ５４０、Ｓ５４１、Ｉ５４８、Ｄ５５０、Ｆ５５３、Ｖ５６１、Ｋ５６２、Ｅ５７３、Ａ５８９、Ｌ５９８、Ｄ６０５、Ｌ６０７、Ｎ６０９、Ｎ６１２、Ｅ６１７、Ｄ６１８、Ｄ６２８、Ｒ６２９、Ｒ６３５、Ｋ６３７、Ｌ６５１、Ｋ６５２、Ｒ６５４、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｌ６６６、Ｋ６７３、Ｓ６７５、Ｉ６７９、Ｌ６８０、Ｌ６８３、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｆ６９３、Ｓ７０１、Ｆ７０４、Ｑ７１２、Ｇ７１５、Ｑ７１６、Ｈ７２３、Ｉ７２４、Ｌ７２７、Ｉ７３３、Ｌ７３８およびＱ７３９からなる群から選択されるアミノ酸残基位置に位置する少なくとも１つの変異を含み、ここで、改変アミノ酸配列の位置は、配列番号１によって同定される非改変の成熟ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の対応位置のアミノ酸番号を参照して同定される。

好ましくは、本発明によると、Ｋ５２６位における変異は、Ｋ５２６ＮおよびＫ５２６Ｅからなる群から選択される；より好ましくはＫ５２６Ｅである。

本発明の好ましい実施形態によると、Ｋ５２６変異を有する改変Ｃａｓ９は、
Ｋ３７７、Ｅ３８７、Ｄ３９７、Ｒ４００、Ｑ４０２、Ｒ４０３、Ｆ４０５、Ｄ４０６、Ｎ４０７、Ａ４２１、Ｌ４２３、Ｒ４２４、Ｑ４２６、Ｙ４３０、Ｋ４４２、Ｐ４４９、Ｙ４５０、Ｖ４５２、Ａ４５６、Ｒ４５７、Ｗ４６４、Ｍ４６５、Ｋ４６８、Ｅ４７０、Ｔ４７２、Ｉ４７３、Ｔ４７４、Ｐ４７５、Ｗ４７６、Ｆ４７８、Ｋ４８４、Ｓ４８７、Ａ４８８、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｆ４９８、Ｌ５０２、Ｎ５０４、Ｋ５０６、Ｐ５０９、Ｙ５１５、Ｆ５１８、Ｎ５２２、Ｅ５２３、Ｌ５４０、Ｓ５４１、Ｉ５４８、Ｄ５５０、Ｆ５５３、Ｖ５６１、Ｋ５６２、Ｅ５７３、Ａ５８９、Ｌ５９８、Ｄ６０５、Ｌ６０７、Ｎ６０９、Ｎ６１２、Ｅ６１７、Ｄ６１８、Ｄ６２８、Ｒ６２９、Ｒ６３５、Ｋ６３７、Ｌ６５１、Ｋ６５２、Ｒ６５４、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｌ６６６、Ｋ６７３、Ｓ６７５、Ｉ６７９、Ｌ６８０、Ｌ６８３、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｆ６９３、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｓ７０１、Ｆ７０４、Ｑ７１２、Ｇ７１５、Ｑ７１６、Ｈ７２１、Ｈ７２３、Ｉ７２４、Ｌ７２７、Ａ７２８、Ｉ７３３、Ｌ７３８、Ｑ７３９
からなる群から選択されるアミノ酸残基位置に位置する１つまたは複数のさらなる変異を含む。

１つまたは複数のさらなる変異は、１〜８の間に含まれる数である。

好ましくは、１つまたは複数のさらなる変異は、
Ｋ３７７Ｅ、Ｅ３８７Ｖ、Ｄ３９７Ｅ、Ｒ４００Ｈ、Ｑ４０２Ｒ、Ｒ４０３Ｈ、Ｆ４０５Ｌ、Ｄ４０６Ｙ、Ｄ４０６Ｖ、Ｎ４０７Ｐ、Ｎ４０７Ｈ、Ａ４２１Ｖ、Ｌ４２３Ｐ、Ｒ４２４Ｇ、Ｑ４２６Ｒ、Ｙ４３０Ｃ、Ｋ４４２Ｎ、Ｐ４４９Ｓ、Ｙ４５０Ａ、Ｙ４５０Ｓ、Ｙ４５０Ｈ、Ｙ４５０Ｎ、Ｖ４５２Ｉ、Ａ４５６Ｔ、Ｒ４５７Ｐ、Ｒ４５７Ｑ、Ｗ４６４Ｌ、Ｍ４６５Ｒ、Ｋ４６８Ｎ、Ｅ４７０Ｄ、Ｔ４７２Ａ、Ｉ４７３Ｆ、Ｉ４７３Ｖ、Ｔ４７４Ａ、Ｐ４７５Ｈ、Ｗ４７６Ｒ、Ｆ４７８Ｙ、Ｆ４７８Ｖ、Ｋ４８４Ｍ、Ｓ４８７Ｙ、Ａ４８８Ｖ、Ｍ４９５Ｖ、Ｍ４９５Ｔ、Ｔ４９６Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｆ４９８Ｉ、Ｆ４９８Ｙ、Ｌ５０２Ｐ、Ｎ５０４Ｓ、Ｋ５０６Ｎ、Ｐ５０９Ｌ、Ｙ５１５Ｎ、Ｆ５１８Ｌ、Ｆ５１８Ｉ、Ｎ５２２Ｋ、Ｎ５２２Ｉ、Ｅ５２３Ｋ、Ｅ５２３Ｄ、Ｌ５４０Ｑ、Ｓ５４１Ｐ、Ｉ５４８Ｖ、Ｄ５５０Ｎ、Ｆ５５３Ｌ、Ｖ５６１Ｍ、Ｖ５６１Ａ、Ｋ５６２Ｅ、Ｅ５７３Ｄ、Ａ５８９Ｔ、Ｌ５９８Ｐ、Ｄ６０５Ｖ、Ｌ６０７Ｐ、Ｎ６０９Ｄ、Ｎ６０９Ｓ、Ｎ６１２Ｙ、Ｎ６１２Ｋ、Ｅ６１７Ｋ、Ｄ６１８Ｎ、Ｄ６２８Ｇ、Ｒ６２９Ｇ、Ｒ６３５Ｇ、Ｋ６３７Ｎ、Ｌ６５１Ｐ、Ｌ６５１Ｈ、Ｋ６５２Ｅ、Ｒ６５４Ｈ、Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ｅ、Ｗ６５９Ｒ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６６１Ｗ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６６１Ｓ、Ｌ６６６Ｐ、Ｋ６７３Ｍ、Ｓ６７５Ｃ、Ｉ６７９Ｖ、Ｌ６８０Ｐ、Ｌ６８３Ｐ、Ｎ６９０Ｉ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｎ６９２Ｉ、Ｆ６９３Ｙ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ｈ、Ｑ６９５Ｌ、Ｈ６９８Ｑ、Ｈ６９８Ｐ、Ｓ７０１Ｆ、Ｆ７０４Ｓ、Ｑ７１２Ｒ、Ｇ７１５Ｓ、Ｑ７１６Ｈ、Ｈ７２１Ｒ、Ｈ７２３Ｌ、Ｉ７２４Ｖ、Ｌ７２７Ｈ、Ａ７２８Ｇ、Ａ７２８Ｔ、Ｉ７３３Ｖ、Ｌ７３８Ｐ、Ｑ７３９Ｅ、Ｑ７３９ＰおよびＱ７３９Ｋ
からなる群から選択される。

好ましい実施形態では、上記の前記変異の総数は１〜９の間；好ましくは１〜５の間；最も好ましくは１〜４の間に含まれる。

配列番号１は、ＳｐＣａｓ９を指す、受託番号ＮＰ＿２６９２１５（ＮＣＢＩ）を有する配列である。

本発明によると、改変ポリペプチドは、変異を除いて、好ましくは配列番号１と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。

２つのポリペプチドまたは核酸配列の間のパーセント同一性は、アライメントソフトウェア（すなわち、ＢＬＡＳＴプログラム）を使用して当業者に決定され得る。

好ましくは、改変Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ＳｐＣａｓ９オルソログ（すなわち、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス：S. aureus）、髄膜炎菌（ナイセリア・メニンギティディス：N. meningitidis））である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９オルソログは、ＳｐＣａｓ９のＲｅｃ１−ＩＩドメインと少なくとも１０％または２５％アミノ酸同一性を有し、ＳｐＣａｓ９と１０％または２５％〜１００％の間の任意のパーセンテージの完全アミノ酸同一性を有する。当業者は、配列および／または構造アライメントによって改変される適切な相同残基を決定できる。同定したアミノ酸は、以下のグループ内：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；フェニルアラニン、チロシンの置換によって保存的に改変され得る。

改変ポリペプチドは、ｇＲＮＡおよび／または標的ＤＮＡもしくはＲＮＡと相互作用する能力を保持する。

本発明により、変異Ｘ１ｎｎｎＸ２は、ｎｎｎ位に、野生型ポリペプチド内に存在するアミノ酸Ｘ１の代わりにアミノ酸Ｘ２が存在することを意味する；したがって、例えば、Ｋ５２６Ｅは、５２６位のアミノ酸が、野生型ポリペプチド内に存在するアミノ酸リシン（ＬｙｓまたはＫ）の代わりにグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）に相当することを意味する。

本発明の好ましい実施形態によると、改変Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｋ５２６位に変異、およびＹ４５０、Ｍ４９５、Ｙ５１５、Ｒ６６１、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｑ６９５、Ｈ６９８；好ましくはＭ４９５、Ｙ５１５、Ｒ６６１、Ｈ６９８からなる群から選択される位置に１つまたは複数のさらなる変異を含む。

本発明の好ましい実施形態によると、少なくとも１つのさらなる変異は、Ｙ４５０Ｓ、Ｍ４９５Ｖ、Ｙ５１５Ｎ、Ｒ６６１Ｘ、Ｎ６９０Ｉ、Ｒ６９１Ｑ、Ｑ６９５Ｈ、Ｈ６９８Ｑからなる群から選択され；好ましくは、Ｍ４９５Ｖ、Ｙ５１５Ｎ、Ｋ５２６Ｅ、Ｒ６６１Ｘ、Ｈ６９８Ｑからなる群から選択され；ここで、Ｘは、Ｌ、ＱおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；好ましくは、ＸはＱまたはＳである。

本発明の好ましい実施形態によると、改変Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｋ５２６Ｅ＋Ｙ４５０Ｓ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｍ４９５Ｖ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｙ５１５Ｎ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｘ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｎ６９０Ｉ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６９１Ｑ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｑ６９５ＨおよびＫ５２６Ｅ＋Ｈ６９８Ｑからなる群から選択される２重の変異を含み；ここで、Ｘは、Ｌ、ＱおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；好ましくは、ＸはＱまたはＳである。

本発明の好ましい実施形態によると、上記の改変Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｍ４９５Ｖ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｘ、Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｘ、Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｘ＋Ｈ６９８ＱおよびＭ４９５Ｖ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ５２６Ｅからなる群から選択される３重の変異を含み；ここで、Ｘは、Ｌ、ＱおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；好ましくは、ＸはＱまたはＳである。

本発明の好ましい実施形態によると、上記の改変Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｍ４９５Ｖ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１ＸおよびＭ４９５Ｖ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｘ＋Ｈ６９８Ｑからなる群から選択される４重の変異を含み；ここで、Ｘは、Ｌ、ＱおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；好ましくは、ＸはＱまたはＳである。

最も好ましいのは、上記の改変Ｃａｓ９ポリペプチドは、４重の変異Ｍ４９５Ｖ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｑ（以降、ｅｖｏＣａｓ９とも呼ばれる）またはＭ４９５Ｖ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｓ（以降、ｅｖｏＣａｓ９−ＩＩとも呼ばれる）を含む改変Ｃａｓ９ポリペプチドである。一態様では、本発明の主題は、Ｋ３７７Ｅ、Ｅ３８７Ｖ、Ｄ３９７Ｅ、Ｒ４００Ｈ、Ｑ４０２Ｒ、Ｒ４０３Ｈ、Ｆ４０５Ｌ、Ｄ４０６Ｙ、Ｄ４０６Ｖ、Ｎ４０７Ｐ、Ｎ４０７Ｈ、Ａ４２１Ｖ、Ｌ４２３Ｐ、Ｒ４２４Ｇ、Ｑ４２６Ｒ、Ｙ４３０Ｃ、Ｋ４４２Ｎ、Ｐ４４９Ｓ、Ｙ４５０Ｓ、Ｙ４５０Ｈ、Ｙ４５０Ｎ、Ｖ４５２Ｉ、Ａ４５６Ｔ、Ｒ４５７Ｐ、Ｒ４５７Ｑ、Ｗ４６４Ｌ、Ｍ４６５Ｒ、Ｋ４６８Ｎ、Ｅ４７０Ｄ、Ｔ４７２Ａ、Ｉ４７３Ｆ、Ｉ４７３Ｖ、Ｔ４７４Ａ、Ｐ４７５Ｈ、Ｗ４７６Ｒ、Ｆ４７８Ｙ、Ｆ４７８Ｖ、Ｋ４８４Ｍ、Ｓ４８７Ｙ、Ａ４８８Ｖ、Ｍ４９５Ｖ、Ｍ４９５Ｔ、Ｔ４９６Ａ、Ｆ４９８Ｉ、Ｆ４９８Ｙ、Ｌ５０２Ｐ、Ｎ５０４Ｓ、Ｋ５０６Ｎ、Ｐ５０９Ｌ、Ｙ５１５Ｎ、Ｆ５１８Ｌ、Ｆ５１８Ｉ、Ｎ５２２Ｋ、Ｎ５２２Ｉ、Ｅ５２３Ｋ、Ｅ５２３Ｄ、Ｋ５２６Ｅ、Ｋ５２６Ｎ、Ｌ５４０Ｑ、Ｓ５４１Ｐ、Ｉ５４８Ｖ、Ｄ５５０Ｎ、Ｆ５５３Ｌ、Ｖ５６１Ｍ、Ｖ５６１Ａ、Ｋ５６２Ｅ、Ｅ５７３Ｄ、Ａ５８９Ｔ、Ｌ５９８Ｐ、Ｄ６０５Ｖ、Ｌ６０７Ｐ、Ｎ６０９Ｄ、Ｎ６０９Ｓ、Ｎ６１２Ｙ、Ｎ６１２Ｋ、Ｅ６１７Ｋ、Ｄ６１８Ｎ、Ｄ６２８Ｇ、Ｒ６２９Ｇ、Ｒ６３５Ｇ、Ｋ６３７Ｎ、Ｌ６５１Ｐ、Ｌ６５１Ｈ、Ｋ６５２Ｅ、Ｒ６５４Ｈ、Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ｅ、Ｗ６５９Ｒ、Ｒ６６１Ｗ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６６１Ｓ、Ｌ６６６Ｐ、Ｋ６７３Ｍ、Ｓ６７５Ｃ、Ｉ６７９Ｖ、Ｌ６８０Ｐ、Ｌ６８３Ｐ、Ｎ６９０Ｉ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｎ６９２Ｉ、Ｆ６９３Ｙ、Ｑ６９５Ｈ、Ｑ６９５Ｌ、Ｈ６９８Ｑ、Ｈ６９８Ｐ、Ｓ７０１Ｆ、Ｆ７０４Ｓ、Ｑ７１２Ｒ、Ｇ７１５Ｓ、Ｑ７１６Ｈ、Ｈ７２１Ｒ、Ｈ７２３Ｌ、Ｉ７２４Ｖ、Ｌ７２７Ｈ、Ａ７２８Ｇ、Ａ７２８Ｔ、Ｉ７３３Ｖ、Ｌ７３８Ｐ、Ｑ７３９Ｅ、Ｑ７３９ＰおよびＱ７３９Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、単離した改変Ｃａｓ９ポリペプチドである。

好ましい実施形態によると、本発明は、改変Ｃａｓ９ポリペプチドであって、
Ｄ４０６Ｙ、Ｗ４６４Ｌ、Ｔ４７４Ａ、Ｋ５２６Ｅ、Ｎ６１２Ｋ、Ｌ６８３Ｐからなる群から選択される１ヵ所変異；または
Ｒ４００Ｈ＋Ｙ４５０Ｓ、Ｄ４０６Ｖ＋Ｅ５２３Ｋ、Ａ４２１Ｖ＋Ｒ６６１Ｗ、Ｒ４２４Ｇ＋Ｑ７３９Ｐ、Ｗ４７６Ｒ＋Ｌ７３８Ｐ、Ｐ４４９Ｓ＋Ｆ７０４Ｓ、Ｎ５２２Ｋ＋Ｇ６５８Ｅ、Ｅ５２３Ｄ＋Ｅ６１７Ｋ、Ｌ５４０Ｑ＋Ｌ６０７Ｐ、Ｗ６５９Ｒ＋Ｒ６６１Ｗ、Ｓ６７５Ｃ＋Ｑ６９５ＬおよびＩ６７９Ｖ＋Ｈ７２３Ｌからなる群から選択される２重変異；または
Ｋ３７７Ｅ＋Ｌ５９８Ｐ＋Ｌ６５１Ｈ、Ｄ３９７Ｅ＋Ｙ４３０Ｃ＋Ｌ６６６Ｐ、Ｑ４０２Ｒ＋Ｖ５６１Ｍ＋Ｑ６９５Ｌ、Ｎ４０７Ｐ＋Ｆ４９８Ｉ＋Ｐ５０９Ｌ、Ｎ４０７Ｈ＋Ｋ６３７Ｎ＋Ｎ６９０Ｉ、Ｙ４５０Ｈ＋Ｆ５５３Ｌ＋Ｑ７１６Ｈ、Ｙ４５０Ｎ＋Ｈ６９８Ｐ＋Ｑ７３９Ｋ、Ｔ４７２Ａ＋Ｐ４７５Ｈ＋Ａ４８８Ｖ、Ｉ４７３Ｆ＋Ｄ５５０Ｎ＋Ｑ７３９Ｅ、Ｆ４７８Ｙ＋Ｎ５２２Ｉ＋Ｌ７２７Ｈ、Ｋ４８４Ｍ＋Ｑ６９５Ｈ＋Ｑ７１２Ｒ、Ｓ４８７Ｙ＋Ｎ５０４Ｓ＋Ｅ５７３Ｄ、Ｔ４９６Ａ＋Ｎ６０９Ｄ＋Ａ７２８Ｇ、Ｒ６５４Ｈ＋Ｒ６９１Ｑ＋Ｈ６９８ＱおよびＲ６９１Ｌ＋Ｈ７２１Ｒ＋Ｉ７３３Ｖからなる群から選択される３重変異；
Ｆ４０５Ｌ＋Ｆ５１８Ｌ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｉ７２４Ｖ、Ｌ４２３Ｐ＋Ｍ４６５Ｒ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ６７３Ｍ、Ｒ４５７Ｐ＋Ｋ４６８Ｎ＋Ｒ６６１Ｗ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｅ４７０Ｄ＋Ｉ５４８Ｖ＋Ａ５８９Ｔ＋Ｑ６９５Ｈ、Ａ４８８Ｖ＋Ｄ６０５Ｖ＋Ｒ６２９Ｇ＋Ｔ６５７ＡおよびＭ４９５Ｖ＋Ｋ５２６Ｎ＋Ｓ５４１Ｐ＋Ｋ５６２Ｅからなる群から選択される４重変異；または
Ｒ４０３Ｈ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される５ヵ所変異；
Ｅ３８７Ｖ＋Ｖ５６１Ａ＋Ｄ６１８Ｎ＋Ｄ６２８Ｇ＋Ｌ６８０Ｐ＋Ｓ７０１Ｆ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｍ４９５Ｔ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｌ５０２Ｐ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｋ５０６Ｎ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｎ６９２Ｉ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される６ヵ所変異；または
Ｒ４０３Ｈ＋Ａ４５６Ｔ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ＋Ｇ７２８Ｔ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｆ４９８Ｙ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｒ６６１Ｌ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｒ４０３Ｈ＋Ｑ４２６Ｒ＋Ｆ４７８Ｖ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される７ヵ所変異；または
Ｒ４０３Ｈ＋Ｒ４４２Ｎ＋Ｖ４５２Ｉ＋Ｎ６０９Ｓ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｒ６３５Ｇ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｆ６９３Ｙ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される８ヵ所変異；または
Ｒ４０３Ｈ＋Ｒ４５７Ｑ＋Ｆ５１８Ｉ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｒ６３５Ｇ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｆ６９３Ｙ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される９ヵ所変異
を含む改変Ｃａｓ９ポリペプチドに関する。

好ましくは、本発明によると、改変Ｃａｓ９ポリペプチドは、Ｙ４５０Ｓ、Ｍ４９５Ｖ、Ｙ５１５Ｎ、Ｋ５２６Ｅ、Ｒ６６１Ｘ、Ｎ６９０Ｉ、Ｒ６９１Ｑ、Ｑ６９５Ｈ、Ｈ６９８Ｑからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含み；ここで、Ｘは、Ｌ、ＱおよびＳからなる群から選択され；好ましくは、ＸはＱまたはＳである。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９について同定された前記変異は、これまでに報告された他のＣａｓ９ヌクレアーゼバリアント（ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１−４、ｅＳｐＣａｓ９（１．０）−（１．１．））の特異性を改善するのに好適である。したがって、任意選択により、上記のＣａｓ９バリアントは、Ｌ１６９Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｒ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ、Ｄ１１３５Ｅ残基において１つまたは複数のさらなる変異をさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９について同定された前記変異は、他のＣａｓ９ニッカーゼ、ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩまたはｄＣａｓ９の特異性を改善するのに好適である。したがって、任意選択により、上記のＣａｓ９バリアントは、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８３およびＤ９８６からなる群から選択される残基において少なくとも１つのさらなる変異をさらに含み、ヌクレアーゼ活性を減少させることができる。好ましくは、そのようなさらなる変異は、Ｄ１０Ａ、またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙである。好ましくは、前記変異は、Ｃａｓ９ニッカーゼまたは触媒的に不活性なＣａｓ９をもたらす（Ran F et al. Cell. 2013, 154(6):1380-1389; Maeder M et al. Nature Methods. 2013, 10(10):977-979）。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９について同定された前記変異は、代替えのＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９ヌクレアーゼバリアントの特異性を改善するのに好適である。したがって、任意選択により、上記のＣａｓ９バリアントは、米国特許出願公開第２０１６／０３１９２６０号により、Ｄ１１３５Ｖ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＱＶＲバリアント）、Ｄ１１３５Ｅ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＥＶＲバリアント）、Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｑ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＱＲバリアント）、Ｄ１１３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｒ１３３５Ｅ／Ｔ１３３７Ｒ（ＶＲＥＲバリアント）残基において１つまたは複数のさらなる変異をさらに含み得る。

本発明のさらなる主題はまた、他のポリペプチド配列に融合した上記のとおりのバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質である。

好ましくは、Ｃａｓ９バリアントはタンパク質タグ（すなわち、Ｖ５−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ポリＨｉｓ−タグ、ＭＢＰ−タグ）、タンパク質、タンパク質ドメイン、転写モジュレーター、小分子基質に作用する酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質修飾酵素（すなわち、アデノシンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、グアノシルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ＲＮＡデメチラーゼ、ジオキシゲナーゼ、ポリアデニル酸ポリメラーゼ、プソイドウリジン合成酵素、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、ユビキチン−リガーゼ、デユビキチナーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＮＥＤＤ８−リガーゼ、脱ＮＥＤＤ化酵素（de-NEDDylase）、ＳＵＭＯ−リガーゼ、脱ＳＵＭＯ化酵素（deSUMOylase）、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ）、タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合タンパク質、特異的な生物学的機能を有するポリペプチド配列（すなわち、核局在シグナル、ミトコンドリア局在シグナル、プラスチド局在シグナル、細胞内局在シグナル、不安定化シグナル、ジェミニン破壊ボックスモチーフ）、生物学的係留ドメイン（すなわち、ＭＳ２、Ｃｓｙ４およびラムダＮタンパク質）をコードするアミノ酸配列に融合される。

本発明のさらなる主題は、上記のＣａｓ９バリアントを産生する方法であって、前記方法は、その１つまたは複数の断片からＣａｓ９バリアントを再構築するステップを含み；好ましくはそれにより、インテインまたはタンパク質イントロンまたは二量体化ドメインがＣａｓ９ポリペプチド内に含まれる。

いくつかの実施形態では、再構築ステップはインビトロ（in vitro）で実施され得、いくつかの他の実施形態では、それはインビボ（in vivo）で実施され得る（以下を参照）。

好ましくは、そのような断片は、ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９の二量体化によって導入され、Ｃａｓ９タンパク質を再構築することができる（Wright AV et al. PNAS 2015 12(10):2984-9; Liu KI et al. Nat Chem Biol. 2016, 12(11):980-987）。

好ましくは、そのような断片は、ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９のインテイン二量体化によって導入され、触媒的に活性なＣａｓ９タンパク質を再構築することができる（Truong DJ et al. Nucleic Acids Res 43(13):6450-8）。

本発明によると、ベクターは、ヌクレオチドまたはタンパク質配列の送達または発現に好適なシステムである。

本発明のさらなる主題は、改変Ｃａｓ９ポリペプチドを含有する、タンパク質またはリボヌクレオタンパク質複合体または混合タンパク質、リボヌクレオタンパク質および脂質複合体（Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体、ならびに例えば、限定はされないが、細胞浸透ペプチド、核酸アプタマーおよび脂質小胞などのさらなるタンパク質、核酸または脂質成分とのそれらのコンジュゲーション）でもある。

本発明のさらなる主題は、改変Ｃａｓ９ポリペプチドを含有するタンパク質またはタンパク質リボヌクレオチドベクターである。いくつかの実施形態では、そのようなベクターは天然のまたは人工的な複合体または小胞である（上記を参照）。いくつかの実施形態では、そのようなベクターは、パッケージングまたは放出セルに由来する。いくつかの実施形態では、そのようなベクターは、本発明によるＣａｓ９改変ポリペプチドを含有する細胞外小胞ベース構造（すなわち、限定はされないが、エクソソームおよびエクソソーム様構造）、またはウイルス粒子もしくはウイルス様粒子である。

本発明のさらなる主題は、上記の改変Ｃａｓ９ポリペプチドおよびその断片をコードするヌクレオチドの配列である。

好ましくは、本発明によると、上記の改変Ｃａｓ９またはその断片をコードするヌクレオチドの配列は、受託番号ＮＣ＿００２７３７を有する配列である配列番号２、またはヒト細胞における発現のためのコドン最適化によって得られた、上記の変異に相当する塩基置換を示す配列番号３に基づく。改変Ｃａｓ９ポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチドの配列は、好ましくは、変異を除いて、配列番号２または配列番号３と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％の同一性を有する。

本発明のさらなる主題は、上記のヌクレオチドの配列を含む核酸である。

上記の改変Ｃａｓ９ポリペプチドを生産する方法は、それにより改変Ｃａｓ９ポリペプチドが上記の核酸によって発現される。

本発明のさらなる主題は、上記の核酸を含むベクターであり；ここで前記ベクターは、原核細胞または真核細胞（例えば、イースト、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞）における遺伝子発現に好適である。好ましくは、ベクターは、限定はされないが、プラスミド、ファージミド、バクテリアもしくはイースト人工染色体、ＤＮＡもしくはＲＮＡ断片、またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）ベースベクター、またはウイルスベクターであってよい。

本発明の核酸は、好ましくは、ｌｅｎｔｉＳＬｉＣＥＳによって送達され、イタリア特許出願第１０２０１６０００１０２５４２号に記載のとおり自己制御回路によってさらなる特異性を可能にする。本発明の核酸は、好ましくは、レトロウイルスベクター、ＥＩＡＶベクター、ＳＩＶベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ヘルペスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクターまたはバクテリオファージによって送達される。好ましくは、バクテリオファージベクターは、λファージ、Ｍ１３ファージ、またはＰ１ファージに基づく。

本発明のさらなる主題は、上記のヌクレオチドの配列の断片を含む核酸である。

好ましくは、上記のヌクレオチドの配列の断片を含む２つまたはそれ以上の異なる核酸によってコードされる翻訳されたポリペプチドを、インビトロまたはインビボで使用して、上記の触媒的に活性なＣａｓ９バリアントを再構築できる。

好ましくは、Ｃａｓ９のそのような断片を使用して、異なるウイルスベクター間の組換えを用いることによってＤＮＡレベルでＣａｓ９タンパク質発現を再構築できる（すなわち、Wu Z et al. Mol Ther. 2010, 18(1)80-86）。

好ましくは、Ｃａｓ９のそのような断片を使用して、トランススプライシングを用いることによって転写レベルでＣａｓ９タンパク質を再構築できる（Fine EJ et al. Sci Rep. 2015, 5:10777）。

本発明のさらなる主題はまた、上記の核酸もしくはベクターをコードするように工学的に操作された細胞または本発明のＣａｓ９バリアントによって恒的に改変された細胞である。

好ましくは、工学的に操作された細胞は、原核細胞、より好ましくはバクテリアである。

好ましくは、工学的に操作された細胞は、真核細胞である。好ましくは、工学的に操作された細胞は、動物細胞である。好ましくは、工学的に操作された細胞は、哺乳動物細胞である。より好ましくは、工学的に操作された細胞は、ヒト細胞である。好ましくは、工学的に操作された細胞は、体細胞であり、より好ましくは、腫瘍細胞であり、最も好ましくは幹細胞または人工多能性幹細胞である。

本発明のさらなる主題はまた、上記の核酸またはベクターをコードするように工学的に操作された動物、または本発明のＣａｓ９バリアントによって恒久的に改変された動物である。好ましくは、動物はモデル生物であり（すなわち、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、マウス、蚊、ラット）、または動物は家畜動物もしくは養殖魚もしくはペットである。好ましくは、動物は少なくとも疾患のベクターである。より好ましくは、生物は、ヒト疾患のベクターである（すなわち、蚊、ダニ、トリ）。

本発明のさらなる主題は、上記の核酸もしくはベクターを使用して工学的に操作された植物、または本発明のＣａｓ９バリアントによって永久に改変された植物である。好ましくは、植物は作物（すなわち、米、大豆、麦、タバコ、綿、アルファルファ、キャノーラ、トウモロコシ、テンサイ）である。

本発明のさらなる主題はまた、細胞、動物または植物を恒久的に改変する方法であって、前記方法は、細胞、動物または植物のＤＮＡを編集するための本発明のＣａｓ９分子を使用するステップを含む。

本発明のさらなる主題はまた、遺伝子治療の医薬としての使用のための、上記のヌクレオチドの配列または核酸またはベクターである。本発明のさらなる主題はまた、上記の配列ヌクレオチドまたは核酸またはベクターおよび少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる主題はまた、上記の変異を含有する組換えＣａｓ９ポリペプチドおよび少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物である。

本発明のさらなる主題はまた、ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現または他のバイオテクノロジー利用のための、上記の配列ヌクレオチドまたは核酸またはベクターのインビトロでの使用である。

本発明のさらなる主題は、ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現または他のバイオテクノロジー利用のための、ｇＲＮＡを一緒に用いる、上記の変異を含有する組換えＣａｓ９ポリペプチドのインビトロでの使用である。

本発明のさらなる主題は、上記のヌクレオチドの配列または核酸またはベクターまたは組換えＣａｓ９ポリペプチドを含む、同時に、別々に、または順に使用するためのキットオブパーツである。

細胞のゲノムを変更するインビトロまたはインビボでの方法であって、この方法は、特定のゲノム配列を標的化するガイドＲＮＡと一緒に、上記の改変Ｃａｓ９を細胞で発現させることを含む。

細胞の転写を変更するインビトロまたはインビボでの方法であって、この方法は、特定のゲノム配列を標的化するガイドＲＮＡと一緒に、上記の改変ｄＣａｓ９ベースの転写調節因子を細胞で発現させることを含む。

細胞のエピゲノムを変更するインビトロまたはインビボでの方法であって、この方法は、特定のゲノム配列を標的化するガイドＲＮＡと一緒に、上記の改変ｄＣａｓ９ベースのエピゲノムエディターを細胞で発現させることを含む。

本発明は、以下の実験に照らしてより理解される。

図１：ＳｐＣａｓ９のオンおよびオフターゲット活性を定量するインビボイーストアッセイの設計を示す。イーストレポーター株の生成を示す図である。ＴＲＰ１およびＡＤＥ２遺伝子座は、オンターゲット部位（ＴＲＰ１）または異なるオフターゲット配列（ＡＤＥ２、配列は右上の箱に報告する）を含有するレポーターカセットの挿入によって改変された。標的の両側の相同領域（ＨＲ）の存在は、Ｃａｓ９による切断時の一本鎖アニーリングによる効果的な修復を可能にする。適切な選択プレートを使用して、２つの遺伝子座の編集状態を追跡することが可能である。コロニーの生存は、ＴＲＰ１オンターゲット切断を示すが、コロニーの色はＡＤＥ２オフターゲットの切断の評価を可能にする。

図２：野生型ＳｐＣａｓ９を使用するｙＡＣＭＯ株の検証を示す。ＴＲＰ１遺伝子座のオンターゲット配列にマッチングするｓｇＲＮＡを安定に発現するｙＡＣＭＯ−オフ１／オフ４レポーター株への野生型（ｗｔ） ＳｐＣａｓ９によるトランスフォーメーション後の、赤（オンターゲット）および白（オフターゲット）コロニーの平均パーセンテージの定量を示す図である。Ｃａｓ９発現はプレーティングの２４時間前に誘導された。エラーバーは、ｎ＝３のｓ．ｅ．ｍ．を表す。

図３：ランダムなライブラリー生成のための標的ドメインの選択を示す。ＳｐＣａｓ９ドメインの概略図である。Ｒｅｃ１−ＩＩドメイン（ハイライトした）は、アルファヘリックス認識ローブの一部である。ＢＨ：架橋ヘリックス。

図４：高特異性ＳｐＣａｓ９バリアントのイーストスクリーニングを示す。（ａ）イーストスクリーニングワークフローを表す概略図である。（ｂ）ｙＡＣＭＯ−オフ４レポーター株による分析によってイーストスクリーニングから得られたＳｐＣａｓ９バリアントのオンターゲット活性および特異性の評価を示す図である。Ｃａｓ９発現は、プレーティングの５時間前に誘導された。添付資料の表１を参照。（ｃ）Ｃ１３バリアントの特異性の評価を示す図である。Ｃ１３は、オンターゲットのｓｇＲＮＡを発現するｙＡＣＭＯ−オフ１／オフ４レポーター株をトランスフォームし、赤（オンターゲット）および白（オフターゲット）コロニーのパーセンテージがＣａｓ９発現の２４時間後に評価された。エラーバーは、ｎ＝３のｓ．ｅ．ｍ．を表す。

図５：哺乳動物細胞において最適化されたＳｐＣａｓ９バリアントの選択を示す図である。ＥＧＦＰを安定に発現する２９３細胞に、オンターゲットｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰオン）または各ミスマッチガイドと一緒に優良イースト単離バリアントから得られた変異体の階層的な組合せによって生成された１重および２重（ａ）ならびに３重（ｂ）の変異体をトランスフェクトした。ＥＧＦＰ蛍光の消失を、トランスフェクション後７日目にＦＡＣＳ分析によって測定した。（ｃ）最良の生成バリアントの以前に報告された変異体との対照比較を示す図である。２９３細胞株のＥＧＦＰノックアウトアッセイを使用して、トップの単離したバリアント（ＶＮＥＬ、ＶＮＥＱおよびＶＮＥＳバリアント）の特異性を評価し、それらの性能を以前に報告された高忠実度の変異体と比較した。ＥＧＦＰ蛍光の消失を、トランスフェクション後７日目にＦＡＣＳ分析によって測定した。ｓｇＧＦＰ１３１４はスペーサー配列のＰＡＭから１３および１４位にミスマッチを含有し；ｓｇＧＦＰ１８１９は１８および１９位にミスマッチを含有し；ｓｇＧＦＰ１８は１８位に単一のミスマッチを含有する。点線は、示したオン／オフ対について算出したオン／オフターゲット比を示す。破線は、ＥＧＦＰ蛍光のバックグラウンド消失を示す。エラーバーは、ｎ≧２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。

図６：ＥＧＦＰに対するｅｖｏＣａｓ９オンターゲット活性を示す。（ａ）ＥＧＦＰ遺伝子座に対するｅｖｏＣａｓ９活性を示す図である。ＥＧＦＰを安定に発現する２９３細胞に、ＥＧＦＰコード配列の異なる領域を標的化するｓｇＲＮＡと一緒に、ｗｔ ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９（ＶＮＥＱ）またはＶＮＥＬバリアントをトランスフェクトした。ＥＧＦＰ蛍光の消失を、トランスフェクション後７日目にＦＡＣＳ分析によって測定した。破線は、ＥＧＦＰ蛍光のバックグラウンド消失を示す。エラーバーは、ｎ≧２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。（ｂ）ＥＧＦＰ遺伝子座上で算出したｅｖｏＣａｓ９およびＶＮＥＬバリアントのオンターゲット活性の、野生型ＳｐＣａｓ９に対する比を示す図である。中央値および四分位範囲が示される。ｗｔタンパク質の７０％を超えるオンターゲット活性のレベルは、斜線部によって示される。（ｃ）ｅｖｏＣａｓ９細胞内発現を示す図である。ｗｔ ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９または他の高忠実度バリアントをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来のライセートの代表的なウェスタンブロット。チューブリンをローディングコントロールとして使用した。ＳｐＣａｓ９を抗ＦＬＡＧ抗体を使用して検出した。

図７：内因性遺伝子座へのｅｖｏＣａｓ９活性を示す。（ａ）内因性遺伝子座に対するｗｔ ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１活性を、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトするステップおよびＴＩＤＥツールを使用してトランスフェクション後の７日目のインデル形成を測定するステップによって比較した図である。（ｂ）内因性遺伝子座上で算出したｅｖｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオンターゲット活性の、野生型ＳｐＣａｓ９に対する比を示す図である。中央値および四分位範囲を示す。ｗｔタンパク質の７０％を超えるオンターゲット活性のレベルは、斜線部によって示される。エラーバーは、ｎ＝２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。

図８：ｅｖｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１特異性の対照比較を示す。（ａ）選択した遺伝子座上のｅｖｏＣａｓ９のオフターゲット活性を示す図である。２９３Ｔ細胞は、ＦＡＮＣＦ部位２またはＣＣＲ５ｓｐ１１遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡと一緒に、ｗｔ ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ１をトランスフェクトされた。以前に検証された２つのオフターゲット部位におけるインデル形成を、ＴＩＤＥツールを使用してトランスフェクション後の７日目に評価した。エラーバーは、ｎ＝２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。（ｂ）オン／オフ比を、（ａ）で得られた平均インデルパーセンテージから算出した図である。破線は、１に等しいオン／オフ比を示す。（ｃ）高度に相同なＣＣＲ２遺伝子におけるＣＣＲ５遺伝子座およびそのオフターゲット部位の概略図である。２つの部位の同時切断は、およそ１６ｋｂの染色体欠失を生成する。半定量的ＰＣＲを、ｗｔ ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ１およびＣＣＲ５ガイドＲＮＡをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡで実施し、各条件で生成された染色体欠失の量を評価した。ＦＡＮＣＦ遺伝子座を内部基準(normalizer)として使用した。欠失の量は、ＩｍａｇｅＪによるデンシトメトリーを使用して定量した。エラーバーは、ｎ＝２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。

図９：標的化ディープシーケンシングによるｅｖｏＣａｓ９特異性の検証を示す。ＥＭＸ１部位１遺伝子座（ａ）およびＶＥＧＦＡ部位３遺伝子座（ｂ）に対して以前に検証したオフターゲット部位の標的化ディープシーケンシングを、各特異的ｓｇＲＮＡと一緒にｗｔ ＳｐＣａｓ９またはｅｖｏＣａｓ９のいずれかを発現する２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡに実施した。Ｃａｓ９を発現しない細胞は、バックグラウンドインデルレベルを決定するためにシーケンスした。３つの生物学的複製物からのゲノムＤＮＡを、ライブラリー調整の前に混合した。

図１０：ｅｖｏＣａｓ９のゲノム全体での特異性を示す。（ａ）２９３Ｔ細胞におけるｗｔ ＳｐＣａｓ９およびｅｖｏＣａｓ９両方に実施した、ＶＥＧＦＡ部位２遺伝子座に対するオフターゲット部位のＧＵＩＤＥ配列分析を示す図である。黒い四角はオンターゲット部位を示す。（ｂ）ｗｔ ＳｐＣａｓ９およびｅｖｏＣａｓ９の検出されたオフターゲット部位の総数を示す図である。３つの生物学的複製物からのゲノムＤＮＡを、ライブラリー調整の前に混合した。

図１１：ｅｖｏＣａｓ９の転写活性を示す。（ａ）Ｔｅｔ応答因子（ＴＲＥ）−ＥＧＦＰベースの転写活性化因子レポーターの概略図である。ｄＣａｓ９−ＶＰ６４のＴｅｔＯリピートへの結合時に、ＥＧＦＰ発現が活性化される。（ｂ）ＥＧＦＰ活性化は、マッチングｓｇＲＮＡ（５’ミスマッチＧ有りもしくは無しの両方）またはミスマッチガイドと一緒にｄＣａｓ９またはｅｖｏ−ｄＣａｓ９ベースの転写活性化因子をトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において測定された。ＴｅｔＯ−オフ６はＰＡＭから６位にミスマッチを含有し、ＴｅｔＯ−オフ１３１４は１３〜１４位に２つのミスマッチを含有し、ＴｅｔＯ−オフ１８１９は１８〜１９位に２つのミスマッチを含有する。（ｃ）（ｂ）のデータから算出した非標的化コントロールに関するＥＧＦＰ発現の活性化倍数を示す図である。エラーバーは、ｎ＝２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。ＥＧＦＰ発現を、トランスフェクション後の２日目にＦＡＣＳ分析によって測定した。

図１２：ｅｖｏＣａｓ９の長期特異性を示す図である。ＳｐＣａｓ９（ａ）、ｅｖｏＣａｓ９（ｂ）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１（ｃ）は、ＥＧＦＰを安定に発現する２９３Ｔ細胞中でレンチウイルス送達によって安定に発現される。各レンチウイルスベクターは、ＥＧＦＰコード配列に対するオンターゲットまたは図５に示す異なるミスマッチガイドのｓｇＲＮＡを有した。ＥＧＦＰノックアウトを、グラフに示した時点でのＦＡＣＳ分析によって評価した。形質導入細胞を、ピューロマイシン選択培地中で培養した。エラーバーは、ｎ＝２のｓ．ｅ．ｍ．を表す。

Ｃａｓ９活性の検出のためのレポーターイースト株の設計
サッカロミセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）を、指向進化スクリーニングを開発するための実験モデルとして使用し、高特異性ＳｐＣａｓ９バリアントを単離した。イーストベースのアッセイプラットフォームを使用する利点は、一面では、速い倍化速度、単一のクローンを容易に単離する能力および迅速かつ信頼性のあるトランスフォーメーションプロトコールの利用可能性などの、イーストがバクテリアと共有する類似性にあり、別の面ではイーストのＤＮＡ編成および代謝が高等真核細胞のものと類似していることにある。したがって、イーストモデルは、スクリーニング結果の頑強性を増大する哺乳動物システムとの類似性と合わせたハイスループットスクリーニングのためのフレキシブルなプラットフォームを提供する。最初は、Ｃａｓ９オン対オフターゲット活性の同時測定のための栄養要求性レポーターイースト株を生成する戦略が設計された。この手法は、２つのイーストゲノム遺伝子座：ＴＲＰ１（染色体ＩＶ）およびＡＤＥ２（染色体ＸＶ）の改変の試験からなる。ｄｅｌｉｔｔｏ ｐｅｒｆｅｔｔｏ手法を使用することにより、２つの遺伝子座の野生型コード配列は、ＴＲＰ１遺伝子座の場合にはオンターゲットｓｇＲＮＡにマッチする特異的標的配列によって分けられ、またはＡＤＥ２遺伝子座の場合には異なるオフターゲット配列によって分けられた２等分に分割された（図１に図式化する）。各オフターゲット（ＡＤＥ２オフ１〜オフ４、添付資料の表４）は、ＰＡＭ配列からの距離が増加した位置で単一のミスマッチを含有した。１００ｂｐの重複を標的配列（ＴＲＰ１またはＡＤＥ２）の両側に追加し、終止コドンは、２つの相同領域の間のすぐ上流に配置されて、翻訳の早期中断を確実にした（図１）。レポーターカセット挿入によるＴＲＰ１およびＡＤＥ２遺伝子のノックアウトは、トリプトファンおよびアデニン代謝経路の欠損をもたらし、トリプトファンの非存在下での増殖を抑制し、細胞が低濃度のアデニンで増殖する場合、アデニン生合成の中間産物の細胞液胞における蓄積をもたらし、よってアガープレート上のコロニーに特徴的な赤色の着色を与えた。Ｃａｓ９によって誘導される二本鎖切断の形成後、各遺伝子座は、２つの隣接している相同領域の存在のおかげで一本鎖アニーリング修復経路を使用してイースト細胞によって効果的に修復され、２つの栄養素の原栄養性への復帰を得ることができる。２つの遺伝子座のそれぞれにおける成功裏の編集イベントは、次に、トリプトファンを欠いた、アデニンを低濃度でのみ含有する適切なレポータープレートを使用して可視化できる（ＳＤｌｕｔａ_５、図１）。アッセイの完全な読み出しは、２ステッププロセスからなる。最初のステップは、ＳＤｌｕｔａ_５レポータープレートで得られたコロニー数を形質転換体の総数（ＳＤｌｕプレート）のみを選択する場合に得られたものと比較するステップによるオンターゲット切断効率の評価からなる。第２のステップは、オンターゲット活性対オフターゲット活性の評価のためのレポータープレート上で、オンターゲット切断に対応する赤色コロニー（ＴＲＰ１^＋／ＡＤＥ２⁻）およびオフターゲット遺伝子座が編集された白色コロニー（ＴＲＰ１^＋／ＡＤＥ２^＋）の数を数えるステップからなる。４つの潜在的なオフターゲット部位（ＡＤＥ２オフ１〜オフ４）を含有する４つのイースト株が生成され、ｙＡＣＭＯ−オフ１／オフ４と名付けた。次に、異なるｙＡＣＭＯ株のＡＤＥ２遺伝子座およびＴＲＰ１遺伝子座の自然発生的な復帰の割合を見積り、アッセイの読み出しにおける複雑化させる任意の変数の加入を回避した。ＴＲＰ１遺伝子座の復帰は、実際には、擬陽性クローンの単離をもたらし得るが、ＡＤＥ２遺伝子の自然発生的な組換えは偽陰性コロニーを生成し得る。本発明者らのアッセイ中に使用した実験条件を近づけるため、４つの株のそれぞれが別々にＳｐＣａｓ９をコードするプラスミドによってトランスフォームされ；選択培地中での２４時間インキュベーション後、細胞を選択プレート上に広げ、形質転換体の総数を測定し、１０００倍多くの細胞をトリプトファンまたはアデニンを欠損した選択プレート上にプレートし、各遺伝子座の復帰変異体の数を数えた。異なる選択条件下で得られたコロニーの数を比較することにより、ＴＲＰ１遺伝子座とＡＤＥ２遺伝子座との両方に関しておよそ１〜１．５×１０^−５の平均復帰頻度を見積もることができ、したがって自然発生的な復帰が無視できることを示した。

ｙＡＣＭＯレポーター株の検証
レポーターアッセイの機能性は、野生型ＳｐＣａｓ９と組み合わせて４つのレポーター株（ｙＡＣＭＯ−オフ１／オフ４）を試験することによって検証した。全体的な有効性を最大にするため、ＳｐＣａｓ９によるチャレンジの前に、それぞれの株を、ＴＲＰ１遺伝子座においてオンターゲット配列に完全にマッチングするｓｇＲＮＡ−オンを発現するプラスミドによって安定にトランスフォームした。４つの株は、次いで、ガラクトース誘導性プロモーターによって制御される野生型ＳｐＣａｓ９の発現のためのプラスミドによってトランスフォームされ、４時間の回復インキュベーション後、ガラクトース含有培地中で一晩誘導して、ＳＤｌｕおよびレポーターＳＤｌｕｔａ_５プレートにプレーティングした。これらの実験条件で、本発明者らは１００％のオンターゲット切断に一貫して達した。また、オフターゲット活性は、レポータープレート上の白色コロニー（ＴＲＰ１^＋／ＡＤＥ２^＋）のパーセンテージとして測定して、予測した通り、ＰＡＭ配列からのミスマッチ塩基の距離にしたがって増加した（図２）。最もＰＡＭ遠位の２つのオフターゲット（オフ３およびオフ４）については、ＳｐＣａｓ９は、マッチング配列と２つのミスマッチ配列との間を区別することが全くできなかった（図２）。

これらの結果を考慮して、ＳｐＣａｓ９バリアントは、忠実度が明らかに増加する変異体を選択するため、最強のオフターゲット配列を含有するｙＡＣＭＯ−オフ４株を使用してスクリーニングされた。

高特異性ＳｐＣａｓ９バリアントのイーストベーススクリーニング
公表された研究（Slaymaker IM et al., Science. 2016, 351(6268):84-8; Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5）とは異なり、本発明者らは、バイアスなしの手法は、高忠実度のＳｐＣａｓ９バリアントを得る見込みを増加する重要なアミノ酸置換の単離をもたらし得ると考えた。ランダム変異誘発に好適な標的を見出すため、利用可能な構造データを分析し、どのＳｐＣａｓ９ドメインがそのような種類の相互作用の形成に、より関与し得るか同定した。Ｃａｓ９のヌクレアーゼローブは、切断活性を維持するために保存されなければならない触媒部位を２つ含有するため、この分析から除外された。Ｒｅｃ１、Ｒｅｃ２および架橋ヘリックスドメインを含有する認識ローブは、ｇＲＮＡ：ＤＮＡ二量体とのいくつかの接触を生じることが報告されている。さらに、認識ローブは、全体として、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに属する３つのＣａｓ９ファミリー全てにわたって最小限の保存領域の１つであり、高い配列可変性を示す。対照的に、架橋ヘリックスは異なるＣａｓ９オルソログ中の最も保存された領域の１つであり、その配列はヌクレアーゼ機能に特に重要であることを示唆している。Ｒｅｃ１−Ｒｅｃ２領域は、６００アミノ酸超のランダム変異導入に適さない範囲にわたるが、相互作用する残基の大部分はＲｅｃ１−ＩＩドメインの最後の部分、およそ４００〜７００残基の間に位置する（図３）。エラープローンＰＣＲによって分子あたりおよそ４〜５個の変異を含有するように生成されたＲＥＣ１−ＩＩバリアントのライブラリーは、変異誘発されたＲＥＣ１−ＩＩ断片（適切な相同アームを含有するもの）と、ガラクトース誘導性ＳｐＣａｓ９を発現するプラスミド（同領域が事前に除去されたもの）との間の相同組換えを利用して、ｙＡＣＭＯ−オフ４レポーターのイースト株において直接構築された。全体的なスクリーニングワークフローを図４ａに図式化した。コトランスフォーメーションおよびＳＤｌｕ培地中での終夜の回復インキュベーションにより相同組換えによるＣａｓ９コードプラスミドの修復およびトランスフォームした細胞の選択を可能にした後、培養物はガラクトースを用いて５時間誘導されてＳｐＣａｓ９を発現し、次いでいくつかのＳＤｌｕｔａ_５レポータープレート上にプレートされた。本発明者らは野生型ＳｐＣａｓ９がこの制限された時間間隔でオンターゲット配列を完全に切断できることを観察したため（データは示さない）、誘導時間は、以前の実験に対して短くされ、高オンターゲット活性を維持するバリアントを得た。２日後、複数のコロニーが得られ、赤色コロニーをデキストロースの代わりにガラクトースを含有する新しいレポータープレートにストリークして、ＳｐＣａｓ９発現を再活性化し、その発現をオンにしたまま一定に維持して、任意のオフターゲット効果を悪化させた。４８時間後、最も赤いストリークからプラスミドを回収し、バクテリア中での増幅後、サンガー法配列決定を行い、ＲＥＣ１−ＩＩドメインに導入された変異を同定した。いくつかのアミノ酸置換が同定され、そのいくつかは、異なる変異の群と組み合わせた変異体のプール中で１回より多く存在した。注目すべきことに、バリエーション尾同じセットを含有する変異体は、回復インキュベーション中に複製した同起源の細胞から誘導されたクローンを表すようである。しかしながら、得られた置換の多様性を考慮すると、この現象はスクリーニングの結果に影響しなかった。次いで、各単離したバリアントを含むｙＡＣＭＯ−オフ４株において再チャレンジ実験を実施して、より正確にその切断活性を測定し、野生型ＳｐＣａｓ９と比較してそれらの標的を効果的に切断しなかったものを除去して、残りのものを、それらのパラメーターおよびオフターゲット部位を区別するそれらの能力にしたがってランク付けした（図４ｂ）。スクリーニングの結果をさらに検証するため、得られたバリアントの１つ（Ｃ１３バリアント）の特異性を、４つのｙＡＣＭＯレポーター株全てをチャレンジするステップにより、より詳細に評価した。Ｃａｓ９発現の２４時間後、レポータープレート上の白色コロニーおよび赤色コロニーの定量によって、野生型ＳｐＣａｓ９と比較した場合にオフターゲット活性が著しく低減されたことが示された（図４ｃおよび図２を比較）。

哺乳動物細胞における高忠実度ＳｐＣａｓ９バリアントの最適化
オンターゲット切断効率および非特異的活性の減少の両方によるイーストのスクリーニングから単離した優良バリアントに属する置換のプールを選択した。同定した変異体に対して著しく増加した忠実度を得るために、ランダムに生成された各バリアントにおけるいくつかの置換が中間的または有害であり得たと予想されたので、これらの変異の階層的な組合せを企図した。利用可能な構造データによる各置換およびｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二量体の相対位置を最初のフィルタリング基準として用い、変異の最初のサブセットを同定した。さらに、標的ＤＮＡ配列のよりＰＡＭ遠位の部分（ｎｔ．１７〜２０）と接触するＲＥＣ１−ＩＩドメインの末端に位置する置換の立体構造クラスターが注目を集めた。したがって、このクラスターに属する変異は、これまでにｓｇＲＮＡ：ＤＮＡ二量体との相互作用が報告されていなかったとしても選択された。特に、Ｋ５６２Ｅ変異体から出発して変異を順次追加することが決定され、これをイーストアッセイにおいて特によく実施した（図４ｃ）。とりわけ、Ｋ５６２Ｅ変異は、上述のＲＥＣ１−ＩＩドメインに含まれる（図３）。

ＥＧＦＰを安定に発現するレポーター細胞株（２９３ｍｕｌｔｉＧＦＰ）を使用して、二重の変異体のオンターゲット活性（ｓｇＧＦＰオン）を、ＥＧＦＰコード配列へのフレームシフト変異によって誘導された蛍光の消失を測定することによって試験した。並行して、ＰＡＭトリヌクレオチドから遠位の１つまたは２つ（ｓｇＧＦＰ１８の１８位およびｓｇＧＦＰ１８１９の１８〜１９位）のミスマッチ塩基のｓｇＲＮＡへの導入後、当該部位の切断を回避する能力を評価した。野生型ＳｐＣａｓ９は、マッチおよびミスマッチｓｇＲＮＡの両方によってガイドされた場合、等しい効率で標的配列を切断し、ＥＧＦＰ^＋細胞の同じパーセンテージ減少をもたらしたという観察から確かめられるように、これらの代用オフターゲット配列を区別することができなかった（図５ａ）。初回の選択後、最良の置換を、ＥＧＦＰレポーター細胞系のチャレンジを繰り返すために使用した３重の変異体に組み合わせた（図５ｂ）。次いで、最終回の選択を、前の回の最良の置換を組み合わせることによって４重の変異体（ＶＮＥＬバリアント）を生成した後に実施した。さらに、ＰＡＭにより近位の領域に２つのミスマッチを含有する別のｓｇＲＮＡ（１３および１４位、ｓｇＧＦＰ１３１４）を試験して、ＶＮＥＬバリアントの忠実度の観察された増加が全スペーサー配列にわたる変異に保存されたことを実証した。ＶＮＥＬバリアントは、全てのミスマッチガイドＲＮＡに関してＥＧＦＰ蛍光のロスほとんどまたはまったく誘導せず、これは、ＰＡＭから１８位の単一の置換を含有するｓｇＲＮＡ（ｓｇＧＦＰ１８）での特に目立つ結果であった。一方で、特異性のこの強い増加は、オンターゲット活性における小さいけれども測定可能な減少をもたらした（約２０％減少、図５ｃ）。この問題に取り組むため、ＶＮＥＬバリアントの２つの代替えの誘導体（ＶＮＥＱおよびＶＮＥＳバリアント）を合理的設計によって生成し、同じＥＧＦＰノックアウトアッセイを使用して試験した。予測されたように、オフターゲット活性のわずかな増加と並行して、オンターゲット切断効率の完全な回復が観察された。全体的に、ＶＮＥＱバリアント変異体は最良のオン／オフターゲット比を示した（図５ｃ）。

４重変異体（ＶＮＥＬ、ＶＮＥＱ、ＶＮＥＳバリアント）の、上記のＥＧＦＰレポーター細胞系を使用する、以前に公表された高忠実度バリアントＳｐＣａｓ９−ＨＦ１およびｅＳｐＣａｓ９（１．１）との対照比較により忠実度の明白な増加を明らかにした。このことは、１８位に単一のミスマッチを含有するｓｇＲＮＡを使用して特に明らかである。この特別な代用のオフターゲットに関して、ＶＮＥＬ、ＶＮＥＱおよびＶＮＥＳバリアントを、本実験によるとｅＳｐＣａｓ９（１．１）よりもずっと良好にミスマッチ部位をすでに識別していたＳｐＣａｓ９−ＨＦ１と比較する場合、非特異的な切断においておよそ１７分の１〜４分の１への絶対的な減少が測定された（図５ｃ）。この観察は、２つの最強の代用のオフターゲット（ｓｇＧＦＰ１８１９およびｓｇＧＦＰ１８）に関して算出した異なるＳｐＣａｓ９バリアントのオン／オフターゲット比を分析することによって、さらに確かめられた（図５ｃの点線を比較）。次に、ＥＧＦＰコード配列の異なる領域を標的化することによって、２９３ｍｕｌｔｉＧＦＰレポーター細胞株を使用してＥＧＦＰ蛍光の消失を測定して、ＶＮＥＬおよびＶＮＥＱバリアントのオンターゲット活性をより詳細に評価した。ＶＮＥＳバリアントは、ＶＮＥＱ変異体と似た挙動を示したため分析から除外した。先の結果（図５ｃ）にしたがって、本発明者らはＶＮＥＱの活性の野生型レベルを観察し、ＶＮＥＬは、試験した遺伝子座の１つについては活性が著しく落ち、いくつかの部位でわずかに低く働いていた（図６ａおよび６ｂ）。オンターゲット部位およびオフターゲット部位に対して測定された異なる切断挙動が、ＳｐＣａｓ９バリアントの細胞内レベルの変更によるものであった可能性を除外するため、野生型ＳｐＣａｓ９、ＶＮＥＬおよびＶＮＥＱ、ならびに以前に公表された２つの高忠実度バリアントｅＳｐＣａｓ９（１．１）およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のタンパク質レベルを、等量の発現プラスミドをトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞で分析した。結果によりはっきりと示されたように（図６ｃ）、タンパク質レベルの大きな差は観察されなかった。これらの結果を考慮して、ＶＮＥＱバリアントは、本明細書で分析した変異体の中でもほぼ野生型レベルの活性を維持し、ＥＧＦＰ−破壊細胞モデルにおいて非マッチング配列の切断を徹底的に減少させたため、さらに特徴付けを行った。ＶＮＥＱ変異体をｅｖｏＣａｓ９（進化したＣａｓ９）と名付けた。

内因性遺伝子座に対するｅｖｏＣａｓ９活性
次いで、上記の発見を、内因性遺伝子座を標的化することによってさらに検証した。以前に試験したゲノム標的部位の群は、各遺伝子座におけるｅｖｏＣａｓ９の切断活性を野生型ＳｐＣａｓ９の切断活性と比較するために選択された。さらに、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１もまた、さらなるベンチマークとして比較に導入された。異なる遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡと一緒に各ＳｐＣａｓ９バリアントによる２９３Ｔ細胞のトランスフェクション後、インデル形成が、各標的部位に対してサンガー法配列決定したアンプリコンについて、トラッキング−オブ−インデル−バイ−デコンポジッション（ＴＩＤＥ）ソフトウェアパッケージを使用することにより分析された（Brinkman EK et al., Nucleic Acids Res. 2014, 42(22):e168）。大部分の遺伝子座に関して、本発明者らは、野生型ＳｐＣａｓ９とｅｖｏＣａｓ９との間の標的化効率の大きな違いは観察せず、ｅｖｏＣａｓ９は概ねわずかに低い活性であり、全体的な平均活性が野生型タンパク質の平均活性の８０％であった（図７ａおよび図７ｂ）。本発明者らは、一つの標的部位であるＺＳＣＡＮ２遺伝子座に関して、非常に弱い切断効率を観察したが、その挙動に関する理解しやすい説明はない（図７ａ）。ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントは、野生型と比較して６０％の全体的な平均活性であり、全体的に低い切断効率を示した（図７ａおよび図７ｂ）。これは、以前に公表された観察（Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5）とは一致せず、この不一致は異なる実験手順によるものであり得ると推測できる。これらのデータは、ｅｖｏＣａｓ９が、試験した実験条件下で、内因性遺伝子座のパネルに対してほぼ野生型レベルのオンターゲット活性を維持し、以前に報告されたＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントに勝ることを実証するものである。

ｅｖｏＣａｓ９オフターゲット活性の評価
オンターゲット部位に対する活性と併せて、ｅｖｏＣａｓ９の特異性を、２つの遺伝子座：ＦＡＮＣＦ部位２およびＣＣＲ５ ｓｐ１１における編集と関連する以前に検証した２つのオフターゲット部位における編集率を確かめることによって測定した。これらの遺伝子座のＣａｓ９編集は興味深いものである。なぜなら、ＦＡＮＣＦ部位２関連オフターゲットは、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１が特異的なオンターゲット部位と区別できない数少ない非反復性部位の１つであり、一方、ＣＣＲ５ｓｐ１１遺伝子座は、ＡＩＤＳ処置におけるその治療利用に価値があるものであり、相同性が高いＣＣＲ２遺伝子のオフターゲット切断と相関するためである。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション後、これら２つのオフターゲット遺伝子座におけるインデル形成はＴＩＤＥを使用して測定され、野生型ＳｐＣａｓ９をトランスフェクトした細胞と比較した場合、ｅｖｏＣａｓ９を発現する細胞における切断が著しく減少したことが明らかにされた（図８ａ）。さらに、野生型ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９−ＨＦ１のオン／オフターゲット比の算出によって、本発明のバリアントがこれら２つの遺伝子座においてその競合物に勝り得ることが確認された（図８ｂ）。ＣＣＲ５ｓｐ１１遺伝子座とＣＣＲ２遺伝子中のオフターゲットとの協調的切断により、およそ１６キロベースの染色体欠失が生成される（図８ｃに図式化した）。この染色体再配置の頻度は、野生型ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を、ＣＣＲ５遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡと一緒にトランスフェクトした細胞における半定量的ＰＣＲによって測定された。特に野生型ＳｐＣａｓ９によって編集された細胞において転座イベントが明らかであり、一方、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１存在下およびｅｖｏＣａｓ９存在下の両方では欠失がわずかに検出可能なレベルの量まで大きく低減されたことが観察され、ｅｖｏＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１に対して測定される欠失をほぼ２分の１までさらに減少させた（図８ｃ）。

次に、ｅｖｏＣａｓ９が望ましくないゲノム切断を回避する能力を、ＶＥＧＦＡ部位３ゲノム部位およびＥＭＸ１−Ｋゲノム部位における編集と関連するオフターゲット部位の選択されたセットに対して標的化ディープシーケンシングを実施することによって調べた。全ての選択部位は、オンターゲット遺伝子座と一緒に編集されることが以前に示された（Kleinstiver BP, et al., Nature. 2015, 523(7561):481-5）。アンプリコンシーケンス手法の利点は、広範囲のいくつかの標的を同時に測定して、大量ではない編集イベントでさえも検出する可能性にある。シーケンスデータの分析は、両ゲノム遺伝子座において高いオンターゲット活性を維持しながら、ｅｖｏＣａｓ９が試験したオフターゲット部位の大部分における編集がバックグラウンドレベルであることによって特徴づけられることを実証した（図９ａおよび９ｂ）。第１のＶＥＧＦＡ部位３オフターゲット部位（ＶＥＧＦＡ３−ＯＴ１）は、ｅｖｏＣａｓ９編集活性がバックグラウンドを超えることを示す唯一の遺伝子座であった（図９ｂ）。しかしながら、同じ遺伝子座が野生型ＳｐＣａｓ９によりほぼオンターゲット部位として編集され、以前に報告されたＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントがこの配列の非特異的な切断を完全には抑制できなかったことを考慮しなければならない（Kleinstiver BP et al. Nature., 2016, 529(7587):490-5）。この結果は、この特定の遺伝子座が高度に反復性の性質をもつことによって説明され得ると推測されている。４つのＶＥＧＦＡ部位３オフターゲット部位（ＶＥＧＦＡ３−ＯＴ１、−ＯＴ４、−ＯＴ５、−ＯＴ７）に関して、著しく高いバックグラウンド編集率は、より壊れやすく、よって変異を蓄積しやすい特定位置のクロマチンの固有の特徴に起因する可能性が高いことを明らかにした（図９ｂ）。

要するに、このデータは、ｅｖｏＣａｓ９が、試験したオフターゲット部位のほとんどで望ましくないゲノム切断を検出できないレベルまで著しく減少することを示している。さらに、選択されたオフターゲット部位の以前に公表されたＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントとの対照比較によって、ミスマッチ部位を区別する能力の増加が実証された。

ｅｖｏＣａｓ９のゲノムワイドな特異性
ｅｖｏＣａｓ９オフターゲット活性のゲノムワイドなレベルでの分析を、以前に確率されたＧＵＩＤＥシーケンス技術を使用して拡張した（Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97）。この手法は、Ｃａｓ９によって切断された部位に３４ｂｐのオリゴヌクレオチドタグを挿入してそれらの捕捉をライブラリー調製および次世代シーケンシングのために可能にすることに基づく。このように、Ｃａｓ９によって非特異的に標的化される特定のガイドＲＮＡと関連する新規のゲノム部位のコレクションを、公平な様式で同定することが可能である。ＧＵＩＤＥシーケンス分析を実施して、高度に反復性であり、細胞ゲノムに多くの望ましくない切断を生成することが示されているＶＥＧＦＡ部位２遺伝子座の編集と関連するオフターゲット部位を分析した。さらに、過去の報告（Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5）は、いくつかの検出されたオフターゲットが依然として高忠実度ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントによって切断されたことを示した。従って、ＧＵＩＤＥシーケンスライブラリーを、野生型ＳｐＣａｓ９またはｅｖｏＣａｓ９のいずれかをＶＥＧＦＡ部位２ｓｇＲＮＡおよびベイト二本鎖オリゴヌクレオチドと一緒にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のゲノムＤＮＡから調製した。配列決定データを、オープンソースソフトウェアのパイプライン（Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2016, 34(5):483）を使用して分析し、野生型ＳｐＣａｓ９の６００の異なるオフターゲット部位が、オンターゲット配列との７つ以下のミスマッチによって特徴づけられることを明らかにした（図１０ａおよび図１０ｂ）。注目すべきことに、各特定の部位での実際の切断活性の良い代わりとなることが報告されている（Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97）ＧＵＩＤＥシーケンス分析後に得たリードの数によると、およそ１００のこれらのオフターゲット配列は、オンターゲット部位よりもより効果的に編集されていた（図１０ａ）。ｅｖｏＣａｓ９試料について同じ分析を実施した場合、全部で１０個の部位のみが検出され、その大部分がオンターゲットと高い類似性を共有し、ＶＥＧＦＡ部位２遺伝子座と５未満のミスマッチによって特徴づけられた（図１０ａ）。ｅｖｏＣａｓ９による高頻度切断を示す分析（オンターゲットより多い）から、１つのオフターゲットのみが明らかになった。これは、おそらくは、その配列が意図した標的から２つのヌクレオチドのみ異なり、各ミスマッチのレベルでシトシンの２つの連続したストレッチを含有し（図１０ａ）、バルジ部位を形成して非マッチングヌクレオチドに対応可能にしたという、その配列の特定の性質に起因したのであろう。全体的に、上記のＧＵＩＤＥシーケンス分析は、ｅｖｏＣａｓ９が、細胞ゲノムへの複数のオフターゲットによって特徴づけられる反復性標的配列を使用して試験した場合でさえも、ゲノムワイドなレベルでの非常に高い特異性を保持することを実証した。

ｅｖｏ−ｄＣａｓ９ベース転写活性化因子の特異性
Ｃａｓ９の代替の利用は、そのヌクレアーゼ活性とは独立して、触媒的に不活性なバージョンのＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を、転写を刺激できる様々なタンパク質ドメインに融合することによって、ＲＮＡガイド型転写活性化因子を生成することである。ｅｖｏＣａｓ９の触媒的に不活性な変異体を使用してＶＰ６４ベースの転写活性化因子（ｅｖｏ−ｄＣａｓ９）を工学的に作製し、野生型ｄＣａｓ９−ＶＰ６４活性化因子と並べて試験した。転写活性化は、最小ＣＭＶプロモーター内に組み込まれたＴｅｔオペレーターエレメントを通してＴｅｔＲベースのトランス活性化因子によって制御される誘導性ＥＧＦＰ発現ベクターに基づくレポーターシステムを使用することによって試験した。Ｔｅｔトランス活性化因子は、反復Ｔｅｔオペレーター配列を標的化するｓｇＲＮＡによってガイドされるＣａｓ９ベースの転写活性化因子で置換した（図１１ａ）。余分な５’−Ｇヌクレオチドの存在または不在のみが異なる２つの異なるオンターゲットｓｇＲＮＡが、レポータープラスミドのＴｅｔオペレーター遺伝子座に対して設計され、さらに、１つまたは２つのいずれかの変異をスペーサー配列に沿って異なる位置に有する、同じオンターゲット配列に基づく３つの追加のミスマッチガイドも設計した。マッチングガイドＲＮＡおよびミスマッチガイドＲＮＡの両方に対して、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４と比較してｅｖｏ−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４を用いると、ＥＧＦＰ発現のより低い絶対レベルが観察された。このことは、野生型ｄＣａｓ９が標的ＤＮＡにより強く結合したことを示唆している（図１１ｂ）。しかしながら、野生型ｄＣａｓ９およびｅｖｏ−ｄＣａｓ９の両方に関して、コントロールｓｇＲＮＡに対するオンターゲットの活性化倍率は、ｅｖｏ−ｄＣａｓ９で観察された低いバックグラウンド活性化に起因して、類似していた。この結果は、ｅｖｏ−Ｃａｓ９の非特異的にＤＮＡに結合する傾向がより低いことに起因する可能性がある（図１１ｃ）。興味深いことに、ｅｖｏ−ｄＣａｓ９−ＶＰ６４によって示された特異性の増加は、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４と比較した場合に控えめであった。このことは、ｅｖｏＣａｓ９が、効率がより低くともミスマッチ標的に結合するが、その場合、切断反応を完了できないことを示唆する（図１１ｃ）。全体的に、これらの結果は、ｅｖｏＣａｓ９が、絶対活性化能力がより低いもののより低いバックグラウンド活性化、およびわずかに増加した活性化忠実度によって特徴づけられる転写制御因子を構築するために利用され得ることを示す。

ｅｖｏＣａｓ９の長期特異性
細胞へのＣａｓ９の持続的な発現は、オフターゲット活性の増加と関連しているため、調べなければならない重要な問題は、細胞へのｅｖｏＣａｓ９の長期挙動であった。この点を解決するため、野生型ＳｐＣａｓ９、ｅｖｏＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９−ＨＦ１を、目的のｓｇＲＮＡと一緒に安定発現させ得るように、レンチウイルス粒子を生成した。高特異性バリアントをスクリーニングするために以前に用いられたものに類似の細胞のＥＧＦＰノックアウトモデルを用いるために、ＥＧＦＰコード配列に対するｓｇＲＮＡであって、標的遺伝子座に完全にマッチングするｓｇＲＮＡ、またはスペーサー配列の異なる位置に１つまたは複数のミスマッチを含有することによって代用のオフターゲットとして作用するｓｇＲＮＡのいずれかのｓｇＲＮＡの同じセットを使用して実験を行った。レポーター細胞株は、等量の異なるレンチウイルスベクターを用いて形質導入された。その培養物を実験の全期間にわたり選択して、形質導入された集団を単離し、編集される細胞の消失または形質導入細胞の適合の減少によって時間内に生じる、編集イベントが希釈化される可能性を回避した。一過性のトランスフェクション実験で観察されたものと同様に、異なる時点でのＥＧＦＰ蛍光の消失は、野生型ＳｐＣａｓ９が、完全にマッチングするｓｇＲＮＡまたはミスマッチｓｇＲＮＡのいずれかを用いる場合と類似の有効性で標的配列を切断することを明らかにした（図１２ａおよび図５ｃ参照）。反対に、ｅｖｏＣａｓ９とＳｐＣａｓ９−ＨＦ１の両方は、ｓｇＧＦＰ１３１４およびｓｇＧＦ１８１９ｓｇＲＮＡ（両方とも２重のミスマッチを含有する）を使用すると、ＥＧＦＰを効果的に切断しなかった（図１２ｂ〜ｃ）。注目すべきことに、ｅｖｏＣａｓ９試料に関して蛍光の消失は全ての時点でバックグラウンドレベルであり、一方、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１発現ベクターによって形質導入された培養物ではＥＧＦＰ陰性細胞の測定可能な数は経時的に一定のまま存在した（図１２ｃ）。さらに、ＰＡＭ遠位に単一のミスマッチを含有する最強の代用オフターゲット、ｓｇＧＦＰ１８を検討する場合、２つのバリアントの挙動は著しく異なった：ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１は、マッチングｓｇＲＮＡとミスマッチｓｇＲＮＡとの間を正確に区別することはできず、類似の効率で標的遺伝子座を切断したが、ｅｖｏＣａｓ９は蛍光細胞の消失の増加傾向を示し、形質導入後４０日目でのオンターゲットノックアウトの半分より少ないレベルに達した（図１２ｂ〜ｃ）。これらのデータは、ガイドＲＮＡの注意深い選択により、本発明の高特異性Ｃａｓ９バリアントｅｖｏＣａｓ９が、細胞ゲノム中の切断が制限されヌクレアーゼまたは望まない切断がないヌクレアーゼの長期の発現を可能にすることを示唆する。

材料および方法
プラスミドおよび構築物。プラスミドｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔを使用して、イーストでＣａｓ９を発現させた（Ａｄｄｇｅｎｅから取得した、♯４３８０４）（Di Carlo JE, et al., Nucleic Acids Res. 2013, 41(7):4336-43）。制限酵素消化によるＲＥＣ１−ＩＩドメインの正確な除去を可能にするため、それぞれＲＥＣ１−ＩＩドメインの上流および下流に、２つの制限部位、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩを導入するためにＰＣＲを通して同義の変異を生成した（プライマーについては添付資料の表２参照）。ｓｇＲＮＡの発現カセットは、ｐ４２６−ＳＮＲ５２ｐ−ｇＲＮＡ．ＣＡＮ１．Ｙ−ＳＵＰ４ｔプラスミドから取得した（Ａｄｄｇｅｎｅから取得した、♯４３８０３）（Di Carlo JE, et al., Nucleic Acids Res. 2013, 41(7):4336-43）。オリジナルのスペーサー配列を所望の標的と交換するため、アセンブリー−ＰＣＲベース戦略を利用した。ｓｇＲＮＡ発現カセットの５’部分を、Ｔ３フォワードプライマー（ＳＮＲ５２プロモーターの前にアニーリングする）およびスペーサー配列のすぐ上流にアニーリングし、所望のオンターゲット配列に対応する５’オーバーハングを含有するリバースプライマーを使用してＰＣＲ増幅した（添付資料の表２参照）。同じことを、プライマーＴ７リバースプライマーおよびスペーサー配列のすぐ後にアニーリングし、先に述べたものに逆平行の５’オーバーハングを含有するフォワードプライマーを使用して、ｓｇＲＮＡの３’断片に対して行った。ｇＲＮＡカセットを得るためのアセンブリー反応は、両方のＰＣＲアンプリコンを混合して、変性、アニーリングおよび伸長の単回ステップその後にＴ３およびＴ７の外側プライマーのみを使用する指数的増幅を実施することによって調製した。次いで、得られた断片を、ゲル精製して、ＳａｃＩＩ／ＸｈｏＩによって予備消化および平滑末端化したｐＲＳ３１６（ＡＴＣＣ）（ＵＲＡ３イースト選択可能マーカーを有する低コピー数のセントロメアプラスミド（centromeric plasmid））に平滑末端クローニングして、ｐＲＳ３１６−ＳＮＲ５２ｐ−ｇＲＮＡ．ＯＮ−ＳＵＰ４ｔプラスミドを生成した。

哺乳動物細胞でのＳｐＣａｓ９の発現のため、本発明者らは、ｓｇＲＮＡコードカセットが除去されている、ｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９（Ａｄｄｇｅｎｅから取得した、♯４２２３０）（Cong L et al., Science. 2013, 339(6121):819-23）由来のプラスミド、ｐＸ−Ｃａｓ９を用いた。Ｓｐ−Ｃａｓ９コード配列は、ヒトコドン最適化されており、ＣＢｈプロモーターによって制御される。さらに、２つの核局在シグナル（ＮＬＳ）がＳｐＣａｓ９のＮおよびＣ末端に追加されており、核移入を可能にし、３重のＦＬＡＧをタンパク質のＮ末端に配置して、検出を容易にしている。改善したＣａｓ９バリアントをコードするプラスミドを、ｐＸ−Ｃａｓ９プラスミドから出発し、連続した部位特異的変異誘発によって得た。以前に公表された増強したＳｐＣａｓ９変異体の発現のため、ＶＰ１２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから得た、♯７２２４７）（Kleinstiver BP et al., Nature. 2016, 529(7587):490-5）およびｅＳｐＣａｓ９（１．１）プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅから取得した、♯７１８１４）（Slaymaker IM et al., Science. 2016, 351(6268):84-8）を使用した。所望のスペーサー配列を、適切なオーバーハングを有するアニーリングしたオリゴヌクレオチドとして、Ｕ６プロモーター駆動発現カセットを含有するｐＵＣ１９プラスミドのガイドＲＮＡ定常部分上流の２つのＢｂｓＩ部位にクローニングした。レンチウイルスベクターを含む実験のため、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１送達ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅから取得した、♯４９５３５）（Cong L et al., Science. 2013, 339(6121):819-23）を、ｐＣＭＶ−ｄｅｌｔａ８．９１パッケージングベクター（Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ、ＥＰＦＬ、スイスからご厚意によりいただいた）および水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）をコードするｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅから取得した、♯１２２５９）と一緒に用いてウイルス粒子を産生した。ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１送達ベクターは、２Ａペプチドを介してピューロマイシンコード配列と融合した、ヒト化コドン型のＮ末端ＦＬＡＧ−タグ化ＳｐＣａｓ９のための発現カセットを含有し、形質導入細胞の選択を可能にする。Ｕ６駆動発現カセットはｓｇＲＮＡを転写する。所望のスペーサーに相当するアニールしたオリゴを、２つのＢｓｍＢＩ部位を使用してガイドＲＮＡにクローニングした。ＳｐＣａｓ９コード配列の一部分を、変異を含有するＣＤＳの領域に相当するＰＣＲ断片と交換することにより、増強したＳｐＣａｓ９バリアントをコードするｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ１ベースのベクターを生成した（プライマーについては、添付資料の表２参照）。ｐＴＲＥ−ＧＦＰプラスミドを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）プラスミド由来のＥＧＦＰコード配列をｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔクローニングベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングすることによって得た。ガイドＲＮＡ標的部位の完全なリストは、添付資料から入手できる。全てのオリゴヌクレオチドをＥｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入した。

イースト培養。ｙＬＦＭ−ＩＣＯＲＥイースト株（Ｒｉｃｈａｒｄ ｌｇｇｏからご厚意によりいただいた親ｙｌＧ３９７株から、本発明者らの研究室の１つが生成した）（Jegga AG et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(3):944-9; Tomso DJ et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005, 102(18):6431-6）を使用して、本研究で使用されるレポーターイースト株を生成した。全てのイースト実験において、合成最少培地（ＳＤ）を用いた（アミノ酸を含まないイースト窒素塩基６．７ｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン６００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン１５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アデニン２００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン１０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン１００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リシン９０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン２００ｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ウラシル２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸２００ｇ／Ｌ、Ｌ−セリン４００ｍｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）−グルコース２０ｇ／Ｌ）。選択培地が必要な場合には、実験設定にしたがって単一のアミノ酸を取り除いた。ｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔの誘導のため、２０ｇ／ＬのＤ−（＋）−ガラクトースおよび１０ｇ／ＬのＤ−（＋）−ラフィノースをデキストロースの代わりに使用した。ＡＤＥ２変異体のカラースクリーニングのための特定培地を、低濃度のアデニン（５ｍｇ／Ｌ）を使用して調製した。非選択培地が必要な場合には、ＹＰＤＡ富栄養培地を用いた（イースト抽出物１０ｇ／Ｌ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、Ｄ−（＋）グルコース２０ｇ／Ｌ、Ｌ−アデニン２００ｍｇ／Ｌ）。全ての溶液を、ｄｄＨ_２Ｏを使用して調製し、フィルター滅菌し、４℃で保存した。固体培地を、オートクレーブによる滅菌によって調製し、２０ｇ／Ｌのアガーを溶液に添加した。イースト培地を調製するための全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。

イーストトランスフォーメーション。トランスフォーメーションの前日、およそ１ｍｍ^３の所望のイースト株を５ｍＬの富栄養培地または選択合成培地に播種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で終夜増殖させた。次の日、３〜５ｍＬの培養物を全部で３０ｍＬの同じ培地に播種し、さらに２〜４時間２００ｒｐｍ、３０℃で増殖した。次いで、細胞を２分間２０００×ｇの遠心分離により回収し、３０ｍＬのｄｄＨ_２Ｏで洗浄し、２分間２０００×ｇで再度遠心分離し、１０ｍＬのＬｉＡｃ／ＴＥ １×（酢酸リチウム０．１ＭおよびＴｒｉｓ １０ｍＭ ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。この溶液を、２分間２０００×ｇで再度遠心分離し、適切な容積のＬｉＡｃ／ＴＥ １×中に再懸濁した（５００μＬ中に１００ｍｇのイーストペレット）。トランスフォーメーションミックスは、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡ、前もって超音波処理で切断して１０分間１００℃でボイルしたキャリアサケ精子ＤＮＡ５μｌ（およそ１μｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μＬの再懸濁したイースト培養物、および分子量約３６，５００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＬｉＡｃ／ＴＥ １×中で５００ｇ／Ｌに希釈したもの３００μＬを含有した。ボルテックス後、トランスフォーメーションミックスを３０℃で３０分間置き、次いで４２℃で３０分間乾燥浴を使用して熱ショックを与えた。次いで、細胞を、３分間３０００×ｇで遠心分離し、５ｍＬの適切なＳＤ選択培地中に再懸濁または選択ＳＤアガロースプレートに直接プレーティングし、３０℃でインキュベートした。自然復帰頻度評価のため、ｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔによるトランスフォーメーション後の細胞を選択培地中で２４時間増殖させた。次いで、細胞の濃度を、ＯＤ_６００を測定することによって評価し、１０００個の細胞をロイシン欠失選択プレート（ＳＤｌ）にプレーティングするか、または１０^６個の細胞をトリプトファン（ＳＤｌｔ）のアデニン（ＳＤｌａ）をさらに欠失するプレートに広げ、復帰変異体の数を評価した。

イーストコロニーＰＣＲ。およそ１ｍｍ^３のイーストのコロニーを、４９μＬのｄｄＨ_２Ｏ中に再懸濁することによって、コロニーＰＣＲを実施した。１μＬのリティカーゼ（lyticase）（１００００Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、細胞壁を消化し、次いで懸濁液を３０分間３０℃でインキュベートした。細胞をペレットにし、上澄み液を除去し、乾燥ペレットを１００℃で１０分間ボイルした。次いで、ペレットを５０μＬのｄｄＨ_２Ｏ中に再懸濁し、５μＬを、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲ反応の鋳型として使用した。

イーストからのプラスミドＤＮＡの回収。イーストから変異体Ｃａｓ９プラスミドを単離するため、単一コロニーを、ロイシンを含まない５ｍＬのＳＤ培地（ＳＤｌ）中、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で終夜増殖させ、ｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔプラスミドの存在を選択し、一方でガイドＲＮＡプラスミドの選択を緩和して、その希釈および欠損を誘導した。翌日、細胞を５０００×ｇで５分間遠心分離によって回収し、０．１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを含有する２５０μｌの緩衝液Ａ１に再懸濁した（ヌクレオスピンプラスミド、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）。次いで、細胞を、１００μＬの酸洗浄済みガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、５分間続けてボルテックスすることによって機械的に溶解した。次いで、プラスミドＤＮＡを、製造業者の指示に従って標準的なミニプレップシリカカラム使用して上澄み液から回収した。ＤＮＡを、３０μＬの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８．５で溶出した。溶出したＤＮＡを、ＮｃｏＩ酵素およびＮｈｅＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によって消化し、ｓｇＲＮＡベクターを除去して、後者プラスミド由来の夾雑を回避した。このことはアンピシリン耐性によっても選択可能である。消化後、１０μＬを化学的にコンピテントな大腸菌（E. coli）にトランスフォームさせた。次いで、回収したプラスミドを消化し、それらの同一性を確認し、次いでサンガーシーケンスによってＲＥＣ１−ＩＩドメインに導入された変異を同定した。

改変ＴＲＰ１およびＡＤＥ２ゲノムカセットのアセンブリー。ＡＤＥ２（ＡＤＥ２−オフ１、ＡＤＥ２−オフ２、ＡＤＥ２−オフ３およびＡＤＥ２−オフ４）およびＴＲＰ１（ＴＲＰ１−オン）ゲノム遺伝子座を工学的に操作するために使用されるＤＮＡカセットは、同様の戦略を使用して構築した。２つの異なるコロニーＰＣＲを実施して、各野生型遺伝子座を２等分して別々に増幅した。前半は、遺伝子ＣＤＳの上流のフォワードプライマー、およびそれぞれＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩ制限部位に続くオンまたはオフ１〜４標的配列を含有するリバースオーバーハングプライマーを用いた（添付資料の表３参照）。全てのリバースプライマーは、オン／オフターゲット配列の前に終止コドンを含有し、タンパク質の中断を確実にした。カセットの後半は、ＡＤＥ２およびＴＲＰ１コード配列の下流にアニールするリバースプライマー、ならびにカセットの前半を構築するために使用したリバースプライマーの１００ｂｐ前にアニーリングするフォワードプライマーを使用してアセンブルした。このようにして、２つの部分が一緒に合わされた場合、最終構築物は、オン／オフターゲット配列の上流および下流に１００ｂｐ長の相同領域を含有した。さらに、これらのフォワードプライマーは、カセットの前半に対応するリバースプライマー中に存在する同じ制限部位を含有した。したがって、ＴＲＰ１およびＡＤＥ２断片は、２等分をＫｐｎＩまたはＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によって消化してライゲートすることによってアセンブルした。生成物をアガロースゲル上で分離し、ホモライゲーション由来の断片を除去した。最終カセットを、最も外側のプライマーを使用するＰＣＲによって濃縮し、イーストに直接トランスフォームした。

イーストレポーター株の生成。ｄｅｌｉｔｔｏ ｐｅｒｆｅｔｔｏ手法は、イーストで特に有効である相同性指向型修復メカニズムの利用を介した一般的な選択システムの実用性により、特定の遺伝子座の遺伝的標的化を可能にする（Stuckey S and Storici F, Methods Enzymol. 2013, 533:103-31）。最初のステップは、目的の特定の遺伝子座における、カウンター選択可能なレポーターＩ−ＳｃｅＩカセット（ＣＯｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ＲＥｐｏｒｔｅｒ Ｉ−ＳｃｅＩ：ＣＯＲＥ−Ｉ−ＳｃｅＩ）の挿入に在る。カセットは、Ｉ−ＳｃｅＩの認識部位、ならびにガラクトース誘導性ＧＡＬ１プロモーター、耐性遺伝子ｋａｎＭＸ４（Ｇ４１８）およびクリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）（ＫＩＵＲＡ３）由来の対抗選択可能なマーカーＵＲＡ３遺伝子の制御下のエンドヌクレアーゼ自体のコード配列を含有する。ＣＯＲＥ−Ｉ−ＳｃｅＩカセットを、ＡＤＥ２遺伝子座およびＴＲＰ１遺伝子座の特定のオーバーハングを含有するプライマーによって増幅した（添付資料の表３参照）。同じ手順にしたがって、ＡＤＥ２遺伝子座から始めて各遺伝子座を続けて編集した。５００ｎｇの遺伝子座特異的なＣＯＲＥ−Ｉ−ＳｃｅＩカセットをイーストにトランスフォームし、細胞をＹＰＤＡプレート上にプレーティングし、３０℃で終夜インキュベートした。次の日、コロニーを、２００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含有するＹＰＤＡ培地上にレプリカプレートした。耐性コロニーを、挿入部位に隣接するゲノム配列にアニーリングするプライマーおよびカセットにアニーリングするプライマーを使用するコロニーＰＣＲによって所望の遺伝子座へのカセットの挿入の成功に関してスクリーニングした。標的遺伝子座内にインテグレートされたＣＯＲＥ−Ｉ−ＳｃｅＩカセットを、次いで最終編集した配列（ＴＲＰ１−オン、ＡＤＥ２−オフ１、ＡＤＥ２−オフ２、ＡＤＥ２−オフ３およびＡＤＥ２−オフ４）と交換し、同じオンターゲット配列および４つの異なるオフターゲットによって特徴づけられる、全部で４つの異なるイースト株を生成した。標的ＣＯＲＥ−Ｉ−ＳｃｅＩカセットを含有する適切な中間イースト株を、５ｍＬのＹＰＤＡに終夜播種した。次の日、トランスフォーメーションの前に、デキストロースの代わりにガラクトースおよびラフィノースを含有する合成培地（ＳＲＧ）３０ｍＬ中に、接種菌を再懸濁した。このステップは、ＣＯＲＥカセット内に在る標的部位を切断するＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼの転写を誘導するのに必須である。このＤＳＢは、ＨＲ駆動修復イベントの通常の頻度を増加し、所望の新しい配列とのカセットの交換に適している。ＳＲＧ中で４時間後、イーストを、標準的なトランスフォーメーションプロトコールにしたがって、所望の配列を含有する５００ｎｇのＨＲ鋳型によってトランスフォームさせた。形質転換体を、次いで、６０ｍｇ／Ｌのウラシルおよび１ｇ／ｌの５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有するＳＤにプレーティングした。オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ＫＩＵＲＡ３によってコードされる）の存在下で５−ＦＯＡは、強力なチミジル酸合成酵素阻害剤であるフルオロウラシルに変換される。５−ＦＯＡ耐性コロニーを、次いで、ＹＰＤＡおよびＧ４１８を補足したＹＰＤＡにレプリカプレートし、ＣＯＲＥカセットの欠失をさらに選択した。２つのレプリカプレートを比較することにより、陽性クローンに対応するＧ４１８感受性ＦＯＡ耐性コロニーを選択することができる。ゲノム遺伝子座全体の上流および下流にアニールするゲノムプライマーを使用して実施したコロニーＰＣＲは、サンガーシーケンスによって分析され、編集した遺伝子座の配列を確認した。改変ＴＲＰ１およびＡＤＥ２遺伝子座を含有する新しく生成されたイースト株は、ｙＡＣＭＯ−オフ１、ｙＡＣＭＯ−オフ２、ｙＡＣＭＯ−オフ３およびｙＡＣＭＯ−オフ４と呼ばれ、ＴＲＰ１遺伝子座の選択されたオンターゲット配列およびＡＤＥ２遺伝子座の４つの異なるオフターゲット配列によって特徴づけられ、オンターゲット配列に関してそれぞれオフ１はよりＰＡＭ近位であり、オフ４はよりＰＡＭ遠位である位置に単一のミスマッチを含有する（添付資料の表４参照）。

イーストアッセイ読み出し。ＡＤＥ２およびＴＲＰ１遺伝子は、アデニンおよびトリプトファンの産生をもたらす代謝経路の重要な酵素であり、このため、それらのノックアウトは、イーストがこれら２つの関連栄養素を欠失した培地中で増殖する能力を破壊する。本研究で生成されたｙＡＣＭＯイースト株は、Ｃａｓ９が各コード配列を切断して標的配列を中断させない限りＴＲＰ１およびＡＤＥ２遺伝子活性を欠失し：標的部位の両側における２つの１００ｂｐ相同領域の間の一本鎖アニーリング媒介組換えは、野生型遺伝子座の再構築を確実にする。次いで、栄養素要求性選択に基づくスクリーニングを使用して、２つのゲノム遺伝子座におけるＣａｓ９切断活性を評価することができ、オンターゲットおよびオフターゲットイベントの両方を測定する。ｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔおよびｐＲＳ３１６−ＳＮＲ５２ｐ−ｇＲＮＡ．ＯＮ−ＳＵＰ４ｔによるトランスフォーメーション後、細胞を、ロイシンおよびウラシルを含まない合成培地（ＳＤｌｕ）中で４時間増殖させて、ガラクトースを含有する培地（ＳＲＧｌｕ）中で終夜誘導した。次いでＳＤｌｕプレート上に等しい数の細胞をプレートし、形質転換体の総数を測定し、そしてトリプトファンを欠失して低濃度のアデニンを含むＳＤｌｕプレート（ＳＤｌｕｔａ_５）上で、Ｃａｓ９がオンターゲット配列のみ切断したコロニーまたはオフターゲット配列もまた切断したコロニーを区別した。特に、ＳＤｌｕｔａ_５読み出しプレートを観察する場合、異なる表現型が存在し得た：増殖しないことはＴＲＰ１遺伝子座の編集の欠如を示す（ＴＲＰ１⁻／ＡＤＥ２^＋／−）；赤色コロニー（ＴＲＰ１^＋／ＡＤＥ２⁻）の増殖はＴＲＰ１遺伝子座においてのみの編集を示し、オフターゲット活性は検出されない；白色コロニー（ＴＲＰ１^＋／ＡＤＥ２^＋）の増殖はＴＲＰ１遺伝子座およびＡＤＥ２遺伝子座両方における編集を示し、オフターゲット切断を検出する。コロニーの典型的な赤色の色素形成は、ＡＤＥ２遺伝子産物のレベルでの遮断によって生成されたアデニン生合成経路の中間体の細胞液胞への蓄積によって決定される。ＳＤｌｕおよびＳＤｌｕｔａ_５で得られたコロニーの総数を比較することにより、オンターゲット切断効率を測定することができ、ＳＤｌｕｔａ５の赤色および白色コロニーのパーセンテージを定量することにより、試験したオフターゲット配列に対するＣａｓ９活性の特異性の評価を得ることができる。

ＳｐＣａｓ９変異体のイーストスクリーニング。変異体のライブラリーを、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、エラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）によって生成した。製造業者の指示にしたがって、鋳型ＤＮＡ（ｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔ）の最初の量およびサイクル数を、キロベースあたり平均５個の変異を得るように設定した。５０ｂｐ長のプライマーを、ＲＥＣ１−ＩＩコード配列の１５０ｂｐ上流および下流にアニールするように選択した（添付資料の表５を参照）。ＰＣＲライブラリーを、ＮｃｏＩおよびＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によって前もって消化してＲＥＣ１−ＩＩドメインを除去したｐ４１５−ＧａｌＬ−Ｃａｓ９−ＣＹＣ１ｔプラスミドと、変異誘発したアンプリコンプールとのコトランスフォーメーション（インサート／プラスミド比が３：１である）によってインビボで直接アセンブルした。アンプリコンの両端の２つの１５０ｂｐの相同領域を使用し、イーストによる相同組換えにより消化したプラスミドを修復し、よって変異誘発した部分を組み込んだ。これらの１５０ｂｐの隣接する領域に変異を含有するクローンは、完全な相同性の欠失により、このインビボアセンブリーステップ中にネガティブ選択される可能性がある。それにもかかわらず、これらの変異は、本発明者らの目的の領域（ＲＥＣ１−ＩＩドメイン）の外側にあった。変異原性のライブラリーを、ＴＲＰ１遺伝子座に含有されたオンターゲット配列にマッチングするｓｇＲＮＡを安定に発現するｙＡＣＭＯ−オフ４イースト株中に、上記断片をコトランスフォーメーションすることによって、そのアセンブリーに付随してスクリーニングした。トランスフォーメーション後、培養物を、ウラシルおよびロイシンを欠くＳＤ培地中で終夜増殖させ（ＳＤｌｕ、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドおよびＣａｓ９発現プラスミドの両方を有する細胞を選択するため）、回復及び正確な組換えを可能にした。次の日、ガラクトース含有培地（ＳＲＧｌｕ）中で５時間、培養物を増殖させることによってＣａｓ９発現を誘導して、トリプトファンを欠き低濃度のアデニンを含有するいくつかの選択プレート（ＳＤｌｕｔａ_５）にプレーティングして、ＴＲＰ１遺伝子座およびＡＤＥ２遺伝子座の編集状態にしたがってコロニーを区別した。４８時間後、ＴＲＰ１^＋／ＡＤＥ２⁻（赤）コロニーを、ガラクトースおよびラフィノースを含有し、低アデニンおよびトリプトファン無しの選択プレート（ＳＲＧｌｕｔａ_５）上にストリークし、構成的に誘導されるＣａｓ９発現を維持し、オフターゲット切断を生成させた。さらに４８時間のインキュベーション後、Ｃａｓ９発現プラスミドを、Ｃａｓ９がオンターゲット部位のみを切断するコロニーに対応する、最も赤色のストリークから抽出し、変異をサンガー法配列決定によって特徴づけた。

イーストコロニーカラー分析および定量。全てのプレート画像をＣａｎｏｎ ＥＯＳ １１００Ｄ（１／６０、ｆ／９．０およびＩＳＯ８００）によって得て、ＯｐｅｎＣＦＵによって分析した（Geissmann Q, PLoS One. 2013;8(2):e54072）。全ての画像に関して、８〜５０ピクセルの間の半径で逆閾値（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（値＝２）を使用した。白色コロニーと赤色コロニーとの間の区別を、ＲＧＢチャンネルの平均シグナルを計算すること、および各実験の赤色と白色のコロニーの間を正確に区別する手動の閾値を設定することによって算出した。

哺乳動物細胞およびトランスフェクション。２９３Ｔ／１７細胞を、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から取得して（ＡＴＣＣから取得した）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および抗生物質（ＰｅｎＳｔｒｅｐ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。２９３ｍｕｌｔｉＧＦＰ細胞を、ｐＥＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎによる安定なトランスフェクションによって生成し、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで選択した。２９３ｂｌａｓｔＥＧＦＰを、ＥＧＦＰ発現レンチウイルスベクターｐＡＩＢ−ＧＦＰによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の低ＭＯＩ感染、その後の５μｇ／ｍｌのブラスチシジンによるクローン選択によって得た。トランスフェクションについては、ウェル当たり１×１０^５個の２９３ｍｕｌｔｉＧＦＰまたは２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに播種し、４００〜７５０ｎｇのＣａｓ９発現プラスミドおよび２００〜２５０ｎｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドを使用して、製造業者のプロトコールに従ってＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を使用して次の日トランスフェクションを行った。ＥＧＦＰ発現を含む一過性のトランスフェクション実験については、１００ｎｇのｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを使用した。２９３ｍｕｌｔｉＧＦＰへのトランスフェクション後のＣａｓ９によるＥＧＦＰのレベルの下方制御を決定するため、細胞をトランスフェクションの７日後に回収し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。

レンチウイルスベクター産生および形質導入。レンチウイルス粒子を、１０ｃｍディッシュに４×１０^６個の２９３Ｔ細胞を播種することによって産生した。次の日、プレートに、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法を使用して、６．５μｇのｐＣＭＶ−ｄｅｌｔａＲ８．９１パッケージングベクターおよび３．５μｇのｐＭＤ２．Ｇと一緒に１０μｇの各ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲベース（Cong L et al., Science. 2013, 339(6121):819-23）の移入ベクターをトランスフェクトした。終夜のインキュベーション後、培地を新しい完全ＤＭＥＭと置き換え、４８時間後、ウイルス粒子を含有する上澄み液を回収し、５００×ｇで５分間遠心沈殿し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。ベクター力価の定量を、ＳＧ−ＰＥＲＴ法を使用して実施した（Pizzato M et al., J Virol Methods. 2009, 156(1-2):1-7）。ベクターストックを、将来使用するために−８０℃で保存した。

形質導入については、１０^５個の２９３ｂｌａｓｔＧＦＰ細胞を２４ウェルプレートに播種し、次の日に２時間１６００×ｇ、１６℃で遠心分離することにより、０．４逆転写酵素単位（ＲＴＵ）／ウェルの各ベクターで形質導入した。終夜のインキュベーション後、ウイルス上澄み液を除去し、細胞を全部で４８時間にわたって培養して維持して、その後、０．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを添加して実験中を通して選択を維持した。感染後のＣａｓ９によるＥＧＦＰのレベルの下方制御を決定するため、形質導入後の示した時点で２９３ｂｌａｓｔＧＦＰ細胞を回収し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。

Ｃａｓ９誘導ゲノム変異の検出。ゲノムＤＮＡを、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して、トランスフェクション後の７日目に得た。ゲノム遺伝子座を増幅するためのＰＣＲ反応を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して実施した。試料を添付資料の表８に列挙したオリゴを使用して増幅した。精製したＰＣＲ産物を、シーケンシングおよびＴＩＤＥツールを利用することによって分析した（Brinkman EK et al., Nucleic Acids Res. 2014, 42(22):e168）。ＣＣＲ２−ＣＣＲ５染色体欠失を定量するため、半定量的ＰＣＲ手法を、ＣＣＲ５オンターゲット部位およびＣＣＲ２オフターゲット遺伝子座に隣接するプライマーを使用して設定した（添付資料の表８）。ＰＣＲサイクル数を、増幅プラトーに達しないように調節した。定量を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用し、内部基準としてＦＡＮＣＦゲノム遺伝子座を用いる濃度測定分析を実施することによって得た。

ウェスタンブロット。細胞はＮＥＨＮ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ４０、ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、１％のプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐｉｅｒｃｅ）を補足した）中で溶解した。細胞抽出物は、標準分子量マーカーとしてＰａｇｅＲｕｌｅｒ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動後、試料を０．２２μｍのＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に移した。膜は、ＳｐＣａｓ９および異なる高忠実度バリアントを検出するためにマウス抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）と、ローディングコントロールのためにマウス抗αチューブリン（Ｓｉｇｍａ）と、ＥＣＬ検出のために適切なＨＲＰコンジュゲートゴート抗マウス（ＫＰＬ）二次抗体とインキュベートした。画像は、ＵＶｌｔｅｃ Ａｌｌｉａｎｃｅ検出システムを使用して得た。

標的化ディープシーケンシング。野生型ＳｐＣａｓ９もしくはｅｖｏＣａｓ９を、ＥＭＸ１遺伝子座およびＶＥＧＦＡ３遺伝子座を標的化するｓｇＲＮＡまたはｐＵＣ空ベクターと一緒にトランスフェクションして７日後に抽出した２９３ＴのゲノムＤＮＡから、ＶＥＧＦＡ３ゲノム遺伝子座およびＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の選択したオフターゲット部位を、それらの相対オンターゲットと一緒に、Ｐｈｕｓｉｏｎ ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＥｕｒｏＴａｑポリメラーゼ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）を使用して増幅した。オフターゲットアンプリコンを、精製およびインデックス付けの前にほぼ等モル濃度でプールした。ライブラリーを、Ｎｅｘｔｅｒａインデックス（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用するＰＣＲによってインデックス付けし、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量し、標的の数によってプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ ＲｅａｇｅｎｔキットＶ３−１５０サイクル（単回リード１５０ｂｐ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシステムで配列決定した。アンプリコンを生成するために使用した完全なプライマーリストを添付資料の表７に報告する。

参照ゲノムを、検討したオン／オフターゲット領域のＤＮＡ配列から、Ｐｉｃａｒｄ（http://broadinstitute.github.io/picard）およびｓａｍｔｏｏｌｓ（Li H at al., Bioinformatics. 2009, 25(16):2078-9）を使用して構築した。生シーケンスデータ（ＦＡＳＴＱファイル）を、標準パラメーターを用いたＢＷＡ−ＭＥＭ（Li H and Durbin R, Bioinformatics. 2010, 26(5):589-95）を使用して、作成した参照ゲノムに対してマッピングし、生じたアライメントファイルを、ｓａｍｔｏｏｌｓを使用してソートした。３０以上のマッピングクオリティーのあるリードのみを保持した。それぞれの検討した領域に対する各リード中のインデルの存在を、予測の切断部位に直接隣接するサイズ１ｂｐのインデル、または予測の切断部位の周辺５ｂｐサイズの隣接領域とオーバーラップするサイズが≧２ｂｐのインデルを検索することによって決定した。

ＧＵＩＤＥシーケンス実験およびデータ分析。ＧＵＩＤＥシーケンスは、ほとんど改変せずに、以前に記載されたように実施した（Bolukbasi MF et al., Nat Methods. 2015,12(12):1150-6）。簡潔に言うと、２×１０^５個の２９３Ｔ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、７５０ｎｇのＣａｓ９発現プラスミドを、２５０ｎｇのｓｇＲＮＡコードプラスミドまたは空ｐＵＣ１９プラスミドおよび両端にホスホロチオエート結合を含有する１０ｐｍｏｌのベイトｄｓＯＤＮ（オリジナルのＧＵＩＤＥシーケンスプロトコールに従って設計した）と一緒にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、製造業者の指示に従って、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ音波処理装置（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）によって５００ｂｐの平均長に切断した。ライブラリー調製を、オリジナルアダプターおよび以前の研究によるプライマーによって実施した（Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97）。ライブラリーを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ ＲｅａｇｅｎｔキットＶ２−３００サイクル（２×１５０ｂｐ対の末端）を使用してＭｉｓｅｑシーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。

生シーケンスデータ（ＦＡＳＴＱファイル）を、ＧＵＩＤＥシーケンス計算パイプラインを使用して分析した（Tsai SQ et al., Nat Biotechnol. 2015, 33(2):187-97）。デマルチプレクシング後、推定のＰＣＲ複製を単一リードに集結した。集結したリードは、ＢＷＡ−ＭＥＭを使用してヒト参照ゲノムＧｒＣｈ３７にマッピングし（Li H and Durbin R, Bioinformatics. 2010, 26(5):589-95）；マッピングクオリティーが５０より低いリードは除外した。二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を挿入しているゲノム領域を整列データにおいて同定する際、標的に対して多くて８個のミスマッチが存在する場合、およびバックグラウンドコントロールが無い場合は、ＲＧＮ部位を保持した。アラインしたオフターゲット部位の可視化は、カラーコード配列グリッドとして利用できる。
添付資料

Claims (28)

1. Ｋ５２６、Ｋ３７７、Ｅ３８７、Ｄ３９７、Ｒ４００、Ｄ４０６、Ａ４２１、Ｌ４２３、Ｒ４２４、Ｑ４２６、Ｙ４３０、Ｋ４４２、Ｐ４４９、Ｖ４５２、Ａ４５６、Ｒ４５７、Ｗ４６４、Ｍ４６５、Ｋ４６８、Ｅ４７０、Ｔ４７４、Ｐ４７５、Ｗ４７６、Ｆ４７８、Ｋ４８４、Ｓ４８７、Ａ４８８、Ｔ４９６、Ｆ４９８、Ｌ５０２、Ｎ５０４、Ｋ５０６、Ｐ５０９、Ｆ５１８、Ｎ５２２、Ｅ５２３、Ｌ５４０、Ｓ５４１、Ｉ５４８、Ｄ５５０、Ｆ５５３、Ｖ５６１、Ｋ５６２、Ｅ５７３、Ａ５８９、Ｌ５９８、Ｄ６０５、Ｌ６０７、Ｎ６０９、Ｎ６１２、Ｅ６１７、Ｄ６１８、Ｄ６２８、Ｒ６２９、Ｒ６３５、Ｋ６３７、Ｌ６５１、Ｋ６５２、Ｒ６５４、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｌ６６６、Ｋ６７３、Ｓ６７５、Ｉ６７９、Ｌ６８０、Ｌ６８３、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｆ６９３、Ｓ７０１、Ｆ７０４、Ｑ７１２、Ｇ７１５、Ｑ７１６、Ｈ７２３、Ｉ７２４、Ｌ７２７、Ｉ７３３、Ｌ７３８、Ｑ７３９からなる群から選択されるアミノ酸残基位置に位置する少なくとも１つの変異を含む、単離した改変Ｃａｓ９分子であって、ここで、改変アミノ酸配列の位置は、配列番号１によって同定される非改変の成熟ストレプトコッカス・ピオゲネス（streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の対応位置のアミノ酸番号を参照して同定される、改変Ｃａｓ９分子。
2. Ｋ５２６位に少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の改変Ｃａｓ９。
3. Ｋ５２６位における前記変異が、Ｋ５２６ＮおよびＫ５２６Ｅからなる群から選択される、請求項２に記載の改変Ｃａｓ９。
4. Ｋ３７７、Ｅ３８７、Ｄ３９７、Ｒ４００、Ｑ４０２、Ｒ４０３、Ｆ４０５、Ｄ４０６、Ｎ４０７、Ａ４２１、Ｌ４２３、Ｒ４２４、Ｑ４２６、Ｙ４３０、Ｋ４４２、Ｐ４４９、Ｙ４５０、Ｖ４５２、Ａ４５６、Ｒ４５７、Ｗ４６４、Ｍ４６５、Ｋ４６８、Ｅ４７０、Ｔ４７２、Ｉ４７３、Ｔ４７４、Ｐ４７５、Ｗ４７６、Ｆ４７８、Ｋ４８４、Ｓ４８７、Ａ４８８、Ｍ４９５、Ｔ４９６、Ｎ４９７、Ｆ４９８、Ｌ５０２、Ｎ５０４、Ｋ５０６、Ｐ５０９、Ｙ５１５、Ｆ５１８、Ｎ５２２、Ｅ５２３、Ｌ５４０、Ｓ５４１、Ｉ５４８、Ｄ５５０、Ｆ５５３、Ｖ５６１、Ｋ５６２、Ｅ５７３、Ａ５８９、Ｌ５９８、Ｄ６０５、Ｌ６０７、Ｎ６０９、Ｎ６１２、Ｅ６１７、Ｄ６１８、Ｄ６２８、Ｒ６２９、Ｒ６３５、Ｋ６３７、Ｌ６５１、Ｋ６５２、Ｒ６５４、Ｔ６５７、Ｇ６５８、Ｗ６５９、Ｒ６６１、Ｌ６６６、Ｋ６７３、Ｓ６７５、Ｉ６７９、Ｌ６８０、Ｌ６８３、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｎ６９２、Ｆ６９３、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｓ７０１、Ｆ７０４、Ｑ７１２、Ｇ７１５、Ｑ７１６、Ｈ７２１、Ｈ７２３、Ｉ７２４、Ｌ７２７、Ａ７２８、Ｉ７３３、Ｌ７３８、Ｑ７３９
   からなる群から選択されるアミノ酸残基位置に位置する少なくとも１つのさらなる変異を含む、請求項２から３のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
5. 前記少なくとも１つのさらなる変異が、Ｙ４５０、Ｍ４９５、Ｙ５１５、Ｒ６６１、Ｎ６９０、Ｒ６９１、Ｑ６９５、Ｈ６９８からなる群から選択される位置である、請求項４に記載の改変Ｃａｓ９。
6. 前記少なくとも１つのさらなる変異が、
   Ｋ３７７Ｅ、Ｅ３８７Ｖ、Ｄ３９７Ｅ、Ｒ４００Ｈ、Ｑ４０２Ｒ、Ｒ４０３Ｈ、Ｆ４０５Ｌ、Ｄ４０６Ｙ、Ｄ４０６Ｖ、Ｎ４０７Ｐ、Ｎ４０７Ｈ、Ａ４２１Ｖ、Ｌ４２３Ｐ、Ｒ４２４Ｇ、Ｑ４２６Ｒ、Ｙ４３０Ｃ、Ｋ４４２Ｎ、Ｐ４４９Ｓ、Ｙ４５０Ａ、Ｙ４５０Ｓ、Ｙ４５０Ｈ、Ｙ４５０Ｎ、Ｖ４５２Ｉ、Ａ４５６Ｔ、Ｒ４５７Ｐ、Ｒ４５７Ｑ、Ｗ４６４Ｌ、Ｍ４６５Ｒ、Ｋ４６８Ｎ、Ｅ４７０Ｄ、Ｔ４７２Ａ、Ｉ４７３Ｆ、Ｉ４７３Ｖ、Ｔ４７４Ａ、Ｐ４７５Ｈ、Ｗ４７６Ｒ、Ｆ４７８Ｙ、Ｆ４７８Ｖ、Ｋ４８４Ｍ、Ｓ４８７Ｙ、Ａ４８８Ｖ、Ｍ４９５Ｖ、Ｍ４９５Ｔ、Ｔ４９６Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｆ４９８Ｉ、Ｆ４９８Ｙ、Ｌ５０２Ｐ、Ｎ５０４Ｓ、Ｋ５０６Ｎ、Ｐ５０９Ｌ、Ｙ５１５Ｎ、Ｆ５１８Ｌ、Ｆ５１８Ｉ、Ｎ５２２Ｋ、Ｎ５２２Ｉ、Ｅ５２３Ｋ、Ｅ５２３Ｄ、Ｌ５４０Ｑ、Ｓ５４１Ｐ、Ｉ５４８Ｖ、Ｄ５５０Ｎ、Ｆ５５３Ｌ、Ｖ５６１Ｍ、Ｖ５６１Ａ、Ｋ５６２Ｅ、Ｅ５７３Ｄ、Ａ５８９Ｔ、Ｌ５９８Ｐ、Ｄ６０５Ｖ、Ｌ６０７Ｐ、Ｎ６０９Ｄ、Ｎ６０９Ｓ、Ｎ６１２Ｙ、Ｎ６１２Ｋ、Ｅ６１７Ｋ、Ｄ６１８Ｎ、Ｄ６２８Ｇ、Ｒ６２９Ｇ、Ｒ６３５Ｇ、Ｋ６３７Ｎ、Ｌ６５１Ｐ、Ｌ６５１Ｈ、Ｋ６５２Ｅ、Ｒ６５４Ｈ、Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ｅ、Ｗ６５９Ｒ、Ｒ６６１Ａ、Ｒ６６１Ｗ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６６１Ｓ、Ｌ６６６Ｐ、Ｋ６７３Ｍ、Ｓ６７５Ｃ、Ｉ６７９Ｖ、Ｌ６８０Ｐ、Ｌ６８３Ｐ、Ｎ６９０Ｉ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｎ６９２Ｉ、Ｆ６９３Ｙ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ｈ、Ｑ６９５Ｌ、Ｈ６９８Ｑ、Ｈ６９８Ｐ、Ｓ７０１Ｆ、Ｆ７０４Ｓ、Ｑ７１２Ｒ、Ｇ７１５Ｓ、Ｑ７１６Ｈ、Ｈ７２１Ｒ、Ｈ７２３Ｌ、Ｉ７２４Ｖ、Ｌ７２７Ｈ、Ａ７２８Ｇ、Ａ７２８Ｔ、Ｉ７３３Ｖ、Ｌ７３８Ｐ、Ｑ７３９Ｅ、Ｑ７３９ＰおよびＱ７３９Ｋ
   からなる群から選択される、請求項４から５のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
7. Ｍ４９５Ｖ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１ＸおよびＭ４９５Ｖ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｒ６６１Ｘ＋Ｈ６９８Ｑからなる群から選択される４重の変異を含み；ここで、Ｘが、Ｌ、ＱおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；好ましくは、ＸがＱまたはＳである、請求項１から６のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
8. Ｋ３７７Ｅ、Ｅ３８７Ｖ、Ｄ３９７Ｅ、Ｒ４００Ｈ、Ｑ４０２Ｒ、Ｒ４０３Ｈ、Ｆ４０５Ｌ、Ｄ４０６Ｙ、Ｄ４０６Ｖ、Ｎ４０７Ｐ、Ｎ４０７Ｈ、Ａ４２１Ｖ、Ｌ４２３Ｐ、Ｒ４２４Ｇ、Ｑ４２６Ｒ、Ｙ４３０Ｃ、Ｋ４４２Ｎ、Ｐ４４９Ｓ、Ｙ４５０Ｓ、Ｙ４５０Ｈ、Ｙ４５０Ｎ、Ｖ４５２Ｉ、Ａ４５６Ｔ、Ｒ４５７Ｐ、Ｒ４５７Ｑ、Ｗ４６４Ｌ、Ｍ４６５Ｒ、Ｋ４６８Ｎ、Ｅ４７０Ｄ、Ｔ４７２Ａ、Ｉ４７３Ｆ、Ｉ４７３Ｖ、Ｔ４７４Ａ、Ｐ４７５Ｈ、Ｗ４７６Ｒ、Ｆ４７８Ｙ、Ｆ４７８Ｖ、Ｋ４８４Ｍ、Ｓ４８７Ｙ、Ａ４８８Ｖ、Ｍ４９５Ｖ、Ｍ４９５Ｔ、Ｔ４９６Ａ、Ｆ４９８Ｉ、Ｆ４９８Ｙ、Ｌ５０２Ｐ、Ｎ５０４Ｓ、Ｋ５０６Ｎ、Ｐ５０９Ｌ、Ｙ５１５Ｎ、Ｆ５１８Ｌ、Ｆ５１８Ｉ、Ｎ５２２Ｋ、Ｎ５２２Ｉ、Ｅ５２３Ｋ、Ｅ５２３Ｄ、Ｋ５２６Ｅ、Ｋ５２６Ｎ、Ｌ５４０Ｑ、Ｓ５４１Ｐ、Ｉ５４８Ｖ、Ｄ５５０Ｎ、Ｆ５５３Ｌ、Ｖ５６１Ｍ、Ｖ５６１Ａ、Ｋ５６２Ｅ、Ｅ５７３Ｄ、Ａ５８９Ｔ、Ｌ５９８Ｐ、Ｄ６０５Ｖ、Ｌ６０７Ｐ、Ｎ６０９Ｄ、Ｎ６０９Ｓ、Ｎ６１２Ｙ、Ｎ６１２Ｋ、Ｅ６１７Ｋ、Ｄ６１８Ｎ、Ｄ６２８Ｇ、Ｒ６２９Ｇ、Ｒ６３５Ｇ、Ｋ６３７Ｎ、Ｌ６５１Ｐ、Ｌ６５１Ｈ、Ｋ６５２Ｅ、Ｒ６５４Ｈ、Ｔ６５７Ａ、Ｇ６５８Ｅ、Ｗ６５９Ｒ、Ｒ６６１Ｗ、Ｒ６６１Ｌ、Ｒ６６１Ｑ、Ｒ６６１Ｓ、Ｌ６６６Ｐ、Ｋ６７３Ｍ、Ｓ６７５Ｃ、Ｉ６７９Ｖ、Ｌ６８０Ｐ、Ｌ６８３Ｐ、Ｎ６９０Ｉ、Ｒ６９１Ｑ、Ｒ６９１Ｌ、Ｎ６９２Ｉ、Ｆ６９３Ｙ、Ｑ６９５Ｈ、Ｑ６９５Ｌ、Ｈ６９８Ｑ、Ｈ６９８Ｐ、Ｓ７０１Ｆ、Ｆ７０４Ｓ、Ｑ７１２Ｒ、Ｇ７１５Ｓ、Ｑ７１６Ｈ、Ｈ７２１Ｒ、Ｈ７２３Ｌ、Ｉ７２４Ｖ、Ｌ７２７Ｈ、Ａ７２８Ｇ、Ａ７２８Ｔ、Ｉ７３３Ｖ、Ｌ７３８Ｐ、Ｑ７３９Ｅ、Ｑ７３９ＰおよびＱ７３９Ｋからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１に記載の改変Ｃａｓ９。
9. １〜９の間に含まれる前記変異の総数を含む、請求項４から８のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
10. Ｄ４０６Ｙ、Ｗ４６４Ｌ、Ｔ４７４Ａ、Ｎ６１２Ｋ、Ｌ６８３Ｐからなる群から選択される１ヵ所変異；または
    Ｒ４００Ｈ＋Ｙ４５０Ｓ、Ｄ４０６Ｖ＋Ｅ５２３Ｋ、Ａ４２１Ｖ＋Ｒ６６１Ｗ、Ｒ４２４Ｇ＋Ｑ７３９Ｐ、Ｗ４７６Ｒ＋Ｌ７３８Ｐ、Ｐ４４９Ｓ＋Ｆ７０４Ｓ、Ｎ５２２Ｋ＋Ｇ６５８Ｅ、Ｅ５２３Ｄ＋Ｅ６１７Ｋ、Ｌ５４０Ｑ＋Ｌ６０７Ｐ、Ｗ６５９Ｒ＋Ｒ６６１Ｗ、Ｓ６７５Ｃ＋Ｑ６９５ＬおよびＩ６７９Ｖ＋Ｈ７２３Ｌからなる群から選択される２重変異；または
    Ｋ３７７Ｅ＋Ｌ５９８Ｐ＋Ｌ６５１Ｈ、Ｄ３９７Ｅ＋Ｙ４３０Ｃ＋Ｌ６６６Ｐ、Ｑ４０２Ｒ＋Ｖ５６１Ｍ＋Ｑ６９５Ｌ、Ｎ４０７Ｐ＋Ｆ４９８Ｉ＋Ｐ５０９Ｌ、Ｎ４０７Ｈ＋Ｋ６３７Ｎ＋Ｎ６９０Ｉ、Ｙ４５０Ｈ＋Ｆ５５３Ｌ＋Ｑ７１６Ｈ、Ｙ４５０Ｎ＋Ｈ６９８Ｐ＋Ｑ７３９Ｋ、Ｔ４７２Ａ＋Ｐ４７５Ｈ＋Ａ４８８Ｖ、Ｉ４７３Ｆ＋Ｄ５５０Ｎ＋Ｑ７３９Ｅ、Ｆ４７８Ｙ＋Ｎ５２２Ｉ＋Ｌ７２７Ｈ、Ｋ４８４Ｍ＋Ｑ６９５Ｈ＋Ｑ７１２Ｒ、Ｓ４８７Ｙ＋Ｎ５０４Ｓ＋Ｅ５７３Ｄ、Ｔ４９６Ａ＋Ｎ６０９Ｄ＋Ａ７２８Ｇ、Ｒ６５４Ｈ＋Ｒ６９１Ｑ＋Ｈ６９８ＱおよびＲ６９１Ｌ＋Ｈ７２１Ｒ＋Ｉ７３３Ｖからなる群から選択される３重変異；
    Ｆ４０５Ｌ＋Ｆ５１８Ｌ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｉ７２４Ｖ、Ｌ４２３Ｐ＋Ｍ４６５Ｒ＋Ｙ５１５Ｎ＋Ｋ６７３Ｍ、Ｒ４５７Ｐ＋Ｋ４６８Ｎ＋Ｒ６６１Ｗ＋Ｇ７１５Ｓ、Ｅ４７０Ｄ＋Ｉ５４８Ｖ＋Ａ５８９Ｔ＋Ｑ６９５Ｈ、Ａ４８８Ｖ＋Ｄ６０５Ｖ＋Ｒ６２９Ｇ＋Ｔ６５７ＡおよびＭ４９５Ｖ＋Ｋ５２６Ｎ＋Ｓ５４１Ｐ＋Ｋ５６２Ｅからなる群から選択される４重の変異；または
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される５ヵ所変異；
    Ｅ３８７Ｖ＋Ｖ５６１Ａ＋Ｄ６１８Ｎ＋Ｄ６２８Ｇ＋Ｌ６８０Ｐ＋Ｓ７０１Ｆ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｋ５２６Ｅ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｍ４９５Ｔ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｌ５０２Ｐ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｋ５０６Ｎ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｎ６９２Ｉ＋Ｇ７１５Ｓ
    からなる群から選択される６ヵ所変異；または
    Ｒ４０３Ｈ＋Ａ４５６Ｔ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ＋Ｇ７２８Ｔ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｆ４９８Ｙ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｒ６６１Ｌ＋Ｇ７１５Ｓ、
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｑ４２６Ｒ＋Ｆ４７８Ｖ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｇ７１５Ｓ
    からなる群から選択される７ヵ所変異；または
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｒ４４２Ｎ＋Ｖ４５２Ｉ＋Ｎ６０９Ｓ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｒ６３５Ｇ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｆ６９３Ｙ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される８ヵ所変異；または
    Ｒ４０３Ｈ＋Ｒ４５７Ｑ＋Ｆ５１８Ｉ＋Ｎ６１２Ｙ＋Ｒ６３５Ｇ＋Ｌ６５１Ｐ＋Ｋ６５２Ｅ＋Ｆ６９３Ｙ＋Ｇ７１５Ｓからなる群から選択される９ヵ所変異
    を含む、請求項８または９に記載の改変Ｃａｓ９。
11. Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８３およびＤ９８６からなる群から選択される残基においてヌクレアーゼ活性を減少させる少なくとも１つのさらなる変異をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
12. Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｒ１３３５、Ｔ１３３７からなる群から選択される残基においてＰＡＭ認識特異性を変更する少なくとも１つのさらなる変異をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
13. ストレプトコッカス・ピオゲネス（S. pyogenes）またはそのオルソログである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
14. １つまたは複数の他のポリペプチド配列と融合されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９。
15. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９を産生する方法であって、前記改変Ｃａｓ９を１つまたは複数の断片から再構築するステップを含む、方法。
16. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９を含有する、タンパク質またはリボヌクレオタンパク質複合体または混合タンパク質リボヌクレオタンパク質または脂質複合体。
17. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９を含む融合タンパク質。
18. 請求項１から１４のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９およびその断片をコードするヌクレオチドの配列。
19. 請求項１８に記載のヌクレオチドの配列を含む核酸。
20. 請求項１９に記載の核酸を含むベクター。
21. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載の改変Ｃａｓ９を産生する方法であって、前記改変Ｃａｓ９が請求項１９に記載の核酸によって発現される、方法。
22. 請求項１９の核酸または請求項２０のベクターを使用して工学的に操作された細胞、動物または植物。
23. 遺伝子治療の医薬としての使用のための、請求項１８のヌクレオチドの配列または請求項１９の核酸または請求項２０のベクター。
24. 請求項１８のヌクレオチドの配列または請求項１９の核酸または請求項２０のベクターおよび少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
25. 請求項１〜１４のいずれかの組換え改変Ｃａｓ９および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
26. ゲノム工学、細胞工学、タンパク質発現または他のバイオテクノロジー利用のための、ｇＲＮＡと一緒の請求項１〜１４の組換え改変Ｃａｓ９、または請求項１８のヌクレオチドの配列、または請求項１９の核酸、または請求項２０のベクターのインビトロでの使用。
27. ｇＲＮＡと一緒の請求項１〜１４の組換え改変Ｃａｓ９、または請求項１８のヌクレオチドの配列、または請求項１９の核酸、または請求項２０のベクターを含む、同時に、別々に、または順に使用するためのキットオブパーツ。
28. 細胞のゲノムを変更するインビトロでの方法であって、特定のゲノム配列を標的化するガイドＲＮＡと一緒に、請求項１〜１４のいずれかの改変Ｃａｓ９を細胞内で発現させることを含む、方法。